CN106434836A - 快速高效鉴定产黄曲霉毒素菌株的方法 - Google Patents

快速高效鉴定产黄曲霉毒素菌株的方法 Download PDF

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陈铭学
牟仁祥
曹兆云
朱智伟
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曹珍珍
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
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Abstract

本发明涉及一种鉴定方法，尤其是一种快速高效鉴定产黄曲霉毒素菌株的方法。样品中的黄曲霉菌和寄生曲霉菌在梯度稀释筛选时，直接涂布在选择性曲霉素琼脂基础(AFPA)培养基上，根据黄曲霉菌和寄生曲霉菌在APFA培养基上呈亮橘色的特性，能够在一次分离培养的基础上将黄曲霉菌和寄生曲霉菌与其它真菌进行分离，再进行荧光鉴定其种类和含量。采用上述方法进行鉴定，工序简单、鉴定快速，专一性很强。

Description

快速高效鉴定产黄曲霉毒素菌株的方法
技术领域
本发明涉及一种鉴定方法，尤其是一种快速高效鉴定产黄曲霉毒素菌株的方法。
背景技术
黄曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)主要是由黄曲霉、寄生曲霉产生的次级代谢产物，具有强烈的毒性和致癌性，是迄今发现的污染农产品毒性最强的一类生物毒素。当粮食未能及时晒干及储藏不当时，往往容易被黄曲霉或寄生曲霉污染而产生此类毒素。同时，它们存在于土壤、动植物、各种坚果中，特别是容易污染稻米、花生、玉米、大豆、小麦等粮油产品，是霉菌毒素中毒性最大、对人类健康危害极为突出的一类霉菌毒素。1993年，黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为1类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡。在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1最为多见，其毒性和致癌性也最强，其毒性为氰化钾的10倍、砒霜的68倍，国家质检总局规定黄曲霉毒素B1是大部分食品的必检项目之一。当人摄入量大时，可发生急性中毒，出现急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。当微量持续摄入，可造成慢性中毒，生长障碍，引起纤维性病变，致使纤维组织增生。AFT的致癌力也居首位，是目前已知最强致癌物之一，已经受到全世界范围的关注。
黄曲霉毒素污染问题非常严重，而且能够带来巨大的经济损失，并且能对人、畜和禽类的健康造成严重危害。国内外科研工作者的焦点主要集中在黄曲霉毒素产生机理、预防控制技术及黄曲霉毒素的高效高灵敏检测方面，并做了大量的研究工作，但并没有真正从菌株产毒这一头上进行有效防控，但是，目前黄曲霉毒素产生菌的分离方法操作繁琐、工作量大、耗时、分离效率不高，而且复杂基质如土壤中分离产毒菌株困难也较大。而且，常用的方法是先培养黄曲霉菌株，然后再提取毒素，最后对毒素含量进行检测，非常费时费力。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种操作简捷、专一性强、鉴定速度快的快速高效鉴定产黄曲霉毒素菌株的方法。
本发明解决技术问题的技术方案为：一种快速高效鉴定产黄曲霉毒素菌株的方法，其方法如下：选出20个黄曲霉毒素含量较高的稻谷样品，分别取5g样品，加入45ml无菌水中，120r/min，28℃恒温摇床2h。然后取1ml加到9ml无菌水中，逐级进行梯度稀释；将采集的土样室温下自然晾干，然后在灭菌的研钵中研磨至细粉状，准确称取5g土样，加入45ml无菌水中，120r/min，28℃恒温摇床2h。然后取1ml加到9ml无菌水中，逐级进行梯度稀释；将上述菌液100μl均匀涂布在含0.1g/L氯霉素的无菌AFPA平板上，28℃静置培养4-7天，AFPA平板上呈亮橘色的单菌落接种到含0.1g/L氯霉素的无菌PDA平板上，进行纯化培养，28℃恒温培养4-7天；将分离纯化到的菌株分别接种到无菌PDA斜面上，培养5-7天，置于黄曲霉毒素紫外线荧光检测器下观察荧光结果，按照荧光显示的强弱进行分离和排序。
本发明的进一步设置为：曲霉素琼脂基础(AFPA)(g/L)：蛋白胨10.0，酵母浸粉20.0，柠檬酸铁铵0.5，氯硝铵0.002，氯霉素0.1，琼脂15.0，pH：6.3±0.2，加热溶解于1000ml蒸馏水中，分装，121℃高压灭菌15分钟，再加入用细菌滤器过滤除菌的50g/L氯霉素溶液，使其终浓度为0.1g/L，摇匀后倒入无菌的培养皿(直径9cm)中冷却备用，若暂时不用，可置4℃冰箱冷藏保存；马铃薯葡萄糖培养基(PDA培养基)：马铃薯(去皮)200g、葡萄糖20g、琼脂15～20g、蒸馏水1000ml，121℃高压灭菌15分钟，再加入用细菌滤器过滤除菌的50g/L氯霉素溶液，使其终浓度为0.1g/L，摇匀后倒入无菌的培养皿(直径9cm)中冷却备用，若暂时不用，可置4℃冰箱冷藏保存。
本发明的进一步设置为：所述的分离排序，是将有蓝色荧光和绿色荧光的样品分离出来，根据其发光强度进行排序。
采用上述方法进行鉴定，工序简单、鉴定快速，专一性很强。
附图说明
图1为为本实施例中荧光检测鉴定的结果表。
具体实施方式
本发明一种快速高效鉴定产黄曲霉毒素菌株的方法，其方法如下：选出20个黄曲霉毒素含量较高的稻谷样品，分别取5g样品，加入45ml无菌水中，120r/min，28℃恒温摇床2h。然后取1ml加到9ml无菌水中，逐级进行梯度稀释；将采集的土样室温下自然晾干，然后在灭菌的研钵中研磨至细粉状，准确称取5g土样，加入45ml无菌水中，120r/min，28℃恒温摇床2h。然后取1ml加到9ml无菌水中，逐级进行梯度稀释；将上述菌液100μl均匀涂布在含0.1g/L氯霉素的无菌AFPA平板上，28℃静置培养4-7天，AFPA平板上呈亮橘色的单菌落接种到含0.1g/L氯霉素的无菌PDA平板上，进行纯化培养，28℃恒温培养4-7天；将分离纯化到的菌株分别接种到无菌PDA斜面上，培养5-7天，置于黄曲霉毒素紫外线荧光检测器下观察荧光结果，按照荧光显示的强弱进行分离和排序，曲霉素琼脂基础(AFPA)(g/L)：蛋白胨10.0，酵母浸粉20.0，柠檬酸铁铵0.5，氯硝铵0.002，氯霉素0.1，琼脂15.0，pH：6.3±0.2，加热溶解于1000ml蒸馏水中，分装，121℃高压灭菌15分钟，再加入用细菌滤器过滤除菌的50g/L氯霉素溶液，使其终浓度为0.1g/L，摇匀后倒入无菌的培养皿(直径9cm)中冷却备用，若暂时不用，可置4℃冰箱冷藏保存；马铃薯葡萄糖培养基(PDA培养基)：马铃薯(去皮)200g、葡萄糖20g、琼脂15～20g、蒸馏水1000ml，121℃高压灭菌15分钟，再加入用细菌滤器过滤除菌的50g/L氯霉素溶液，使其终浓度为0.1g/L，摇匀后倒入无菌的培养皿(直径9cm)中冷却备用，若暂时不用，可置4℃冰箱冷藏保存，所述的分离排序，是将有蓝色荧光和绿色荧光的样品分离出来，根据其发光强度进行排序。
本发明优点以及原理
有研究表明，寄生曲霉有3-6％的菌株不产生黄曲霉毒素，而黄曲霉有0-80％的菌株不产生黄曲霉毒素。寄生曲霉能产生B组和G组黄曲霉毒素，而黄曲霉只有部分菌株能产生黄曲霉毒素，且只能产生B组黄曲霉毒素。在紫外线下黄曲霉毒素B1和B2发蓝色荧光，黄曲霉毒素G1和G2发绿色荧光，采用这种机制进行最终的荧光分离和排序清楚明显，鉴定快速直接，针对性强。
以往的培养往往是将梯度稀释的菌液涂布在培养真菌常用的培养基平板上(如PDA培养基)，待所有真菌都长出后，经过多次分离纯化，获得所有生长的真菌菌株，然后在采用各种手段一一鉴定是否为黄曲霉菌和寄生曲霉菌，整个分离过程操作繁琐，工作量很大，耗时费力。本发明中，样品中的黄曲霉菌和寄生曲霉菌在梯度稀释筛选时，直接涂布在选择性曲霉素琼脂基础(AFPA)培养基上，根据黄曲霉菌和寄生曲霉菌在APFA培养基上呈亮橘色的特性，能够在一次分离培养的基础上将黄曲霉菌和寄生曲霉菌与其它真菌进行分离，一步到位，只需直接检测其为产毒或非产毒菌株即可，操作简便，省时高效，专一性强。
用于黄曲霉菌和寄生曲霉菌的分离培养的AFPA成分(g/L)：蛋白胨10.0，酵母浸粉20.0，柠檬酸铁铵0.5，氯硝铵0.002，氯霉素0.1，琼脂15.0，pH：6.3±0.2。加热溶解于1000ml蒸馏水中，分装，121℃高压灭菌15分钟，备用。其中：
(1)蛋白胨和酵母浸粉为微生物的生长提供必不可少的氮源和碳源。
(2)为避免其他生长较快的真菌对黄曲霉分离产生干扰，本发明的培养基中添加了适量的氯硝胺，氯硝胺能抑制除黄曲霉外大多数真菌的生长。
(3)筛选过程中，由于样品中存在大量细菌，其生长明显快于真菌，会影响黄曲霉及寄生曲霉的生长，培养基加入抗生素可有效抑制细菌的生长繁殖。
(4)由于抗生素均不耐高温，无法利用高温灭菌，需通过细菌滤器过滤除菌后再加入经高温灭菌的其他组分中。本专利采用的是无水乙醇配置的50g/L的氯霉素母液过滤除菌后加入到灭菌培养基中，终浓度为0.1g/L。
本发明中稻谷样品：从广西、湖北、湖南、江西和重庆的稻谷样品中共选出20个黄曲霉毒素含量较高的稻谷样品，分别取5g样品，加入45ml无菌水中，120r/min，28℃恒温摇床2h。然后取1ml加到9ml无菌水中，逐级进行梯度稀释。土壤样品：将采集的土样室温下自然晾干，然后在灭菌的研钵中研磨至细粉状，准确称取5g土样，加入45ml无菌水中，120r/min，28℃恒温摇床2h。然后取1ml加到9ml无菌水中，逐级进行梯度稀释，通过本发明的方法进行鉴定，得到结果如图1所示。
利用本发明中的AFPA培养基可以一步实现黄曲霉菌和寄生曲霉菌与其他真菌的分离，没有干扰，不会出现假阳性，分离专一性强，分离效率高；与常规分离方法相比(通用平板上会长出各种各样的真菌和细菌)，一步分离大大减少了分离菌株的工作量，省时高效。
本发明通过一次检测就能够区别分离到的黄曲霉菌和寄生曲霉菌是否为产毒素菌株，而且借助荧光强弱能够区分产毒菌株产毒的多少，可以通过此步简单操作实现高效产毒素菌株的快速筛选，可谓一举两得，与现有技术相比，不需要进行复杂操作(如，培养获得各种真菌，再提取毒素，然后进行仪器测定；或者提取各菌株的DNA，然后进行PCR，产物再进行分子鉴定等)，比较直观且简便易行。
最终进行，产毒菌株的验证
(1)仪器鉴定：选择荧光检测中荧光强度较强(包括绿色荧光和蓝色荧光)的菌株培养好后，提取毒素后，进行液相色谱(或液相色谱质谱联用仪)测定。结果：上述分离到的菌株均能检测到黄曲霉毒素。
(2)分子验证：选择荧光检测中荧光强度较强(包括绿色荧光和蓝色荧光)的菌株培养好后，提取总DNA，利用真菌通用引物进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，再利用PCR回收试剂盒回收纯化得到目的片段，然后将扩增产物送于生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列分析。将测序得到的序列结果在NCBI数据库利用Blast软件进行比对分析。通过比对发现，分离到的产毒菌株均为黄曲霉菌和寄生曲霉菌，同源性达到99％。
显然，上述实施例仅仅是为了清楚的说明所做的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种快速高效鉴定产黄曲霉毒素菌株的方法，其方法如下：
选出20个黄曲霉毒素含量较高的稻谷样品，分别取5g样品，加入45ml无菌水中，120r/min，28℃恒温摇床2h。然后取1ml加到9ml无菌水中，逐级进行梯度稀释；将采集的土样室温下自然晾干，然后在灭菌的研钵中研磨至细粉状，准确称取5g土样，加入45ml无菌水中，120r/min，28℃恒温摇床2h。然后取1ml加到9ml无菌水中，逐级进行梯度稀释；
将上述菌液100μl均匀涂布在含0.1g/L氯霉素的无菌AFPA平板上，28℃静置培养4-7天，AFPA平板上呈亮橘色的单菌落接种到含0.1g/L氯霉素的无菌PDA平板上，进行纯化培养，28℃恒温培养4-7天；
将分离纯化到的菌株分别接种到无菌PDA斜面上，培养5-7天，置于黄曲霉毒素紫外线荧光检测器下观察荧光结果，按照荧光显示的强弱进行分离和排序。
2.按照权利要求1所述的快速高效鉴定产黄曲霉毒素菌株的方法，其特征在于：曲霉素琼脂基础(AFPA)(g/L)：蛋白胨10.0，酵母浸粉20.0，柠檬酸铁铵0.5，氯硝铵0.002，氯霉素0.1，琼脂15.0，pH：6.3±0.2，加热溶解于1000ml蒸馏水中，分装，121℃高压灭菌15分钟，再加入用细菌滤器过滤除菌的50g/L氯霉素溶液，使其终浓度为0.1g/L，摇匀后倒入无菌的培养皿(直径9cm)中冷却备用，若暂时不用，可置4℃冰箱冷藏保存；
马铃薯葡萄糖培养基(PDA培养基)：马铃薯(去皮)200g、葡萄糖20g、琼脂15～20g、蒸馏水1000ml，121℃高压灭菌15分钟，再加入用细菌滤器过滤除菌的50g/L氯霉素溶液，使其终浓度为0.1g/L，摇匀后倒入无菌的培养皿(直径9cm)中冷却备用，若暂时不用，可置4℃冰箱冷藏保存。
3.按照权利要求1或2所述的快速高效鉴定产黄曲霉毒素菌株的方法，其特征在于：所述的分离排序，是将有蓝色荧光和绿色荧光的样品分离出来，根据其发光强度进行排序。
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