CN103937685A - 一种不产黄曲霉毒素的黄曲霉混合菌株及其应用 - Google Patents
一种不产黄曲霉毒素的黄曲霉混合菌株及其应用 Download PDFInfo
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Landscapes
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Abstract
本发明公开了一种不产黄曲霉毒素的黄曲霉混合菌株。该混合菌株由黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-8和黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20混合而成；所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-8和所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号分别为CGMCC No.8964和CGMCC No.8966。实验证明，本发明所提供的混合菌株对产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株产毒有抑制作用，且当这两株菌混合在一起时，比单独使用时对产毒菌的抑制效果好，当不产毒菌AF-8、AF-20与产毒菌GD-1的孢子浓度比为5×104:5×104:1×105时，该不产毒混合菌株对产毒菌的抑制产毒率达到近100％。该菌株对于抑制产毒黄曲霉侵染农产品、降低农产品中黄曲霉毒素污染具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于农产品安全领域，涉及一种不产黄曲霉毒素的黄曲霉混合菌株，以及该菌株在抑制黄曲霉产毒方面的应用。
背景技术
黄曲霉毒素(Aflatoxins，AFT)属于真菌毒素，是由黄曲霉(Aspergillus.flavus)、寄生曲霉(A.parasiticus)、集蜂曲霉(A.nonius)和溜曲霉(A.tamarii)产生的具有致畸、致癌性、致突变的次级代谢产物。常常存在于土壤、动植物、各种坚果特别是花生和核桃中。现已分离出AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2等18种不同结构的黄曲霉毒素，其中最重要的是AFB1、AFB2、AFG1、AFG2。其中AFB1的毒性最强，其毒性为氰化钾的10倍、砒霜的68倍。具有强致癌性，并能引发家畜疾病，从而产生巨大的经济损失。1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织(World HealthOrganization，WHO)的癌症研究机构划定为第一类致癌物。黄曲霉毒素主要污染花生等作物，严重影响我国花生及其制品的出口，给我国的出口贸易带来了巨大损失。因此，有效防控黄曲霉毒素污染，对于保障我国食品安全和维护国家经济利益具有重要意义。
其中，利用不产毒黄曲霉或寄生曲霉来抑制产毒菌菌群数量及产毒量是防控黄曲霉毒素污染的重要手段。美国环境保护协会注册了两株不产毒的黄曲霉菌株，用于防治棉花和花生黄曲霉毒素污染，并在美国多个州的试验田中广泛试用。但是来自不同地区的不产毒菌株在抑制产毒菌方面有一定的适用范围，例如非洲筛选获得的不产毒菌能较好地抑制当地黄曲霉产毒，而美国筛选得到的菌株在抑制非洲产毒黄曲霉产毒方面就没有很好的效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种不产黄曲霉毒素的黄曲霉混合菌株，以及该菌株在抑制黄曲霉产毒方面的应用。
本发明所提供的不产黄曲霉毒素的黄曲霉混合菌株，具体由黄曲霉(Aspergillusflavus)AF-8和黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20混合而成；
所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-8，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.8964；
所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.8966。
在所述混合菌株中，所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-8CGMCC No.8964和所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCC No.8966的孢子数配比具体可为1:1。
另外，所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCC No.8966也属于本发明的保护范围。
所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-8CGMCC No.8964有大段基因缺失，缺失黄曲霉毒素合成基因aflT、黄曲霉毒素合成基因hypE、黄曲霉毒素合成基因nor-1、黄曲霉毒素合成基因hypD、黄曲霉毒素合成基因fas-2、黄曲霉毒素合成基因aflR、黄曲霉毒素合成基因norA、黄曲霉毒素合成基因ver-1、黄曲霉毒素合成基因hypB、黄曲霉毒素合成基因omtB、黄曲霉毒素合成基因omtA、黄曲霉毒素合成基因vbs、黄曲霉毒素合成基因hypA。因此，该菌株不能合成黄曲霉毒素。
所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCC No.8966有大段基因缺失，缺失黄曲霉毒素合成基因aflT、黄曲霉毒素合成基因pksA、黄曲霉毒素合成基因nor-1、黄曲霉毒素合成基因fas-2、黄曲霉毒素合成基因fas-1、黄曲霉毒素合成基因aflR、黄曲霉毒素合成基因aflJ、黄曲霉毒素合成基因adhA、黄曲霉毒素合成基因estA、黄曲霉毒素合成基因norA、黄曲霉毒素合成基因ver-1、黄曲霉毒素合成基因verA；因此，该菌株不能合成黄曲霉毒素。
所述的混合菌株，或所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCC No.8966，在抑制产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了一种用于抑制产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒的菌剂。
本发明所提供的用于抑制产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒的菌剂，它的活性成分具体可为所述混合菌株，或所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCC No.8966。
在上述应用或菌剂中，各黄曲霉(Aspergillus flavus)均可为分生孢子或/和菌丝体。
在上述应用或菌剂中，所述抑制产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒体现在：使所述产黄曲霉毒素的黄曲霉的产毒素量降低，具体如使所述产黄曲霉毒素的黄曲霉在农产品中的产毒量降低。
所述农产品可为谷物、油料作物、坚果、香辛料、饲料原料、中草药和水果等。在本发明的一个实施例中，所述农产品为花生，具体为含水量25％(质量百分含量)的花生。在本发明的另一个实施例中，所述农产品为玉米，具体为含水量25％(质量百分含量)的玉米。
在所述混合菌株抑制所述产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒的过程中，所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-8CGMCC No.8964、所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCC No.8966和所述产黄曲霉毒素的黄曲霉的孢子个数比为1:1:2。
具体的，在本发明中，在抑制所述产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒的过程中，所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-8CGMCC No.8964的孢子、所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCC No.8966的孢子、所述产黄曲霉毒素的黄曲霉的孢子和所述花生的配比为5×104个孢子：5×104个孢子：1×105个孢子：10g花生(或玉米)。另外，在抑制所述产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒的过程中，培养条件为30℃，培养14天。
在所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCC No.8966抑制所述产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒的过程中，所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCC No.8966和所述产黄曲霉毒素的黄曲霉的孢子个数比为1:1。
具体的，在本发明中，在抑制所述产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒的过程中，所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCC No.8966的孢子、所述产黄曲霉毒素的黄曲霉的孢子和所述花生的配比为1×105个孢子：1×105个孢子：10g花生(或玉米)。另外，在抑制所述产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒的过程中，培养条件为30℃，培养14天。
在上述应用或菌剂中，所述产黄曲霉毒素的黄曲霉具体可为黄曲霉(Aspergillusflavus)GD-1。
在上述应用或菌剂中，所述不产黄曲霉毒素具体为至少不产黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2。
以上所有的所述产毒中的“毒”均指“黄曲霉毒素”，进一步为“黄曲霉毒素B1”和/或“黄曲霉毒素B2”。
所述混合菌株，或所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCC No.8966，在制备所述菌剂中的应用也属于本发明的保护范围。
所述混合菌株，或所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCC No.8966，在生产分生孢子或/和菌丝体中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的所述混合菌株，或所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCCNo.8966的菌落形态与普通黄曲霉相似，但不合成黄曲霉毒素；其不产毒素的机制是：AF-8缺失13个黄曲霉毒素生物合成路径上的基因，AF-20缺失12个黄曲霉毒素生物合成路径上的基因。
实验证明，本发明所提供的由所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-8CGMCC No.8964和所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCC No.8966组成的混合菌株对产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株产毒有抑制作用，且当这两株菌混合在一起时，比单独使用时对产毒菌的抑制效果好，当不产毒菌AF-8、AF-20与产毒菌GD-1的孢子浓度比为5×104:5×104:1×105时，该不产毒混合菌株对产毒菌的抑制产毒率达到近100％。该菌株对于抑制产毒黄曲霉侵染农产品、降低农产品中黄曲霉毒素污染具有重要意义。
保藏说明
菌种名称：黄曲霉
拉丁名：(Aspergillus flavus)
菌株编号：AF-8
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2014年3月25日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.8964
菌种名称：黄曲霉
拉丁名：(Aspergillus flavus)
菌株编号：AF-20
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2014年3月25日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.8966
菌种名称：黄曲霉
拉丁名：(Aspergillus flavus)
菌株编号：GZ-17
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2013年8月21日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.8050
附图说明
图1为黄曲霉毒素混合标准品的HPLC图谱。其中，1为黄曲霉毒素标准品中AFG2，保留时间为8.914min；2为黄曲霉毒素标准品中AFG1，保留时间为10.092min；3为黄曲霉毒素标准品中AFB2，保留时间为11.879min；4为黄曲霉毒素标准品中AFB1，保留时间为13.713min。
图2为菌株AF-8的HPLC图谱。
图3为菌株AF-20的HPLC图谱。
图4为黄曲霉菌株AF-8和AF-20毒素合成基因缺失示意图。空心圆对应的基因表示缺失；实心圆对应的基因表示不缺失。
图5为单独产黄曲霉毒素的黄曲霉菌GD-1在花生培养基上的HPLC图谱。其中，1和2为目的洗脱峰。
图6为单独产黄曲霉毒素的黄曲霉菌GD-1在玉米培养基上的HPLC图谱。其中，1和2为目的洗脱峰。
图7为AF-8:AF-20:GD-1(5×104:5×104:1×105)在花生培养基上的HPLC图谱。其中，1为目的洗脱峰。
图8为AF-8:AF-20:GD-1(5×104:5×104:1×105)在玉米培养基上的HPLC图谱。无目的洗脱峰。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
产黄曲霉毒素的黄曲霉菌GD-1：记载于“张初署.中国四个生态区花生土壤中黄曲霉菌分布,产毒特征及遗传多样性研究[D].中国农业科学院,2013.”一文。
黄曲霉毒素B1(A6636)、B2(A9887)、G1(A0138)、G2(A0263)购于Sigma公司。
实施例1、黄曲霉菌株AF-8和AF-20的采集、分离、鉴定
一、从花生种植土壤中分离黄曲霉菌株AF-8和AF-20
AF-8和AF-20分别从湖北省和山东省花生种植土壤中用DG18培养基分离黄曲霉菌株。具体操作如下：
1、土壤样品菌悬液的制备
取10g土样，加入90mL0.1％蛋白胨无菌水(w/v)，在室温震荡30min，制成10-1菌悬液；再取0.5mL10-1菌悬液加4.5mL0.1％蛋白胨无菌水，制备出10-2稀释度的菌悬液；按上述方法制备10-3稀释度的菌悬液。
2、菌株的分离与纯化
每个稀释度取0.1mL菌液，涂布在DG18培养基(配方：酪蛋白胨5.0g，无水葡萄糖10.0g，磷酸二氢钾1.0g，硫酸镁0.5g，氯硝胺0.002g，琼脂15.0g，氯霉素0.1g，用蒸馏水1000mL溶解，再加入200.0g的甘油，混匀，121℃灭菌。)上，30℃黑暗培养5d，每个稀释度重复3次。挑取长有黄色孢子的菌株在DG18培养基上进行二次划线分离，直至得到单个菌落。挑取单个菌落于MEA斜面试管培养基(配方：每升培养基中含有麦芽浸粉30.0g，大豆蛋白胨3.0g，琼脂15.0g；pH5.8)上，于30℃培养3d后保存于4℃中。将其中两株菌记为AF-8和AF-20。
二、菌株AF-8和AF-20的鉴定
1、形态学鉴定
挑取保存于MEA培养基上的菌株AF-8和AF-20于AFPA培养基(配方：蛋白胨10.0g/L，酵母浸粉20.0g/L，柠檬酸铁铵0.5g/L，氯硝铵0.002g/L，氯霉素0.1g/L，琼脂15.0g/L，pH为6.3)上，30℃培养3-5d，可见AFPA培养基背面为亮橘色。
2、分子鉴定
通过真菌钙调基因序列对菌株AF-8和AF-20进行分子鉴定(Rodrigues,P.,Santos,C.,Venancio,A.,Lima,N.,2011.Species identification of Aspergillus section Flavi isolatesfrom Portuguese almonds using phenotypic,including MALDI-TOF ICMS,and molecularapproaches.J Appl Microbiol111,877-892)。黄曲霉基因组钙调蛋白PCR扩增所用的引物为CL1和CL2A(序列如下)。PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；72℃最后延伸7min。扩增后，产物保存于4℃。产物送至上海生工生物工程有限公司测序。并在BLASTresearches上比对测序结果(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
CL1：5’-GARTWCAAGGAGGCCTTCTC-3’；
CL2A：5’-TTTTTGCATCATGAGTTGGAC-3’。
菌株AF-8和AF-20的PCR扩增产物的测序结果分别如序列表中序列1和序列2所示。将菌株AF-8和AF-20的钙调蛋白基因的测序结果提交上NCBI上进行比对，发现，序列1和序列2与黄曲霉菌NRRL3357和NRRL21882的同源性均为99％。
经过以上形态学鉴定和分子鉴定，可知菌株AF-8和AF-20为黄曲霉(Aspergillusflavus)。
3、利用高效液相色谱法检测菌株AF-8和AF-20是否产黄曲霉毒素
(1)待测样品制备
将黄曲霉菌株AF-8和AF-20分别接种到YES培养基(配方：20g酵母提取物/L，150g蔗糖/L，15g琼脂/L)上，30℃黑暗条件下培养7天。从培养好的平板上挑取3块琼脂放入4ml的离心管中，加入1ml的甲醇，用高振荡器高速震荡60min，然后用灭过菌的滤纸进行过滤，用蒸流水将滤液进行稀释后，再用微纤维滤纸过滤；取10mL滤液加入到免疫亲和柱(华安麦科，HCM0125)中(使黄曲霉毒素挂到柱子上，从而有效去除杂质)，使液体以2-3ml/min的速度流出；待液体排干后，用蒸馏水或去离子水洗涤2次，每次10mL，流速3-4ml/min；待液体排干后，上样1mL甲醇(色谱级)，用样品瓶接洗脱液，流速1ml/min；洗脱后液体将用0.45μm的滤膜过滤，滤液利用HPLC测定黄曲霉毒素的含量。
(2)高效液相色谱法检测待测样品
取Sigma公司的黄曲霉毒素B1(A6636)、B2(A9887)、G1(A0138)、G2(A0263)，自行配制黄曲霉混合标准品，用色谱级甲醇配制成溶液，使其中黄曲霉毒素B1的终浓度为10ng/μl、黄曲霉毒素B2的终浓度为5ng/μl、黄曲霉毒素G1的终浓度为10ng/μl、黄曲霉毒素G2的终浓度为5ng/μl。再取步骤(1)制备的待测样品，分别按照如下条件进行高效液相色谱检测。看待测样品的色谱图在与黄曲霉毒素标准品相同的保留时间处是否有色谱峰出现。
其中，高效液相色谱条件为：C18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；荧光检测器2475型，激发波长360nm，发射波长：440nm；柱温：30℃；流动相：以甲醇：水(1:1,V:V)为流动相；进样量：20μL；流速：1.0mL/min。
黄曲霉毒素混合标准品的HPLC图谱如图1所示，从图1中可以看出，黄曲霉毒素标准品中AFB1的保留时间为13.713min，AFB2的保留时间为11.879min，AFG1的保留时间为10.092min，AFG2的保留时间为8.914min。
菌株AF-8的HPLC图谱如图2所示，从图2中可以看出，在与黄曲霉毒素标准品对应的以上四个保留时间处均没有色谱峰产生。由此可见，菌株AF-8不产黄曲霉毒素。
菌株AF-20的HPLC图谱如图3所示，从图3中可以看出，在与黄曲霉毒素标准品对应的以上四个保留时间处均没有色谱峰产生。由此可见，菌株AF-20不产黄曲霉毒素。
通过以上鉴定结果，确定步骤二所得的菌株AF-8和AF-20为不产生黄曲霉毒素的黄曲霉(Aspergillus flavus)。并对菌株AF-8和AF-20分别进行了保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏日期为：2014年3年25日，菌株AF-8的保藏号：CGMCC NO.8964；菌株AF-20的保藏号：CGMCC NO.8966。
实施例2、黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-8和AF-20中黄曲霉毒素合成基因缺失鉴定
本发明的发明人以Genbank登录号为AY510451黄曲霉的毒素合成基因的序列为参照，设计了毒素合成相关基因hypB、hypC、hypD和hypE四对引物，其他基因的引物参考Perng-Kuang Chang(Chang,P.K.,Horn,B.W.and Dorner,J.W.(2005)Sequencebreakpoints in the aflatoxin biosynthesis gene cluster and flanking regions innonaflatoxigenic Aspergillus flavus isolates.Fungal Genet Bio42,914–923.)。待测的29个基因及其对应的引物序列如表1所示。
表1不同黄曲霉毒素合成基因的引物序列
分别提取黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-8CGMCC NO.8964和黄曲霉(Aspergillusflavus)AF-20CGMCC NO.8966的基因组DNA，以其为模板，分别用表1中的各引物对进行常规PCR反应，每个反应均设置产黄曲霉毒素的黄曲霉菌GD-1的基因组DNA对照和阴性对照(以无菌水作为模板)。
PCR反应体系：1μL DNA模板，上下游引物(10μM)各1μL，Gotag(Gotag colorlessmaster mix，Promega公司，M7133)10μL，无菌水补足至20μL。
反应条件：95℃预变性2min，94℃变性30s，各组引物55℃退火30s，72℃延伸1min30s，进行30个循环，最后72℃延伸7min。
PCR产物用1.0％的琼脂糖凝胶在1×TAE缓冲液中电泳后，用凝胶成像系统进行拍照。
结果显示，通过表1中各组引物的多次PCR验证，实施例1所得的黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-8CGMCC NO.8964缺失黄曲霉毒素合成基因aflT、黄曲霉毒素合成基因hypE、黄曲霉毒素合成基因nor-1、黄曲霉毒素合成基因hypD、黄曲霉毒素合成基因fas-2、黄曲霉毒素合成基因aflR、黄曲霉毒素合成基因norA、黄曲霉毒素合成基因ver-1、黄曲霉毒素合成基因hypB、黄曲霉毒素合成基因omtB、黄曲霉毒素合成基因omtA、黄曲霉毒素合成基因vbs、黄曲霉毒素合成基因hypA。因此，该菌株不能合成黄曲霉毒素。
黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCC NO.8966缺失黄曲霉毒素合成基因aflT、黄曲霉毒素合成基因pksA、黄曲霉毒素合成基因nor-1、黄曲霉毒素合成基因fas-2、黄曲霉毒素合成基因fas-1、黄曲霉毒素合成基因aflR、黄曲霉毒素合成基因aflJ、黄曲霉毒素合成基因adhA、黄曲霉毒素合成基因estA、黄曲霉毒素合成基因norA、黄曲霉毒素合成基因ver-1、黄曲霉毒素合成基因verA；因此，该菌株不能合成黄曲霉毒素。该菌株与以前专利报道的不产毒黄曲霉菌株A051(申请号：200810120929.2，授权公告号：CN101363006B)的基因缺失类型不同。黄曲霉菌株AF-8和AF-20毒素合成基因缺失示意图如图4所示。
实施例3、黄曲霉(Aspergillus flavus)混合菌株“AF-8+AF-20”在花生中对产黄曲霉毒素的黄曲霉菌的抑制作用
一、实验方法
(1)花生的准备
挑选完整的没有破损的花生颗粒，然后分别称取10g大小均匀的花生，用75％酒精进行表面消毒2min，用无菌滤纸吸干后放入到灭过菌的150ml的三角瓶内；将样品中的水分含量调整到25％(质量百分含量)，瓶子用生物用安全膜密封，在恒温恒湿箱中黑暗条件下30℃下培养7天，观察表面消毒的效果。结果显示，花生表面没有任何杂菌的生长，将用此方法用于后续试验中样品的表面消毒。
(2)菌悬液的制备
将不产毒黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-8CGMCC NO.8964、不产毒黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCC NO.8966，以及产毒黄曲霉GD-1的菌种分别接种于MEA斜面试管培养基上，28℃培养5天，然后用棉签蘸取培养基上的孢子于无菌水中，利用涡旋振荡器震荡均匀，然后用血球计数板调整孢子浓度，配制如下五种菌悬液：
菌悬液1：每mL菌悬液中含有5×104个不产毒黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-8CGMCC NO.8964的孢子、5×104个不产毒黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCCNO.8966的孢子，以及1×105个产毒黄曲霉GD-1的孢子。
菌悬液2：每mL菌悬液中含有1×105个不产毒黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-8CGMCC NO.8964的孢子，以及1×105个产毒黄曲霉GD-1的孢子。
菌悬液3：每mL菌悬液中含有1×105个不产毒黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCC NO.8966的孢子，以及1×105个产毒黄曲霉GD-1的孢子。
菌悬液4：每mL菌悬液中仅含有1×105个产毒黄曲霉GD-1的孢子。
菌悬液5：每mL菌悬液中含有5×104个不产毒黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-8CGMCC NO.8964的孢子、5×104个不产毒黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCCNO.8966的孢子。
(3)竞争培养
挑选完整的没有破损的花生颗粒，然后分别称取10g大小均匀的花生，用75％酒精进行表面消毒2min用无菌滤纸吸干后放入到灭过菌的150ml的三角瓶内，向三角瓶中加入1ml现配制的不产毒菌和产毒菌(105:105)孢子菌悬液作为实验组，共得到3个实验组，分别对应菌悬液1、菌悬液2和菌悬液3。实验同时设置向三角瓶中加入1ml现配制的产毒菌(105)的孢子菌悬液(对应菌悬液4)作为阳性对照组；以及向三角瓶中加入1ml现配制的不产毒菌(105)的孢子菌悬液(对应菌悬液5)作为阴性对照组。温育后花生样品的水分含量为25％。每个处理做三个平行，30℃，黑暗条件下培养14天。
(4)黄曲霉毒素含量测定
将培养好的花生样品放入高压灭菌锅里121℃，30min下进行灭菌(使黄曲霉失活)；将灭完菌的花生放入高速万能粉碎机中捣碎，然后并向三角瓶中加入50ml80％(体积分数)的甲醇溶液(溶剂为水)，用振荡器高速震荡30min，然后用灭过菌的滤纸进行过滤，用蒸流水将滤液进行稀释后，再用微纤维滤纸过滤；取10mL滤液加入到免疫亲和柱(华安麦科，HCM0125)中(使黄曲霉毒素挂到柱子上，从而有效去除杂质)，使液体以2-3ml/min的速度流出；待液体排干后，用蒸馏水或去离子水洗涤2次，每次10mL，流速3-4ml/min；待液体排干后，上样1mL甲醇(色谱级)，用样品瓶接洗脱液，流速1ml/min；洗脱后液体将用0.45μm的滤膜过滤，滤液利用HPLC测定黄曲霉毒素的含量。
其中，高效液相色谱条件同实施例1步骤二3(2)中所述。
取Sigma公司的黄曲霉毒素B1(A6636)、B2(A9887)、G1(A0138)、G2(A0263)，自行配制黄曲霉混合标准品，用色谱级甲醇配制成各黄曲霉毒均具有不同已知浓度的系列溶液。按照如上条件进行高效液相色谱检测。以特定种类的黄曲霉毒素的峰面积(Y)对相应种类的黄曲霉毒素的进样量(X，ng/μl)进行回归计算，得到标准曲线方程。
将各处理组中与特定种类的黄曲霉毒素标准品保留时间相同的的色谱峰的峰面积代入相应的标准曲线方程中，计算得到待测样品中相应种类的黄曲霉毒素的含量。
二、实验结果
1、各处理组的HPLC图谱
单独产黄曲霉毒素的黄曲霉菌GD-1在花生培养基上的HPLC图谱如图5所示。可见，与黄曲霉毒素混合标准品的HPLC图谱(图1)相比，产毒菌GD-1所产毒主要为黄曲霉毒素B1(图5中峰1)和黄曲霉毒素B2(图5中峰2)，基本上不产黄曲霉毒素G1和G2。
AF-8:AF-20:GD-1(5×104:5×104:1×105)的在花生培养基上HPLC图谱如图7所示。与图5所示的单独黄曲霉菌GD-1的HPLC图谱相比，仅有黄曲霉毒素B1的洗脱峰(图7中峰1)，无其他三种黄曲霉毒素的洗脱峰；且黄曲霉毒素B1的洗脱峰的峰高和峰面积远小于图5中的峰1。
另外，阴性对照组(不产毒混合菌“AF-8+AF-20”，无产毒菌GD-1)的HPLC图谱显示，无黄曲霉毒素色谱峰。
2、各处理组产毒抑制率的计算
将步骤1中各HPLC图谱中的峰1的峰面积代入黄曲霉毒素B1的标准曲线方程，计算得到待测样品中黄曲霉毒素B1的含量；将步骤1中各HPLC图谱中的峰2的峰面积代人黄曲霉毒素B2的标准曲线方程，计算得到待测样品中黄曲霉毒素B2的含量。两种黄曲霉毒素含量的加和即视为待测样品中黄曲霉毒素的总含量。进而计算各处理组的产毒量、抑制产毒量及抑制产毒率。
结果显示，在P<0.05水平下，不产毒混合菌“AF-8+AF-20”对产毒菌GD-1的抑制效果明显高于不产毒菌单独使用时对产毒菌GD-1产毒的抑制效果。当不产毒混合菌“AF-8+AF-20”与产毒菌GD-1的孢子浓度比为(5×104:5×104:1×105)时，该不产毒混合菌“AF-8+AF-20”对产毒菌GD-1的抑制产毒率达到99.99％，具体结果如表2所示(阴性对照组不产毒)。而当两株不产毒菌单独对产毒菌GD-1进行抑制时，不产毒菌对产毒菌GD-1的抑制效果也达到95％以上。当不产毒菌AF-8和产毒菌GD-1孢子浓度比为105:105时，该不产毒菌AF-8对产毒菌GD-1的抑制产毒率近97.76％；当不产毒菌AF-20和产毒菌GD-1孢子浓度比为105:105时，该不产毒菌AF-20对产毒菌GD-1的抑制产毒率达到95.61％。从表2可以看出不产毒混合菌“AF-8+AF-20”比单菌对产毒菌GD-1的产毒抑制效果好(P<0.05)，几乎完全抑制了产毒菌GD-1的产毒。而且该不产毒混合菌“AF-8+AF-20”对产毒菌GD-1产毒的抑制效果也明显高于已申请专利201310445854.6中GZ-17菌株对产毒菌GD-1产毒的抑制效果。综上所述，该不产毒混合菌“AF-8+AF-20”在花生培养基上对产毒菌GD-1产毒有很明显的抑制效果。
表2不产毒混合菌“AF-8+AF-20”在花生中对产毒菌GD-1产毒的抑制比较
注：“μg/g”表示“黄曲霉毒素μg/g花生”。“抑制产毒率”一列中，数据后不同的小写字母表示彼此之间的差异在P<0.05水平上差异显著。
实施例4、黄曲霉(Aspergillus flavus)混合菌株“AF-8+AF-20”在玉米中对产黄曲霉毒素的黄曲霉菌的抑制作用
一、实验方法
(1)玉米的准备
挑选完整的没有破损的花生颗粒，然后分别称取10g大小均匀的玉米，用75％酒精进行表面消毒2min，用无菌水冲洗三遍，然后用无菌滤纸吸干后放入到灭过菌的150ml的三角瓶内；将样品中的水分含量调整到25％(质量百分含量)，瓶子用生物用安全膜密封，在恒温恒湿箱中黑暗条件下30℃下培养7天，观察表面消毒的效果。结果显示，玉米表面没有任何杂菌的生长，将用此方法用于后续试验中样品的表面消毒。
(2)菌悬液的制备
将不产毒黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-8CGMCC NO.8964、不产毒黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCC NO.8966、不产毒黄曲霉(Aspergillus flavus)GZ-17CGMCC NO.8050(已申请专利201310445854.6)，以及产毒黄曲霉GD-1的菌种分别接种于MEA斜面试管培养基上，28℃培养5天，然后用棉签蘸取培养基上的孢子于无菌水中，利用涡旋振荡器震荡均匀，然后用血球计数板调整孢子浓度，配制如下六种菌悬液：
菌悬液1：每mL菌悬液中含有5×104个不产毒黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-8CGMCC NO.8964的孢子、5×104个不产毒黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCCNO.8966的孢子，以及1×105个产毒黄曲霉GD-1的孢子。
菌悬液2：每mL菌悬液中含有1×105个不产毒黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-8CGMCC NO.8964的孢子，以及1×105个产毒黄曲霉GD-1的孢子。
菌悬液3：每mL菌悬液中含有1×105个不产毒黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCC NO.8966的孢子，以及1×105个产毒黄曲霉GD-1的孢子。
菌悬液4：每mL菌悬液中仅含有1×105个产毒黄曲霉GD-1的孢子。
菌悬液5：每mL菌悬液中含有5×104个不产毒黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-8CGMCC NO.8964的孢子、5×104个不产毒黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCCNO.8966的孢子。
菌悬液6：每mL菌悬液中含有1×105个不产毒黄曲霉(Aspergillus flavus)GZ-17CGMCC NO.8050的孢子，以及1×105个产毒黄曲霉GD-1的孢子。
3)竞争培养
挑选完整的没有破损的玉米颗粒，然后分别称取10g大小均匀的玉米，用75％酒精进行表面消毒2min用无菌滤纸吸干后放入到灭过菌的150ml的三角瓶内，向三角瓶中加入1ml现配制的不产毒菌和产毒菌(105:105)孢子菌悬液作为实验组，共得到3个实验组，分别对应菌悬液1、菌悬液2和菌悬液3。实验同时设置向三角瓶中加入1ml现配制的产毒菌(105)的孢子菌悬液(对应菌悬液4)作为阳性对照组；向三角瓶中加入1ml现配制的不产毒菌(105)的孢子菌悬液(对应菌悬液5)作为阴性对照组；以及向三角瓶中加入1ml现配制的不产毒菌(105)的孢子菌悬液(对应菌悬液6)作为现有不产毒菌株对照组。温育后玉米样品的水分含量为25％。每个处理做三个平行，30℃，黑暗条件下培养14天。
(4)黄曲霉毒素含量测定
将培养好的玉米样品放入高压灭菌锅里121℃，30min下进行灭菌(使黄曲霉失活)；将灭完菌的玉米放入高速万能粉碎机中捣碎，然后并向三角瓶中加入50ml80％(体积分数)的甲醇溶液(溶剂为水)，用振荡器高速震荡30min，然后用灭过菌的滤纸进行过滤，用蒸流水将滤液进行稀释后，再用微纤维滤纸过滤；取10mL滤液加入到免疫亲和柱(华安麦科，HCM0125)中(使黄曲霉毒素挂到柱子上，从而有效去除杂质)，使液体以2-3ml/min的速度流出；待液体排干后，用蒸馏水或去离子水洗涤2次，每次10mL，流速3-4ml/min；待液体排干后，上样1mL甲醇(色谱级)，用样品瓶接洗脱液，流速1ml/min；洗脱后液体将用0.45μm的滤膜过滤，滤液利用HPLC测定黄曲霉毒素的含量。
其中，高效液相色谱条件同实施例1步骤二3(2)中所述。
取Sigma公司的黄曲霉毒素B1(A6636)、B2(A9887)、G1(A0138)、G2(A0263)，自行配制黄曲霉混合标准品，用色谱级甲醇配制成各黄曲霉毒均具有不同已知浓度的系列溶液。用色谱级甲醇配制成系列已知浓度的溶液，按照如上条件进行高效液相色谱检测。以特定种类的黄曲霉毒素的峰面积(Y)对相应种类的黄曲霉毒素的进样量(X，ng/μl)进行回归计算，得到标准曲线方程。
将各处理组中与特定种类的黄曲霉毒素标准品保留时间相同的的色谱峰的峰面积代入相应的标准曲线方程中，计算得到待测样品中相应种类的黄曲霉毒素的含量。
二、实验结果
1、各处理组的HPLC图谱
单独产黄曲霉毒素的黄曲霉菌GD-1在玉米培养基上的HPLC图谱如图6所示。可见，与黄曲霉毒素混合标准品的HPLC图谱(图1)相比，产毒菌GD-1所产毒主要为黄曲霉毒素B1(图6中峰1)和黄曲霉毒素B2(图6中峰2)，基本上不产黄曲霉毒素G1和G2。
AF-8:AF-20:GD-1(5×104:5×104:1×105)的HPLC图谱如图8所示。图中无任何一种黄曲霉毒素的洗脱峰。
另外，阴性对照组(不产毒混合菌“AF-8+AF-20”，无产毒菌GD-1)的HPLC图谱显示，无黄曲霉毒素色谱峰。
2、各处理组产毒抑制率的计算
将步骤1中各HPLC图谱中的峰1的峰面积代入黄曲霉毒素B1的标准曲线方程，计算得到待测样品中黄曲霉毒素B1的含量；将步骤1中各HPLC图谱中的峰2的峰面积代人黄曲霉毒素B2的标准曲线方程，计算得到待测样品中黄曲霉毒素B2的含量。两种黄曲霉毒素含量的加和即视为待测样品中黄曲霉毒素的总含量。进而计算各处理组的产毒量、抑制产毒量及抑制产毒率。
结果显示，在P<0.05水平下，不产毒混合菌“AF-8+AF-20”对产毒菌GD-1的抑制效果明显高于不产毒菌单独使用时对产毒菌GD-1产毒的抑制效果。当不产毒混合菌“AF-8+AF-20”与产毒菌GD-1的孢子浓度比为(5×104:5×104:1×105)时，该不产毒混合菌“AF-8+AF-20”对产毒菌GD-1的抑制产毒率达到100％，具体结果如表3所示(阴性对照不产毒)。而当两株不产毒菌单独对产毒菌GD-1进行抑制时，不产毒菌对产毒菌GD-1的抑制效果也达到96.82％以上。当不产毒菌AF-8和产毒菌GD-1孢子浓度比为105:105时，该不产毒菌AF-8对产毒菌GD-1的抑制产毒率近99.62％；当不产毒菌AF-20和产毒菌GD-1孢子浓度比为105:105时，该不产毒菌AF-20对产毒菌GD-1的抑制产毒率达到96.82％。从表3可以看出不产毒混合菌“AF-8+AF-20”比单菌对产毒菌的产毒抑制效果好(P<0.05)，几乎完全抑制了产毒菌的产毒。而且该不产毒混合菌“AF-8+AF-20”对产毒菌GD-1产毒的抑制效果也明显高于已申请专利201310445854.6中GZ-17对产毒菌GD-1产毒的抑制效果。综上所述，该混合不产毒菌在玉米培养基上对产毒菌GD-1产毒有很明显的抑制效果。
表3不产毒混合菌“AF-8+AF-20”在玉米中对GD-1产毒的抑制比较
注：“μg/g”表示“黄曲霉毒素μg/g玉米”“抑制产毒率”一列中，数据后不同的小写字母表示彼此之间的差异在P<0.05水平上差异显著。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形，如在各种农产品种植、收获、储藏、加工等过程中施用。本领域以上所有的变形也属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种不产黄曲霉毒素的黄曲霉混合菌株，由黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-8和黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20混合而成；
所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-8，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.8964；
所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.8966。
2.根据权利要求1所述的混合菌株，其特征在于：所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-8CGMCC No.8964和所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCC No.8966的孢子数配比为1:1。
3.黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.8966。
4.权利要求1或2所述的混合菌株，或权利要求3所述的黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20，在抑制产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒中的应用。
5.一种用于抑制产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒的菌剂，它的活性成分为权利要求1或2所述的混合菌株，或权利要求3所述的黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20。
6.根据权利要求4所述的应用，或权利要求5所述的菌剂，其特征在于：所述抑制产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒体现在：使所述产黄曲霉毒素的黄曲霉的产毒量降低。
7.根据权利要求4或6所述的应用，其特征在于：在所述混合菌株抑制所述产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒的过程中，所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-8CGMCC No.8964、所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCC No.8966和所述产黄曲霉毒素的黄曲霉的孢子个数比为1:1:2；或
在所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCC No.8966抑制所述产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒的过程中，所述黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20CGMCC No.8966和所述产黄曲霉毒素的黄曲霉的孢子个数比为1:1。
8.根据权利要求4-7中任一所述的应用或菌剂，其特征在于：所述产黄曲霉毒素的黄曲霉为黄曲霉(Aspergillus flavus)GD-1。
9.权利要求1或2所述的混合菌株，或权利要求3所述的黄曲霉(Aspergillus flavus)AF-20，在制备权利要求5、6和8中任一所述菌剂中的应用。
10.权利要求1或2所述的混合菌株，或权利要求3所述的黄曲霉(Aspergillusflavus)AF-20，在生产分生孢子或/和菌丝体中的应用。
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