CN104789480B - 不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株和混合菌群及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株和混合菌群及其应用，该菌株分别为黄曲霉(Aspergillus flavus)AF052，保藏编号CGMCC NO.9858，保藏日期2014年11月20日，和黄曲霉(Aspergillus flavus)AF053，保藏编号CGMCC NO.9859，保藏日期2014年11月20日。该菌株和菌群均能有效抑制玉米和花生中黄曲霉毒素的形成，提高农产品质量；此外，A051、AF052和AF053还能够分泌纤维素酶，利用该黄曲霉制备的生防菌群处理的玉米和秸秆作为动物饲料时，携带的生防菌产生纤维素酶，能够降解纤维素，提高畜牧对饲料的利用效率。
Description
技术领域
本发明涉及农产品安全领域，尤其涉及一种不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株和混合菌群及其应用。
背景技术
黄曲霉毒素主要由黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)的代谢产物，是迄今发现的污染农产品毒性最强的一类生物毒素。其中，毒性最强、危害最大的为黄曲霉毒素B1，其毒性为氰化钾的10倍、砒霜的68倍，被列入严管的特剧毒物质。农产品黄曲霉毒素污染已成为影响食品安全和危害人们身体健康的重要污染物。
据世界粮农组织估计，目前世界范围内有25％的农作物产品受真菌毒素的污染，其中主要就是黄曲霉毒素。近年来，世界各国不仅纷纷制订了相应的黄曲霉毒素限量标准和法规，而且其允许上限均有进一步降低。1998年欧盟委员会通过了1525/98号指令，公布了欧盟国家食品中黄曲霉毒素的最高限量：规定人类直接食用的花生及其制品中黄曲霉毒素(B1+B2+G1+G2)从20μg/kg统一降到4μg/kg，其中，B1≤2μg/kg。目前，黄曲霉毒素污染对农产品输出国的对外贸易已产生了严重影响。黄曲霉毒素主要污染花生、玉米等作物，严重影响我国花生、玉米等作物及其制品的出口，给我国的出口贸易带来了巨大损失。因此，黄曲霉毒素的有效防治与控制，对于保障我国食品安全和提升我国农产品出口竞争力具有重要意义。
利用不产黄曲霉毒素来抑制产毒菌菌群数量及产毒量的生物防治是目前控制农产品黄曲霉毒素非常有效的手段。美国近来在黄曲霉毒素生物防治研究方面已取得重大进展，已经批准两个不产毒素的黄曲霉生防菌株(AF36和NRRL21882)，该黄曲霉生防菌株在大田大面积使用，取得了显著的经济和社会效益。利用不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株NRRL21882能有效防治花生黄曲霉毒素污染，其防效可达90％以上，使花生中黄曲霉毒素的含量能有效控制在限量标准范围内。但是，美国的生防菌株在对非洲黄曲霉群体没有很好的抑制作用，而非洲分离到的高竞争力的不产毒素的菌株对非洲产毒黄曲霉则有很好的抑制作用。这表明，不同地区的不产毒素的黄曲霉生防菌株有其一定的适用范围。单个生防菌在田间施用常因为生防菌株的适生性问题而导致防效不稳定的情况。我国在黄曲霉毒素生防防治方面还处于初步阶段，暂无登记的防治黄曲霉的生防菌剂。筛选、开发利用防治黄曲霉毒素的生物农药，对解决我国农产品黄曲霉毒素污染问题将具有重要的应用价值。
纤维素由2000-10000个葡萄糖分子组成的长链大分子，在植物体中的含量最多，约占植物干重的1/2。除反刍动物借瘤胃微生物可以利用纤维素外，其他高等动物几乎不能消化和利用纤维素。我国是一个饲料资源十分紧张的国家，土地少、人口多，人畜争粮的矛盾十分突出。饲料资源匮乏阻碍了我国畜牧业的发展，因此，成功开发这一潜在饲料资源显得尤为迫切和重要。微生物添加剂指由许多有益微生物及其代谢产物和生长促进物质组成的，可直接饲喂动物，提高反刍动物对饲料利用率的重要添加剂。其中，产纤维素酶的有益微生物饲料添加剂，能显著提高反刍动物对纤维素的利用效率。因此，筛选、开发产纤维素酶的有益微生物作为饲料添加剂具有改善饲料的营养价值，降低饲料成本和提高经济效益，具有广阔的开发前景。
发明内容
本发明提供了一种不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株和混合菌群及其应用，该黄曲霉菌株和混合菌群均能有效抑制玉米和花生中的黄曲霉毒素的形成，降低农产品中黄曲霉毒素的污染；此外，A051、AF052和AF053还能够分泌纤维素酶，利用该黄曲霉制备的生防菌群处理的玉米及秸秆作为动物饲料时，其携带的生防菌产生纤维素酶，能够降解纤维素，提高畜牧对饲料的利用效率。
本发明提供了一种不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株，命名为黄曲霉(Aspergillusflavus)AF052，保藏编号为CGMCC NO.9858，保藏日期为2014年11月20日。
本发明提供了一种不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株，命名为黄曲霉(Aspergillusflavus)AF053，保藏编号为CGMCC NO.9859，保藏日期为2014年11月20日。
本发明还提供了一种不产黄曲霉毒素的黄曲霉混合菌群，由黄曲霉(Aspergillusflavus)A051、黄曲霉(Aspergillus flavus)AF052和黄曲霉(Aspergillus flavus)AF053混合而成；
所述黄曲霉(Aspergillus flavus)A051的保藏编号为CGMCC NO.2556，保藏日期为2008年6月24日；
所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF052的保藏编号为CGMCC NO.9858，保藏日期为2014年11月20日；
所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF053的保藏编号为CGMCC NO.9859，保藏日期为2014年11月20日。
所述黄曲霉混合菌群的组建是按照不同地理来源进行组合的，以降低生防菌剂在田间应用过程中的防效不稳定问题和扩大该生防菌剂的适用地域范围；具体地，黄曲霉(Aspergillus flavus)A051分离自浙江省绍兴市，即长江流域；黄曲霉(Aspergillusflavus)AF052分离自山东省莱西市，即黄河流域；黄曲霉(Aspergillus flavus)AF053分离自福建省漳浦县，即东南沿海地区。
所述黄曲霉混合菌群的组建还同时具有不产毒黄曲霉遗传多样性。各菌株在产毒基因簇上缺失的基因存在差异；具体地，黄曲霉(Aspergillus flavus)A051缺乏黄曲霉毒素合成基因C1、C2、C3、norB、cypA、aflT、pksA、nor1、hexA、hexB、aflR、aflJ、adhA、estA和norA；黄曲霉(Aspergillus flavus)AF052缺乏黄曲霉毒素合成基因C2、C3、norB、cypA、aflT、pksA、norl、hexA、hexB、aflR、aflJ、adhA、estA和norA；黄曲霉(Aspergillus flavus)AF053缺乏黄曲霉毒素合成基因C1、C3、norB、avnA、vbs；因此，A051菌株、AF052菌株和AF053菌株均不能合成黄曲霉毒素。
作为优选，所述的混合菌群中，黄曲霉(Aspergillus flavus)A051CGMCCNO.2556、黄曲霉(Aspergillus flavus)AF052CGMCC NO.9858和黄曲霉(Aspergillusflavus)AF053CGMCCNO.9859的菌体数比例为1∶1∶1。
本发明还提供了所述的菌株或混合菌群在抑制产黄曲霉毒素的黄曲霉生长中的应用。
具体地，所述黄曲霉生长在农产品中。
所述的农产品为谷物、油料作物、坚果、香辛料、饲料原料、中草药或水果；优选地，所述的农产品为玉米或花生。
本发明还提供了一种用于抑制产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒的生防菌剂，所述菌剂的活性成分为所述的菌株或混合菌群。
所述的生防菌剂的制备方法，包括：黄曲霉(Aspergillus flavus)A051、黄曲霉(Aspergillus flavus)AF052和黄曲霉(Aspergillus flavus)AF053分别单独发酵后，将得到的菌液混匀，制备获得生防菌剂。
所述的发酵过程包括：以小麦为基质，将小麦浸泡、高温灭菌后，接种黄曲霉菌株，在28℃温度、0.04-0.06Mpa气压下发酵48小时。发酵终止后，将温度升至40℃，搅拌烘干的发酵产品。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明分离获得的黄曲霉不产黄曲霉毒素，能有效抑制农产品中的黄曲霉毒素的形成，降低农产品中黄曲霉毒素的污染，提高农产品质量；
(2)本发明将不同地域分离获得的不产黄曲霉毒素的黄曲霉进行混合制备生防菌剂，克服了现有生防菌剂对不同地域防治效果存在差异的问题，有效降低了本发明生防菌剂在田间应用过程中防效不稳定的问题，并扩大了该生防菌剂的适用地域范围；
(3)本发明分离获得的黄曲霉(Aspergillus flavus)A051CGMCC NO.2556，AF052CGMCC NO.9858和黄曲霉(Aspergillus flavus)AF053CGMCC NO.9859可分泌纤维素酶，利用该黄曲霉制备的生防菌群处理后的玉米、秸秆作为动物饲料时，其产生的纤维素酶能有降解纤维素，提高反刍动物对饲料的利用率。
附图说明
图1为本发明黄曲霉菌株A051、AF052和AF053中黄曲霉毒素合成基因缺失示意图。
图2为本发明黄曲霉菌株A051、AF052和AF053产生纤维素酶的活平板测定结果图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
黄曲霉毒素B1购于Sigma公司。
实施例1不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株的分离、鉴定
1、从土壤、玉米、花生等生境中分离黄曲霉菌株
从江苏、浙江、山东、福建、安徽等地的玉米、花生田块中采集土壤，将该土壤用YES培养基培养分离黄曲霉菌株。每升YES培养基成分：酵母提取物1g，蔗糖10g，NaCl 60g，琼脂20g，灭菌后加入CuSO4.ZnSO41mL，0.4％氯硝胺5ml，链霉素100μg/mL。
2、用生物测定、薄层层析以及酶联免疫法分析菌株产生黄曲霉毒素的情况。
具体如下：
生物测定方法：将分离到的黄曲霉菌株接种在含0.3％环状糊精的YES培养基上，30℃培养7天后，将菌落用25％氨水熏蒸3分钟，如果菌落背面呈粉红色，该菌株为产毒菌株；如果菌落背面不变色，该菌株可能是不产毒素菌株，需进行下一步的薄层层析检测。薄层层析测定方法：将分离到的黄曲霉菌株接种在含0.3％环状糊精的YES培养基上，30℃培养7天后，收集100毫克菌丝和孢子，置于1.5毫升的离心管中，并向其中加入200微升的80％甲醇；室温下震荡30分钟后10,000g离心5分钟，取50微升上清液点到硅胶层析板上，吹干后将薄层层析板置于展布槽内用无水乙醚预展12厘米，取出凉干后在经过丙酮∶三氯甲烷(8∶92)展开10～12cm，然后，取出层析板，365nm紫外灯下观测，有淡蓝色银光斑点的菌株为产毒菌株；如果没有淡蓝色银光斑点，说明该菌株很可能是不产毒菌株，这些菌株可进行下一步分子生物学检测。
酶联免疫法检测菌株是否产生黄曲霉毒素：按照中华人民共和国国家标准GB/T5009.22-2003《食品中黄曲霉毒素B1的测定》方法，并利用北京市营养源研究所研发的ELISA定量试剂盒定量检测黄曲霉毒素B1。
通过上述方法分析，筛选出不产黄曲霉毒素的菌株A051，分离自浙江省绍兴市的土壤；不产黄曲霉毒素的菌株AF052，分离自山东省莱西市的花生上；不产黄曲霉毒素的菌株AF053，分离自福建省漳浦县的土壤。
3、菌株的分子鉴定
通过钙调基因序列对真菌A051、AF052和AF053进行分子鉴定(Rodrigues P，Santos C，A，Lima N.，2011.Species identification of Aspergillus sectionFlavi isolates from Portuguese almonds using phenotypic，including MALDI-TOFICMS，and molecular approaches.JAppl Microbiol.111(4)：877-92.)黄曲霉基因组钙调基因cmdA的PCR扩增所用的引物为CL1和CL2A，序列为：
CL1：5’-GARTWCAAGGAGGCCTTCTC-3’
CL2A：5′-TTTTTGCATCATGAGTTGGAC-3′。
PCR反应的体系为：1μL DNA模板(约4ng)，0.1mM引物各1μL，10mM dNTP 0.5μL，25mM MgCl2 2μL，10×buffer 2.5μL，聚合酶1.5U个单位，双蒸水补足至25μL。
反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性40s，各组引物53℃退火40s，72℃延伸1min，进行35个循环，最后72℃延伸10min。
PCR产物经纯化后送至华大基因进行测序。测序结果在BLAST researches上比对测序结果(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
菌株A051、AF052和AF053的钙调蛋白基因的PCR扩增产物的测序结果分别如SEQID NO.1～3所示。序列在NCBI上对比结果显示，菌株A051、AF052和AF053与黄曲霉菌标准菌株NRRL3357的同源性均为99％。
菌株A051、AF052和AF053在YES培养基上菌落生长较快，30℃条件下5天可长满直径9cm的培养n；菌落黄绿色，产生大量分生孢子；分生孢子梗长度一般为700μm～1200μm，直径为11μm～16μm，顶囊近球形；分生孢子球形或近球形，直径3.5μm～4.5μm，孢子表面粗糙。符合黄曲霉菌株的特征。
综上，通过上述各方法从土壤、花生上，分离、筛选和鉴定出不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株A051、AF052和AF053，并对菌株进行了保藏。
菌株保藏说明：
(1)菌株名称：黄曲霉；拉丁名：Aspergillus flavus；菌株编号：A051；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏机构简称：CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2008年6月24日；保藏号：CGMCCNO.2556(该菌株已在)。
(2)菌株名称：黄曲霉；拉丁名：Aspergillus flavus菌株编号：AF052；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏机构简称：CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2014年11月20日；保藏号：CGMCC NO.9858。
(3)菌株名称：黄曲霉；拉丁名：Aspergillus flavus；菌株编号：AF053；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏机构简称：CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2014年11月20日；保藏号：CGMCC NO.9859。
实施例2不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株A 051、A F 052和A F 053中黄曲霉毒素合成基因缺失鉴定
(1)引物合成
为明确不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株A051、AF052和AF053中黄曲霉毒素合成基因缺失情况，试验参考了文献Perng-Kuang Chang(ChangP.K.，Horn，B.W.and Dorner，J.W.(2005)Sequence breakpoints in the aflatoxin biosynthesis gene cluster andflanking regions in nonaflatoxigenic Aspergillus flavus isolates.Fungal GenetBio 42，914-923.)中设计的关于毒素合成基因的鉴定引物，对菌株A051、AF052和AF053中相关基因进行了缺失情况鉴定。
(2)基因缺失鉴定
以提取的黄曲霉菌株A051、AF052和AF053的DNA为模板，分别用以上引物进行常规PCR反应，每个反应均有产毒黄曲霉菌株DNA对照和阴性对照(以无菌水作为模板)。PCR反应的体系为：1μL DNA模板(约4ng)，0.1mM引物各1μl，10mM dNTP 0.5μl，25mM MgCl2 2μl，10×buffer 2.5μL，聚合酶1.5U个单位，双蒸水补足至25μL。
反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性40s，各组引物53℃退火40s，72℃延伸(具体时间视扩增片段大小而定)，进行35个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用1.5％的琼脂糖在1×TAE缓冲液中电泳后，用EB显色拍照。
结果显示通过表1中各组引物的多次PCR验证，实施例1所得的黄曲霉(Aspergillus flavus)A051菌株缺乏黄曲霉毒素合成基因C1、C2、C3、norB、cypA、aflT、pksA、nor1、hexA、hexB、aflR、aflJ、adhA、estA和norA。因此，A051菌株不能合成黄曲霉毒素。AF052菌株缺乏黄曲霉毒素合成基因C2、C3、norB、cypA、aflT、pksA、nor1、hexA、hexB、aflR、aflJ、adhA、estA和norA。因此，AF052菌株不能合成黄曲霉毒素；AF053菌株缺乏黄曲霉毒素合成基因C1、C3、norB、avnA、vbs。因此，AF053菌株不能合成黄曲霉毒素。
黄曲霉菌株A051、AF052和AF053中黄曲霉毒素合成基因缺失示意图见图1。
实施例3室内试验评价不产黄曲霉毒素的黄曲霉生防菌株群对玉米上产黄曲霉毒素的黄曲霉菌的抑制作用
(1)玉米的准备
称取20g玉米，用榨汁机进行破碎后，121℃灭菌30min后待用。
(2)菌悬液的制备及培养
将不产毒素的黄曲霉菌株A051、AF052、AF053及产黄曲霉毒素的黄曲霉标准菌株NRRL3357分别接种在PDA培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，加水至1L)上，平板置于30℃培养5天后，加0.1％的吐温20冲洗并收集孢子，利用涡旋振荡器震荡混匀，然后用血球计数板调整孢子浓度。试验共设置5种处理，如下：
处理1：不产毒黄曲霉(Aspergillus flavus)A051、AF052、AF053的孢子按照1×105个孢子∶1×105个孢子∶1×105个孢子＝1∶1∶1的比例预制成混合孢子悬浮液，终浓度为3×105个孢子/mL，再和所述产黄曲霉毒素标准菌株NRRL3357的孢子3×105个孢子/mL，等体积混合，加入2mL混合孢子液到破碎后的20g玉米；
处理2：不产毒黄曲霉(Aspergillus flavus)A051的孢子浓度调至3×105个孢子/mL，再和所述产黄曲霉毒素标准菌株NRRL3357的孢子3×105个孢子/mL，等体积混合，加入2mL混合孢子液到破碎后的20g玉米；
处理3：不产毒黄曲霉(Aspergillus flavus)AF052的孢子浓度调至3×105个孢子/mL，再和所述产黄曲霉毒素标准菌株NRRL3357的孢子3×105个孢子/mL，等体积混合，加入2mL混合孢子液到破碎后的20g玉米；
处理4：不产毒黄曲霉(Aspergillus flavus)AF053的孢子浓度调至3×105个孢子/mL，再和所述产黄曲霉毒素标准菌株NRRL3357的孢子3×105个孢子/mL，等体积混合，加入2mL混合孢子液到破碎后的20g玉米；
处理5：对照处理组。加入1mL的所述产黄曲霉毒素标准菌株NRRL3357的孢子3×105个孢子/mL孢子液到破碎后的20g玉米。
接种后的玉米置于30℃，培养20天。
(3)黄曲霉毒素B1含量的测定
处理后样品按照中华人民共和国国家标准GB/T 5009.22-2003《食品中黄曲霉毒素B1的测定》方法，分离提取玉米中黄曲霉毒素B1，并利用北京市营养源研究所研发的ELISA定量试剂盒定量检测黄曲霉毒素B1，评价抑制效果。
(4)产毒抑制率
将对照组的黄曲霉毒素B1含量与处理组对比发现，本发明的生防菌群能有效抑制产毒素黄曲霉的毒素产生，防效高达98.64％，且混合菌群的防治效果显著高于单个生防菌的效果。
表1室内条件下，不产毒混合菌群在玉米中对产毒菌株产毒的抑制效果比较
| 处理组 | 菌株名称 | 产毒量(μg/g) | 抑制产毒率(％) |
| 1 | (A051+AF052+AF053)∶NRRL3357＝1∶1 | 0.82±0.07 | 98.64±0.13a |
| 2 | A051∶NRRL3357＝1∶1 | 6.87±2.13 | 88.58±3.53b |
| 3 | AF052∶NRRL3357＝1∶1 | 11.94±3.24 | 80.15±5.38c |
| 4 | AF053∶NRRL3357＝1∶1 | 11.16±1.51 | 81.45±2.52c |
| 5 | NRRL3357 | 60.17±2.97 |
注：小写字母表示差异在P＜0.05水平上差异显著。
实施例4室内试验评价不产黄曲霉毒素的黄曲霉生防菌株群对花生上产黄曲霉毒素的黄曲霉菌的抑制作用
(1)花生的准备
称取20g花生，用榨汁机进行破碎后，121℃灭菌30min后待用。
(2)菌悬液的制备及培养
将不产毒素的黄曲霉菌株A051、AF052、AF053及产黄曲霉毒素的黄曲霉标准菌株NRRL3357分别接种在PDA培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，加水至1L)上，平板置于30℃培养5天后，加0.1％的吐温20冲洗并收集孢子，利用涡旋振荡器震荡混匀，然后用血球计数板调整孢子浓度。试验共设置5种处理，如下：
处理1：不产毒黄曲霉A051、AF052、AF053的孢子按照1×105个孢子∶1×105个孢子∶1×105个孢子＝1∶1∶1的比例预制成混合孢子悬浮液，终浓度为3×105个孢子/mL，再和所述产黄曲霉毒素标准菌株NRRL3357的孢子3×105个孢子/mL，等体积混合，加入2mL混合孢子液到破碎后的20g花生。
处理2：不产毒黄曲霉A051的孢子浓度调至3×105个孢子/mL，再和所述产黄曲霉毒素标准菌株NRRL3357的孢子3×105个孢子/mL，等体积混合，加入2mL混合孢子液到破碎后的20g花生。
处理3：不产毒黄曲霉AF052的孢子浓度调至3×105个孢子/mL，再和所述产黄曲霉毒素标准菌株NRRL3357的孢子3×105个孢子/mL，等体积混合，加入2mL混合孢子液到破碎后的20g花生。
处理4：不产毒黄曲霉AF053的孢子浓度调至3×105个孢子/mL，再和所述产黄曲霉毒素标准菌株NRRL3357的孢子3×105个孢子/mL，等体积混合，加入2mL混合孢子液到破碎后的20g花生。
处理5：对照处理组。加入1mL的所述产黄曲霉毒素标准菌株NRRL3357的孢子3×105个孢子/mL孢子液到破碎后的20g花生。
接种后的玉米置于30℃，培养20天。
(3)黄曲霉毒素B1含量的测定
处理后样品按照中华人民共和国国家标准GB/T 5009.22-2003《食品中黄曲霉毒素B1的测定》方法，分离提取花生中黄曲霉毒素B1，并利用北京市营养源研究所研发的ELISA定量试剂盒定量检测黄曲霉毒素B1，评价抑制效果。
(4)产毒抑制率
将对照组的黄曲霉毒素B1含量与处理组对比发现，本发明的生防菌群能有效抑制产毒素黄曲霉的毒素产生，防效高达96.76％，且混合菌群的防治效果显著高于单个生防菌的效果。
表2室内条件下，不产毒混合菌群在花生中对产毒菌株产毒的抑制效果比较
| 处理组 | 菌株名称 | 产毒量(μg/g) | 抑制产毒率(％) |
| 1 | (A051+AF052+AF053)∶NRRL3357＝1∶1 | 2.94±1.01 | 96.76±1.12a |
| 2 | A051∶NRRL3357＝1∶1 | 8.47±2.58 | 90.68±2.84b |
| 3 | AF052∶NRRL3357＝1∶1 | 15.7±3.58 | 82.72±3.94c |
| 4 | AF053∶NRRL3357＝1∶1 | 19.28±1.41 | 78.78±1.55c |
| 5 | NRRL3357 | 90.84±1.57 |
注：小写字母表示差异在P＜0.05水平上差异显著。
实施例5田间施用不产黄曲霉毒素的黄曲霉生防菌株群对玉米上产黄曲霉毒素的黄曲霉菌的抑制作用
(1)混合菌群制剂的制备
本发明还提供了不产毒素黄曲霉生防菌剂的制备技术，也属于本发明的保护范围；各生防菌株首先进行单独发酵，发酵产物出罐后进行浓度测定，再按照有效成分1∶1∶1比例进行混匀。单菌株的发酵过程如下：
本生防菌发酵基质为小麦，发酵设备为双锥回转固体发酵设备(容积1000L)。小麦需要用清水浸泡至麦粒胀开为止(约10小时)，后去水，沥干。将浸泡过的麦子加入发酵罐进行121℃，湿热灭菌30min；灭菌的发酵基质温度降至25度以下，进行接种浓度为5×109孢子/吨。生防菌发酵温度设定为28℃。湿度对发酵很重要，大罐发酵应该设定相关参数或是通过补水的方式进行保湿。发酵时通无菌空气，保持气压在0.04-0.06Mpa；发酵过程中保持发酵罐转速为10转/分钟，以防止基质结块导致发酵产物不均匀；参数设定后，维持设定参数，发酵48小时；发酵终止后，将罐温升至40度，搅拌烘干发酵产品。按照设定参数发酵48小时后，取出适量样品进行发酵产物质量检测，测定发酵的麦粒是否能均匀生长出生防菌及定量分析孢子浓度。调节浓度麦粒带菌量为105个孢子/克·麦粒。
按上述技术方案分别发酵A051、AF052和AF053生防菌株，后按照1∶1∶1进行混合，制备混合生防菌群。
(2)玉米地使用方法
将混合菌群制剂在玉米抽雄、开花期，按照3kg/亩生防菌剂的用量均匀撒施于玉米的垄行上。以无菌基质作为处理对照组，按照同样用量进行施用。试验地的玉米按常规方法管理。试验在生防菌分离地浙江省绍兴市、山东省莱西市和福建省漳浦县进行了抑制玉米黄曲霉毒素试验。
(3)抑制产毒效果评价
玉米收获后，每试验地随机抽取3份玉米样品，每份不少于2kg，进行储藏60天后进行黄曲霉毒素B1的检测。按照中华人民共和国国家标准GB/T 5009.22-2003《食品中黄曲霉毒素B1的测定》方法，分离提取各试验点玉米样品中黄曲霉毒素B1，并利用北京市营养源研究所研发的ELISA定量试剂盒定量检测黄曲霉毒素B1。结果如下：
表3生防菌群玉米地抑制黄曲霉毒素的效果
由上述试验结果可见，本发明的生防菌群在玉米地能有效抑制黄曲霉毒素产生，抑制效果在65.36％～78.34％。
实施例6田间施用不产黄曲霉毒素的黄曲霉生防菌株群对花生上产黄曲霉毒素的黄曲霉菌的抑制作用
(1)生防菌混合菌剂的制备
按照实施例5中所描述的发酵方法进行制备。
(2)花生地使用方法
混合菌剂在花生播种后，按照1.5kg/亩生防菌剂的用量均匀撒施于花生的垄行上；对地膜覆盖的花生地，将生防菌剂点施于花生根部以无菌基质作为处理对照组，按照同样用量进行施用。试验地的花生按常规方法管理。试验在生防菌分离地浙江省绍兴市、山东省莱西市和福建省漳浦县进行了抑制花生黄曲霉毒素试验。
(3)抑制产毒效果评价
花生收获后，每试验地随机抽取3份花生样品，每份至少2kg，进行储藏60天后进行黄曲霉毒素B1的检测。按照中华人民共和国国家标准GB/T 5009.22-2003《食品中黄曲霉毒素B1的测定》方法，分离提取各试验点的花生样品中黄曲霉毒素B1，并利用北京市营养源研究所研发的ELISA定量试剂盒定量检测黄曲霉毒素B1。结果如下：
表4生防菌群花生地抑制黄曲霉毒素的效果
由上述试验结果可见，本发明的生防菌群在花生地能有效抑制黄曲霉毒素产生，抑制产毒率为63.90％～79.16％。
实施例7
利用CMC-Na培养基：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)15g，NH4NO31g，酵母膏1g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO41g，去离子H2O 1000mL，琼脂2％，pH自然。利用CMC-Na培养基培养本发明菌株A051、AF052和AF053。将目的菌株菌牒置于培养基中央，28℃，培养25天后，用1mg/mL的刚果红溶液染色1h，再用蒸馏水清洗，最后用1mol/L的NaCl溶液脱色1h。观察菌落周围的透明圈形成情况。
由图2可见，本申请的菌株A051、AF052和AF053在CMC-Na培养基上培养后，能够降解羧甲基纤维素钠，产生纤维素酶。(图中箭头指，典型的透明圈)。
Claims (8)
1.一种不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株，其特征在于，命名为黄曲霉(Aspergillusflavus)AF052，保藏编号为CGMCC NO.9858，保藏日期为2014年11月20日。
2.一种不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株，其特征在于，命名为黄曲霉(Aspergillusflavus)AF053，保藏编号为CGMCC NO.9859，保藏日期为2014年11月20日。
3.一种不产黄曲霉毒素的黄曲霉混合菌群，其特征在于，由黄曲霉(Aspergillusflavus)A051、黄曲霉(Aspergillus flavus)AF052和黄曲霉(Aspergillus flavus)AF053混合而成；
所述黄曲霉(Aspergillus flavus)A051的保藏编号为CGMCC NO.2556，保藏日期为2008年6月24日；
所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF052的保藏编号为CGMCC NO.9858，保藏日期为2014年11月20日；
所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF053的保藏编号为CGMCC NO.9859，保藏日期为2014年11月20日。
4.如权利要求3所述的混合菌群，其特征在于，黄曲霉(Aspergillus flavus)A051CGMCC NO.2556、黄曲霉(Aspergillus flavus)AF052CGMCC NO.9858和黄曲霉(Aspergillus flavus)AF053CGMCC NO.9859的菌体数比例为1:1:1。
5.如权利要求1～4任一项所述的菌株或混合菌群在抑制产黄曲霉毒素的黄曲霉生长中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述黄曲霉生长在农产品中。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的农产品为玉米或花生。
8.一种用于抑制产黄曲霉毒素的黄曲霉生长的生防菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分为如权利要求1～4任一项所述的菌株或混合菌群。
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