CN108676724A - 霉菌的培养方法、破壁方法及dna提取方法 - Google Patents

霉菌的培养方法、破壁方法及dna提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种霉菌的培养方法、破壁方法，包括①在研磨容器中加入第一CTAB抽提液，将研磨容器进行冷冻，并使第一CTAB抽提液变为冰冻态；②在冷冻之后的研磨容器中加入霉菌及第二CTAB抽提液；以及③对霉菌进行研磨以破坏霉菌的细胞壁，并与第一CTAB抽提液及第二CTAB抽提液形成第一混合溶液等步骤；本发明还公开了一种相应的霉菌DNA的提取方法，包括在第一混合溶液中加入质量体积浓度为10%的SDS溶液，进行温浴，形成第二混合溶液；将第二混合溶液离心，得到第一上清液，第一上清液中含有霉菌的DNA；以及在第一上清液中加入苯酚‑氯仿‑异戊醇抽提液，混匀后离心，得到第二上清液，第二上清液中含有霉菌的DNA。本发明适用于对霉菌进行培养、破壁和DNA提取。

Description

霉菌的培养方法、破壁方法及DNA提取方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及微生物的处理技术，具体地说是一种霉菌的培养方法、破壁方法及DNA提取方法。
背景技术
20世纪50年代后，随着人们对微生物基因的深刻认识，已广泛应用于各方面，同时对于微生物的研究也已经深入到核酸的水平。DNA是遗传信息的载体，是重要的遗传物质。其中基因组DNA提取作为分子实验中基础而重要的技术手段已经应用在了各个研究领域。而DNA样品的质量以及数量的高低对进行各种分子生物学研究有着重要的影响。
霉菌俗称丝状真菌，由于霉菌的种类繁多，仅依靠形态鉴定并不能准确地鉴定其种类，所以对霉菌进行分子水平的鉴定至关重要，而提取高质量的DNA是霉菌进行分子水平鉴定的基础。且因为霉菌的细胞壁包括β-葡聚糖、糖蛋白、几丁质微纤维三层结构，因此使得霉菌的细胞壁不易破碎。传统的霉菌DNA提取方法，往往存在对霉菌DNA的提取量少，且提取的DNA不完整的问题。
发明内容
为解决现有技术中存在的以上不足，本发明旨在提供一种霉菌的培养方法、破壁方法及DNA提取方法，以实现对霉菌DNA的提取量大且提取的DNA完整的目的。
本发明为实现上述目的，所采用的技术方案如下：
一种霉菌的培养方法，按照如下的步骤顺序进行：
（1）霉菌菌丝的收集
将马铃薯洗净、去皮，称取200ɡ切成小块，添加500mL去离子水煮烂之后用八层纱布过滤，于过滤汁中添加16～20ɡ琼脂和20g葡萄糖，冷却后定容至1000mL，加盖密封，115℃灭菌20min后，冷却至50℃后倾倒平板，得马铃薯琼脂培养基；
将冷藏于4℃冰箱中的霉菌接种于马铃薯琼脂培养基的平板上，28～30℃恒温培养48h；之后，
再转接于新鲜马铃薯琼脂培养基，如此重复2～3次，得活化后的霉菌；
（2）活化好的霉菌再次转接于新鲜的马铃薯琼脂培养基上，28～30℃恒温培养48h后，利用锋利的灭菌刀片刮取平板上的菌丝，得到霉菌菌丝体。
本发明还提供了一种霉菌的破壁方法，它包括顺序进行的以下步骤：
①在研磨容器中加入第一CTAB抽提液a1，将所述研磨容器进行冷冻，使所述a1变为冰冻态；然后，
②在研磨容器中加入霉菌菌丝体及第二CTAB抽提液a2；
③对所述霉菌进行研磨，研磨至看不到菌丝体，达到均匀混合液状，以破坏所述霉菌菌丝体的细胞壁，并与第一CTAB抽提液a1、第二CTAB抽提液a2共同形成第一混合溶液b1。
作为限定，所述步骤①中，冷冻的温度为-30～-15℃，时间为1～1.5h。
作为另一种限定，第一CTAB抽提液a1、霉菌菌丝体与第二CTAB抽提液a2的用量比为1mL：0.5～2g：0.5～2mL。
作为第三种限定，第一CTAB抽提液a1与第二CTAB抽提液a2均为CTAB抽提液，即液体a，第一CTAB抽提液a1与第二CTAB抽提液a2的体积相同。
本发明所提供的霉菌的破壁方法还有一种限定，所述液体a由 CTAB、氯化钠、EDTA溶液、Tris-HCL缓冲液及β-巯基乙醇以1ɡ：4.09ɡ：2mL：5mL：0.25ɡ的比例制得，先由CTAB、氯化钠、EDTA溶液、Tris-HCL缓冲液混合后由蒸馏水定容，121℃灭菌15min，冷却后加入β-巯基乙醇，即成；其中：
EDTA溶液、Tris-HCL缓冲液的浓度分别为0.5M、1M；
蒸馏水定容后的体积与CTAB的用量比为50 mL：1ɡ。
本发明的第三个目的，是提供了一种霉菌DNA的提取方法，本发明实现该目的所采用的技术方案如下：
一种霉菌DNA的提取方法，它包括顺序进行的如下步骤：
ⅰ.通过前述的霉菌的破壁方法得到第一混合溶液b1；
ⅱ.在第一混合溶液b1中加入质量体积浓度为10%的SDS溶液d，进行温浴后，形成第二混合溶液b2；
第二混合溶液b2进行离心，得到第一上清液c1，所述第一上清液c1中含有所述霉菌的DNA；
ⅲ.第一上清液中c1中加入苯酚-氯仿-异戊醇抽提液e1，混匀后离心，得到含有所述霉菌的DNA的第二上清液c2。
作为一种限定，所述SDS溶液d与所述第一混合溶液b1的体积比为1：8～12。
作为另一种限定，所述温浴的温度为50-80℃，时间为20～30min。
作为第三种限定，所述苯酚-氯仿-异戊醇抽提液e1与所述第一上清液c1的体积比为1：0.8～1.2。
作为第四种限定，离心的转速为5000～8000r/min，离心时间为5～6min。
作为优化，本发明所提供的霉菌DNA的提取方法，在步骤ⅲ后还设有步骤ⅳ，即：
ⅳ.在第二上清液c2中加入苯酚-氯仿-异戊醇抽提液e2，混匀后离心，得到含有所述霉菌的DNA的第三上清液c3。
作为进一步优化，第二上清液c2与苯酚-氯仿-异戊醇抽提液e2的体积比为：1：0.8～1。
作为进一步的优化，最终的上清液，即第二上清液c2或第三上清液c3，加入预冷的2～2.2倍体积的无水乙醇中，缓慢抽吸混匀；静置1～2min，使霉菌DNA沉淀；在12000r/min转速下离心8～12min，去掉第二上清液c2或第三上清液c3， 得到需要提取的霉菌DNA；
霉菌DNA溶解于TE缓冲液中，于-20℃条件下保存。
可以使用琼脂糖凝胶电泳和全波长酶标仪对提取的DNA进行测定。
本发明由于采用了上述的技术方案，其与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
本发明所提供的霉菌的培养方法通过PDA培养基对霉菌活化2~3次。在适宜的温度和培养基中培养得到的霉菌生长旺盛，菌丝体活性高，为下一步菌丝体的收集做好充分准备。所采用的PDA培养基具有营养成分均衡、配制简单的优点；
本发明所提供的霉菌的破壁方法，通过冷冻对研磨容器进行降温处理，并使第一CTAB抽提液变为冰冻态。在对霉菌进行研磨的过程中，经过降温的研磨容器以及冰冻态的第一CTAB抽提液的双重保障可以提供低温的研磨环境，使对霉菌的研磨处理在温度较低的环境下进行，从而能够最大程度的保证研磨之后的DNA 的完整性；
本发明所提供的霉菌DNA的提取方法具备前面所述的霉菌的破壁方法的优点，在此不再赘述，该霉菌DNA的提取方法同时还具有省时、经济等优点。
本发明适用于对霉菌进行培养、破壁和DNA提取。
附图说明
下面结合附图及具体实施例对本发明作更进一步的详细说明。
图1为本发明实施例21提取的霉菌DNA电泳图；
图2为本发明实施例22提取的霉菌DNA电泳图；
图3为本发明对比例实施例23提取的霉菌DNA电泳图；
图4为本发明实施例24提取的霉菌DNA电泳图；
图5为本发明实施例25提取的霉菌DNA电泳图。
具体实施方式
实施例1-5 霉菌的培养方法
实施例1-5分别为一种霉菌的培养方法，按照如下的步骤顺序进行：
（1）霉菌菌丝的收集
将马铃薯洗净、去皮，称取200ɡ切成小块，添加500mL去离子水煮烂之后用八层纱布过滤，于过滤汁中添加16～20ɡ琼脂和20g葡萄糖，冷却后定容至1000mL，加盖密封，115℃灭菌20min后，冷却50℃后倾倒平板，得马铃薯琼脂培养基；
将冷藏于4℃冰箱中的霉菌接种于马铃薯琼脂培养基的平板上，28～30℃恒温培养48h；之后，
再转接于新鲜马铃薯琼脂培养基，如此重复r=2～3次，得活化后的霉菌；
（2）活化好的霉菌再次转接于新鲜的马铃薯琼脂培养基上，28～30℃恒温培养48 h后，利用锋利的灭菌刀片刮取平板上的菌丝，即霉菌菌丝体。
实施例1－5的相关控制参数见下表：
实施例6－14 霉菌的破壁方法
实施例6－14分别为一种霉菌的破壁方法，它们分别按照以下步骤顺序进行：
①在带有研杵的玻璃或者陶瓷质研钵等研磨容器中，加入0.3～0.6mL第一CTAB抽提液a1，然后将研磨容器在-30～-15℃环境下冷冻1～1.5h，使第一CTAB抽提液a1变为冰冻态。通过对冷冻温度及冷冻时间的控制，可以控制对研磨容器以及第一CTAB抽提液a1的冷冻程度，尽可能保证研磨过程中研磨容器以及冰冻态的第一CTAB抽提液a1能够提供较持久的低温环境。具体的冷冻温度以及时间可以根据研磨容器的大小、研磨容器的材质以及加入研磨容器的第一CTAB抽提液a1的体积适当控制；第一CTAB抽提液a1的具体添加量可以根据需要破壁处理的霉菌的量来进行适当的调整;
②在研磨容器中，加入实施例1－5中任一实施例所提供的霉菌菌丝体0.3～0.6ɡ，以及0.3～0.6mL第二CTAB抽提液a2；
③对霉菌菌丝体进行研磨以破坏霉菌的细胞壁，研磨的过程中，霉菌细胞壁被破坏，研磨至看不到菌丝体，达到均匀混合液状，同时冰冻态的第一CTAB抽提液a1也逐渐融化，与霉菌以及第二CTAB抽提液a2混合共同形成第一混合溶液b1，用于后续的霉菌DNA的提取。
上述步骤中，第一CTAB抽提液a1与第二CTAB抽提液a2可以为同种液体，也可以不同。第一CTAB抽提液a1可以为0.1M的 Tris-Hcl溶液、0.02M的EDTA溶液或CTAB抽提液;第二CTAB抽提液a2可以为0.1M的Tris-Hcl溶液、0.02M的EDTA溶液或CTAB抽提液。其中，CTAB抽提液采用以下方法中来配制：每50mL的该溶液由 CTAB、氯化钠、EDTA溶液（浓度为0.5M）及Tris-HCL缓冲液（浓度为1M）以1ɡ：4.09ɡ：2mL：5mL的比例混合后由蒸馏水定容至50mL，121℃灭菌15min，冷却后加入0.25ɡ的β-巯基乙醇，即成。
实施例6－14提供的上述霉菌的破壁方法，通过冷冻对研磨容器进行降温处理，并使第一CTAB抽提液a1变为冰冻态。在对霉菌进行研磨的过程中，经过降温的研磨容器以及冰冻态的第一CTAB抽提液a1的双重保障可以提供低温的研磨环境，使对霉菌的研磨处理在温度较低的环境下进行，从而能够最大程度的保证研磨之后的霉菌DNA 的完整性。
实施例6－14的相关控制参数见下表：
说明：上表中（1）表示0.1M的Tris-Hcl 溶液；（2）表示0.02M的EDTA溶液（3）表示CTAB抽提液。
实施例15－19 霉菌DNA的提取方法
实施例15－19分别为一种霉菌DNA的提取方法，它们分别按照以下的步骤顺序进行：
ⅰ.取0.5mL实施例6－14中任一项中所得到的第一混合溶液b1 。可以将所取第一混合溶液b1加入到离心管中，从而方便后续的离心处理。
ⅱ.在第一混合溶液b1中加入0.0417～0.0625mL的质量体积浓度为10%的SDS溶液d，在50～80℃进行温浴20～30min，形成第二混合溶液b2，冷却至25℃备用；
第二混合溶液b2在转速5000～8000r/min进行离心5～6min，得到第一上清液c1，第一上清液c1中含有霉菌DNA；
ⅲ.第一上清液中c1中加入苯酚-氯仿-异戊醇抽提液e1，混匀后在转速5000～8000r/min进行离心5～6min，得到含有霉菌DNA的第二上清液c2。其中，所述苯酚-氯仿-异戊抽提液e1与第一上清液c1的体积比为1：0.8～1.2，可以使用移液枪将其混匀。
作为优化，步骤ⅲ后还可以设有步骤ⅳ，即：
ⅳ.在第二上清液c2中加入苯酚-氯仿-异戊醇抽提液e2，混匀后离心，得到含有所述霉菌的DNA的第三上清液c3。第二上清液c2与加入的苯酚-氯仿-异戊醇抽提液e2的体积比为1：0.8～1，苯酚-氯仿-异戊醇抽提液e2中苯酚、氯仿及异戊醇的体积比优选为25：24：1。
实施例15－19的相关控制参数见下表：
实施例15－19所提供的霉菌DNA的提取方法，具备实施例6－10霉菌的破壁方法的优点，同时还具有、省时、经济等优点。
实施例20－24 霉菌DNA的溶解及保存
将实施例15-19中任一实施例所得到的最终的上清液，即第二上清液c2或第三上清液c3，加入预冷的2～2.2倍体积的无水乙醇中，缓慢抽吸混匀；静置1～2min，使霉菌DNA沉淀；在12000r/min转速下离心8～12min，去掉上清液，得到需要提取的霉菌DNA；
霉菌DNA溶解于TE缓冲液中，于-20℃条件下保存。
可以使用琼脂糖凝胶电泳和全波长酶标仪对提取的DNA进行测定。
实施例20－24的相关控制参数见下表：
实施例25 霉菌的培养、破壁、DNA提取、溶解与保存
(1)霉菌的培养
(11)活化：将马铃薯洗净、去皮，称取200g切成小块，添加500mL去离子水煮烂后利用八层纱布过滤，于过滤汁中添加18g琼脂和20g葡萄糖，冷却后定容至1000mL，加盖密封，115℃灭菌20min后，冷却至50℃后倾倒平板，将冷藏于4℃冰箱中的霉菌接种于平板上，28℃恒温培养48h，之后，再转接于新鲜培养基，重复2次；
(12)霉菌菌丝的收集：将活化好的霉菌再次转接于新鲜的马铃薯琼脂培养基上，28℃恒温培养48h后利用锋利的灭菌刀片刮取平板上的菌丝体，备用。
(2)霉菌菌丝体研磨破壁：
在玻璃或陶瓷研钵中加入0.4mL第一CTAB抽提液a1，将添加有第一CTAB抽提液a1的研钵连同研杵一起置于-20℃冰箱中冷冻1h；
取出后在冻后的研钵中加入菌丝体0.4g和0.4mL第二CTAB抽提液a2；
在研钵冰面上快速研磨使菌丝体破壁，得到第一混合液b1，并将第一混合液b1转入1.5mL的离心管中;
(3)霉菌DNA的提取：
温浴：在第一混合溶液b1中加入质量体积分数为10%的SDS溶液d，加入量为第一混合溶液b1体积的1/10，将离心管置于65℃温浴20～30min，将形成的第二混合溶液b1冷却至25℃；
将第二混合溶液b1在转速为5000～8000r/min条件下离心5～6min，得到第一上清液c1，取第一上清液c1置于新的离心管中；
在第一上清液c1中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇抽提液e1，利用移液枪抽吸混匀，进行霉菌DNA的提取，并在12000r/min条件下离心10min，得到第二上清液c2，吸取第二上清液c2于新的离心管中再进行第二次提取，重复两次，得到最终的第三上清液c3。苯酚-氯仿-异戊醇抽提液e1中各组分的比例为苯酚、氯仿、异戊醇按照体积比为25：24：1。
(4)DNA的溶解、保存：将无水乙醇置于-20℃冰箱中预冷1～1.5 h，加入上述第三上清液c3中，预冷无水乙醇加量为该第三上清液c3体积的2倍，缓慢抽吸混匀后，静置1min，使DNA沉降之后再12000r/min条件下离心10min，去掉第三上清液c3得到霉菌DNA，将其溶解于60µL的TE缓冲液中，-20℃冰箱保存，霉菌DNA在TE缓冲液中的浓度为2324ng/mL。
请参阅图1，可以看出本实施例提取的霉菌DNA量多，凝胶效果明显。得到的DNA的纯度为1.897。
实施例26 霉菌的培养、破壁、DNA提取、溶解与保存
本实施例与实施例25的不同之处仅在于：
霉菌菌丝体研磨破壁：第一CTAB抽提液a1的添加量为0.3mL，菌丝体的添加量为0.5g，第二CTAB抽提液a2的添加量为0.5mL。
霉菌DNA的提取：温浴温度为25℃，得到第二混合溶液b2之后在5000r/min条件下离心6min。
DNA的溶解、保存：溶解于70μL的TE缓冲液中，霉菌DNA在TE缓冲液中的浓度为2412ng/mL。
本实施例其它部分的内容与实施例25完全相同。
请参阅图2，可以看出本实施例提取的霉菌DNA量多，凝胶效果明显。得到的DNA的纯度为1.887。
实施例27 霉菌的培养、破壁、DNA提取、溶解与保存
本实施例与实施例25的不同之处仅在于：未对霉菌进行研磨处理。
本实施例其它部分的内容与实施例25完全相同。
请参阅图3，结果显示DNA量少，凝胶效果不明显。得到的DNA纯度为1.256。
实施例28 霉菌的培养、破壁、DNA提取、溶解与保存
本实施例与实施例25的不同之处仅在于：
研磨容器采用常温研钵容器以及常温的第一CTAB抽提液a1及第二CTAB抽提液a2。
本实施例其它部分的内容与实施例25完全相同。
请参阅图4，结果DNA条带浅，DNA量少。得到的DNA纯度为1.713。
实施例29 霉菌的培养、破壁、DNA提取、溶解与保存
本实施例与实施例25的不同之处仅在于：将霉菌菌丝、第一CTAB抽提液a1和研钵容器一起置于-20℃条件下冷冻。
本实施例其它部分的内容与实施例25完全相同。
请参阅图5，结果DNA量少条带浅，几乎没有。得到的DNA纯度为1.364。
通过实施例25－29可见：未进行研磨处理使得DNA提取量极少，纯度较低，且电泳图效果几乎没有。而如果在常温的研钵容器和第一抽提液a1中进行菌丝的快速研磨，提取纯度仅为1.713，说明低温环境研磨对于霉菌的DNA提取是有效果的。如果将菌丝、第一抽提液a1和研钵容器一起置于-20℃冷冻，则发现提取效果欠佳，其原因可能是由于长时间低温处理使得菌丝体的DNA结构发生变化。

Claims (14)

1.一种霉菌的培养方法，其特征在于它按照如下的步骤顺序进行：
（1）霉菌菌丝的收集
将马铃薯洗净、去皮，称取200ɡ切成小块，添加500mL去离子水煮烂之后用八层纱布过滤，于过滤汁中添加16～20ɡ琼脂和20g葡萄糖，冷却后定容至1000mL，加盖密封，115℃灭菌20min后，冷却至50℃后倾倒平板，得马铃薯琼脂培养基；
将冷藏于4℃冰箱中的霉菌接种于马铃薯琼脂培养基的平板上，28～30℃恒温培养48h；之后，
再转接于新鲜马铃薯琼脂培养基，如此重复2～3次，得活化后的霉菌；
（2）活化好的霉菌再次转接于新鲜的马铃薯琼脂培养基上，28～30℃恒温培养48 h后，利用锋利的灭菌刀片刮取平板上的菌丝，得到霉菌菌丝体。
2.一种霉菌的破壁方法，其特征在于它包括顺序进行的以下步骤：
①在研磨容器中加入第一CTAB抽提液a1，将所述研磨容器进行冷冻，使所述a1变为冰冻态；然后，
②在研磨容器中加入霉菌菌丝体及第二CTAB抽提液a2；以及
③对所述霉菌菌丝体进行研磨后，并与第一CTAB抽提液a1、第二CTAB抽提液a2共同形成第一混合溶液b1。
3.根据权利要求2所述的霉菌的破壁方法，其特征在于：所述步骤①中，冷冻的温度为-30～-15℃，时间为1～1.5h。
4.根据权利要求2所述的霉菌的破壁方法，其特征在于：第一CTAB抽提液a1、霉菌菌丝体与第二CTAB抽提液a2的用量比为1mL：0.5～2g：0.5～2mL。
5.根据权利要求2所述的霉菌的破壁方法，其特征在于：第一CTAB抽提液a1与第二CTAB抽提液a2均为CTAB抽提液，即液体a，第一CTAB抽提液a1与第二CTAB抽提液a2的体积相同。
6.根据权利要求5所述的霉菌的破壁方法，其特征在于：所述液体a由 CTAB、氯化钠、EDTA溶液、Tris-HCL缓冲液及β-巯基乙醇以1ɡ：4.09ɡ：2mL：5mL：0.25ɡ的比例制得，先由CTAB、氯化钠、EDTA溶液、Tris-HCL缓冲液混合后由蒸馏水定容，121℃灭菌15min，冷却后加入β-巯基乙醇，即成；其中：
EDTA溶液、Tris-HCL缓冲液的浓度分别为0.5M、1M；
蒸馏水定容后的体积与CTAB的用量比为50 mL：1ɡ。
7.一种霉菌DNA的提取方法，其特征在于它包括顺序进行的如下步骤：
ⅰ.通过权利要求2-6任一项所述的霉菌的破壁方法得到第一混合溶液b1；
ⅱ.在第一混合溶液b1中加入质量体积浓度为10%的SDS溶液d，进行温浴后，形成第二混合溶液b2；
第二混合溶液b2进行离心，得到第一上清液c1，所述第一上清液c1中含有所述霉菌的DNA；
ⅲ.第一上清液中c1中加入苯酚-氯仿-异戊醇抽提液e1，混匀后离心，得到含有所述霉菌的DNA的第二上清液c2。
8.根据权利要求7所述的霉菌DNA的提取方法，其特征在于：所述SDS溶液d与所述第一混合溶液b1的体积比为1：8～12，10%SDS溶液只要少量即可，使得蛋白质变性后与DNA分开。
9.根据权利要求7所述的霉菌DNA的提取方法，其特征在于：所述温浴的温度为50-80℃，时间为20～30min。
10.根据权利要求7所述的霉菌DNA的提取方法，其特征在于：所述苯酚-氯仿-异戊醇抽提液e1与所述第一上清液c1的体积比为1：0.8～1.2。
11.根据权利要求7所述的霉菌DNA的提取方法，其特征在于：离心的转速为5000～8000r/min，离心时间为5～6min。
12.根据权利要求7－11中任一项所述的霉菌DNA的提取方法，其特征在于所述步骤ⅲ后还设有步骤ⅳ，即：
ⅳ.在第二上清液c2中加入苯酚-氯仿-异戊醇抽提液e2，混匀后离心，得到含有所述霉菌DNA的第三上清液c3。
13.根据权利要求12所述的霉菌DNA的提取方法，其特征在于：第二上清液c2与苯酚-氯仿-异戊醇抽提液e2的体积比为1：0.8～1。
14.根据权利要求12所述的霉菌DNA的提取方法，其特征在于：第三上清液c3，加入预冷的2～2.2倍体积的无水乙醇中，缓慢抽吸混匀；静置1～2min，使霉菌DNA沉淀；在12000r/min转速下离心8～12min，去掉第三上清液c3，得到需要提取的霉菌DNA；
霉菌DNA溶解于TE缓冲液中，于-20℃条件下保存。
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