CN106085867A

CN106085867A - 一种富硒灵芝菌丝粉及其制备方法

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Publication number: CN106085867A
Application number: CN201610423885.5A
Authority: CN
Inventors: 张旺凡
Original assignee: Hunan Traditional Chinese Medical College
Current assignee: Hunan Traditional Chinese Medical College
Priority date: 2016-06-16
Filing date: 2016-06-16
Publication date: 2016-11-09

Abstract

本发明提供了一种富硒灵芝菌丝粉及其制备方法。本发明以生物学理论为指导，采用玉米粉、大豆饼、蔗糖、葡萄糖、磷酸二氢钾以及有机态二硒糖做为添加剂配制成液体培养基，灭菌冷却后，将培养好的菌种液添加其中，在振荡器或液体发酵罐中28℃、振荡速率180次/min、高通氧条件下培养两周左右，过滤、干燥后，得到富硒灵芝菌丝粉。采用本技术生产得到的富硒灵芝菌丝粉硒含量大大提高，且生产成本低、产量高，有机态硒稳定有效，得到的产品营养成份含量高、安全可靠，适合工业化生产。

Description

一种富硒灵芝菌丝粉及其制备方法

技术领域

本发明涉及灵芝菌丝粉的培养技术领域，更具体地，涉及一种富硒灵芝菌丝粉及其制备方法。

背景技术

随着城市化、工业化、人口老龄化的到来，环境污染加剧，农业生态条件恶化，各种食物安全性下降，给人类生存带来严重威胁。近三十年来，人类疾病谱、死因谱已经发生根本变化，据统计，影响人类健康、死亡率最高的是心脑血管病、恶性肿瘤和糖尿病等代谢性疾病，占到死亡率的70％以上。

硒是人体必需的微量元素之一,具有重要的生理功能，被誉为“生命之火”、“长寿元素”、“抗癌之王”。肌体中硒含量的多少，与人的健康密切相关。硒缺乏对人的代谢影响表现在对某些氧化损伤的敏感性和对胛状腺代谢的改变，对镉、汞等重金属损伤敏感的增加以及生物转化作用酶类的改变。人体的低硒状态，与癌症、关节炎、心血管病、糖尿病、中风等490多种疾病发病率密切相关。据美国亚利桑那大学进行的防癌实验报道，给各类成人每天补充200ug/天有机态硒，癌症总发病率降低37％，其中前列腺癌降低63％、结肠癌降低58％、肺癌降低46％，癌症总死亡率降低50％以上。

硒的存在形态有无机态与有机态两种，无机态硒以矿质元素存在地壳中。有机态硒以硒蛋白、硒糖和氨基酸存在动植物和微生物体内。人只能吸收利用有机态硒，无法直接利用无机态硒。硒在地壳中的含量只有0.000009％，全世界有40多个国家缺硒，我国有72％的国土面积缺硒，富硒区不到1％，贫硒区占27％。据调查我国城市居民的饮食结构中，硒的成年人日摄入量大约在20--30微克范围，离中国营养学会提出的推荐值50～250微克相差甚远。因此，专家们提倡“像补典一样全民补硒”，以提高居民硒的摄入量，达到防病抗病目的。近年来，许多地方将硒与其它元素一起做成硒肥在农作物上施用，开发成如富硒大米、富硒水果、富硒茶叶等，其价格是同类产品的3～8倍。当前人们正广泛地应用微生物作为硒的生物有机化载体进行富硒功能性食品和药品的研究开发,其中运用发酵工程手段，通过食用菌富硒培养进行硒资源的微生物转化获取富含有机硒的保健品，是硒生物有机化的安全有效途径之一，而药用真菌灵芝因其极高的药用价值和富硒能力，在硒生物有机化方面的研究和应用正在得到越来越多的关注。

近年来，我国学者对灵芝富硒特性及发酵条件进行了一些研究，尚德静等通过研究金针菇、香菇、猴头和灵芝在液体深层培养中的富硒能力发现四者中灵芝富硒能力最强，是其他3种食用菌的10～20倍；谢必峰等通过发酵工程手段进行灵芝富硒深层培养，也得出灵芝富硒和耐硒能力很强的结论；姚敏等对富硒灵芝中硒的赋存形态的研究表明，蛋白质硒是富硒灵芝中硒的主要赋存形态。但对于灵芝液体富硒深层培养基的配方、培养条件、培养时间、硒源选择以及硒浓度、灵芝菌种选择等关键技术尚不成熟，正在探索之中。

本申请人长期致力与富硒灵芝菌丝的培养，2014年发表在杂志《食用菌》(2014(6)第7～9页)名称为“灵芝液体富硒深层培养时间与菌丝产量及品质的关系”论文中提到使用经过预处理的玉米粉、营养肉汤、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素C以及二硒糖和纯化水做为原料制备得到液体培养基，通过对培养条件的优化得到了品质优良并且产率得到提高的灵芝菌丝，但是，所得菌丝的富硒率低，且使用的是价格比较昂贵的动物蛋白营养肉汤做为氮源，生产成本高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种工艺简单易于实现、生产成本大大低同时硒富集率显著提高的富硒灵芝菌丝粉的制备方法。

本发明还提供一种富硒灵芝菌丝粉，所得的富硒灵芝菌丝粉在保持原有营养成份的同时硒含量大大提高。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

提供一种富硒灵芝菌丝粉的制备方法，包括以下步骤：

S1.富硒灵芝菌丝粉培养基的制备

S11.玉米粉的预处理：取玉米粉加入纯净水，依次经过加热糊化、液化酶液化、糖化酶糖化，取滤液得玉米粉液，备用；

S12.大豆饼的预处理：取大豆饼用纯净水进行提取，取滤液得大豆饼液，备用；

S13.有机硒培养基的制备：取蔗糖、葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1用纯化水溶解与步骤S11所得玉米粉液、步骤S12所得大豆饼液混合均匀，加入人工合成的二硒糖，灭菌，得富硒灵芝菌丝粉培养基；

S2.富硒灵芝菌丝粉的接种、培养：将大赤芝菌种在无菌条件下接种到富硒灵芝菌丝粉培养基中，经过培养后过滤、干燥，得到所述的富硒灵芝菌丝粉；

其中，步骤S1中所述制备富硒灵芝菌丝粉培养基的各原料的重量份配比如下：

其中，所述硒由二硒糖提供。

优选地，步骤S1中所述制备富硒灵芝菌丝粉培养基的各原料的重量份配比如下：

其中，所述硒由二硒糖提供；所述玉米粉为能过80目筛的玉米粉；所述大豆饼为蛋白质含量35％以上的黄豆饼。

优选地，步骤S11所述玉米粉的预处理具体为：先将玉米粉加入纯净水中，在90℃糊化15min，冷却至室温；再加入液化酶，在60℃恒温液化4小时，100℃煮沸20min后，冷却至室温；再加入糖化酶，在60℃恒温糖化12小时以上，100℃煮沸20min，冷却至室温；然后在转速为800r/min，离心15min或者用4～6层纱布过滤，取滤液得玉米粉液。

进一步优选地，步骤S11中所述玉米粉与纯净水的质量比为1:3～4；玉米粉与液化酶的质量比25:1～2；玉米粉与糖化酶的质量比25:1～1.5。

最优选地，步骤S11中所述玉米粉与纯净水的质量比为1:4；玉米粉与液化酶的质量比25:2；玉米粉与糖化酶的质量比25:1。

优选地，步骤S2所述大豆饼与纯净水的质量比为1:4。

优选地，步骤S2所述大赤芝菌种为液体菌种；液体菌种接种与培养基的体积比为5～10:100。

更优选地，步骤S2所述大赤芝菌液体菌种接种与培养基的体积比为5:100。

优选地，步骤S2所述培养为将培养瓶放入转速为150～200r/min的震荡器，在温度为25～30℃的条件下，培养5～20天。

更优选地，其特征在于，步骤S2所述转速为180r/min，在温度为28℃的条件下，培养5～15天，培养时间的长短，与产量和品质有直接的关系，培养时间太短，产量低，成本高；培养时间过长，不仅产量和品质下降，还消耗能源和材料，生产成本增加。

培养基是灵芝液体培养成败的关键，培养基配方中最关键的是碳氮比合理，同时富硒灵芝菌丝粉的生产，硒源与浓度是重点。单质无机硒粉虽然成本较低，但活性强，灵芝吸收率较低，甚至对灵芝菌丝产生一定毒害，产品硒含量不够稳定；纯化亚硒酸钠盐，虽然较硒粉稳定，但仍伴有其它重金属元素；采用单质硒粉用碳酸铯催化，与葡萄糖分子反向对接后合成的有机态二硒糖，虽然成本稍高，但克服了硒粉和亚硒酸钠的缺陷，灵芝吸收率大大提高，即使较高浓度，也不会对灵芝细胞产生毒害，生产出来的产品有机硒含量稳定，无重金属，产品质量优。

灵芝液体培养需要适宜的温度和充足的氧气，温度太低，菌丝生长慢，温度太高，菌丝会老化，甚至抑制菌丝生长。在20～35℃范围内，随着温度升高，生长加快，但超过30℃生长明显减慢，以28℃最适宜。振荡不仅能增加培养液中的氧含量，振荡濒率与产量有密切关系，振荡濒率太低，培养基中的氧含量低，菌丝生长慢，频率太高也不利菌丝生长，以180次/min为最适宜。培养时间的长短，与产量和品质有直接的关系，培养时间太短，产量低，成本高；培养时间过长，不仅产量和品质下降，还消耗能源和材料，生产成本增加。菌丝生长高峰集中在5～15天，15天后，生长明显减慢，培养20天后，部分菌种多糖和有机硒含量反而下降，这是因为部分菌丝溶解使硒糖和硒蛋白分解所致。灵芝富硒液体深层培养产量与品质与菌种关系也非常密切，不同菌种差异很大，以赤芝中的大赤芝产量和有效成份含量最高，菌种添加量以5％最为适宜。

根据上述所述方法富硒灵芝菌丝粉的制备方法所得到的富硒灵芝菌丝粉。

本发明的有益效果：

本发明以生物学理论为指导，采用玉米粉、大豆饼、蔗糖、葡萄糖、磷酸二氢钾以及有机态二硒糖做为添加剂配制成液体培养基，得到的富硒灵芝菌丝粉硒含量大大提高，需要特别说明的是，培养基是灵芝液体培养成败的关键，培养基配方中最关键的是碳氮比合理，虽然很多材料可供选择，经过本申请人大量的实验探索发现，与本申请人之前的研究相比，使用玉米粉做为碳源，但是使用常规使用的大豆饼替代常用的营养肉汤做为氮源、使用维生素B1替代维生素C做为添加剂并配合使用有机态的二硒糖做为添加剂，在一定配比范围内做为富硒灵芝菌丝粉的培养基原料时存在协同作用，使所得到的菌丝粉的硒含量大大提高，其它营养成份也有一定程度的提高，大大提高了硒的富集率，用于工业生产生产成本大大降低，得到的产品有效成份含量高、品质稳定安全，同时能显著提高产量，适合工业化生产，具有实际推广价值与经济意义。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明。除非特别说明，本发明实施例中采用的原料和方法为本领域常规市购的原料和常规使用的方法，所使用的设备为本领域常规设备。

本发明中评定产品质量的3个参数的测定方法如下：

生物量：采用干重法进行测量，即在60℃将富硒灵芝菌丝干燥至恒重，称量计算每升培养基菌丝粉重量；

多糖含量测定：采用硫酸蒽酮法测定，对富硒灵芝菌丝粉中的含糖量进行确定。

硒含量的测定：取产品经过硝酸微波高压消解后，用电感耦合等离子光谱仪进行测定。

实施例1

按照表1中所示富硒灵芝菌丝粉培养基所需量准备各原料，具体富硒灵芝菌丝粉的制备方法，包括以下步骤：

S1.富硒灵芝菌丝粉培养基的制备

S11.玉米粉的预处理：先将玉米粉加入4倍量纯净水中，在90℃糊化15min，冷却至室温；再加入液化酶，玉米粉与液化酶的质量比25:2，在60℃恒温液化4小时，100℃煮沸20min后，冷却至室温；再加入糖化酶，玉米粉与糖化酶的质量比25:1，在60℃恒温糖化12小时以上，100℃煮沸20min，冷却至室温；然后在转速为800r/min，离心15min过滤，取滤液得玉米粉液，备用；

S12.大豆饼的预处理：取大豆饼用4倍量纯净水进行提取，取滤液得大豆饼液，备用；

S13.有机硒培养基的制备：取蔗糖、葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1用适量纯化水溶解与步骤S11所得玉米粉液、步骤S12所得大豆饼液混合均匀，加入人工合成的二硒糖以及余量纯净水，灭菌，得富硒灵芝菌丝粉培养基；

S2.富硒灵芝菌丝粉的接种、培养：将与培养基的体积比为8:100的液态大赤芝菌种在无菌条件下接种到富硒灵芝菌丝粉培养基中，将培养瓶放入转速为180r/min的震荡器，在温度为28℃的条件下，培养15天后过滤、干燥，得到所述的富硒灵芝菌丝粉。

对制备富硒灵芝菌丝粉的生物量、所得富硒灵芝菌丝粉中多糖含量测定以及硒含量进行测定，结果如表2所示。

实施例2、3

与实施例1不同的是按照表1所示准备各种原料。

实施例4

与实施例1不同的是按如下步骤制备富硒灵芝菌丝粉：

S1.富硒灵芝菌丝粉培养基的制备

S11.玉米粉的预处理：先将玉米粉加入1倍量纯净水中，在90℃糊化15min，冷却至室温；再加入液化酶，玉米粉与液化酶的质量比25:1，在60℃恒温液化4小时，100℃煮沸20min后，冷却至室温；再加入糖化酶，玉米粉与糖化酶的质量比25:1.5，在60℃恒温糖化12小时以上，100℃煮沸20min，冷却至室温；然后在转速为800r/min，离心15min过滤，取滤液得玉米粉液，备用；

S12.大豆饼的预处理：取大豆饼用1倍量纯净水进行提取，取滤液得大豆饼液，备用；

S2.富硒灵芝菌丝粉的接种、培养：将与培养基的体积比为5:100的液态大赤芝菌种在无菌条件下接种到富硒灵芝菌丝粉培养基中，将培养瓶放入转速为150r/min的震荡器，在温度为30℃的条件下，培养5天后过滤、干燥，得到所述的富硒灵芝菌丝粉。

实施例5

与实施例1不同的是按如下步骤制备富硒灵芝菌丝粉：

S1.富硒灵芝菌丝粉培养基的制备

S11.玉米粉的预处理：先将玉米粉加入2倍量纯净水中，在90℃糊化15min，冷却至室温；再加入液化酶，玉米粉与液化酶的质量比25:1，在60℃恒温液化4小时，100℃煮沸20min后，冷却至室温；再加入糖化酶，玉米粉与糖化酶的质量比25:1.5，在60℃恒温糖化12小时以上，100℃煮沸20min，冷却至室温；然后用6层纱布过滤，取滤液得玉米粉液，备用；

S12.大豆饼的预处理：取大豆饼用2倍量纯净水进行提取，取滤液得大豆饼液，备用；

S2.富硒灵芝菌丝粉的接种、培养：将与培养基的体积比为10:100的液态大赤芝菌种在无菌条件下接种到富硒灵芝菌丝粉培养基中，将培养瓶放入转速为200r/min的震荡器，在温度为25℃的条件下，培养20天后过滤、干燥，得到所述的富硒灵芝菌丝粉。

实施例6 二硒糖添加量的影响

其它条件与实施例1相同，不同的是二硒糖的添加量分别为0.0003、0.0006、0.0009、0.0012、0.0015、0.0018。

对制备富硒灵芝菌丝粉的生物量、所得富硒灵芝菌丝粉中多糖含量测定以及硒含量进行测定，结果如表3所示。

对比例1

与实施例1不同的是按照表1所示准备各种原料，其中，使用等量的营养肉汤替代大豆饼，用等量的维生素C替代维生素B1。

对比例2

与实施例1不同的是按照表1所示准备各种原料。

对比例3

与实施例1不同的是按照表1所示准备各种原料。

表1

	实施例1	实施例2	实施例3	对比例1	对比例2	对比例3
							玉米粉	50	40	60	50	50	50
大豆饼	50	60	40	-	-	50
							蔗糖	80	30	50	80	80	80
葡萄糖	20	10	15	20	20	20
							磷酸二氢钾	2	3	5	2	2	2
硫酸镁	0.075	0.007	0.08	0.075	0.075	0.075
							维生素B1	0.001	0.002	0.002	-	0.001	-
纯化水	1000	900	1000	1000	1000	1000
							二硒糖	0.006	0.0036	0.0068	0.005	0.005	0.005

表2

样品	生物量(g/L)	多糖含量(％)	硒含量(mg/Kg)
				实施例1	32.9	6.91	139.2
实施例2	26.5	7.01	128.3
				实施例3	45.1	6.42	131.6
实施例4	20.7	6.89	134.2
				实施例5	40.1	6.75	129.9
对比例1	31.3	6.38	92.7
				对比例2	34.2	6.23	106.8
对比例3	32.8	6.18	99.7

表3

二硒糖添加量	生物量(g/L)	多糖含量(％)	硒含量(mg/Kg)
				0.0024	26.1	6.42	78.3
0.0036	29.2	6.37	103.6
				0.0045	28.9	6.78	134.6
0.0054	31.6	6.69	133.9
				0.0062	33.8	6.90	116.7
0.0068	40.7	6.39	103.2
				0.0076	51.2	6.69	92.1

Claims

1.一种富硒灵芝菌丝粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1. 富硒灵芝菌丝粉培养基的制备

S11. 玉米粉的预处理：取玉米粉加入纯净水，依次经过加热糊化、液化酶液化、糖化酶糖化，取滤液得玉米粉液，备用；

S12. 大豆饼的预处理：取大豆饼用纯净水进行提取，取滤液得大豆饼液，备用；

S13. 有机硒培养基的制备：取蔗糖、葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1用纯化水溶解与步骤S11所得玉米粉液、步骤S12所得大豆饼液混合均匀，加入人工合成的二硒糖，灭菌，得富硒灵芝菌丝粉培养基；

S2. 富硒灵芝菌丝粉的接种、培养：将大赤芝菌种在无菌条件下接种到富硒灵芝菌丝粉培养基中，经过培养后过滤、干燥，得到所述的富硒灵芝菌丝粉；

玉米粉 40～60份；

大豆饼 40～60份；

蔗糖 30～80份；

葡萄糖 10～20份；

磷酸二氢钾 2～5份；

硫酸镁 0.07～0.08份；

维生素B1 0.001～0.002份；

纯化水 900～1000份；

硒 0.0036～0.0068份；其中，所述硒由二硒糖提供。

2.根据权利要求1所述富硒灵芝菌丝粉的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述制备富硒灵芝菌丝粉培养基的各原料的重量份配比如下：

玉米粉 50份；

大豆饼 50份；

蔗糖 80份；

葡萄糖 20份；

磷酸二氢钾 2份；

硫酸镁 0.075份；

维生素B1 0.001份；

纯化水 1000份；

硒 0.0045～0.006份；

其中，所述硒由二硒糖提供；所述玉米粉为能过80目筛的玉米粉；大豆饼为蛋白质含量35%以上的黄豆饼。

3.根据权利要求1所述富硒灵芝菌丝粉的制备方法，其特征在于，步骤S11所述玉米粉的预处理具体为：先将玉米粉加入纯净水中，在90℃糊化15min，冷却至室温；再加入液化酶，在60℃恒温液化4小时，100℃煮沸20min后，冷却至室温；再加入糖化酶，在60℃恒温糖化12小时以上，100℃煮沸20min，冷却至室温；然后在转速为800r/min，离心15min或者用4～6层纱布过滤，取滤液得玉米粉液。

4.根据权利要求3所述富硒灵芝菌丝粉的制备方法，其特征在于，步骤S11中所述玉米粉与纯净水的质量比为1 : 3～4；玉米粉与液化酶的质量比25 :1～2；玉米粉与糖化酶的质量比25 : 1～1.5。

5. 根据权利要求4所述富硒灵芝菌丝粉的制备方法，其特征在于，步骤S11中所述玉米粉与纯净水的质量比为1:4；玉米粉与液化酶的质量比25 : 2；玉米粉与糖化酶的质量比25: 1。

6.根据权利要求1所述富硒灵芝菌丝粉的制备方法，其特征在于，步骤S12所述大豆饼与纯净水的质量比为1:4。

7. 根据权利要求6所述富硒灵芝菌丝粉的制备方法，其特征在于，步骤S2所述大赤芝菌种为液体菌种；液体菌种接种与培养基的体积比为5 ～10 : 100，优选地，所述大赤芝液体菌种接种与培养基的体积比为5 : 100。

8.根据权利要求1所述富硒灵芝菌丝粉的制备方法，其特征在于，步骤S2所述培养为将培养瓶放入转速为150～200r/min的震荡器，在温度为25～30℃的条件下，培养5～20天。

9.根据权利要求8所述富硒灵芝菌丝粉的制备方法，其特征在于，步骤S2所述转速为180r/min，在温度为28℃的条件下，培养5～15天。

10.根据权利要求1至9任意一项所述富硒灵芝菌丝粉的制备方法所得到的富硒灵芝菌丝粉。