CN103233048B

CN103233048B - 用于海洋长孢葡萄穗霉生产纤溶活性化合物的培养基

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Publication number: CN103233048B
Application number: CN201310170435.6A
Authority: CN
Inventors: 蔡孟浩; 王美霞; 周祥山; 张元兴
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2013-05-09
Filing date: 2013-05-09
Publication date: 2014-11-26
Anticipated expiration: 2033-05-09
Also published as: CN103233048A

Abstract

本发明涉及用于海洋长孢葡萄穗霉生产纤溶活性化合物的新型培养基，本发明的培养基适合于海洋长孢葡萄穗霉的生长，且可大大地提高纤溶活性化合物FGFC1的产量。

Description

用于海洋长孢葡萄穗霉生产纤溶活性化合物的培养基

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及用于海洋长孢葡萄穗霉生产纤溶活性化合物的培养基及其制备方法。

背景技术

目前大部分天然药物源于陆地，而海洋则是目前开发极少的巨大生物资源宝库。最近几年从海洋生物特别是无脊椎动物、微生物中分离出了大量新型生物活性物质，统计表明2003年报道了656种新化合物，2004年报道了716种新化合物。其中部分处于I-III期临床实验。海洋微生物，包括海洋放线菌、真菌等是新活性物质的重要来源。相比陆生生物，海洋中发现的新型化合物具有较高几率的生物活性。例如，在国际肿瘤协会对于临床前细胞毒性筛选中，检测到几乎1%的待测海洋活性样品有抗肿瘤活性的潜在能力，而相比陆生活性样品，只有0.1%的待测样品有活性。

纤溶活性化合物FGFC1是上海海洋大学从海洋真菌长孢葡萄穗霉FG216(Stachybotrys longispora FG216)中分离出来的一种具有纤溶活性的新型化合物；很有必要对其进行创新药物的深入研究。

然而纤溶活性化合物FGFC1在原始菌株中含量较低，制约了对其进行进一步的体内外活性评价及构效研究，因此通过规模化发酵及代谢调控研究，进行高效发酵生产是必须加以解决的首要问题。而要进行大规模高效发酵生产和代谢调控研究，继而进行后续的医药学研究，首要解决的就是产量问题，所以开发一种促进海洋长孢葡萄穗霉FG216生产纤溶活性化合物FGFC1的培养基就成为后续研究的一个非常重要的前提条件。

发明内容

本发明的目的在于提供用于海洋长孢葡萄穗霉生产纤溶活性化合物的培养基及其制备方法。

在本发明的第一方面，提供一种海洋长孢葡萄穗霉的培养基，所述培养基包括以下组分：

葡萄糖 30-170重量份；

硝酸钠 2-5重量份；

三水磷酸氢二钾 0.01-0.2重量份；

七水硫酸镁 0.2-0.9重量份；

氯化钾 0.4-0.8重量份；

酵母提取物 0.5-1.5重量份；

六水氯化钴 0.0015-0.005重量份；

七水硫酸亚铁 0.01-0.03重量份；

无水氯化钙 0.004-0.01重量份；和

L-鸟氨酸盐酸盐 8-20重量份。

在一个优选例中，所述培养基包括以下组分：

葡萄糖 35-155重量份；

硝酸钠 2.5-4重量份；

三水磷酸氢二钾 0.01-0.15重量份；

七水硫酸镁 0.3-0.8重量份；

氯化钾 0.5-0.8重量份；

酵母提取物 0.60-1.25重量份；

六水氯化钴 0.002-0.004重量份；

七水硫酸亚铁 0.01-0.025重量份；

无水氯化钙 0.005-0.009重量份；和

L-鸟氨酸盐酸盐 10-20重量份。

在另一优选例中，所述培养基包括以下组分：

葡萄糖 125重量份；

硝酸钠 3.3重量份；

三水磷酸氢二钾 0.07重量份；

七水硫酸镁 0.4重量份；

氯化钾 0.625重量份；

酵母提取物 0.7重量份；

六水氯化钴0.003125重量份；

七水硫酸亚铁0.01875重量份；

无水氯化钙0.0065重量份；和

L-鸟氨酸盐酸盐13-15重量份；

其中，各组分在培养基中的含量按照重量份可在±10%(更佳地±5%)范围内浮动。

在另一优选例中，所述培养基中，各组分配制于1000重量(或体积)份水(较佳地，所述的水是去离子水)中；和/或所述培养基的pH值5.5-6.5。

在本发明的另一方面，提供所述的培养基的用途，用于培养海洋长孢葡萄穗霉，生产纤溶活性化合物FGFC1。

在本发明的另一方面，提供一种制备海洋长孢葡萄穗霉的培养基的方法，所述方法包括：将前面任一所述的培养基的各组分在水中混匀，调节至pH值5.5-6.5。

在另一优选例中，所述的方法还包括：将混匀及调节pH值后的培养基在121℃，灭菌15-20min。

在本发明的另一方面，提供一种利用海洋长孢葡萄穗霉生产纤溶活性化合物FGFC1的方法，所述方法包括：利用前面任一所述的培养基培养海洋长孢葡萄穗霉，从而生产纤溶活性化合物FGFC1。

在一个优选例中，将海洋长孢葡萄穗霉按照体积以5-10%的接种量接入前面任一所述的培养基，发酵培养8-13天，获得发酵液，其中含有纤溶活性化合物FGFC1。

在本发明的另一方面，提供一种用于培养海洋长孢葡萄穗霉的试剂盒，所述试剂盒中包括：前面任一所述的培养基。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究，研究开发了一种新的适合于培养海洋长孢葡萄穗霉(较佳地为FG216)使之高效生产纤溶活性化合物FGFC1的培养基配方。本发明的培养基，适合于海洋长孢葡萄穗霉的生长，且可大大地提高纤溶活性化合物FGFC1的产量。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，“重量份”或“重量份数”可互换使用，所述的重量份可以是任何一个固定的以毫克、克数或千克数表示重量(如1mg、1g、2g、5g、或1kg等)。例如，一个由1重量份组分a和9重量份组分b构成的组合物，可以是1克组分a＋9克组分b，也可以是10克组分a＋90克组分b等构成的组合物。在所述组合物，某一组分的百分比含量＝(该组分的重量份数/所有组分的重量份数之和)×100%。因此，由1重量份组分a和9重量份组分b构成的组合物中，组分a的含量为10%，组分b为90%。

术语“本发明的海洋长孢葡萄穗霉的培养基”指含有葡萄糖，硝酸钠，三水磷酸氢二钾，七水硫酸镁，氯化钾，酵母提取物，六水氯化钴，七水硫酸亚铁，无水氯化钙，L-鸟氨酸盐酸盐的组合物；或基本上由葡萄糖，硝酸钠，三水磷酸氢二钾，七水硫酸镁，氯化钾，酵母提取物，六水氯化钴，七水硫酸亚铁，无水氯化钙，L-鸟氨酸盐酸盐组成的组合物。在组合物中，所述的葡萄糖，硝酸钠，三水磷酸氢二钾，七水硫酸镁，氯化钾，酵母提取物，六水氯化钴，七水硫酸亚铁，无水氯化钙，L-鸟氨酸盐酸盐占培养基总重量的80-100%，较佳地占90-100%，更佳地占95-100%，如98%，99%。

作为本发明的优选方式，用于配制本发明的海洋长孢葡萄穗霉培养基的各组分的用量如表1所示。

表1

在得知本发明的海洋长孢葡萄穗霉培养基所用的组分及其配方以后，本领域技术人员可方便地进行配制。

本发明的培养基的应用的组分(原料)均为商业化的普通化学产品，价格比较低，制备也非常简单，与现有技术的培养基相比，本发明的新型培养基能显著促进海洋长孢葡萄穗霉发酵生产纤溶活性化合物FGFC1，纤溶活性化合物FGFC1的产量得到显著提高，有利于大规模工业化生产。

作为本发明的优选方式，在配制所述的海洋长孢葡萄穗霉培养基时，先分别准确称取各组分，将它们混合于水中。所述的水较佳地为去离子水。更优选的，提供一种用于制备上述培养基的方法，包括步骤：

(a)按照表1重量份称量所述培养基成分，共10种；

(b)加入去离子水1000重量份，搅拌均匀；

(c)调节上述培养基pH至5.5-6.5。

较佳地，步骤(c)之后，进一步包括：在121℃，灭菌15～20min。

本发明还提供了使用所述培养基培养海洋长孢葡萄穗霉(较佳地为FG216)发酵生产纤溶活性化合物FGFC1的发酵方法，包括步骤：取海洋长孢葡萄穗霉FG216孢子接种至种子培养基进行培养，获得新鲜接种液，取所述新鲜接种液按5-10%的接种量接入新鲜的所述新型培养基进行发酵培养8-13天，获得发酵液。较佳地，按终浓度约1～10×10⁶个所述海洋长孢葡萄穗霉孢子/100ml进行接种；所述海洋长孢葡萄穗霉孢子的培养条件是：在25℃，180r/min摇床培养48～72h。较佳地，取海洋长孢葡萄穗霉FG216孢子接种至种子培养基进行培养，获得新鲜一级种子液；再以体积比5-7%的接种量接入种子培养基中培养24-30h，获得新鲜二级种子接种液。

本发明还提供了一种上述发酵方法生产的纤溶活性化合物FGFC1的检测方法，包括步骤：待所述发酵液pH变至7.0左右或所述发酵液变黄褐色后，停止培养；取适量所述发酵液，离心，弃上清，并加入等体积的甲醇进行超声波提取；超声提取后将上述混合物进行离心分离；取适量上层液，用无水甲醇稀释若干倍后，用HPLC测定纤溶活性化合物FGFC1含量，进而换算成所述发酵液中纤溶活性化合物FGFC1的含量。

较佳地，所述发酵液取5ml，所述等体积甲醇取5ml；所述超声提取在800w功率下超声提取15-30min。

本发明的有益效果具体如下：

1.由于本发明的新型培养基成分主要是葡萄糖、三水磷酸二氢钾、七水硫酸镁、硝酸钠、氯化钾、酵母提取物、氯化钴、七水硫酸亚铁、无水氯化钙、L-鸟氨酸盐酸盐等常见物质，原料易得，成本低，制备方法简单，有利于大规模工业化生产；

2.制备本发明的新型培养基时，无难溶物质，称量所述培养基成分后加去离子水溶解即可，制备简单；

3.采用本发明的新型培养基培养目的菌株海洋长孢葡萄穗霉(较佳地为FG216)，该菌株在该新型培养基中可以很好的生长，最终产量可达到11125mg/L(从原始的821.4mg/L提高到11125mg/L)，是原始水平的13.55倍，显著促进海洋长孢葡萄穗霉FG216发酵生产灰纤溶活性化合物FGFC1的产量，有利于大规模(>500L)工业化生产，对海洋长孢葡萄穗霉发酵研究及纤溶活性化合物FGFC1的医药学研究具有重要意义。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1、培养基1

1.1发酵培养基配制

培养基1：准确称取葡萄糖125g，硝酸钠3.3g，三水磷酸氢二钾0.07g，七水硫酸镁0.4g，氯化钾0.625g，酵母提取物0.7g，六水氯化钴0.003125g，七水硫酸亚铁0.01875g，无水氯化钙0.0065g，L-鸟氨酸盐酸盐13g，配制于去离子水1000ml(相当于1000g)中。

1.2发酵生产纤溶活性化合物FGFC1

海洋长孢葡萄穗霉FG216(获自上海海洋大学)，用无菌水从斜面洗下海洋长孢葡萄穗霉FG216孢子，按终浓度约3×10⁶个/100ml接入种子培养基，于25℃，180r/min摇床培养60h，获得新鲜一级种子液；按5%（v/v）接种量接入种子培养基中，于25℃、180r/min摇床培养培养28h，获得新鲜二级种子接种液；按5%(v/v)的接种量接入发酵培养基，培养12天，待发酵液pH变至7.0左右(发酵液变黄褐色后)，停止培养。

其中种子培养基的配方为：葡萄糖35g/L，可溶性淀粉10g/L，脱脂大豆粉20g/L，细菌学蛋白胨5g/L，牛肉浸膏5g/L，酵母提取物3g/L，氯化钠2g/L，三水磷酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.05g/L，调节pH至5.8，在121℃，灭菌15～20min。其中，可溶性淀粉需糊化，糊化过程为：用少量水(较佳地为去离子水)将所述可溶性淀粉制成悬浊液，然后缓慢倒入90-100℃去离子水并不断搅拌，制成半透明状液体。

1.3纤溶活性化合物FGFC1产量的测定

取上一步骤制备的发酵液5ml，离心，弃上清；于菌体沉淀中加入5ml等体积甲醇，于400w超声波下超声提取30min；离心，取上层清液250μl，用无水甲醇稀释10倍后，用HPLC测定纤溶活性化合物FGFC1含量，进而换算成发酵液中纤溶活性化合物FGFC1含量，测得纤溶活性化合物FGFC1含量为11125mg/L。

实施例2、培养基2

2.1发酵培养基配制

培养基2：准确称取葡萄糖125g，硝酸钠3.3g，三水磷酸氢二钾0.07g，七水硫酸镁0.4g，氯化钾0.625g，酵母提取物0.7g，六水氯化钴0.003125g，七水硫酸亚铁0.01875g，无水氯化钙0.0065g，L-鸟氨酸盐酸盐15g，各组分配制于去离子水1000ml中。

2.2发酵生产纤溶活性化合物FGFC1

同实施例1的步骤1.2。

2.3纤溶活性化合物FGFC1产量的测定

同实施例1的步骤1.3，测得纤溶活性化合物FGFC1含量为10320mg/L。

实施例3、培养基3

3.1发酵培养基配制

培养基3：准确称取葡萄糖58g，硝酸钠3g，三水磷酸氢二钾0.1g，七水硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，酵母提取物1g，六水氯化钴0.0025g，无水氯化钙0.0065g，L-鸟氨酸盐酸盐10g，加入去离子水1000ml，调节pH至5.8。

3.2发酵生产纤溶活性化合物FGFC1

发酵时间为10天，其他条件同实施例1的步骤1.2。

3.3纤溶活性化合物FGFC1产量的测定

同实施例1的步骤1.3，测得纤溶活性化合物FGFC1含量为3944mg/L。

实施例4、培养基4

4.1发酵培养基配制

培养基4：准确称取葡萄糖72.5g，硝酸钠3g，三水磷酸氢二钾0.1g，七水硫酸镁0.5g，氯化钾0.625g，酵母提取物1g，六水氯化钴0.003125g，七水硫酸亚铁0.01875g，无水氯化钙0.0065g，L-鸟氨酸盐酸盐12.5g，各组分配制于去离子水1000ml中，调节pH至5.8。

4.2发酵生产纤溶活性化合物FGFC1

发酵时间为10天，其他同实施例1的步骤1.2。

4.3纤溶活性化合物FGFC1产量的测定

同实施例1的步骤1.3，测得纤溶活性化合物FGFC1含量为5138mg/L。

实施例5、培养基5

5.1发酵培养基配制

培养基5：准确称取葡萄糖155g，硝酸钠3.3g，三水磷酸氢二钾0.01g，七水硫酸镁0.68g，氯化钾0.625g，酵母提取物0.7g，六水氯化钴0.003125g，七水硫酸亚铁0.01875g，无水氯化钙0.0065g，L-鸟氨酸盐酸盐17.5g，各组分配制于去离子水1000ml中，调节pH至5.8。

5.2发酵生产纤溶活性化合物FGFC1

同实施例1的步骤1.2。

5.3纤溶活性化合物FGFC1产量的测定

同实施例1的步骤1.3，测得纤溶活性化合物FGFC1含量为6215mg/L。

实施例6、对照培养基

基础培养基配方：蔗糖50g/L，硝酸钠3g/L，；三水磷酸氢二钾0.131g/L，七水硫酸镁1.023g/L，氯化钾0.5g/L，酵母提取物1g/L，六水氯化钴0.00225g/L，七水硫酸亚铁0.025g/L，无水氯化钙0.0065g/L，鸟氨酸10g/L，准确称取各组分后配制于去离子水中，用盐酸调节pH至5.8。

发酵时间为10天，其余发酵生产纤溶活性化合物FGFC1及产量测定条件方法同实施例1的步骤1.2和1.3，测得纤溶活性化合物FGFC1的含量为821.4mg/L。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种海洋长孢葡萄穗霉FG216的培养基，其特征在于，所述培养基包括以下组分：

各组分配制于1000重量份水中；

所述培养基为发酵培养基，其pH值5.5-6.5。

2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基包括以下组分：

3.如权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述培养基包括以下组分：

其中，各组分在培养基中的含量按照重量份可在±10％范围内浮动。

4.权利要求1-3任一所述的培养基的用途，用于培养海洋长孢葡萄穗霉FG216，生产纤溶活性化合物FGFC1。

5.一种制备海洋长孢葡萄穗霉FG216的培养基的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1-3任一所述的培养基的各组分在水中混匀，调节至pH值5.5-6.5。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括：将混匀及调节pH值后的培养基在121℃，灭菌15-20min。

7.一种利用海洋长孢葡萄穗霉FG216生产纤溶活性化合物FGFC1的方法，其特征在于，所述方法包括：利用权利要求1-3任一所述的培养基培养海洋长孢葡萄穗霉FG216，从而生产纤溶活性化合物FGFC1。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，将海洋长孢葡萄穗霉FG216按照体积以5-10％的接种量接入权利要求1-3任一所述的培养基，发酵培养8-13天，获得发酵液，其中含有纤溶活性化合物FGFC1。

9.一种用于培养海洋长孢葡萄穗霉FG216的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：权利要求1-3任一所述的培养基。