CN104418868A - 纤溶活性化合物fgfc1的分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从发酵液中分离纯化FGFC1的方法。所述方法包括步骤：（1）将FGFC1菌丝体和碱性水溶液混合、抽提，得到抽提液；（2）将抽提液和有机溶剂混合后上柱经大孔聚合物填料层析，用有机溶剂与水的碱性混合溶液洗脱，得到FGFC1馏分。

Description

纤溶活性化合物FGFC1的分离纯化方法

技术领域

本发明涉及发酵液的分离纯化，尤其涉及一种从发酵液中分离纯化FGFC1的方法。

背景技术

FGFC1是一种具有纤溶活性的微生物天然产物，由海洋真菌长孢葡萄穗霉Stachybotrys longispora FG216（CCTCC NO.C22010068）发酵产生，活性研究表明，其具有促进纤溶酶原和单链尿激酶型纤溶酶原激活剂相互活化的作用，有望开发成为药物，具有良好的应用前景。

现有文献报道的分离纯化方法为：

甲醇抽提发酵液后用HPLC分离制备，具体工艺如下：FGFC1发酵液与等体积甲醇混合，超声15min，在转速10000rpm条件下离心15min，所得上清液减压浓缩、真空干燥得到含有FGFC1的干固物，而后用少量甲醇溶解，溶解后的溶液用半制备型高效液相色谱仪，色谱柱Sepax HP-C18柱（21.2mm×250mm,10μm）分离，色谱条件为：流动相：A相：0.05M乙酸铵；B相：甲醇；A：B=30：70。洗脱条件为：流速10ml/mim，进样量为0.5ml，检测波长265nm。

该方法存在以下不足:

(1)用甲醇进行抽提，成本较高；且甲醇具有一定毒性；

(2)使用粒径为10μm的反相C18填料进行层析，属于高压色谱，对设备要求较高；层析填料化学稳定性差，不耐酸碱，易污染。层析流动相中含有无机盐乙酸铵，给FCFG1的后续精制过程增加了难度。

综上所述，该方法不适于规模化的制备FGFC1。

因此，本领域迫切需要提供一种从海洋真菌长孢葡萄穗霉Stachybotryslongispora FG216（CCTCC NO.C22010068）的发酵液中分离纯化纤溶活性化合物FGFC1的方法。

发明内容

本发明旨在提供一种从发酵液中分离纯化FGFC1的方法。

本发明提供了一种从发酵液中分离纯化FGFC1的方法，所述方法包括步骤：

（1）将FGFC1菌丝体和碱性水溶液混合、抽提，固液分离后得到抽提液；和

（2）将抽提液和有机溶剂混合后上柱经大孔聚合物填料层析，用有机溶剂与水的碱性混合溶液洗脱，得到FGFC1馏分。

在另一优选例中，所述大孔聚合物填料为非极性大孔聚合物填料。

在另一优选例中，所述的非极性聚合物填料的骨架选自聚苯乙烯-二乙烯苯或甲基丙烯酸酯；更优选聚苯乙烯-二乙烯苯。

在另一优选例中，所述大孔聚合物填料粒径为30-200μm；更优选30-150μm。

在另一优选例中，步骤（1）中所述碱性水溶液为可溶性无机碱的水溶液；更优选，所述可溶性无机碱的水溶液选自氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液。

在另一优选例中，步骤（1）中所述碱性水溶液的pH为8-14；更优选为pH11-13。

在另一优选例中，步骤（2）中以所述有机溶剂与水的碱性混合溶液的总体积计，其中含有有机溶剂20-80％；更优选为30-60％。

在另一优选例中，以抽提液和有机溶剂的混合溶液的总体积计，其中含有有机溶剂5-35％；更优选为15-30％。

在另一优选例中，步骤（2）中所述抽提液和有机溶剂的混合溶液的pH为4-12；更优选pH为6.5。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：经HPLC测定后，将HPLC峰纯度≥95%的FGFC1馏分进行收集，得到FGFC1的纯化液。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：将收集得到的FGFC1的HPLC纯度大于等于95%的馏分，通过减压蒸发去除有机溶剂得到水溶液，所得水溶液冷冻干燥后得到FGFC1的干粉。

在另一优选例中，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮或乙腈；更优选乙醇。

据此，本发明提供了一种从海洋真菌长孢葡萄穗霉Stachybotrys longisporaFG216（CCTCC NO.C22010068）的发酵液中分离纯化纤溶活性化合物FGFC1的方法。

附图说明

图1显示了实施例制备得到的FGFC1的MS图谱。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，惊奇地发现将FGFC1发酵液的菌丝体经过碱性水溶液抽提、大孔聚合物填料层析，可简单有效地得到高纯度的FGFC1。

如本文所用，“FGFC1”是指分子式为C₅₁H₆₈N₂O₁₀的物质，其结构式为：

如本文所用，“FGFC1发酵液”是指能够产生FGFC1的菌体的发酵液，所述能够产生FGFC1的菌体可以是本领域通常使用的，例如但不限于，由长孢葡萄穗霉Stachybotrys longispora FG216经培养后获得，该发酵液的制备方法已公开在张艳，海洋真菌FG216代谢产物中纤溶活性化合物分离、结构鉴定及培养条件优化[学位论文]2008等文献中。Stachybotrys longispora FG216的菌种在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）有保藏，保藏号：CCTCC NO.C22010068。如本文所用，“FGFC1的HPLC纯度”是指色谱图中FGFC1的色谱峰通过面积归一化法计算得到的纯度值。

如本文所用，“室温”是指15-30℃，优选20-25℃。

具体地，本发明提供的从发酵液中分离纯化FGFC1的方法包括步骤：

第一步，将FGFC1菌丝体用碱性水溶液抽提，将菌丝体中的FGFC1释放至溶液中，经固液分离，得到FGFC1的抽提液；

第二步，在FGFC1抽提液中加入一定比例的与水互溶的极性有机溶剂，调节pH至4-12，而后采用小粒径的非极性大孔聚合物填料进行层析，洗脱剂为有机溶剂与水的碱性混合溶液，得到FGFC1的馏分。

上述方法中，第一步中所述FGFC1菌丝体是将发酵培养得到的发酵液经过固液分离而获得；所述固液分离可以使用本领域的常规手段，例如但不限于，离心、过滤等。

上述方法的第一步中，所述碱性水溶液可以是工业上常用的可溶性碱的水溶液，如NaOH、KOH等，所述碱性水溶液的pH范围为8-14，优选pH11-13，最佳pH13。

上述方法的第一步中，所述的抽提过程可以采用搅拌加热、超声，或高压匀浆等方法提高抽提的效率。其中较优的是搅拌加热，温度为45℃-85℃，时间为15-60分钟。抽提后用常规的固液分离方法进行分离，如离心或过滤，即可得到澄清的FGFC1抽提液。

上述方法的第二步中，层析过程所述的大孔非极性聚合物填料，其树脂骨架为聚苯乙烯-二乙烯苯（PS/DVB）或甲基丙烯酸酯（PMMA）。所述填料的粒径范围在30μm-200μm间，优选30μm-150μm，最优30μm。所述填料优选自UniPS30-300、Amberchrom CG161m、Diaion HP20SS、Amberchrom CG71m或UniMC-40。

上述方法的第二步中，FGFC1抽提液加入与水互溶的极性有机溶剂使与水互溶的极性有机溶剂的比例占溶液的5%-30%(V:V)，而后调节pH至4-12上柱，优选pH6.5；所述洗脱剂为20%-80%(V:V)的与水互溶的有机溶液，pH为8-13，与水互溶的有机溶液的比例优选48%(V:V)。

上述方法的第二步中，所用的与水互溶的有机溶液选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮或乙腈，优选乙醇。

上述方法的第二步中，收集FGFC1的HPLC纯度大于等于95%的馏分，具体包括但不限于采用下述高效液相色谱法对各组分收集液浓度进行测定后进行收集：色谱柱为Symmetry HP-C18(4.6mm×250mm，5μm),流动相为甲醇:0.05M乙酸铵(70:30),流速为1ml/min，进样量为10μl，检测波长为265nm。

本发明提供的制备方法还可以包括第三步，将收集得到的FGFC1的HPLC纯度大于等于95%的馏分，通过减压蒸发去除有机溶剂得到水溶液，所得水溶液冷冻干燥后得到FGFC1的干粉。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的主要优点在于：

1、本发明提供的制备方法成本低且环境友好。

2、本发明提供的制备方法中采用大孔聚合物填料作为分离介质，化学稳定性高，且操作压力低；层析洗脱过程不添加无机盐。

3、本发明提供的制备方法有利于规模化制备FGFC1。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。

本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

下述实施例中，长孢葡萄穗霉FG216的发酵液的制备方法如下：

菌种：Stachybotrys longispora FG216，保藏编号CCTCC NO：C22010068。

斜面培养基：马铃薯蔗糖(PSA)。

种子培养基：不含有琼脂的GSB培养基。

发酵培养基：改良察氏培养基(蔗糖30-80g,硝酸钠1-5g,磷酸氢二钾0.05-0.3g,硫酸镁0.2-0.8g,氯化钾0.2-0.8g，酵母提取物0.2-2.0g,氯化钴0.0010-0.0050g,硫酸亚铁0.005-0.030g，氯化钙0.0015-0.0100g,水1000ml,pH为5.0-7.0)。

培养方法：

将冷冻保藏的长孢葡萄穗霉FG216解冻后接种于斜面培养基，于室温培养后，将PSA斜面长孢葡萄穗霉菌株接种于装有GSB种子培养基的锥形瓶中，室温下培养即为种子培养液；取长孢葡萄穗霉FG216种子培养液分别接种至含有发酵培养基的锥形瓶中，室温下发酵培养。

发酵结束后，将上述发酵液合并，离心，得菌体。将所得菌体置于冰箱-18℃冷藏保存，备用。

实施例1

取FGFC1菌体40g于大烧杯，加NaOH水溶液（pH为13）300ml，将混合液倒入圆底烧瓶中，75℃恒温，机械搅拌1h，而后4000rpm/min离心30min，得澄清的抽提液。用HPLC对所得抽提液的浓度进行测定，得其浓度为4.5mg/ml。

取上述FGFC1抽提液，加入乙醇使溶液中乙醇比例达到20%（V:V），用HCl调pH至6.5，得上柱液。上柱液过150ml层析柱床，填料为Uni PS30-300，流速为1/40BV。上柱完毕后，用48%乙醇水溶液（pH为11.5）洗脱，洗脱液用HPLC分析，收集FGFC1的HPLC峰纯度大于95%的馏分，减压浓缩蒸发去乙醇后，将所得水溶液冷冻干燥，得FGFC1（其MS图谱见附图1）的干粉864.0mg，总收率60.5%，纯度为98.0%。

实施例2

取FGFC1菌体40g于大烧杯，加KOH水溶液（pH为10）300ml，超声1h，真空抽滤，得澄清的抽提液。用HPLC对所得抽提液的浓度进行测定，得其浓度为1.2mg/ml。

其它操作同实施例1。最终得到FGFC1的干粉207.0mg，总收率14.4%，纯度为97.2%。

实施例3

取FGFC1菌体40g于烧杯，加NaOH水溶液（pH为14）300ml，将混合液倒入圆底烧瓶中，恒温75℃，机械搅拌1h，4000rpm/min离心30min。用HPLC对所得上清液的浓度进行测定，得其浓度为1.5mg/ml。

其它操作同实施例1。最终得到FGFC1的干粉263.3mg，总收率18.0%，纯度为95.5%。

实施例4

其它操作同实施例1，不同之处在于，上柱后洗脱液为48％的乙醇（pH为8.5）。最终得到FGFC1的干粉668.25mg，总收率46.1%，纯度为96.6%。

实施例5

其它操作同实施例1，不同之处在于，上柱后洗脱液为48％的乙醇（pH为13）。最终得到FGFC1的干粉510.3mg，总收率35.1%，纯度为96.4%。

实施例6

其它操作同实施例1，不同之处在于，抽提液加入甲醇使溶液中甲醇含量达到10％，上柱后洗脱液为48％的甲醇（pH为11.5）。最终得到FGFC1的干粉607.5mg，总收率41.7%，纯度为96.1%。

实施例7

其它操作同实施例1，不同之处在于，抽提液加入异丙醇使溶液中异丙醇含量达到10％，上柱后洗脱液为48％的异丙醇（pH为11.5）。最终得到FGFC1的干粉583.2mg，总收率39.8%，纯度为95.6%。

实施例8

其它操作同实施例1，不同之处在于，抽提液加入丙酮使溶液中丙酮含量达到10％，上柱后洗脱液为48％的丙酮（pH为11.5）。最终得到FGFC1的干粉571.1mg，总收率39.0%，纯度为95.5%。

实施例9

其它操作同实施例1，,不同之处在于，抽提液加入乙腈使溶液中乙腈含量达到10％，上柱后洗脱液为48％的乙腈（pH为11.5）。最终得到FGFC1的干粉615.2mg，总收率42.3%，纯度为96.2%。

实施例10

其它操作同实施例1，不同之处在于，所用大孔聚合物填料为AmberchromCG161m（粒径为75μm，骨架为PS/DVB），得FGFC1的干粉486mg，总收率33.4%，纯度为96.2%。

实施例11

其它操作同实施例1，不同之处在于，所用大孔聚合物填料为Diaion HP20SS（粒径为100μm，骨架为PS/DVB），得FGFC1的干粉303.8mg，总收率20.9%，纯度为96.4%。

实施例12

其它操作同实施例1，不同之处在于，所用大孔聚合物填料为AmberchromCG71m（粒径为75μm，骨架为PMMA），上柱完毕后，用28%的乙醇水溶液（pH为11.5）洗脱，得FGFC1的干粉364.5mg，总收率25.0%，纯度为96.2%。

实施例13

其它操作同实施例1，不同之处在于，所用大孔聚合物填料为Uni MC-40（粒径为40μm，骨架为PMMA），上柱完毕后，用30%乙醇水溶液（pH为11.5）洗脱，得FGFC1的干粉729.0mg，总收率50.7%，纯度为97.3%。

实施例14

其它操作同实施例1，不同之处在于，抽提液加入乙醇后调pH至12，作为上柱液。最终得到FGFC1的干粉668.3mg，总收率46.5%，纯度为97.4%。

实施例15

其它操作同实施例1，不同之处在于，抽提液加入乙醇后调pH至5，作为上柱液。最终得到FGFC1的干粉700.3mg，总收率48.5%，纯度为97.0%。

实施例16

其它操作同实施例1，不同之处在于，上柱完毕后，用45%乙醇水溶液（pH为11.5）洗脱。最终得到FGFC1的干粉364.5mg，总收率24.9%，纯度为95.8%。

实施例17

其它操作同实施例1，不同之处在于，上柱完毕后，用60%乙醇水溶液（pH为11.5）洗脱。最终得到FGFC1的干粉558.9mg，总收率38.8%，纯度为97.1%。

实施例18

其它操作同实施例1，不同之处在于，抽提液加入乙醇使溶液中乙醇含量达到5%（V:V）。最终得到FGFC1的干粉820.1mg，总收率57.1%，纯度为97.4%。

实施例19

其它操作同实施例1，不同之处在于，抽提液加入乙醇使溶液中乙醇含量达到30%（V:V）。最终得到FGFC1的干粉826.5mg，总收率57.6%，纯度为97.6%。

对比例1

以长孢葡萄穗霉FG216的发酵液为原料，重复已报道文献（张艳，海洋真菌FG216代谢产物中纤溶活性化合物分离、结构鉴定及培养条件优化[学位论文]2008）关于FGFC1的制备方法，得到FGFC1干粉，纯度为93.0%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims (12)

1.一种从发酵液中分离纯化FGFC1的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

（1）将FGFC1菌丝体和碱性水溶液混合、抽提，固液分离后得到抽提液；

（2）将抽提液和有机溶剂混合后上柱经大孔聚合物填料层析，用有机溶剂与水的碱性混合溶液洗脱，得到FGFC1馏分。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大孔聚合物填料为非极性大孔聚合物填料。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的非极性聚合物填料的骨架选自聚苯乙烯-二乙烯苯或甲基丙烯酸酯；优选聚苯乙烯-二乙烯苯。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大孔聚合物填料粒径为30-200μm；优选30-150μm。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述碱性水溶液为可溶性无机碱的水溶液。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述可溶性无机碱的水溶液选自氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述碱性水溶液的pH为8-14；优选pH11-13。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中以所述有机溶剂与水的碱性混合溶液的总体积计，其中含有有机溶剂20-80％；优选30-60％。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以抽提液和有机溶剂的混合溶液的总体积计，其中含有有机溶剂5-35％；优选15-30％。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抽提液和有机溶剂的混合溶液的pH为4-12；优选pH为6.5。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：将HPLC峰纯度≥95%的FGFC1馏分进行收集，得到FGFC1的纯化液。

12.如权利要求1-11任一所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮或乙腈；优选乙醇。