CN101928675B - 一株耐受香草醛的酿酒酵母 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株耐受香草醛的酿酒酵母，该菌株名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)EMV-8，已于2010年07月16日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.4012。本发明菌株由酿酒酵母EM-13在以不同浓度玉米秸秆汽爆料提取液配制的YEPD液体培养基中驯化并筛选得到；与出发菌株EM-13相比，在含有1g/L香草醛的YEPD液体培养基中培养时，该菌株能更快地将葡萄糖消耗尽，且具有较高乙醇得率，在含有2g/L香草醛的YEPD液体培养基中培养时，其生长延滞期比出发菌株缩短约20小时；本发明菌株对进一步选育木质纤维素水解液中抑制物耐受性酿酒酵母具有很好的应用价值，同时对研究酿酒酵母的酚类化合物耐受性机制具有一定的理论价值。

Description

一株耐受香草醛的酿酒酵母

技术领域

本发明涉及一株酿酒酵母，具体涉及一株耐受香草醛的酿酒酵母，及其香草醛耐受性能检测，属于微生物育种领域。

背景技术

目前发酵法生产乙醇主要以淀粉质原料为主，生产成本高，且存在与人争粮争地的问题。从发展可再生清洁能源、保护生态环境方面考虑，利用丰富廉价的可再生木质纤维素原料生产乙醇的研究逐渐受到人们的重视。以木质纤维素为原料生产乙醇，预处理是必需的环节，这一过程会产生多种对纤维素酶解及后续乙醇发酵微生物酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的生长有抑制作用的化合物，这些抑制物主要有三大类：弱酸(甲酸、乙酸等)、呋喃醛类(糠醛、5-羟甲基糠醛)和酚类化合物(香草醛、松柏醛等)，它们影响了纤维素水解、降低了乙醇得率和产量，是木质纤维素原料大规模生产乙醇的一个主要障碍。

针对这一问题目前主要有三种应对措施，例如利用物理、化学或生物学方法对预处理原料脱毒从而有利于原料的酶解及改善原料酶解液的发酵性能，但这种措施增加了过程生产成本，同时也会造成可发酵性糖的损失，所以在木质纤维素生物转化生产乙醇过程中应尽量减少脱毒环节；此外还可通过对发酵过程的控制，例如采用流加操作方式减少抑制物的负面作用等；而比较有利的方法是通过菌种驯化或基因工程方法提高微生物菌种自身对抑制物的耐受性。

木质纤维素水解液对酿酒酵母的抑制作用并非各种毒性物质抑制作用的简单加和，其中多种毒性物质间存在协同作用，即使在它们各自浓度很低的情况下，也会对酵母产生较强的抑制作用。因此，基于木质纤维素水解液中各种抑制物之间复杂的综合作用以及不同来源的木质纤维素原料水解液中抑制物成份的差异，有必要在原料预处理液或水解液中对酵母进行定向驯化，并通过筛选得到对原料水解液或对其中某一种抑制物的耐受性增强的菌株。

菌种的定向驯化是在合适的选择性压力下，基于反复的遗传性状变化及多次筛选来选择出有利性状的过程，与短期的适应相比，由长期驯化得到的菌株具有一定的遗传稳定性，即使在没有选择性压力的条件下，其优良性状也能继续保持；文献上曾报道利用这种方法将酿酒酵母在含有糠醛或5-羟甲基糠醛(5-HMF)的YEPD液体培养基中或是在甘蔗渣水解液中进行驯化，从而筛选得到分别对糠醛或5-HMF或是甘蔗渣水解液的耐受性提高的菌株。Larsson等通过在酵母中表达白腐真菌Trametes versicolor漆酶基因得到松柏醛耐受性提高的重组菌，但是通过在木质纤维素原料水解液中驯化并筛选得到对某种酚类化合物耐受性提高的菌株还未有报道，并且由于缺乏定量及定性的分析方法，酚类化合物对酿酒酵母等真核微生物的抑制机制还没有完全阐明。

发明内容

基于上述研究背景，本发明的目的是提供一株耐受香草醛的酿酒酵母。

本发明所述耐受香草醛的酿酒酵母其特征在于：该菌株名为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)EMV-8，已于2010年07月16日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(中国科学院微生物研究所，中国，北京)，保藏编号为CGMCC No.4012。

上述耐受香草醛的酿酒酵母是通过对酿酒酵母菌株EM-13在以不同浓度玉米秸秆汽爆料提取液配制的YEPD液体培养基中驯化并结合筛选获得，该菌株命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)EMV-8，其生物学特征是：营养细胞为二倍体，球形，不运动，YEPD液体或固体培养条件下为出芽繁殖；30℃液体培养时以单细胞形式存在；30℃固体培养时，菌落表面光滑、湿润、粘稠、质地均匀，菌落颜色为乳白色，且边缘和中央部位颜色均一。

本发明所述CGMCC No.4012菌株对进一步选育耐受木质纤维素水解液中抑制物的酿酒酵母具有很好的应用价值，同时对研究酚类化合物对酿酒酵母等真核微生物的抑制机制或酵母对酚类化合物耐受机制具有一定的理论价值。

实验检测，本发明所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)EMV-8菌株香草醛耐受性明显提高。通过与对照菌株相比，在含有1g/L香草醛的YEPD液体培养基中培养时，EMV-8生长延滞期比对照菌株缩短约4小时，且乙醇得率达到45.94％，而对照菌NAN-27、EM-13乙醇得率分别为40.2％、33.38％；在含有2g/L香草醛的YEPD液体培养基中培养时，EMV-8生长延滞期比对照菌株缩短约20h，且乙醇得率达到39.63％，而对照菌NAN-27、EM-13乙醇得率分别为31.51％、36.66％。

附图说明

本发明所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)EMV-8已于2010年07月16日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(中国科学院微生物研究所，中国，北京)，保藏编号为CGMCC No.4012。

图1是驯化培养物在含7mmol/L香草醛的YEPD固体培养基平板上的预筛结果。其中图A代表对照菌株EM-13，图B代表对照菌株NAN-127，图C代表驯化培养物。

图2是三株筛选得到的菌株EMT-7、EMB-42和EMV-8与对照菌NAN-27、NAN-127及EM-13在含有不同浓度香草醛的YEPD固体培养基平板上的点滴试验结果。

图3是菌株EMV-8与对照菌株NAN-27、EM-13分别在含0g/L(A)、1g/L(B)、2g/L(C)、4g/L(D)香草醛的YEPD液体培养基中培养时的生长曲线。

图4是菌株EMV-8与对照菌株NAN-27、EM-13在含1g/L香草醛的YEPD液体培养基中培养时葡萄糖、香草醛消耗(A、C)及乙醇、香草醇生成(B、D)曲线。

图5是菌株EMV-8与对照菌株NAN-27、EM-13在含2g/L香草醛的YEPD液体培养基中培养时葡萄糖、香草醛消耗(A、C)及乙醇、香草醇生成(B、D)曲线。

具体实施方式

实施例1酿酒酵母定向驯化

定向驯化采用的出发菌株为酿酒酵母EM-13，驯化步骤如下：

(1)酿酒酵母菌株EM-13经活化后首先在以浓度为20％的玉米秸秆汽爆料提取液(以下简称为SECE)配制的YEPD液体培养基中(20％-SECE-YEPD)培养，接种量为OD_初始＝0.1，当菌体生长至对数期时以等量接种量(OD_初始＝0.1)转接至相同的培养基(20％-SECE-YEPD)中，以此方式重复转接，每转接一次称为一个驯化批次。

(2)驯化过程中监测各个批次培养11小时处的OD值以及葡萄糖消耗量，当11小时处的葡萄糖消耗量不再增加且基本稳定时，则提高下一批次驯化培养基的SECE浓度，提高幅度为2％。在进行筛选前共进行了180批次菌种转接且相应驯化培养基的SECE浓度最终增加至32％。

其中：

步骤(1)所述培养温度为30℃，摇床转速为200r/min，好氧培养11小时。

步骤(2)所述OD值为600nm处菌悬液吸光度值，菌悬液制备方法为：取驯化培养液1mL，离心并水洗2遍后补水至1mL，旋涡震荡均匀后测OD值。

步骤(2)所述还原糖消耗量的测定方法为3，5-二硝基水杨酸法(DNS法)，分别测得培养0小时及11小时处的还原糖含量，两者之差为还原糖消耗量。

实施例2驯化培养物筛选

将实施例1所得的驯化培养物经预筛、初筛及复筛后最终获得耐受香草醛的酿酒酵母，菌株命名为EMV-8(已于2010年07月16日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.4012)，筛选步骤如下：

(1)稀释平板预筛：将驯化培养液稀释至合适浓度涂布于预筛固体培养基平板上，同时也将菌株NAN-127、EM-13的培养液稀释至合适浓度涂布于预筛固体培养基平板上作为对照，30℃温箱培养，培养过程中观察菌落长出时间、菌落大小及颜色，挑选长出时间较短、菌落大及颜色正常的菌落(见图1)。

(2)平板划线初筛：将步骤(1)挑选得到的菌株及对照菌株制备休止细胞悬浮液，用接种环蘸取少量菌悬液划线于初筛固体培养基平板上，30℃温箱培养，观察各菌株生长状况并挑选具有生长优势的菌株。

(3)点滴平板复筛：将步骤(2)挑选得到的菌株及对照菌制备休止细胞悬浮液，调节休止细胞悬浮液的OD值至1.0左右，并以此浓度的菌悬液为基准(100)稀释制得不同浓度梯度的休止细胞菌悬液(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4)，用移液枪吸取各浓度梯度菌悬液4微升点滴于复筛培养基固体平板上，30℃温箱培养，比较各菌株在平板上不同浓度梯度下的生长情况，挑选出生长优势最优的菌株并将其命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)EMV-8(见图2)。

其中：

步骤(1)所述预筛固体培养基为含7mmol/L香草醛的YEPD固体培养基。

步骤(2)所述初筛固体培养基为含7mmol/L香草醛的YEPD固体培养基。

步骤(3)所述复筛固体培养基为含6mmol/L、7mmol/L或8mmol/L香草醛的YEPD固体培养基。

步骤(2)、(3)所述休止细胞悬浮液的制备方法为：将酵母菌株接种于少量YEPD培养基中，过夜培养，培养物取1mL离心，用无菌水水洗三遍，再悬浮于1mL无菌水中，30℃静置9小时，旋涡震荡均匀后获得休止细胞悬浮液。

实施例3菌株EMV-8的香草醛耐受性能检测

对实施例2筛选得到的菌株EMV-8进行香草醛耐受性能检测，步骤如下：

(1)斜面菌种活化：分别将斜面保藏的菌株EMV-8及对照菌株EM-13、NAN-27挑取1环至20mLYEPD液体培养基中培养，摇床转速为200r/min，30℃好氧培养24小时。

(2)种子制备：按接种量为OD_初始＝0.2将步骤(1)中培养物分别转接至20mL YEPD液体培养基中培养，摇床转速为200r/min，30℃好氧培养12小时。

(3)摇瓶培养：按接种量为OD_初始＝0.1将步骤(2)中培养物分别转接至香草醛耐受性能检测培养基中培养，摇床转速为200r/min，30℃限氧培养60小时。

(4)生长曲线测定：培养过程中间隔一定时间取样，取样量为1mL。用分光光度计读取菌体在600nm下的OD值，以发酵时间为横轴，OD₆₀₀为纵轴，得到菌株的生长曲线。

(5)样品中底物及产物的分析：培养过程取得的样品-20℃冰箱保存，分析前将样品融化并13000r/min离心15分钟，经0.45μm醋酸纤维滤膜过滤后进行HPLC分析。

其中：

步骤(3)中所述的香草醛耐受性能检测培养基为含有0g/L、1g/L、2g/L、4g/L香草醛的YEPD液体培养基。

步骤(5)所述样品中底物及产物的分析中：葡萄糖、乙醇含量的分析使用AminexHPX-87H(Bio-Rad，USA)柱，流动相为5mmol/L H₂SO₄，流速为0.6mL/min，柱温箱温度为45℃，使用示差折光检测器RID-10A(Shimadzu，Japan)进行检测；香草醛、香草醇含量的分析使用WondaSil^TM C18(C/N 5020-390034.6×250mm)柱，流动相为40％甲醇水溶液(methnol∶H₂O＝40∶60(V/V))，流速为0.4mL/min，柱温箱温度为35℃，使用二极管阵列检测器SPD-M20A(Shimadzu，Japan)，检测波长为210nm。

检测结果表明本发明酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)EMV-8菌株的香草醛耐受性明显提高，与对照菌株相比，在含有1g/L香草醛的YEPD液体培养基中培养时，EMV-8生长延滞期比对照菌株缩短约4小时(见图3)，且能以更快的速率将香草醛转化为香草醇，乙醇得率达到45.94％，而对照菌NAN-27、EM-13乙醇得率分别为40.2％、33.38％(见图4)；在含有2g/L香草醛的YEPD液体培养基中培养时，EMV-8生长延滞期比对照菌株缩短约20h(见图3)，且能以更快的速率将香草醛转化为香草醇，乙醇得率达到39.63％，而对照菌NAN-27、EM-13乙醇得率分别为31.51％、36.66％(见图5)。

本发明中所述YEPD培养基配方是：酵母粉(酵母膏)10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，121℃湿热灭菌20min；固体培养基加入2％琼脂粉。

本发明中所述玉米秸秆汽爆料提取液(SECE)制备方法如下：使用水分仪测定玉米秸秆汽爆原料的含水量，假设原料干基含水量为5％，则代表105g原料组成为100g绝干物料加5g水；称取105g原料，同时加入495mL水，80℃水浴萃取1小时，萃取料浆经滤布过滤后的滤液补水至体积为495mL，另称取105g原料与之混合，80℃水浴萃取1小时，萃取料浆经滤布过滤后的滤液为浓度等于40％的SECE，不同浓度的SECE由40％-SECE加去离子水稀释得到。

本发明中所述不同浓度SECE-YEPD培养基配方是：酵母粉(酵母膏)10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，相应浓度的SECE 1000mL，115℃湿热灭菌15min。

Claims (1)

1.一株耐受香草醛的酿酒酵母，其特征在于：该菌株名为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)EMV-8，已于2010年07月16日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.4012。

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