CN107988209A - 一种核酸提取试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，涉及一种核酸提取试剂盒及其应用，所述试剂盒包括玻璃珠、蜗牛酶、裂解液和去除剂，所述裂解液中包括Tween‑40，所述去除剂中包括CTAB和Al2(SO4)3。本发明试剂盒可以高效破碎真菌细胞壁，且能够快速高效的获得高质量的真菌核酸。

Description

一种核酸提取试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种核酸提取试剂盒及其应用，具体涉及一种用于真菌的核酸提取试剂盒及其应用。
背景技术
真菌是一大类真核生物细胞型微生物。在自然界重分布广泛、种类繁多，目前已有一万个属、十万余种。其中绝大多数对人类有益，少数对人类有害，可引起人类及动植物的疾病。
与医学有关的真菌达四百余种，常见的有50-100种，可引起人类感染性、中毒性及超敏反应性疾病。如：皮肤癣、花斑癣、肺炎、肠炎、过敏性皮炎等。
目前，临床上常见真菌的检测方法主要是直接镜检和分离培养法，直接镜检法无法鉴定感染真菌的种类，而分离培养法培养时间长，受人员经验影响比较大，且形态比较接近的真菌也难以区分到种。因此通过分子生物学方法进行真菌鉴定显得越来越重要。但是真菌细胞壁成分复杂，由几丁质、甘露聚糖、葡聚糖组成，难以破碎，且真菌中富含多糖、色素等物质使得真菌核酸提取更加困难，从而限制了真菌分子鉴定方法的应用。因此，探索真菌核酸高效、快速提取方法十分重要。
传统的真菌方法主要有CTAB法、SDS法、酶解法等，提取的步骤大体相似，关键是如何有效地裂解真菌细胞壁释放出核酸，有的是通过机械法破碎细胞壁，有的是通过酶来消化细胞壁。机械法目前主要是通过液氮冷冻干燥研磨破碎细胞壁，但这种方法也无法完全破碎细胞壁，而且这种方法大多会用到有毒有机溶剂、酚等，而且操作耗时较长，使用液氮容易冻伤皮肤，又受研钵数量的限制无法大量提取。酶解法消化细胞壁也存在得不到好的去壁效果，提取效率低的问题。
基于上述问题，如何提取真菌的核酸，能够尽可能获得完整的核酸，提高提取的效率，缩短提取的时间，就成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种核酸提取试剂盒及其应用，本发明试剂盒可以高效破碎真菌细胞壁，且能够快速高效的获得高质量的真菌核酸。
第一方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括玻璃珠、蜗牛酶、裂解液和去除剂。
本发明中，发明人发现，采用蜗牛酶的加入可以分解真菌含有的多糖物质，更有利于核酸的释放，同时有利于多糖的去除，减少多糖对核酸的污染；玻璃珠机械破碎细胞壁和蜗牛酶消化破碎细胞壁相结合的方法，对细胞壁的破碎效率更好。
根据本发明，所述裂解液中包括Tween-40，所述去除剂中包括CTAB和Al2(SO4)3。
本发明中，所述Tween-40的添加提高了样本裂解效率，无需特定震荡破碎仪，普通涡旋仪即可操作，高效便捷，单个样品提取一般可在45min内完成；所述Al2(SO4)3的添加可有效吸附样本腐蚀质，所述CTAB对腐蚀质的吸附有一定能力，且在高盐浓度下，可有效去除样本中多糖类物质，通过这三个试剂的配合，提取得到的DNA纯度高，可直接用于后续分子实验。
根据本发明，所述裂解液中还包括Tris-Cl缓冲液、EDTA或SDS中的任意一种或至少两种的组合，优选为包括Tris-Cl缓冲液、EDTA和SDS。
根据本发明，所述去除剂中还包括NaCl。
根据本发明，所述试剂盒还包括CTAB。
根据本发明，所述试剂盒还包括缓冲液、悬浮液、结合液、漂洗液或洗脱液中的任意一种或至少两种的组合。
根据本发明，所述试剂盒还包括离心吸附柱，所述离心吸附柱的硅基质膜为美国产millpore硅基质膜。。
本发明中，发明人发现，采用所述硅基质膜柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好，克服了膜质量不稳定的弊端。
本发明中，所述试剂盒各试剂的浓度在此不作限定，只需要这些试剂能达到使用时的浓度就可以，本领域技术人员可以根据需要调剂各个试剂的浓度。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的试剂盒用于真菌核酸的提取。
本发明中，所述核酸包括DNA和RNA，当提取DNA时，所述试剂盒中包括常规的RNA消化酶，当提取RNA时，所述试剂盒中包括常规的DNA消化酶，其他试剂并不会改变。
第三方面，本发明提供一种真菌核酸的提取方法，采用如第一方面所述的试剂盒，包括如下步骤：
(1)将样本与玻璃珠涡旋混匀，加入酶液酶解；
(2)向步骤(1)的混合液中加入裂解液混合，重悬；
(3)将步骤(2)重悬后的样本加入去除剂混匀，离心；
(4)将步骤(3)离心后的样本加入结合液混匀，加入吸附柱中，离心，漂洗，加入75％的无水乙醇，离心；
(5)将步骤(4)离心后的样本加入洗脱液，离心得到所述基因组DNA。
根据本发明，所述样本来源于粪便、土壤、尿液或口腔细胞中的任意一种或至少两种的组合，优选为来源于粪便。
根据本发明，步骤(1)所述样本与所述玻璃珠的质量比为1:(0.5-3)，例如可以是1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:1、1:1.2、1:1.3、1:1.5、1:1.6、1:1.8、1:2、1:2.2、1:2.3、1:2.5、1:2.6、1:2.8或,1:3，优选为1:(0.8-2)。
根据本发明，步骤(1)所述的酶液包括蜗牛酶、磷酸缓冲液和MgCl2。
优选地，所述蜗牛酶的质量浓度为50-200mg/mL，例如可以是50mg/mL、52mg/mL、55mg/mL、56mg/mL、58mg/mL、60mg/mL、62mg/mL、65mg/mL、68mg/mL、70mg/mL、75mg/mL、80mg/mL、85mg/mL、90mg/mL、95mg/mL、100mg/mL、105mg/mL、110mg/mL、115mg/mL、120mg/mL、125mg/mL、130mg/mL、140mg/mL、150mg/mL、160mg/mL、170mg/mL、180mg/mL、190mg/mL或200mg/mL，优选为80-120mg/mL。
优选地，所述磷酸缓冲液的pH为6-8，例如可以是6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8，优选为6.8-7.4。
优选地，所述磷酸缓冲液的摩尔浓度为0.01-2M，例如可以是0.01M、0.02M、0.03M、0.04M、0.05M、0.06M、0.07M、0.08M、0.09M、0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1M、1.2M、1.5M、1.6M、1.8M或2M，优选为0.05-0.2M。
优选地，所述MgCl2的摩尔浓度为0.1-2M，例如可以是0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1M、1.2M、1.3M、1.5M、1.6M、1.8M或2M，优选为0.2-0.5M。
优选地，所述酶解的温度为40-70℃，例如可以是40℃、41℃、42℃、43℃、45℃、46℃、48℃、50℃、51℃、52℃、53℃、55℃、56℃、58℃、60℃、62℃、65℃、68℃或70℃，优选为45-65℃。
优选地，所述酶解的时间为10-150min，例如可以是10min、12min、15min、20min、22min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min、65min、70min、75min、80min、85min、90min、95min、100min、110min、120min、130min、140min或150min，优选为20-120min。
根据本发明，步骤(2)所述裂解液包括Tris-Cl缓冲液、Tween-40、EDTA和SDS。
优选地，所述Tris-Cl缓冲液的摩尔浓度为0.01-2M，例如可以是0.01M、0.03M、0.05M、0.08M、0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1M、1.1M、1.2M、1.3M、1.4M、1.5M、1.6M、1.8M或2M，优选为0.05-0.5M。
优选地，所述Tween-40的体积分数为5-16％，例如可以是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或16％，优选为8-12％。
优选地，所述EDTA的摩尔浓度为0.01-1M，例如可以是0.01M、0.02M、0.03M、0.05M、0.06M、0.07M、0.08M、0.09M、0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M或1M，优选为0.05-0.2M。
优选地，所述SDS的体积分数为5-15％，例如可以是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％，优选为8-12％。
根据本发明，步骤(3)所述去除剂包括Al2(SO4)3、CTAB和NaCl。
优选地，所述Al2(SO4)3的摩尔浓度为0.1-2M，例如可以是0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1M、1.2M、1.3M、1.5M、1.6M、1.7M、1.8M、1.9M或2M，优选为0.2-1.0M。
优选地，所述CTAB的质量浓度为50-400g/L，例如可以是50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、120g/L、130g/L、150g/L、160g/L、180g/L、200g/L、210g/L、220g/L、230g/L、250g/L、260g/L、270g/L、280g/L、290g/L、300g/L、310g/L、320g/L、350g/L、380g/L、390g/L或400g/L，优选为80-350g/L。
优选地，所述NaCl的摩尔浓度为0.1-2M，例如可以是0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1M、1.2M、1.3M、1.5M、1.6M、1.7M、1.8M、1.9M或2M，优选为0.5-1.5M。
第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的试剂盒或如第三方面所述的提取方法用于分析分类肠道微生物。
第五方面，本发明提供一种如第三方面所述的提取方法提取的核酸用于免疫组学分析。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明试剂盒采用蜗牛酶分解真菌含有的多糖物质，更有利于核酸的释放，同时有利于多糖的去除，减少多糖对核酸的污染，摒弃了有毒试剂的使用；玻璃珠机械破碎细胞壁和蜗牛酶消化法破碎细胞壁相结合的方法，细胞壁破碎效率更好；
(2)本发明试剂盒所述Tween-40的添加提高了样本裂解效率，无需特定震荡破碎仪，普通涡旋仪即可操作，高效便捷，单个样品提取一般可在45min内完成；所述Al2(SO4)3的添加可有效吸附样本腐蚀质，所述CTAB对腐蚀质的吸附有一定能力，且在高盐浓度下，可有效去除样本中多糖类物质，通过这三个试剂的配合，提取得到的DNA纯度高，可直接用于后续分子实验；
(3)本发明方法试剂盒提取的核酸可以对肠道微生物进行测序及数据分析，实现了更多物种在分类学属甚至种上的鉴别，即获得更多肠道微生物生物学信息，可为免疫组学研究以及临床用药上提供一定指导意义。
附图说明
图1为本发明实施例1中样本A1、A2和A3三个样本的凝胶电泳图；
图2为本发明实施例中采用提取的核酸扩增目的条带的凝胶电泳图，其中，Ca为白色念珠菌，Cg为光滑念珠菌，M代表marker，大小为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1500bp。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本发明相关的部分而非全部结构。
实施例1检测试剂盒的制备
(1)试剂的制备
缓冲液A：0.5-0.5M Tris-Cl缓冲液(pH5.0-8.0)，0.5-1.5M NaCl；
酶液B：0.05-0.2M磷酸缓冲液(pH6.8-7.4)，0.25M MgCl2,80-120mg/mL蜗牛酶；
裂解液C：0.05-0.5M Tris-Cl缓冲液(pH5.0-8.0)，0.05-0.2M EDTA，8-12％SDS，8-12％Tween-40；
悬浮液D：5-40mg/ml RNAaseA
去除剂E：0.2-1M Al2(SO4)3，80-350g/L CTAB，0.5-1.5M NaCl；
结合液F：0.1-0.5M Tris-Cl缓冲液(pH5.0-8.0)，2-8M异硫腈酸胍；
漂洗液G：0.1-0.5M Tris-Cl缓冲液(pH5.0-8.0)，15-25％(体积比)无水乙醇；
洗脱液H：无菌去离子水；
(2)耗材
玻璃珠、吸附柱和收集管
(3)试剂盒的组装
将所述引物组合物和检测探针与试剂盒相关的试剂进行组装，制备成所述检测试剂盒。
实施例2样本DNA(A1/B1/C1)的提取
选取3个粪便样本：A、B、C，平均分成6份，标记为：A1-A6，B1-B6、C1-C6，A1、B1、C1三个样本用本实施例的方法处理，具体的DNA提取方法包括如下步骤：
(1)取800μl缓冲液A和200mg玻璃珠至2ml离心管中；
(2)在上述2ml离心管中加入200mg样本，涡旋混匀30s；
(3)向步骤(2)离心管中加入100μl酶液B，于45-65℃温育20min；
(4)向样本中加入50μl裂解液C，涡旋振荡5min混匀样本，12,000rpm(～13,400×g)，离心60s，转移上清液(400μl)至新的2ml离心管；
(5)加入300μl悬浮液D，涡旋振荡5-10s，室温放置5min，12,000rpm(～13,400×g)，离心60s，沉淀样本颗粒；
(6)转移上清至新的2ml离心管，加入100μl去除剂E混匀，4℃放置2min；
(7)12,000rpm(～13,400×g)，离心60s，转移上清液至新的2ml离心管，加入1000μl结合液F颠倒混匀；
(8)取上一步所得溶液600μl加入到一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)，离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
(9)向吸附柱中，加入300μl漂洗液G，12,000rpm(～13,400×g)，离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
(10)向吸附柱中，加入300μl 75％无水乙醇，12,000rpm(～13,400×g)，离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
(11)将吸附柱放回空收集管中，12,000rpm(～13,400×g)，离心60s，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；
(12)取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加200μl洗脱液H(洗脱液可事先在60～70℃水浴中预热)，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)，离心60s，将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)，离心1min；
(13)使用琼脂凝胶电泳，检测基因组DNA的完整性、浓度和污染的情况；
(14)使用分光光度计或Qubit对样品进行精确定量，DNA可以存放在0～10℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃。
实施例3样本DNA(A1/B1/C1)的提取
将A1、B1、C1三个样本用本实施例的方法处理，具体的DNA提取方法包括如下步骤：
(1)取800μl缓冲液A和100mg玻璃珠至2ml离心管中；
(2)在上述2ml离心管中加入200mg样本，涡旋混匀30s；
(3)向步骤(2)离心管中加入50μl酶液B，于40-50℃温育120min；
(4)向样本中加入100μl裂解液C，涡旋振荡5min混匀样本，12,000rpm(～13,400×g)，离心60s，转移上清液(400μl)至新的2ml离心管；
(5)加入300μl悬浮液D，涡旋振荡5-10s，室温放置5min，12,000rpm(～13,400×g)，离心60s，沉淀样本颗粒；
(6)转移上清至新的2ml离心管，加入50μl去除剂E混匀，4℃放置2min；
(7)12,000rpm(～13,400×g)，离心60s，转移上清液至新的2ml离心管，加入1000μl结合液F颠倒混匀；
(8)取上一步所得溶液600μl加入到一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)，离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
(9)向吸附柱中，加入50μl漂洗液G，12,000rpm(～13,400×g)，离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
(10)向吸附柱中，加入300μl 75％无水乙醇，12,000rpm(～13,400×g)，离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
(11)将吸附柱放回空收集管中，12,000rpm(～13,400×g)，离心60s，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；
(12)取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加200μl洗脱液H(洗脱液可事先在60～70℃水浴中预热)，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)，离心60s，将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)，离心1min；
(13)使用琼脂凝胶电泳，检测基因组DNA的完整性、浓度和污染的情况；
(14)使用分光光度计或Qubit对样品进行精确定量，DNA可以存放在0～10℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃。
实施例3样本DNA(A1/B1/C1)的提取
将A1、B1、C1三个样本用本实施例的方法处理，具体的DNA提取方法包括如下步骤：
(1)取800μl缓冲液A和300mg玻璃珠至2ml离心管中；
(2)在上述2ml离心管中加入100mg样本，涡旋混匀30s；
(3)向步骤(2)离心管中加入100μl酶液B，于60-70℃温育10min；
(4)向样本中加入30μl裂解液C，涡旋振荡5min混匀样本，12,000rpm(～13,400×g)，离心60s，转移上清液(400μl)至新的2ml离心管；
(5)加入100μl悬浮液D，涡旋振荡5-10s，室温放置5min，12,000rpm(～13,400×g)，离心60s，沉淀样本颗粒；
(6)转移上清至新的2ml离心管，加入50μl去除剂E混匀，4℃放置2min；
(7)12,000rpm(～13,400×g)，离心60s，转移上清液至新的2ml离心管，加入800μl结合液F颠倒混匀；
(8)取上一步所得溶液300μl加入到一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)，离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
(9)向吸附柱中，加入100μl漂洗液G，12,000rpm(～13,400×g)，离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
(10)向吸附柱中，加入200μl 75％无水乙醇，12,000rpm(～13,400×g)，离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
(11)将吸附柱放回空收集管中，12,000rpm(～13,400×g)，离心60s，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；
(12)取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加200μl洗脱液H(洗脱液可事先在60～70℃水浴中预热)，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)，离心60s，将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)，离心1min；
(13)使用琼脂凝胶电泳，检测基因组DNA的完整性、浓度和污染的情况；
(14)使用分光光度计或Qubit对样品进行精确定量，DNA可以存放在0～10℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃。
对比例1样本DNA(A2/B2/C2)的提取
将A2、B2、C2三个样本用以下的方法处理，具体的DNA提取方法包括如下步骤：除了不加入蜗牛酶酶解，其他步骤和试剂同实施例2。
对比例2样本DNA(A3/B3/C3)的提取
将A3、B3、C3三个样本用以下的方法处理，具体的DNA提取方法包括如下步骤：除了不加入玻璃珠，其他步骤和试剂同实施例2。
对比例3样本DNA(A4/B4/C4)的提取
将A4、B4、C4三个样本用以下的方法处理，具体的DNA提取方法包括如下步骤：所述裂解液C中不含有Tween-40，其他组分同实施例1，DNA提取方法同实施例2。
对比例4样本DNA(A5/B5/C5)的提取
将A5、B5、C5三个样本用以下的方法处理，具体的DNA提取方法包括如下步骤：所述裂解液C中不含有Al2(SO4)3，其他组分同实施例1，DNA提取方法同实施例2。
对比例5样本DNA(A6/B6/C6)的提取
将A6、B6、C6三个样本用以下的方法处理，具体的DNA提取方法包括如下步骤：所述裂解液C中不含有CTAB，其他组分同实施例1，DNA提取方法同实施例2。
结果检测：
I)电泳结果检测
将实施例2和对比例1-2中提取的核酸检测电泳结果，结果如图1所示，可以看出，A1为本申请方法(实施例2)提取的DNA完整性好，条带较亮，A2为对比例1提取的DNA有明显拖尾，DNA部分降解，A3为对比例3提取的DNA条带亮度较低，提示浓度比较低。
II)Qubit定量结果检测
将实施例2-4和对比例1-5中提取的核酸进行Qubit定量检测，结果如下表1所示：
表1
从表1可以看出，本申请方法提取的核酸浓度高，纯度高，而对比例1-5中提取的核酸浓度降低，可见，玻璃珠和蜗牛酶协同作用，促进了核酸的提取，Tween-40、Al2(SO4)3和CTAB协同作用，促进了核酸的提取，提高了核酸提取的浓度。
实施例5白色念珠菌和光滑念珠菌DNA的提取验证
选取白色念珠菌(Candida albicans)和光滑念珠菌(Candida glabrata)的培养产物，提取DNA，以提取的DNA为模板，扩增白色念珠菌和光滑念珠菌的特异片段，具体如下：
1)DNA提取具体的步骤同实施例2；
2)目的片段扩增：
(1)在冰上配制以下反应液。除DNA提取液和H2O以外，依照如下组份先按反应数+α的量配制扩增预混Mix，取配制好的预混Mix分装到PCR反应管中，其中引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.1)：GCTCAGTGAATCATCGTCGAATCTTTG；
下游引物(SEQ ID NO.2)：ATCCGTCCTCCGCTTATTGATATGC；
具体反应体系如下表2所示：
表2
设置一组以水为样本的阴性对照；
(2)添加上述DNA提取液，按照如下反应条件进行PCR反应：
(3)片段大小确定
琼脂糖电泳确定扩增是否准确，结果如图2所示，可见扩增产物长度约200-300bp，成功扩增出目的条带。
综上所述，本发明试剂盒采用蜗牛酶分解真菌含有的多糖物质，更有利于核酸的释放，同时有利于多糖的去除，减少多糖对核酸的污染，摒弃了有毒试剂的使用；玻璃珠机械破碎细胞壁和蜗牛酶消化法破碎细胞壁相结合的方法，细胞壁破碎效率更好；不仅如此，所述Tween-40的添加提高了样本裂解效率，无需特定震荡破碎仪，普通涡旋仪即可操作，高效便捷，单个样品提取一般可在45min内完成；所述Al2(SO4)3的添加可有效吸附样本腐蚀质，所述CTAB对腐蚀质的吸附有一定能力，且在高盐浓度下，可有效去除样本中多糖类物质，通过这三个试剂的配合，提取得到的DNA纯度高，可直接用于后续分子实验。
注意，上述仅为本发明的较佳实施例及所运用技术原理。本领域技术人员会理解，本发明不限于这里所述的特定实施例，对本领域技术人员来说能够进行各种明显的变化、重新调整和替代而不会脱离本发明的保护范围。因此，虽然通过以上实施例对本发明进行了较为详细的说明，但是本发明不仅仅限于以上实施例，在不脱离本发明构思的情况下，还可以包括更多其他等效实施例，而本发明的范围由所附的权利要求范围决定。
序列表
<110> 苏州普瑞森基因科技有限公司
<120> 一种核酸提取试剂盒及其应用
<130> 2017
<141> 2017-12-30
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 1
gctcagtgaa tcatcgtcga atctttg 27
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 2
atccgtcctc cgcttattga tatgc 25

Claims (10)

1.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括玻璃珠、蜗牛酶、裂解液和去除剂。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解液中包括Tween-40；
优选地，所述去除剂中包括CTAB和Al2(SO4)3；
优选地，所述裂解液中还包括Tris-Cl缓冲液、EDTA或SDS中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述去除剂中还包括NaCl；
优选地，所述试剂盒还包括CTAB；
优选地，所述试剂盒还包括缓冲液、悬浮液、结合液、漂洗液或洗脱液中的任意一种或至少两种的组合。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括离心吸附柱；
优选地，所述离心吸附柱的硅基质膜为美国产millpore硅基质膜。
4.一种如权利要求1-3中任一项所述的试剂盒用于真菌核酸的提取。
5.一种真菌核酸的提取方法，其特征在于，采用如权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，包括如下步骤：
(1)将样本与玻璃珠涡旋混匀，加入酶液酶解；
(2)向步骤(1)的混合液中加入裂解液混合，重悬；
(3)将步骤(2)重悬后的样本加入去除剂混匀，离心；
(4)将步骤(3)离心后的样本加入结合液混匀，加入吸附柱中，离心，漂洗，加入75％的无水乙醇，离心；
(5)将步骤(4)离心后的样本加入洗脱液，离心得到所述基因组DNA。
6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述样本来源于粪便、土壤、尿液或口腔细胞中的任意一种或至少两种的组合，优选为来源于粪便；
优选地，步骤(1)所述样本与所述玻璃珠的质量比为1:(0.5-3)，优选为1:(0.8-2)；
优选地，步骤(1)所述的酶液包括蜗牛酶、磷酸缓冲液和MgCl2；
优选地，所述蜗牛酶的质量浓度为50-200mg/mL，优选为80-120mg/mL；
优选地，所述磷酸缓冲液的pH为6-8，优选为6.8-7.4,；
优选地，所述磷酸缓冲液的摩尔浓度为0.01-2M，优选为0.05-0.2M；
优选地，所述MgCl2的摩尔浓度为0.1-2M，优选为0.2-0.5M；
优选地，所述酶解的温度为40-70℃，优选为45-65℃；
优选地，所述酶解的时间为10-150min，优选为20-120min。
7.根据权利要求5或6所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)所述裂解液包括Tris-Cl缓冲液、Tween-40、EDTA和SDS；
优选地，所述Tris-Cl缓冲液的摩尔浓度为0.01-2M，优选为0.05-0.5M；
优选地，所述Tween-40的体积分数为5-16％，优选为8-12％；
优选地，所述EDTA的摩尔浓度为0.01-1M，优选为0.05-0.2M；
优选地，所述SDS的体积分数为5-15％，优选为8-12％。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)所述去除剂包括Al2(SO4)3、CTAB和NaCl；
优选地，所述Al2(SO4)3的摩尔浓度为0.1-2M，优选为0.2-1.0M；
优选地，所述CTAB的质量浓度为50-400g/L，优选为80-350g/L；
优选地，所述NaCl的摩尔浓度为0.1-2M，优选为0.5-1.5M。
9.一种如权利要求1-3中任一项所述的试剂盒或如权利要求5-8中任一项所述的提取方法用于分析分类肠道微生物。
10.一种如权利要求5-8中任一项所述的提取方法提取的核酸用于免疫组学分析。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114438170A (zh) * 2022-03-02 2022-05-06 秦皇岛海关技术中心 圆苞车前子壳dna的提取及分子鉴别

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102392016A (zh) * 2011-11-17 2012-03-28 中国计量学院 一种高通量快速提取真菌基因组dna的方法
KR20150007054A (ko) * 2013-07-10 2015-01-20 솔젠트 (주) 중합효소연쇄반응 및 실시간중합효소연쇄반응을 이용한 세포치료제 또는 생물학적 의약품에 오염되는 진균을 검출하는 방법 및 이 방법에 사용하기 위한 키트
CN104975006A (zh) * 2015-07-28 2015-10-14 福建师范大学 一种提取真菌基因组dna的试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102392016A (zh) * 2011-11-17 2012-03-28 中国计量学院 一种高通量快速提取真菌基因组dna的方法
KR20150007054A (ko) * 2013-07-10 2015-01-20 솔젠트 (주) 중합효소연쇄반응 및 실시간중합효소연쇄반응을 이용한 세포치료제 또는 생물학적 의약품에 오염되는 진균을 검출하는 방법 및 이 방법에 사용하기 위한 키트
CN104975006A (zh) * 2015-07-28 2015-10-14 福建师范大学 一种提取真菌基因组dna的试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
林万明等: "《细菌分子遗传学分类鉴定法》", 30 September 1990, 上海：上海科学技术出版社 *
邵俊: "不同农业利用下武汉狮子山土壤微生物多样性", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114438170A (zh) * 2022-03-02 2022-05-06 秦皇岛海关技术中心 圆苞车前子壳dna的提取及分子鉴别
CN114438170B (zh) * 2022-03-02 2023-05-23 秦皇岛海关技术中心 圆苞车前子壳dna的提取及分子鉴别

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