ITRM20130305A1 - Ceppo atossigeno di aspergillus flavus. - Google Patents

Ceppo atossigeno di aspergillus flavus.

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ITRM20130305A1
ITRM20130305A1 IT000305A ITRM20130305A ITRM20130305A1 IT RM20130305 A1 ITRM20130305 A1 IT RM20130305A1 IT 000305 A IT000305 A IT 000305A IT RM20130305 A ITRM20130305 A IT RM20130305A IT RM20130305 A1 ITRM20130305 A1 IT RM20130305A1
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matrix
flavus
aflatoxins
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Paola Battilani
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Description

“CEPPO ATOSSIGENO DI ASPERGILLUS FLAVUSâ€
CAMPO TECNICO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce ad un nuovo ceppo atossigeno di Aspergillus flavus, come anche a composizioni che lo comprendono, e al suo uso come agente di biocontrollo contro la contaminazione da aflatossine prodotte da ceppi tossigeni di Aspergillus flavus e/o Aspergillus parasiticus. Inoltre, la presente invenzione fornisce anche un metodo per prevenire e/o ridurre e/o eliminare la contaminazione da aflatossine prodotte da ceppi tossigeni di Aspergillus flavus e/o Aspergillus parasiticus in colture come colture in pieno campo o in ambienti controllati, quali tunnel o serre e colture fuori suolo.
STATO DELLA TECNICA NOTA
Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus sono funghi produttori di micotossine, quali le aflatossine e l’acido ciclopiazonico. In particolare Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus possono in condizioni ambientali e nutrizionali favorevoli produrre l’aflatossina B1e B2, G1e G2. L’aflatossina B1 à ̈ la sostanza naturale più tossica che si conosca, classificata dall’Agenzia Internazionale per la Ricerca sul Cancro (IARC, 2002. IARC Monographs on the Evaluation of the Carcinogenic Risks to Humans: Some Traditional Herbal Medicines, some Mycotoxins, Naphthalene and Styrene, vol. 82. IARC, Geneva, pp. 301–366.) come gruppo 1, massima classe di pericolosità, per la sua dimostrata attività cancerogena sull’uomo e sugli animali. Sebbene anche l’aflatossina B2 sia classificata nel gruppo 1 vi sono limitate evidenze sul suo effetto cancerogeno. L’azione tossica delle aflatossine si manifesta in seguito ad ingestione di alimenti contaminati con queste tossine con conseguenti effetti avversi sia acuti sia cronici.
Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus sono in grado di infettare diversi tipi di colture quali, ad esempio, colture di mais, cotone ed i cosiddetti nuts, che comprendono la frutta secca a guscio, con conseguente contaminazione dei prodotti alimentari derivati da tali colture con le aflatossine. Inoltre, le aflatossine sono soggette anche a passaggio negli animali alimentati con prodotti contaminati. In particolare, documentato à ̈ il passaggio nel latte ottenuto da bovine e bufale come nei formaggi derivati, nei quali si assiste ad una concentrazione delle tossine che dipende anche dal tipo di caseificazione e dalla durata della stagionatura.
Nel continente africano, ad esempio, si à ̈ assistito in anni recenti, 2004 e 2005, alla morte di più di 200 persone per tossicità acuta da aflatossine ingerite da mais altamente contaminato (Probst et al., 2007. Outbreak of an acute aflatoxicosis in Kenya in 2004: identification of the causal agent. App. Environ. Microbiol. 73:2762-2764).
Proprio per l’elevata tossicità delle aflatossine, in Europa à ̈ in vigore un regolamento (European Commission (EC), 2010. Commission Regulation No 165/2010 setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs as regards aflatoxins. Official Journal of the European Union L50, 8–12) che fissa i limiti massimi di presenza delle aflatossine in vari prodotti ad uso alimentare umano. In particolare il citato regolamento stabilisce 2 valori, quello per l’aflatossina B1(5,0 µg/kg) e quello per la somma totale delle aflatossine B1, B2, G1e G2(10 µg /kg), nel mais destinato ad uso umano prima della pulizia e il contenuto massimo di aflatossina B1nel latte (0,050 µg /kg). Inoltre, il regolamento EC 2003 (European Commission (EC), 2003. Commission Directive No 2003/100/EC on undesirable substances in animal feed. Official Journal of the European Union L285, 33-37) stabilisce i limiti massimi di presenza di aflatossine negli alimenti destinati agli animali (0,02 mg/kg) con particolari restrizioni per quelli da latte (0,005 mg/kg).
Tra le aflatossine, la B1 à ̈ quella più presente negli alimenti contaminati. In particolare, in Italia si à ̈ visto che rappresenta il 90% del totale delle aflatossine rilevate nel mais (Battilani P., Barbano C., Piva G., Aflatoxin B1contamination in maize related to the aridity index in North Italy. World Mycotoxin Journal, 2008, 1, 449-456).
Non sono al momento disponibili mezzi diretti di lotta per controllare lo sviluppo del fungo in campo. Sono state stilate linee guida che definiscono le migliori tecniche colturali per minimizzare le contaminazioni da aflatossine e definiti i criteri da seguire per ottimizzare la raccolta, l’essiccazione e lo stoccaggio della granella al fine di impedire l’incremento delle contaminazioni in queste fasi. Tuttavia, in annate e aree geografiche in cui si verificano condizioni meteorologiche favorevoli ai funghi aflatossigeni, l’attenta applicazione delle linee guida non garantisce una produzione nel rispetto dei requisiti legislativi. Inoltre, i processi tecnologici comunemente applicati non consentono l’abbattimento della contaminazione e non esistono sistemi di detossificazione efficaci ed autorizzati per applicazioni alla granella in post-raccolta .
Tra le strategie proposte per limitare la contaminazione da aflatossine nelle colture destinate ad uso alimentare quella più promettente si basa sull’utilizzo di ceppi atossigeni di A. flavus ovvero di ceppi di A. flavus che non sono in grado di produrre aflatossine. Il principio su cui si basa tale strategia consiste nell’esclusione competitiva tra ceppi di A. flavus atossigeni e ceppi tossigeni (ceppi di A. flavus produttori di aflatossine) consentendo, di fatto, di limitare in campo l’attività dei ceppi tossigeni e quindi la contaminazione da aflatossine.
L’impiego di ceppi atossigeni di A. flavus in campo, come agenti di biocontrollo che agiscono per esclusione competitiva, à ̈ stato proposto negli USA dove esistono attualmente 2 ceppi commerciali (Aspergillus flavus AF36 e AFLAGUARD®). Inoltre, in Africa à ̈ in corso di registrazione una miscela di ceppi atossigeni di A. flavus (AFLASAFETM). Convenzionalmente, la selezione dei ceppi atossigeni da utilizzare come agenti di biocontrollo come quelli esemplificati sopra, à ̈ effettuata su colture di mais. I ceppi così selezionati sono poi utilizzabili come agenti di biocontrollo anche su diversi tipi di colture soggetto ad infezione da parte di Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus.
Tuttavia, i ceppi disponibili negli USA o in Africa non sono trasferibili in Europa, incluso l’Italia. Infatti, anche trascurando la regolamentazione in merito all’introduzione di microrganismi provenienti da paesi diversi, l’adattamento ad ambienti agro-climatici assai differenti, come quello africano e quello statunitense, rende i ceppi atossigeni disponibili scarsamente competitivi nei confronti dei ceppi autoctoni. A questo si aggiunga che, con l’utilizzo di tali ceppi, non può essere escluso il rischio di ripristino della tossigenicità del ceppo impiegato, se non verificando a priori il gruppo di compatibilità vegetativa (VCG) di appartenenza dei ceppi poiché A. flavus ha la possibilità di scambiare materiale genetico per fusione di ife con ceppi appartenenti allo stesso VCG. In altre parole, nel caso in cui ceppi tossigeni e atossigeni appartenessero alla medesima VCG e venissero in contatto, di fatto, si avrebbe scambio di materiale genetico con acquisizione del ceppo atossigeno della capacità di produrre aflatossine.
Scopo della presente invenzione, à ̈ di superare gli svantaggi associati all’utilizzo di ceppi atossigeni di A. flavus noti e fornire un ceppo non tossigeno di A. flavus alternativo da utilizzarsi per prevenire e/o eliminare parzialmente o totalmente la contaminazione da aflatossine. Ciò pare quanto mai opportuno in seguito ai rilevanti problemi verificatisi nell’annata agraria 2012, con una quota rilevante del mais prodotto in Italia, stimata intorno al 60%, contaminata al di sopra dei limiti di legge. L’elevata contaminazione, imputabile principalmente alle condizioni meteorologiche verificatesi, con temperature elevate ed assenza di piogge durante il periodo estivo, si suppone possano verificarsi con maggiore probabilità nel prossimo futuro per il cambiamento climatico in atto, con conseguenti problemi di salute pubblica.
SOMMARIO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce ad un nuovo ceppo di Aspergillus flavus atossigeno. In particolare, l’inventore ha scoperto che tale ceppo può essere utilizzato come agente di biocontrollo contro la contaminazione da aflatossine, come ad esempio nelle colture da campo in Italia, ottenendo sorprendenti riduzioni della contaminazione da A. flavus e/o da A. parasiticus, con vantaggi superiori a quelli riconosciuti ai ceppi di A. flavus atossigeni noti come si potrà vedere nella sezione degli esempi, sotto.
La presente invenzione nasce dall’osservazione che, i ceppi attualmente presenti in commercio, ceppi di A. flavus non tossici autoctoni del territorio americano (AF36 e AFLAGUARD®) o miscele di ceppi di A. flavus sempre non tossici di origine africana (AFLASAFE) non sono utilizzabili in Italia, sia per motivi legislativi che per la presunta scarsa capacità competitiva, come indicato da Probst et al (Probst, C., Bandyopadhyay, R., Price, L. E., and Cotty, P. J. 2011. Identification of atoxigenic Aspergillus flavus isolates to reduce aflatoxin contamination of maize in Kenya. Plant Disease 95, 212-218.). In particolare, l’inventore della presente invenzione ha selezionato un nuovo ceppo atossigeno di Aspergillus flavus, autoctono del territorio italiano, che si à ̈ dimostrato estremamente efficace come agente di biocontrollo contro la contaminazione da aflatossine in Italia. Quindi, à ̈ qui descritto per la prima volta un ceppo italiano di A. flavus atossigeno il cui utilizzo, sul territorio italiano, consente di ottenere colture, come anche prodotti di post-raccolta, in cui i livelli di aflatossine sono minimi. Ne consegue che con il ceppo qui descritto à ̈ altissima la probabilità di ottenere colture e prodotti derivati con livelli di aflatossine compresi nei limiti imposti dai regolamenti europei in materia (Regolamento Europeo 1881/2006, aggiornato con Regolamento Europeo 165/2010 per i prodotti destinati all’uso umano e Direttiva 100/2003 per i prodotti destinati all’uso zootecnico) anche in annate ad alto rischio.
In particolare, la capacità del ceppo di A. flavus qui descritto di prevenire e/o eliminare totalmente o in parte la contaminazione da aflatossine quali, ad esempio, aflatossine B1, B2, G1e G2in diverse colture agricole italiane à ̈ dovuta all’insieme delle sue caratteristiche genetiche/biochimiche tra le quali rientrano le seguenti:
a) origine italiana, quindi in altri termini à ̈ un ceppo autoctono italiano; b) incapacità di produrre aflatossine, ed à ̈ quindi un ceppo atossigeno; c) incapacità di produrre acido ciclopiazonico (CPA)
d) gruppo di compatibilità vegetativa (VCG) IT6 ovvero VCG che ha dimostrato la maggiore diffusione sul territorio italiano
e) allele MAT1-1 al locus per il gene Mating-type (MAT)
Come dimostrato nella sezione “Esempi†di cui sotto, si à ̈ sorprendentemente dimostrato come il ceppo di A. flavus qui descritto à ̈ più efficace di qualsiasi altro ceppo autoctono italiano e come agente di biocontrollo in agricoltura. Infatti, il ceppo atossigeno qui descritto à ̈ in grado di ridurre il contenuto di aflatossina in un intervallo dal 75% al 100%% in prove in pieno campo in colture contaminate da Aspergillus flavus e e/o Aspergillus parasiticus. Inoltre, con il metodo dell’inoculo della spiga attraverso il foro, il ceppo della presente invenzione si à ̈ dimostrato capace di ridurre il contenuto di aflatossine in una percentuale maggiore dell’80% in spighe contaminate da Aspergillus flavus
Pertanto, formano oggetto della presente invenzione:
un ceppo atossigeno di Aspergillus flavus avente numero di deposito MUCL54911, depositato il 13 Maggio 2013 presso “The Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms (BCCM™) e/o suoi derivati che conservino le caratteristiche di detto ceppo divulgate nella presente descrizione.
- una composizione comprendente il ceppo di cui sopra o suoi derivati e uno o più diluenti e/o veicolanti.
- l’uso del ceppo avente numero di deposito MUCL54911 o di suoi derivati o della composizione che lo comprende come agente di biocontrollo contro la contaminazione da aflatossine prodotte da Aspergillus flavus e/o Aspergillus parasiticus;
- un metodo per prevenire e/o ridurre e/o eliminare la contaminazione da aflatossine prodotte da Aspergillus flavus e/o Aspergillus parasiticus tossigeni in colture da campo comprendente un passaggio di distribuzione in detta coltura da campo del ceppo avente numero di deposito MUCL54911 o suoi derivati o della composizione di cui sopra
- una matrice inoculata con il ceppo avente numero di deposito MUCL54911 secondo la rivendicazione 1 o suoi derivati o parti come sotto definiti.
FIGURE
La figura 1 mostra un grafico relativo alla valutazione dell’efficacia in pieno campo del ceppo atossigeno di Aspergillus flavus dell’invenzione di ridurre il contenuto di aflatossine. Il numero sopra le barre indica la percentuale di riduzione ottenuta nei campi trattati con il ceppo atossigeno di A. flavus rispetto al controllo non trattato.
TABELLE
La tabella 1 riporta i dati relativi alla capacità di ceppi atossigeni di Aspergillus flavus, rispetto al ceppo dell’invenzione (in grassetto) di ridurre la produzione di aflatossina B1in granella di mais.
Tabella 1
a i ceppi atossigeni sono stati inoculati con AF13 ad una concentrazione di 1x105 spore/ml. Il ceppo NRRL 21882 Ã ̈ il componente attivo del biopesticida Afla-Guard. Il ceppo AF13 Ã ̈ un elevato produttore di aflatossine.
b Gruppo di Compatibilità Vegetativa; n.d.= non disponibile.
c La concentrazione di aflatossina B1à ̈ stata misurata sulla granella di mais coinoculata con i ceppi atossigeni e tossigeni dopo 7 giorni di incubazione a 31°C d Percentuale di riduzione dell’aflatossina B1(R) = [1- (aflatossina nella granella coinoculata/ aflatossina totale prodotta da AF13 da solo)] x 100.
e Le lettere indicano significative differenze tra gli isolati (P<0.05). Nella tabella sono riportati i dati combinati (P<0.05) di due repliche dell’esperimento.
La tabella 2 riporta i dati relativi alla capacità del ceppo dell’invenzione (in grassetto), rispetto ad un altro ceppo italiano atossigeno di Aspergillus flavus precedentemente descritto in letteratura, di ridurre la concentrazione di aflatossina B1prodotta da sei ceppi italiani tossigeni di A. flavus.
Tabella 2
a I ceppi atossigeni MUCL54911 e A2321 (descritto in letteratura) sono stati coinoculati allo stesso tempo dei ceppi tossigeni ad una concentrazione di 1x105 spore/ml.
b La concentrazione (mg/kg) di aflatossina B1della granella di mais à ̈ stata determinata dopo 7 giorni di incubazione a 31°C.
c Percentuale di riduzione dell’aflatossina B1(R) = [1 - (aflatossina nella granella di mais co-inoculata/aflatossina prodotta dai rispettivi ceppi tossigeni)] x 100.
d Le lettere indicano significative differenze tra gli isolati (colonne); * indica differenze tra i ceppi atossigeni (righe). Sono riportati i dati combinati (P<0.05) provenienti da due indipendenti repliche dell’esperimento.
La tabella 3 riporta i dati relativi all’influenza del rapporto atossigeno:tossigeno tra ceppi di Aspergillus flavus rispetto al ceppo dell’invenzione (in grassetto) nel ridurre il contenuto di aflatossine B1prodotta da un ceppo tossigeno.
Tabella 3
a Il ceppo NRRL 21882 Ã ̈ il componente attivo del biopesticida Afla-Guard. Il ceppo AF13 Ã ̈ un elevato produttore di aflatossine e rappresenta il controllo positivo. I restanti sono ceppi italiani atossigeni.
b Il ceppo Atossigeno (A) e Tossigeno (T) sono stati co-inoculati alla concentrazione di 1x105 spore/ml in due rapporti: (a) 1/5 atossigeno e 4/5 tossigeno (1:4) e (b) proporzioni uguali (1:1).
c La concentrazione (mg/kg) di aflatossina B1della granella di mais à ̈ stata determinata dopo 7 giorni di incubazione a 31°C.
d Percentuale di riduzione dell’aflatossina B1(R) = [1 - (aflatossina nella granella di mais co-inoculata /aflatossina prodotta dal ceppo AF13)] x 100.
e L’efficienza (E) à ̈ stata calcolata con la seguente formula: E = R/(A/A+T ); dove R à ̈ la percentuale di riduzione dell’aflatossina B1 e il denominatore rappresenta la percentuale del ceppo atossigeno in ogni trattamento.
f Le lettere indicano significative differenze tra gli isolati (colonne); * indica differenze tra i ceppi atossigeni (righe). Sono riportati i dati combinati (P<0.05) provenienti da due indipendenti repliche dell’esperimento.
La tabella 4 riporta i dati relativi alla produzione di acido ciclopiazonico (CPA) su granella di mais e substrato sintetico (CZ) di ceppi di A. flavus rispetto al ceppo dell’invenzione riportato in grassetto.
Tabella 4
<a>Ceppi di Aspergillus flavus. Controllo: mais o CZ non inoculato.
b n.r. = non rilevata
La tabella 5 riporta l’aplotipo di ceppi italiani atossigeni di Aspergillus flavus rispetto al ceppo dell’invenzione (in grassetto) per 19 loci di microsatelliti
Tabella 5
a Numero di paia di basi per ciascun allele; ** allele non presente.
GLOSSARIO
Ceppo di A. flavus MUCL 54911. Con questo termine si indica il fungo avente numero di deposito MUCL 54911, depositato il 13 Maggio 2013 presso “The Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms (BCCM™)†in un qualsiasi momento della fase vitale e anche singole cellule dello stesso. Sono pertanto compresi nella definizione di A. flavus avente numero di deposito MUCL 54911, singole cellule fungine, l’intero organismo, parti dell’organismo come, ife, spore, sclerozi e simili.
Ceppo inoculato su una matrice/supporto/substrato. Con l’espressione “ceppo inoculato su una matrice/supporto/substrato†s’intende nella presente descrizione che parti del fungo in grado di permetterne la crescita, ad esempio micelio o spore di vario tipo, sono messe a contatto con una matrice o substrato allo scopo di permettere la crescita del fungo sulla matrice/substrato/supporto stesso.
Compatibilità Vegetativa (VC). Con l’espressione “Compatibilità Vegetativa†si intende nella presente descrizione, in accordo a quanto indicato nella letteratura scientifica, la capacità dei funghi, incluso Aspergillus flavus, di fondere le proprie ife con quelli di altri funghi appartenenti alla stessa specie, formando eterocarionti (cellule provviste di più nuclei) stabili. I loci genici che regolano la compatibilità vegetativa sono noti come loci vic. La fusione stabile tra le ife à ̈ possibile solo tra ceppi che presentano gli stessi alleli in tutti i loci vic. Due ceppi che possono fondere le proprie ife sono definiti come ceppi apparenti allo stesso gruppo di compatibilità vegetativa (VCG) (Barros et al 2006. Genetic diversity within Aspergillus flavus strains isolated from peanut-cropped soils in Argentina. Soil Biol.Biochem.38:145-152.).
Tossigeno. Con il termine “tossigeno†nella presente descrizione si intende un ceppo di A. flavus o di A. parasiticus che produce aflatossine e che risulta essere pertanto un ceppo che origina sostanze tossiche . Viceversa con il termine “atossigeno†ci si riferisce, sempre nella presente descrizione, ad un ceppo di A. flavus che non à ̈ in grado di produrre aflatossine inclusa l’aflatossina B1e che in quanto tale risulta essere un ceppo non tossigeno.
Aflatossine. Con il termine “aflatossine†s’intende nella presente descrizione, metaboliti secondari prodotte da diverse specie di fungo Aspergillus, incluse la specie A. flavus e/o la specie A. parasiticus. In particolare, con riferimento alle aflatossine prodotte da A. flavus e/o da A. parasiticus, esse sono indicate come aflatossine B1, B2, G1e G2. Nella presente descrizione, a meno che non espressamente indicato, il termine “aflatossina/e†si riferisce indifferentemente all’aflatossina B1, B2, G1, G2o loro miscele.
Derivati. Con il termine “derivati†nella presente descrizione ci si riferisce a ceppi di A. flavus derivati, ad esempio per mutazione o trasformazione o incrocio, dal ceppo avente numero di deposito MUCL54911, depositato il 13 Maggio 2013 presso “The Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms (BCCM™)†che conservino le caratteristiche rivendicate e qui descritte del ceppo dell’invenzione, e che possano quindi essere utilizzati come il ceppo dell’invenzione.
Tra le caratteristiche conservate dovranno esserci:
a) origine italiana;
b) incapacità di produrre aflatossine;
c) incapacità di produrre acido ciclopiazonico (CPA);
d) gruppo di compatibilità vegetativa (VCG) IT6
e) allele MAT1-1 al locus per il gene Mating-type (MAT)
f) capacità di ridurre il contenuto di aflatossina in un intervallo dal 75% al 100% in prove in pieno campo in colture contaminate da Aspergillus flavus e/o Aspergillus parasiticus.
g) capacità di ridurre il contenuto di aflatossine in una percentuale maggiore dell’80% in colture contaminate da Aspergillus flavus e/o Aspergillus parasiticus con il metodo dell’inoculo attraverso il foro come descritto nella presente domanda.
Autoctono italiano. Nella presente descrizione l’espressione “autoctono italiano†à ̈ da intendersi, in accordo a quanto comunemente noto, come indicativo di un ceppo di A. flavus originario o che si à ̈ sviluppato del territorio italiano in cui à ̈ stato isolato.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce ad un nuovo ceppo atossigeno di Aspergillus flavus, come depositato il 13 Maggio 2013 presso “The Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms (BCCMâ„¢)†a nome Università Cattolica del Sacro Cuore ed a cui à ̈ stato attribuito il numero di deposito MUCL54911 in accordo a quanto stabilito dal Trattato di Budapest del 28 aprile 1977, ratificato con legge 14 ottobre 1985, n.610.
In particolare, tale ceppo presenta diverse caratteristiche tra le quali rientrano quelle di seguito riportate. Si tratta di un ceppo autoctono italiano, quindi, di un ceppo che in quanto isolato dai raccolti presenti in particolare nel nord Italia, à ̈ originario o si à ̈ sviluppato nell’area geografica italiana.
Il ceppo avente numero di deposito MUCL54911 à ̈ caratterizzato dal fatto di stato di essere un ceppo atossigeno ovvero un ceppo di A. flavus privo della capacità di produrre aflatossine. In particolare, come riportato nello stato della tecnica nota (Sweeney, M. J., and Dobson, A. D. W. 1999. Molecular biology of mycotoxin biosynthesis. FEMS Microbiol. Lett. 175:149-163) la sintesi delle aflatossine avviene secondo una via sintetica che coinvolge almeno 23 conversioni enzimatiche, che coinvolgono altrettanti geni, nel ceppo avente numero di deposito MUCL54911 à ̈ interrotta dal momento che l’intero cluster dei geni coinvolti in tale sintesi à ̈ deleto. Per questa sua caratteristica genetica il ceppo avente numero di deposito MUCL54911 à ̈ quindi un ceppo che non produce né l’aflatossina B1 né l’aflatossina B2 e pertanto à ̈ un ceppo non tossigeno.
Il ceppo avente numero di deposito MUCL54911 à ̈ anche caratterizzato dal fatto di essere privo della capacità di produrre acido ciclopiazonico (CPA) poiché una delezione genetica coinvolge i geni coinvolti nella produzione di CPA.
Inoltre, il ceppo avente numero di deposito MUCL54911 presenta come caratteristica genotipica la presenza dell’allele MAT1-1 al locus per il gene Mating-type (MAT) Infine, il ceppo dell’invenzione à ̈ anche caratterizzato dal fatto di essere in grado di ridurre il contenuto di aflatossine, come aflatossina B1,in una percentuale dal 75% al 100% in prove in pieno campo in colture contaminate da Aspergillus flavus e/o Aspergillus parasiticus. In particolare, il contenuto di aflatossine in pieno campo può essere ridotto del 75%, 76%, 77%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%.100%.
Inoltre, il ceppo della presente invenzione si à ̈ dimostrato capace di ridurre il contenuto di aflatossine in una percentuale maggiore dell’80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86% 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% in colture contaminate da Aspergillus flavus e/o Aspergillus parasiticus utilizzando il metodo dell’inoculo attraverso il foro (descritto nella parte degli esempi) del suddetto ceppo nella pianta di interesse.
Tale efficacia, sorprendentemente elevata à ̈ una caratteristica unica del ceppo qui descritto.
Le caratteristiche sopra descritte per il ceppo dell’invenzione saranno presenti anche nei suoi derivati come sopra definiti.
Esperimenti condotti dall’inventore sul ceppo avente numero di deposito MUCL54911 selezionato hanno anche dimostrato che esso appartiene al gruppo di compatibilità vegetativa (VCG) IT6 ovvero al VCG che ha la maggiore diffusione tra i ceppi di A. flavus sul territorio italiano.
Il ceppo avente numero di deposito MUCL54911 qui descritto, come anche suoi derivati, può essere anche formulato come composizione insieme ad uno o uno o più diluenti e/o veicolanti. Qualsiasi diluente e/o veicolante descritto nello stato della tecnica nota e considerato idoneo dall’esperto del settore ad essere incluso nella composizione comprendente il ceppo avente numero di deposito MUCL54911 deve essere inteso come incluso nello scopo della presente invenzione. A titolo meramente esemplificativo e non limitativo i diluenti e i veicolanti possono essere scelti nel gruppo comprendente: acqua, mezzi idonei alla coltura di funghi, conservanti, additivi, amminoacidi, sali ecc. materiale di origine vegetale e/o prodotti da essi derivati, qualsiasi supporto solido e/o liquido capace di veicolare il fungo. In particolare, sia i diluenti sia i veicolanti saranno preferibilmente sterili al fine di impedire l’apporto di microrganismi indesiderati all’interno della composizione.
Laddove s’indica che la composizione dell’invenzione “può comprendere†il ceppo avente numero di deposito MUCL54911, tale composizione à ̈ intesa essere anche come “consistente in†tale ceppo avente numero di deposito MUCL54911, come anche suoi derivati, e, opzionalmente, un veicolante/diluente idoneo.
In una forma di realizzazione della presente composizione, il ceppo e/o suoi derivati, sono inoculati su una matrice o supporto che deve essere in grado di consentire al ceppo di mantenere tutte le caratteristiche ad esso associate e qui descritte. La matrice in cui sarà inoculato il ceppo avente numero di deposito MUCL54911 (e/o suoi derivati) può essere una qualsiasi matrice di origine naturale, sintetica o anche semi-naturale/semi-sintetica ritenuta idonea dal tecnico del settore in accordo a quanto indicato nella presente descrizione. La matrice/supporto à ̈ preferibilmente sterile e deriva da materiali di origine vegetale quali semi o prodotti ottenuti dalla lavorazione dei materiali di origine vegetale, quali amidi vegetali.
In maniera esemplificativa la matrice può essere una matrice naturale scelta principalmente tra materiale vegetale ottenuto da piante quali ad esempio sorgo, mais, soia, frumento.
In una forma di realizzazione tale materiale vegetale comprende semi, quali ad esempio semi di frumento e/o semi di sorgo.
Come dimostrato nella sezione “esempi†di cui sotto, il ceppo avente numero di deposito MUCL54911 qui descritto si à ̈ dimostrato particolarmente efficace se usato come agente di biocontrollo contro la contaminazione da aflatossine prodotte da ceppi tossigeni di Aspergillus flavus e/o Aspergillus parasiticus.
Particolarmente vantaggioso à ̈ l’uso del ceppo avente numero di deposito MUCL54911 come agente di biocontrollo, ad esempio, nel campo dell’agricoltura, e, specificatamente, nelle contaminazioni da aflatossine che colpiscono le colture di mais, di arachidi, frutta a guscio, quali pistacchio, noci, nocciole, mandorle, castagne e cotone. Infatti, come sotto riportato, il ceppo qui descritto à ̈ in grado di ridurre in percentuale compresa tra il 75-100% in prove in pieno campo la contaminazione da aflatossine prodotte dai ceppi tossigeni di Aspergillus flavus e/o Aspergillus parasiticus e/o di ridurre, con il metodo dell’inoculo attraverso il foro, il contenuto di aflatossine in una percentuale maggiore dell’80% in colture contaminate da ceppi tossigeni di Aspergillus flavus e/o Aspergillus parasiticus.
Oggetto della presente invenzione à ̈ anche un metodo per prevenire e/o ridurre e/o eliminare la contaminazione da aflatossine prodotte da ceppi tossigeni di Aspergillus flavus e/o Aspergillus parasiticus in colture in pieno campo o in ambienti controllati, quali tunnel o serre e colture fuori suolo, comprendente almeno) un passaggio di distribuzione nella coltura da campo del ceppo avente numero di deposito MUCL54911 e/o di suoi derivati o della composizione come precedentemente descritti. Preferibilmente, il metodo qui descritto à ̈ utilizzato per prevenire e/o eliminare parzialmente o completamente la contaminazione da aflatossina B1.
In particolare, il passaggio di distribuzione può essere effettuato secondo una qualsiasi tecnica nota all’esperto del settore e idonea a consentire la diffusione dell’agente di biocontrollo, o della composizione che lo comprende, nel campo da trattare. A titolo esemplificativo e non limitativo il passaggio di distribuzione può essere effettuato utilizzando mezzi comunemente disponibile per la concimazione delle colture, come ad esempio gli spandiconcimi. La distribuzione inoltre può avvenire sia mediante un’applicazione per via aerea e/o direttamente al suolo o comunque secondo tecniche ritenute dall’esperto del settore come efficaci a garantire l’uso del ceppo avente numero di deposito MUCL54911 in accordo a quanto qui descritto. Le colture agricole che possono essere sottoposto al metodo di cui sopra, sono, ad esempio, scelte nel gruppo comprendente coltura di mais, di arachidi, frutta a guscio come ad esempio pistacchio, noci, nocciole e mandorle, castagne e cotone.
In una forma di realizzazione del presente metodo, il ceppo avente numero di deposito MUCL54911, suoi derivati, o le sue spore sono inoculate prima del passaggio di distribuzione su una matrice, preferibilmente di tipo naturale, del tipo precedentemente descritto.
L’invenzione à ̈ descritta di seguito in alcune delle sue forme esemplificative che hanno lo scopo di illustrare quanto descritto nella presente domanda di brevetto. Tali esempi non sono in alcun modo da considerare come una limitazione dell’ambito della protezione conferita.
ESEMPI
Esempio 1
Efficacia di ceppi atossigeni nel ridurre il contenuto di aflatossina B1su granella di mais.
Diciotto (18) ceppi italiani atossigeni di Aspergillus flavus sono stati confrontati con il ceppo di Aspergillus flavus NRRL 21882 per valutare la capacità nel ridurre il contenuto di aflatossina B1prodotta dal ceppo tossigeno di Aspergillus flavus AF13 in granella di mais in vitro. Il ceppo di A. flavus NRRL 21882 à ̈ il componente attivo del prodotto commerciale AFLA-GUARD® (U.S. Patent 6306386 del 23 Ottobre 2001) mentre il ceppo AF13 à ̈ comunemente utilizzato in prove di laboratorio e di campo (Cotty, P. J. 1989. Virulence and cultural characteristics of two Aspergillus flavus strains pathogenic on cotton. Phytopathology 79:808-814.). Le spore di ciascun ceppo sono state raccolte con tamponi di cotone da colture di 6 giorni (31°C al buio), sospese in acqua distillata sterile, e la concentrazione à ̈ stata determinata come descritto da Probst e al. (Probst, C., Bandyopadhyay, R., Price, L. E., and Cotty, P. J. 2011. Identification of atoxigenic Aspergillus flavus isolates to reduce aflatoxin contamination of maize in Kenya. Plant Disease 95, 212-218.). La concentrazione delle spore à ̈ stata aggiustata a 105 spore/ml. La granella di mais intatta à ̈ stata sterilizzata in acqua calda per 45s a 80°C (Mehl, H. L., and Cotty, P. J. 2010. Variation in competitive ability among isolates of Aspergillus flavus from different vegetative compatibility groups during maize Infection. Phytopathology 100:150-159) e distribuita in beute di sterili (10 g di mais per beuta da 250 ml). Le beute sono state chiuse con tappi permeabili ai gas (Bugstoppers; Whatman, Piscataway, NJ) per prevenire la perdita di umidità e consentire lo scambio gassoso. Dopo sterilizzazione, la quantità di umidità del mais à ̈ stata quantificata con un analizzatore alogeno di umidità HB43 (Mettler Toledo, Columbus, OH) e il volume di acqua in cui sono stati applicati la sospensione di spore dei ceppi atossigeni e tossigeni sulla granella à ̈ stato aggiustato per portare il contenuto di acqua della granella al 25%. Le spore dei ceppi atossigeni e tossigeni sono state aggiunte alle beute contemporaneamente e agitate delicatamente per consentire la distribuzione sulla granella. Ai controlli à ̈ stata aggiunta la stessa quantità di acqua ma contenente soltanto le spore dei ceppi tossigeni. Il mais inoculato à ̈ stato incubato a 31°C per 7 giorni al buio. Il disegno sperimentale dell’esperimento à ̈ completamente randomizzato con quattro repliche. L’esperimento à ̈ stato ripetuto due volte. Al termine del periodo d’incubazione il contenuto di aflatossina B1 à ̈ stato quantificato come descritto da Probst et al. (Probst, C., Bandyopadhyay, R., Price, L. E., and Cotty, P. J. 2011. Identification of atoxigenic Aspergillus flavus isolates to reduce aflatoxin contamination of maize in Kenya. Plant Dis.95:212-218).
Tutti i ceppi atossigeni sono stati in grado di ridurre il contenuto di tossina nella granella rispetto a quanto prodotto dal ceppo tossigeno. In particolare, la contaminazione media da aflatossina B1nella granella inoculata con il solo ceppo tossigeno AF13 era di 146 ppm, mentre in quella co-inoculata con il ceppo AF13 e il ceppo avente numero di deposito MUCL54911 il contenuto di aflatossina à ̈ stato ridotto dell’83% (Tabella 1).
Esempio 2
Valutazione dell’efficacia del ceppo avente numero di deposito MUCL54911 atossigeno nel ridurre il contenuto di aflatossina B1prodotta da 6 ceppi tossigeni italiani
Il ceppo oggetto della presente descrizione e il ceppo atossigeno A2321 utilizzato come controllo positivo sono stati testati per la capacità di ridurre il contenuto da aflatossina B1prodotta da 6 diversi ceppi italiani tossigeni su granella di mais vitale in vitro. Il saggio à ̈ stato condotto come descritto nell’esempio 1 utilizzando 6 ceppi tossigeni italiani invece del ceppo tossigeno AF13. Il ceppo oggetto della presente descrizione e il ceppo A2321, sono stati capaci di ridurre la contaminazione da aflatossina B1nella granella di mais vitale inoculata con 6 diversi ceppi tossigeni (Tabella 2). La contaminazione della granella inoculata con i soli ceppi tossigeni variava tra 17 e 98 mg/kg. La misura in cui la contaminazione nel contenuto di aflatossina B1à ̈ stata ridotta dal ceppo avente numero di deposito MUCL54911 à ̈ compresa tra 60 e 78% con riduzioni simili (dal 60% al 68%) nella granella inoculata con 5 dei ceppi produttori di aflatossine e una riduzione significativamente maggiore (78%) nella granella inoculata con 1 dei ceppi. La capacità del ceppo avente numero di deposito MUCL54911 di ridurre con la stessa intensità il contenuto di aflatossina B1prodotta da diversi ceppi italiani tossigeni lo rende sorprendentemente adatto ad essere utilizzato come agente di biocontrollo per ridurre la contaminazione da aflatossine in colture di mais.
Esempio 3
Influenza del rapporto tra ceppo atossigeno e tossigeno nel ridurre la contaminazione da aflatossina B1.
Il ceppo avente numero di deposito MUCL54911 à ̈ stato testato per la capacità di ridurre il contenuto di aflatossina B1prodotta dal ceppo tossigeno AF13 in due diversi rapporti atossigeno:tossigeno su granella di mais vitale in vitro. Inoltre à ̈ stato utilizzato il ceppo NRRL 21882 come controllo positivo, ceppo americano noto per la sua efficienza nel ridurre la contaminazione da aflatossine. Anche in questo caso il saggio à ̈ stato condotto come descritto nell’esempio 1 utilizzando però due diversi rapporti (1:1 e 1:4) atossigeno:tossigeno. Oltre alla percentuale di riduzione del contenuto di aflatossina B1à ̈ stata calcolata anche l’efficienza (E) di ciascun ceppo con la seguente formula: E = R/(A/A+T), dove R à ̈ la percentuale di riduzione dell’aflatossina B1e il denominatore rappresenta la percentuale del ceppo atossigeno in ogni trattamento.
In particolare, il ceppo avente numero di deposito MUCL54911 ha mostrato una maggiore riduzione (72%) (Tabella 3) nel contenuto di aflatossina B1nella granella di mais inoculata con uguali quantità dell’atossigeno e tossigeno rispetto alla granella inoculata con una dose del ceppo atossigeno pari a un quarto rispetto al ceppo tossigeno. Inoltre il ceppo avente numero di deposito MUCL54911 ha mostrato una maggiore efficienza rispetto al ceppo NRRL 21882 quando testato nel rapporto 1:4 atossigeno:tossigeno. Questo risultato sorprendentemente mostra che il ceppo avente numero di deposito MUCL54911 aumenta la sua efficienza nel ridurre il contenuto di aflatossina B1al diminuire della concentrazione rispetto al ceppo tossigeno. Quindi, anche se dovesse trovarsi in concentrazioni inferiori ai ceppi tossigeni in campo produrrebbe un ottimo risultato in termini di riduzione della concentrazione di aflatossine.
Esempio 4
Produzione di acido ciclopiazonico
Il ceppo di A. flavus atossigeno avente numero di deposito MUCL54911 oggetto della presente descrizione à ̈ stato testato su granella di mais intatta e su substrato sintetico Czapek Agar (CZ) per la produzione di acido ciclopiazonico (CPA). Il CPA dalla granella à ̈ stato estratto seguendo la metodica descritta da Urano e al.
1992 (Urano et al. 1192. Co-occurrence of cyclopiazonic acid and aflatoxins in corn and peanuts. J AOAC Int 75:838–841) e quantificato come riportato da Zamboni e al. (2001;Zambonin, C. G., Monaci, L., & Aresta, A. (2001). Determination of cyclopiazonic acid in cheese samples using solid phase microex- traction and high performance liquid chromatography. Food Chemistry, 75, 249–254.). La metodica riportata da Giorni e al. (2007; Giorni, P., Magan, N., Pietri, A., Bertuzzi, T., Battilani, P., 2007. Studies on Aspergillus section Flavi isolated from maize in northern Italy. Int. J. Food Microbiol.113:330-338) invece à ̈ stata seguita per l’estrazione e la quantificazione di CPA dal terreno di coltura CZ. L’esperimento à ̈ stato condotto in entrambi i casi con 4 repliche.
In particolare, il ceppo avente numero di deposito MUCL54911 testato non ha prodotto quantità rilevabili di acido ciclopiazonico (CPA) (Tabella 4) sia su substrato naturale (granella di mais) sia su substrato sintetico (CZ), differentemente da quanto osservato per i ceppi utilizzati come controllo positivo A2062, A2068 e A2092.
Esempio 5
Prova su spighe di mais
Il ceppo atossigeno italiano avente numero di deposito MUCL54911 oggetto della presente descrizione à ̈ stato testato su spighe di mais in pieno campo per la capacità nel ridurre il contenuto di aflatossina B1prodotta da un ceppo tossigeno utilizzando 2 metodi di inoculo (goccia e foro).
Il ceppo à ̈ stato valutato per la capacità di ridurre il contenuto di aflatossina B1prodotta dal ceppo tossigeno A2092 (VCG IT3) su spighe di mais. Due tipi di inoculo sono stati effettuati sulle spighe di mais. Nel primo (foro), à ̈ stata seguita la metodica descritta da Atehnkeng e al. (Atehnkeng et al. 2008. Distribution and toxigenicity of Aspergillus species isolated from maize kernels from three agro-ecological zones in Nigeria. Int. J. Food Microbiol. 122:74-84). Brevemente in ogni spiga di mais dopo l’emissione delle sete à ̈ stato praticato un foro (3 mm di diametro) attraverso le brattee fino ad una profondità di circa 5 mm prima di inoculare con 10 µl di una sospensione di 106 spore/ml del solo ceppo tossigeno nel controllo o con il ceppo tossigeno e atossigeno, distribuiti contemporaneamente, nell’esperimento di co-inoculo. Nel secondo tipo di inoculo (goccia), i ceppi fungini sono stati inoculati all’apice delle spighe, nel punto di uscita delle sete, con 1 ml di una sospensione 106 spore/ml del solo ceppo tossigeno nel controllo o con il ceppo tossigeno e atossigeno contemporaneamente nell’esperimento di co-inoculo. L’esperimento à ̈ stato condotto su 5 spighe di mais per ciascun trattamento. La quantificazione delle aflatossine à ̈ stata fatta seguendo la metodica riportata da Stroka et al. (2003. Stroka, J., von Holst, C., Anklam, E., 2003. Immunoaffinity column cleanup with liquid chromatography using post-column bromination for determination of aflatoxin B1 in cattle feed: collaborative study. Journal of AOAC International 86, 1179–1186.).
I ceppi atossigeni MUCL54911 (IT6) e A2321 (IT19) non sono stati capaci di ridurre il contenuto di aflatossina B1prodotta dal ceppo tossigeno quando inoculati con il metodo della goccia depositata sul punto di fuoriuscita delle sete dalle brattee. Nel metodo dell’inoculo attraverso il foro, il ceppo A2321 à ̈ stato capace di ridurre il contenuto di aflatossina B1del 2,4% mentre il ceppo MUCL54911 oggetto della presente descrizione del 93,2%.
Esempio 6
Prove in pieno campo
Il ceppo atossigeno avente numero di deposito MUCL54911 oggetto della presente descrizione à ̈ stato testato in 8 campi di mais di circa 2 ha ciascuno per valutare l’efficacia nel ridurre la contaminazione da aflatossina B1In condizioni di inoculo naturale. I campi erano localizzati nella provincia di Verona (2 campi; VR1, VR2), di Rovigo (3 campi; RO1, RO2, RO3), di Mantova (2 campi, MN1, MN2) e di Parma (PR). L’esperimento à ̈ stato organizzato con 3 repliche del trattato e del controllo per ciascun campo. Alla raccolta sono state campionate 10 spighe di mais da ciascuna replica, essiccate, sgranate e macinate prima di procedere all’analisi delle aflatossine. La quantificazione delle aflatossine in ciascuna replica à ̈ stata fatta seguendo la metodica riportata da Stroka et al. (2011. Stroka, J., von Holst, C., Anklam, E., 2003. Immunoaffinity column cleanup with liquid chromatography using post-column bromination for determination of aflatoxin B1 in cattle feed: collaborative study. Journal of AOAC International 86, 1179–1186).
In particolare, à ̈ stato osservato che in 4 dei campi analizzati (MN1, MN2, RO1, RO2) (Figura 1) la contaminazione da aflatossina B1era inferiore al limite di rilevazione del metodo di analisi impiegato, come ai limiti stabiliti dalla legge. Nei restanti campi (RO3, PR, VR1 e VR2), dove la contaminazione era compresa tra 9,97 e 156,42 µg/kg, e la riduzione nella contaminazione à ̈ risultata complessivamente compresa tra l’83,3% e il 99,6% (Figura 1).
Esempio 7
Microsatelliti
Il genoma del ceppo avente numero di deposito MUCL54911 (IT6) oggetto del presente brevetto e il ceppo A2321 (IT19) Ã ̈ stato amplificato con 19 coppie di primers per identificare la presenza di micro satelliti seguendo la metodica descritta da Grubisha e Cotty (2009; Grubisha, L. C., e Cotty, P. J.2009. Twenty-four microsatellite markers for the aflatoxin-producing fungus Aspergillus flavus. Mol. Ecol. Resour.
9:264-267).
L’amplificazione del genoma del ceppo avente numero di deposito MUCL54911, oggetto della presente descrizione, ha mostrato un caratteristico profilo allelico come riportato in tabella 5. In particolare, per tre loci (AF18, AF33, AF34) non sono stati rilevati alleli mentre per i loci AF8, AF11, AF13, AF17, AF42, AF55, AF66, che sono polimorfici con il ceppo A2321, la grandezza in paia di basi di ciascun allele à ̈ rispettivamente di 141, 367, 150, 181 e 271.
Esempio 8
Profilo genetico dei geni MAT
Il genoma del ceppo avente numero di deposito MUCL54911 (IT6) oggetto del presente brevetto à ̈ stato amplificato per i geni MAT come riportato da Ramirez-Prado et al. 2008 (Ramirez-Prado JH, Moore GG, Horn BW, Carbone I. 2008. Characterization and population analysis of the mating-type genes in Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus. Fungal Genetics and Biology, 45, 1292–1299). In particolare, l’analisi molecolare dei geni MAT ha mostrato che il ceppo avente numero di deposito MUCL54911 (IT6) oggetto del presente brevetto presenta l’allele MAT1-1.

Claims (18)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Ceppo atossigeno di Aspergillus flavus avente numero di deposito MUCL54911 e/o suoi derivati.
  2. 2. Ceppo atossigeno di Aspergillus flavus e/o suoi derivati secondo la rivendicazione 1, caratterizzati dal fatto di ridurre in una percentuale compresa tra il 75-100% in prove in pieno campo la contaminazione da aflatossine prodotte dai ceppi tossigeni di Aspergillus flavus e/o Aspergillus parasiticus e/o di ridurre, con il metodo dell’inoculo attraverso il foro, in una percentuale maggiore dell’80% il contenuto di aflatossine in colture contaminate da ceppi tossigeni di Aspergillus flavus e/o Aspergillus parasiticus.
  3. 3. Composizione comprendente il ceppo atossigeno di Aspergillus flavus e/o suoi derivati secondo la rivendicazione 1 o 2 e uno o più diluenti e/o veicolanti.
  4. 4. Composizione secondo la rivendicazione 3, in cui detto ceppo e/o detti suoi derivati sono inoculati su una matrice.
  5. 5. Composizione secondo la rivendicazione 4, in cui detta matrice à ̈ una matrice naturale.
  6. 6. Composizione secondo la rivendicazione 5, in cui detta matrice naturale comprende materiale vegetale ottenuto da piante scelte nel gruppo comprendente sorgo, mais, soia e frumento.
  7. 7. Composizione secondo la rivendicazione 6, in cui detto materiale vegetale comprende semi di frumento e/o semi di sorgo
  8. 8. Uso del ceppo atossigeno di Aspergillus flavus e/o di suoi derivati secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 o 2 o della composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 3 a 7 come agenti di biocontrollo contro la contaminazione da aflatossine prodotte da ceppi tossigeni di Aspergillus flavus tossigeno e/o Aspergillus parasiticus.
  9. 9. Uso secondo la rivendicazione 8, in cui dette aflatossine comprendono B1, B2, G1, G2o loro miscele.
  10. 10. Uso secondo la rivendicazione 8 o 9, in cui detto biocontrollo à ̈ in agricoltura.
  11. 11. Uso secondo la rivendicazione 10, in cui detto biocontrollo in agricoltura comprende il biocontrollo delle colture di mais, di arachidi, pistacchio, noci, nocciole, mandorle, castagne e cotone.
  12. 12. Metodo per prevenire e/o ridurre e/o eliminare la contaminazione da aflatossine prodotte da ceppi tossigeni di Aspergillus flavus e/o Aspergillus parasiticus in colture in pieno campo e/o in ambienti controllati e/o fuori suolo comprendente almeno un passaggio di distribuzione in detta coltura del ceppo e/o suoi derivati secondo una delle rivendicazioni 1-2 o della composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 3-7.
  13. 13. Metodo secondo la rivendicazione 11, in cui dette aflatossine comprendono l’aflatossina B1, B2,G1, G2o loro miscele.
  14. 14. Metodo secondo la rivendicazione 12 o 13, in cui detta coltura à ̈ scelta nel gruppo comprendente coltura di mais, di arachidi, pistacchio, noci, nocciole, mandorle, castagne e cotone.
  15. 15. Matrice inoculata con il atossigeno di Aspergillus flavus e/o di suoi derivati secondo la rivendicazione 1 o 2.
  16. 16. Matrice secondo la rivendicazione 15, in cui detta matrice à ̈ una matrice naturale.
  17. 17. Matrice secondo la rivendicazione 16, in cui detta matrice à ̈ scelta tra materiale vegetale ottenuto da piante scelte nel gruppo sorgo, mais, soia, frumento.
  18. 18. Matrice secondo la rivendicazione 17, in cui detto materiale vegetale comprende semi di frumento e/o semi di sorgo.
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