CN101363006A - 一种不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株，其属于曲霉属(Aspergillus)黄曲霉(Aspergillus flavus)，保藏名称为：黄曲霉菌株A051，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2008年6月24日，保藏号：CGMCC NO.2556。本发明还同时公开了上述黄曲霉菌株的用途，其特征是：用于抑制花生田土壤中产黄曲霉毒素的黄曲霉病菌群体。
Description
技术领域
本发明属于农产品安全领域，主要涉及一种抑制花生田土壤中产黄曲霉毒素的黄曲霉群体的生防菌株---黄曲霉菌株A051，以及该菌株的生防应用。
背景技术
黄曲霉毒素(Aflatoxins，以下简写成AFT)主要是黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)的代谢产物，是迄今发现的污染农产品毒性最强的一类生物毒素。其中，毒性最强、危害最大的为黄曲霉毒素B1，其毒性为氰化钾的10倍、砒霜的68倍，被列入严管的特剧毒物质。农产品AFT污染已成为影响食品安全和危害人们身体健康的隐形杀手。
据世界粮农组织估计，目前世界范围内有25％的农作物产品受真菌毒素的污染，其中主要就是AFT。近年来，世界各国不仅纷纷制订了相应的AFT限量标准和法规，而且其允许上限均有进一步降低。1998年欧盟委员会通过了1525/98号指令，公布了欧盟国家食品中黄曲霉毒素的最高限量：规定人类直接食用的花生及其制品中黄曲霉毒素(B1+B2+G1+G2)从20ug/kg统一降到4ug/kg，其中B1≤2ug/kg。目前，AFT污染对农产品输出国的对外贸易已产生了严重影响。因此。AFT污染的有效防治与控制对于保障我国食品安全和提升我国农产品出口竞争力具有重要意义。
生物防治是目前控制农产品AFT非常有效的手段，美国近来在AFT生物防治研究方面已取得重大进展，即：利用不产AFT的黄曲霉菌株NRRL 21882能有效防治花生AFT污染，其防效可达90％以上，使花生中AFT的含量能有效控制在限量标准范围内。但是美国的生防菌株在对非洲黄曲霉群体没有很好的抑制作用，而非洲分离到的高竞争力的不产毒素的菌株对非洲产毒黄曲霉则有很好的抑制作用；表明，不同地区的不产毒素的黄曲霉生防菌株有其一定的适用范围。目前，我国在该领域还没有相关报道。
黄曲霉和寄生曲霉是腐生菌，主要在土壤中存活。在作物生长期，农作物对病菌有较强的抗性，病菌难以侵染作物或仅在表面处于潜伏状态。在农产品成熟期和收获后的储存过程中，潜伏在农产品表面的病菌遇到适合的条件可迅速生长，并产生AFT。因此，防治农作物生长过程中黄曲霉的潜伏侵染是控制农产品生长后期和储存过程中AFT污染的非常重要的环节，而防治农作物生长过程中黄曲霉潜伏侵染的重要措施是减少土壤中产AFT的黄曲霉病菌的菌量。AFT主要是黄曲霉和寄生曲霉这两种真菌产生的次生代谢物质，但并不是所有的黄曲霉和寄生曲霉菌株都能产AFT毒素。AFT是病菌在长期进化过程中对逆境的一种适应反应，因此，在正常的环境条件下，一些黄曲霉菌的菌株由于AFT合成途径中的某个或某些基因发生缺失或突变，使得这些菌株不产生AFT，而且有些不产AFT的黄曲霉菌株的竞争力可能会优于产AFT的黄曲霉菌株。因此，将高竞争力的不产AFT的菌株大面积施用于田间后，使其在自然种群的竞争中以强劲的生长优势来抑制产AFT菌株，进而可显著降低AFT污染农产品的风险。
目前，我国在AFT生物防治方面研究还刚刚起步。开发利用防治AFT的生物农药，对解决我国农产品AFT污染问题将具有重要的应用价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株及其用途，该菌株能用于抑制花生田土壤中产毒黄曲霉群体。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株，属于曲霉属(Aspergillus)黄曲霉(Aspergillus flavus)，保藏名称为：黄曲霉菌株A051，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(位于：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏日期：2008年6月24日，保藏号：CGMCC NO.2556。
上述黄曲霉菌株A051在查氏培养基上菌落生长较快，30℃条件下5天可长满直径9cm的培养皿；菌落黄绿色，产生大量分生孢子；分生孢子梗长度一般为700μm～1 200μm，直径为11μm～16μm，顶囊近球形；分生孢子球形或近球形，直径3.5μm～4.5μm，孢子表面粗糙。
上述黄曲霉菌株A051缺乏黄曲霉毒素合成基因C1、黄曲霉毒素合成基因C2、黄曲霉毒素合成基因C3、黄曲霉毒素合成基因norB、黄曲霉毒素合成基因cypA、黄曲霉毒素合成基因aflT、黄曲霉毒素合成基因pksA、黄曲霉毒素合成基因nor1、黄曲霉毒素合成基因hexA、黄曲霉毒素合成基因hexB、黄曲霉毒素合成基因aflR、黄曲霉毒素合成基因aflJ、黄曲霉毒素合成基因adhA、黄曲霉毒素合成基因estA和黄曲霉毒素合成基因norA；因此，该菌株不能合成黄曲霉毒素。
本发明还同时提供了上述黄曲霉菌株A051的用途，用于抑制花生田土壤中产黄曲霉毒素的黄曲霉病菌群体。
本发明的黄曲霉菌株A051的菌落形态与普通黄曲霉相似，但不合成黄曲霉毒素；其不产毒素的机制是：该菌株的毒素合成基因从基因C1至norA基因出现缺失，ver1基因至最后一个毒素合成基因hypA之间的基因是完整的；该菌株的毒素合成基因的缺失位点位于基因ver1启始密码子上游297bp处，缺失位点的序列是：
TTCATTGAGACACACGGCGGTTTTCGTT。
具体内容如下：
在本发明中，首先用YES培养基从土壤中分离出黄曲霉菌株，用生物测定、化学分析以及分子生物学方法筛选出其中不产AFT的黄曲霉菌株，然后测定这些不产AFT菌株的生长速率、产孢量、土壤中的存活期、以及与产AFT菌株的竞争力等指标，从而筛选出了一个高竞争力的不产AFT的黄曲霉菌株A051。根据毒素合成相关基因C1、C3、norB、cypA、aflT、pksA、aflR、norA、ver1、verA、ordA、hypA和glcA的基因序列，设计PCR引物，以黄曲霉菌株A051的DNA为模板，进行PCR扩增，结果表明，该菌株的毒素合成基因从基因C1至norA基因出现缺失，ver1基因至最后一个毒素合成基因hypA之间的基因是完整的。通过TAIL-PCR技术，发现C1基因后的缺失位点的序列是TTCATTGAGACACACGGCGGTTTTCGTT。
根据该缺失点的DNA序列，设计一组PCR引物：AFB-F：5’—TATTCCGAATTGCATGCATCA—3’和AFB-R：5’-AACGAAAACCGCCGTGTGT-3’，该组引物能从A051菌株中特异地扩增出一条260bp的DNA片段，而其他类型的不产毒素和产毒素黄曲霉则不能扩到相应的片段。因此，该组引物能特异性鉴定该黄曲霉菌株A051。
本发明的黄曲霉菌株A051对土壤中产毒黄曲霉群体有抑制作用，该菌株A051对产毒素的黄曲霉菌具有高竞争力，将该菌株A051施用于作物田后，使其在自然种群的竞争中以强劲的生长优势来减少土壤中产毒黄曲霉菌群体，控制农作物生长过程中的潜伏侵染，进而可显著降低农作物生长后期和存贮过程中黄曲霉毒素污染的风险。
为了证明黄曲霉菌株A051对土壤中产毒黄曲霉群体有抑制作用，发明人作了如下的实验：
将黄曲霉菌株A051以麦粒为基质，28-30℃条件下发酵5天，将发酵的麦粒在低于50℃条件下烘干，然后于5月下旬至6月上旬施用于花生田中。黄曲霉菌株A051在土壤中以强劲的生长优势来抑制土壤中产毒黄曲霉菌群体，其抑制效果可达到97％以上。
通过上述实验可表明：该黄曲霉菌株A051能有效控制农作物生长过程中的产毒素黄曲霉菌的潜伏侵染，进而可显著降低农作物生长后期和存贮过程中黄曲霉毒素污染的风险。
本发明的黄曲霉菌株A051的花生田间使用方法具体如下：
在花生种植后两至两个半月，将经菌株A051发酵的麦粒均匀撒在花生田中，含菌株A051麦粒的用量为3公斤/亩；施用后如果土壤干燥，可灌溉一次，使土壤湿润，以利于生防菌的定殖。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是黄曲霉菌株A051毒素合成基因缺失示意图；
图2是黄曲霉菌株A051毒素合成基因缺失位点DNA序列及检测A051特异PCR引物在该DNA序列上的位置图谱。
具体实施方式
实施例1、生防菌株A051(即黄曲霉菌株A051)的采集、分离、鉴定
(1)、从土壤中分离黄曲霉菌株
从江苏、浙江、山东等花生田块采集的土壤用YES培养基培养分离黄曲霉菌株。每升YES培养基成分：酵母提取物1g，蔗糖10g，NaCl 60g，琼脂20g，灭菌后加入CuSO4.ZnSO41ml，0.4％氯硝胺5ml，链霉素100ppm。
(2)、用生物测定、薄层层析以及分子生物学方法筛选出其中不产AFT的黄曲霉菌株，然后测定这些不产AFT菌株的生长速率、产孢量、土壤中的存活期、以及与产AFT菌株的竞争力等指标，从而筛选出了一个高竞争力的不产AFT的黄曲霉菌株A051。具体如下：
生物测定方法：将分离到的黄曲霉菌株接种在含0.3％环状糊精的YES培养基上，30℃培养7天后，将菌落用25％氨水熏蒸3分钟，如果菌落背面呈粉红色，该菌株为产毒菌株；如果菌落背面不变色，该菌株可能是不产毒素菌株，需进行下一步的薄层层析检测。
薄层层析测定方法：将分离到的黄曲霉菌株接种在含0.3％环状糊精的YES培养基上，30℃培养7天后，收集100毫克菌丝和孢子，置于1.5毫升的离心管中，并向其中加入200微升的80％甲醇；室温下震荡30分钟后10，000g离心5分钟，取50微升上清液点到硅胶层析板上，吹干后将薄层层析板置于展布槽内用无水乙醚预展12厘米，取出凉干后在经过丙酮—三氯甲烷(8：92)展开10—12厘米，然后取出层析板，365nm紫外灯下观测，有淡蓝色银光斑点的菌株为产毒菌株；如果没有淡蓝色银光斑点，说明该菌株很可能是不产毒菌株，这些菌株可进行下一步分子生物学检测。
分子生物学方法：根据黄曲霉毒素合成基因的DNA序列(GenBank AY510451)我们设计了四组PCR引物C3-F/C3-R、aflT-F/aflT-R、norA-F/norA-R和hypA-F/hypA-R，其序列和PCR产物大小见表1。将这四组引物置于同一个PCR反应中，如果能扩出全部四条条带，表明该菌株可能是产毒菌株；如果不能扩增全部四条条带(大小为544bp，750bp，399bp，654bp)，表明，该菌株一定不产黄曲霉毒素。
将所得的不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株进行保藏，保藏名称为：黄曲霉(Aspergillusflavus)菌株A051，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(位于：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏日期：2008年6月24日，保藏号：CGMCC NO.2556。
实施例2、菌株A051毒素合成基因的缺失测定
(1)引物合成
本发明是以Genbank登录号为AY510451黄曲霉的毒素合成基因的序列为参照，设计了检测毒素合成相关基因C1、C3、norB、cypA、aflT、pksA、aflR、norA、ver1、verA、ordA、hypA以及glcA的引物，引物序列以及扩增片段大小见表1。
表1、不同毒素合成基因引物序列
| 基因 | 引物名称 | 序列(5’-3’) | 扩增片段大小 |
| C1 | C1-FC1-R | CCGTTGCAGTTAAAACTCACA (SEQ ID NO：1)GAAGCTCGATCTTCTCCATGA (SEQ ID NO：2) | 409 |
| C3 | C3-FC3-R | TCTGGAGTCGGAGGTTAGGTT (SEQ ID NO：3)GAGCAACACGATCATTGCAT (SEQ ID NO：4) | 544 |
| norBcypA | norB-cypA-Fnorb-cypA-R | GTGCCCAGCATCTTGGTCCA (SEQ ID NO：5)AGGACTTGATGATTCCTCGTC (SEQ ID NO：6) | 300/800/1800 |
| aflT | aflt-Faflt-R | TGCGGACATCTAACGACCAT (SEQ ID NO：7)AGGTCACTTCGTTCGTGAAGG (SEQ ID NO：8) | 750 |
| pksA | pksA-F1pksA-R1 | CCCTTGGTCTACCATTGTTTGA (SEQ ID NO：9)CAGTTGCTCCCAAGGAGTGGT (SEQ ID NO：10) | 367 |
| pksA | pksA-F3pksA-R3 | CGGTCGATCAGATCGCTAATT (SEQ ID NO：11)ACTTCATGTTGGGAAGCGG (SEQ ID NO：12) | 1027 |
| pksA | pksA-F4pksA-R4 | AATAAGGCTCGTAACCCCAGA (SEQ ID NO：13)AAGTGCAAGCTGGCTATTGTG (SEQ ID NO：14) | 1086 |
| aflR | aflR-FaflR-R | TGAGAAAGGGGACGCTGGAT (SEQ ID NO：15)CAATCGAATCAACCACCACA (SEQ ID NO：16) | 873 |
| norA | norA-FnorA-R | CCTTATGCCTGGGAACGAT (SEQ ID NO：17)TTCGCATCACTTCCTCCACA (SEQ ID NO：18) | 399 |
| ver1 | ver1-Fver1-R | ACCACCGTTTAGATGGCAAA (SEQ ID NO：19)AGAGCTGGTCAGGATAATCCG (SEQ ID NO：20) | 472 |
| verA | verA-FverA-R | ACACTCAATTGCACCACCAAA (SEQ ID NO：21)GAAGTAGTGGCCGGGTGAAT (SEQ ID NO：22) | 898 |
| ordA | ordA-FordA-R | TATTCTGGGCGAAGCATCAA (SEQ ID NO：23)CAGAGTAGTTGGTCCCACGA (SEQ ID NO：24) | 1156 |
| hypA | hypA-FhypA-R | GCATGTCCGTCGTCCTGATA (SEQ ID NO：25)CCCATTGATCAATCTCGGAT (SEQ ID NO：26) | 654 |
(2)、以提取的黄曲霉菌株A051的DNA为模板，分别用以上引物进行常规PCR反应，每个反应均有产毒黄曲霉菌株DNA对照和阴性对照(以无菌水作为模板)。
PCR反应的体系为：1μL DNA模板(约4ng)，0.1mM引物各1ul，10mM dNTP 0.5ul，25mM MgCl2 2ul，10×buffer(北京东胜公司生产)2.5ul，聚合酶1.5 U个单位，双蒸水补足至25μL。
反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性40s，各组引物53℃退火40s，72℃延伸(具体时间视扩增片段大小而定)，进行35个循环，最后延伸7min。PCR产物用1.5％的琼脂糖在1×TAE缓冲液中电泳后，用EB显色拍照。
(3)、通过各组引物的多次PCR验证，本发明涉及的黄曲霉菌株A051的毒素合成基因从基因C1缺失至基因norA，ver1基因至最后一个毒素合成基因之间的基因是完整的(如图1所示)。
实施例3、菌株A051毒素合成基因缺失位点序列的确定
通过上述方法已经确定菌株A051是从第一个毒素合成基因缺失至毒素合成基因norA，从ver1基因至最后一个毒素合成基因是完整的。根据ver1的序列设计3个特异性巢式引物AFT1、AFT2和AFT3，与1个随机引物RA5组合进行Tail-PCR扩增，从而确定具体的缺失位点。(引物序列见表2)
表2、Tail-PCR扩增所用巢式引物以及随机引物的序列
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| AFT1 | CATCGGCCTGGATTGCGATA (SEQ ID NO：27) |
| AFT2 | ACTTTCTCCGCGGCCTCAC (SEQ ID NO：28) |
| AFT3 | CGCCGGTGACTAAGGCCACT (SEQ ID NO：29) |
| RA5 | WGTGNAGWANCANAGA |
按照以下步骤进行巢式PCR反应，每个反应均有阴性对照(以产毒黄曲霉菌株DNA和无菌水作为模板)：
Tail-PCR-1：以菌株A051的DNA为模板，用随机引物RA5和引物AFT1进行PCR扩增。
Tail-PCR-2：以Tail-PCR-1的稀释产物(体积比1：10)为模板，用随机引物RA5和AFT2进行PCR扩增。
Tail-PCR-3：以Tail-PCR-2的稀释产物(1：10)为模板，用随机引物RA5和AFT3进行PCR扩增。
Tail2和Tail3的PCR产物用1.5％的琼脂糖在1×TAE缓冲液中电泳后，用EB显色拍照。发现Tail2-PCR产物中有目标片段，将目标产物纯化、测序，测序结果发现本发明涉及的菌株A051毒素合成基因的缺失位点位于基因ver1启始密码子上游297bp处，缺失位点上游300-bp的DNA序列见图2。
实施例4、特异性PCR引物检测黄曲霉菌株A051
根据菌株A051毒素合成基因确定的缺失位点的序列，在缺失位点处设计SEQ ID NO：30所示的特异性下游引物AFB-R(5’AACGAAAACCGCCGTGTGT3’)，在缺失位点上游设计SEQID NO：31所示的特异性上游引物AFB-F(5’TATTCCGAATTGCATGCATCA3’)，利用该组引物，以A051菌株DNA和其它黄曲霉菌株的DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应的体系为：1μLDNA模板(约4ng)，0.1mM引物各1ul，10mM dNTP 0.5ul，25mM MgCl2 2ul，10×buffer(北京东胜公司生产)2.5ul，聚合酶1.5 U个单位，双蒸水补足至25μL。反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性40s，各组引物58℃退火40s，72℃延伸30s，进行35个循环，最后延伸7min。PCR结果发现，该特异性引物能够从菌株A051中扩增出260bp大小的DNA片段，不能从其他类型的黄曲霉菌株中扩增出任何DNA片段。表明，该组PCR引物能特异检测A051菌株。
实施例5、生防菌株A051(黄曲霉菌株A051)施用花生田间能有效抑制土壤产毒素黄曲霉病菌群体增长
以江苏、浙江、山东、四川、辽宁等地的花生田作为实验对象，在花生种植后两至两个半月为施用的时间。以小麦为基质发酵菌株A051，小麦先高温121℃灭菌2h，再将菌龄为3天菌株A051接种于小麦，接种量为105个分生孢子/500克麦粒，28-30℃培养5天，期间应适当震荡以防菌丝集结产孢，50℃干燥2天，然后将这些小麦颗粒以3公斤/亩均匀播撒于田间的花生中，施用菌A051后灌溉一次使土壤湿润，以利于生防菌株繁殖。施用菌A051后每隔15天，取施用菌株A051花生田间的土样，检测土样中菌株A051的群体数量，比较使用生防菌前后土样中的产毒黄曲霉百分比的变化。结果发现，施用菌株A051前，土壤中产AFT毒素的黄曲霉菌占84％—98％；菌株A051施用15天后，从土壤中分离的黄曲霉菌株基本均为不产毒素的A051，表明在田间施用菌株A051后，可以有效的抑制土壤中产毒素的黄曲霉病菌群体增长。具体结果如表3所示。
表3、菌株A051的施用效果
| 菌株A051施用前，产AFT毒素的黄曲霉菌的含量 | 菌株A051施用后，产AFT毒素的黄曲霉菌的含量 | |
| 江苏 | 98％ | 0 |
| 浙江 | 90％ | 0 |
| 山东 | 84％ | 0 |
| 四川 | 93％ | 3％ |
| 辽宁 | 87％ | 0 |
实施例6、将美国的黄曲霉菌株NRRL 21882替代生防菌株A051，其余同实施例5。所得的结果如下：施用15天后，土壤中产AFT毒素的黄曲霉菌仍然占10～30％。具体如表4所示。
表4、菌株NRRL 21882的施用效果
| 菌株NRRL 21882施用前，产AFT毒素的黄曲霉菌的含量 | 菌株NRRL21882施用后，产AFT毒素的黄曲霉菌的含量 | |
| 江苏 | 98％ | 30％ |
| 浙江 | 90％ | 23％ |
| 山东 | 84％ | 14％ |
| 四川 | 93％ | 23％ |
| 辽宁 | 87％ | 10％ |
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
SEQ ID NO：1
SEQ ID NO：2
SEQ ID NO：3
SEQ ID NO：4
SEQ ID NO：5
SEQ ID NO：6
SEQ ID NO：7
SEQ ID NO：8
SEQ ID NO：9
SEQ ID NO：10
SEQ ID NO：11
SEQ ID NO：12
SEQ ID NO：13
SEQ ID NO：14
SEQ ID NO：15
SEQ ID NO：16
SEQ ID NO：17
SEQ ID NO：18
SEQ ID NO：19
SEQ ID NO：20
SEQ ID NO：21
SEQ ID NO：22
SEQ ID NO：23
SEQ ID NO：24
SEQ ID NO：25
SEQ ID NO：26
SEQ ID NO：27
SEQ ID NO：28
SEQ ID NO：29
SEQ ID NO：30
SEQ ID NO：31
Claims (4)
1、一种不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株，其特征是：属于曲霉属(Aspergillus)黄曲霉(Aspergillus flavus)，保藏名称为：黄曲霉菌株A051，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2008年6月24日，保藏号：CGMCC NO.2556。
2、根据权利要求1所述不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株，其特征是：所述黄曲霉菌株A051在查氏培养基上菌落生长较快，30℃条件下5天可长满直径9cm的培养皿；菌落黄绿色，产生大量分生孢子；分生孢子梗长度为700μm～1200μm，直径为11μm～16μm，顶囊近球形；分生孢子球形或近球形，直径3.5μm～4.5μm，孢子表面粗糙。
3、根据权利要求1或2所述不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株，其特征是：所述黄曲霉菌株A051缺乏黄曲霉毒素合成基因C1、黄曲霉毒素合成基因C2、黄曲霉毒素合成基因C3、黄曲霉毒素合成基因norB、黄曲霉毒素合成基因cypA、黄曲霉毒素合成基因aflT、黄曲霉毒素合成基因pksA、黄曲霉毒素合成基因nor1、黄曲霉毒素合成基因hexA、黄曲霉毒素合成基因hexB、黄曲霉毒素合成基因aflR、黄曲霉毒素合成基因aflJ、黄曲霉毒素合成基因adhA、黄曲霉毒素合成基因estA和黄曲霉毒素合成基因norA；因此，该菌株不能合成黄曲霉毒素。
4、如权利要求1所述不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株的用途，其特征是：用于抑制花生田土壤中产黄曲霉毒素的黄曲霉病菌群体。
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