CN202415563U - 一种组织细胞分离培养试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开了一种组织细胞分离培养试剂盒，包括试剂盒本体，在试剂盒本体内盛装胶原酶浓缩液试剂瓶、胰蛋白酶EDTA浓缩液试剂瓶、营养因子浓缩液试剂瓶，抗生素浓缩液试剂瓶、青霉素玻璃瓶和说明书。营养因子浓缩液试剂瓶为盛装有多种细胞生长因子、牛血清白蛋白和转铁蛋白浓缩液的试剂瓶。抗生素浓缩液试剂瓶为抗细菌、霉菌浓缩液试剂瓶。青霉素玻璃瓶为5个5ml容量小玻璃瓶。胶原酶浓缩液试剂瓶为肝脏类胶原酶浓缩液试剂瓶和非肝脏类胶原酶浓缩液试剂瓶中的至少一种。该试剂盒用于组织细胞分离培养，操作简便，能保证所分离的细胞成活率高，贴壁速度快，达到高效分离的效果。
Description
技术领域
本实用新型涉及一种组织细胞分离培养试剂盒。
背景技术
传统的原代细胞分离方法主要有消化法和小块组织贴壁法。消化法主要有胰蛋白酶消化法、EDTA消化法、胰蛋白酶EDTA消化法、胶原酶消化法及胶原酶混合胰酶消化法等。
胰蛋白酶消化法：胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰蛋白酶的作用不一样。胰蛋白酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃，浓度为0.25%时，胰蛋白酶消化作用最佳。所以使用胰蛋白酶时，需要把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。
EDTA消化法：EDTA是一种非酶性消化物，常用不含Ca2+和Mg2+的BSS平衡液配成0.02%的工作液。EDTA的作用机制一般认为是：一些组织，尤其是上皮组织，在生存中需要Ca2+和Mg2+才能维持组织的完整性。EDTA能从这些组织生存环境中吸收这些离子，形成螯合物，能促进组织中细胞相互分离。
胰蛋白酶EDTA消化法：EDTA作用比胰蛋白酶缓和，很少用于单独消化新鲜组织（传代细胞可单用），如与胰蛋白酶按不同比例相混合并用，消化作用更好。EDTA最适消化传代细胞，也多与胰蛋白酶混合使用（1：1或2：1）。
胶原酶消化法：胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在特定的生理PH和温度条件下特异性地水解胶原蛋白的三维螺旋结构，对非胶原蛋白无水解作用。所以胶原酶消化法适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织等。当胶原酶浓度为2mg/ml，PH为6.0,温度为37℃，可达到最佳消化效果。
胶原酶混合胰酶消化法：因胶原酶不含胰蛋白酶的水解位点，所以不对胶原酶造成破坏，而胶原酶只能水解胶原蛋白也不对胰蛋白酶产生影响，所以两种酶按最佳消化浓度1：1混合使用,能分离硬度较强的组织，如软骨细胞等。
小块组织贴壁法：利用组织小块对细胞瓶的贴壁生长性，使其长出延伸细胞，通过胰蛋白酶消化加以分离，从而获得原代细胞。
上述各类方法均存在一定的缺陷性：胰蛋白酶消化法，由于胰蛋白酶在长时间消化过程 中使细胞间连接蛋白得以消化的同时也消化细胞膜表面蛋白，从而影响细胞活性；EDTA消化法，其消化强度极弱，细胞难以从组织分离，同时容易螯合细胞所必须的钙、镁离子，细胞在消化过程中缺乏营养物质，易而降低活性；传统胶原酶消化法因溶剂中多用平衡液或简单培养基，不含促细胞生长因子，在较长的消化过程中，，也会影响所分离出来的细胞质量，也不能实现高效分离；传统胶原酶混合胰酶消化法，同样不能添加细胞因子和必须蛋白，只因胰蛋白酶对这些细胞生长因子和必须蛋白发生竞争式消化，即损耗了胰蛋白酶也消化了必须蛋白。总之，传统消化法，要么消化强度过大，要么分离时间较长，或使细胞消化过度死亡，或使细胞在分离过程中因缺少营养而活性减弱，还有小块组织贴壁法依靠细胞延伸生长，因延伸生长速度慢，因而获得原代细胞少且慢，大大降低组织细胞分离效率。
实用新型内容
为克服上述技术缺陷，本实用新型的目的是提供一种组织细胞分离培养试剂盒，又称之为原代细胞分离培养试剂盒。该试剂盒用于组织细胞分离培养，能保证所分离的细胞成活率高，贴壁速度快，达到高效分离的效果。
为实现上述目的，采用如下的技术方案：
本实用新型的一种组织细胞分离培养试剂盒，包括试剂盒本体，在所述试剂盒本体内盛装胶原酶浓缩液试剂瓶、胰蛋白酶EDTA浓缩液试剂瓶、营养因子浓缩液试剂瓶，抗生素浓缩液试剂瓶和青霉素玻璃瓶。
所述营养因子浓缩液试剂瓶为盛装有多种细胞生长因子、牛血清白蛋白和转铁蛋白浓缩液的试剂瓶。
所述抗生素浓缩液试剂瓶为抗细菌、霉菌等抗生素浓缩液试剂瓶。
所述青霉素玻璃瓶为5个5ml容量小玻璃瓶。所述试剂盒中还含有说明书。
所述胶原酶浓缩液试剂瓶为肝脏类胶原酶浓缩液试剂瓶或非肝脏类胶原酶浓缩液试剂瓶中的至少一种。胶原酶浓缩液试剂瓶主要分为两大类，根据实验者针对所分离的器官组织细胞，分为肝脏类胶原酶浓缩液试剂瓶和非肝脏类胶原酶浓缩液试剂瓶。
本实用新型的试剂盒存放于-20℃。使用该试剂盒进行组织细胞培养时，将试剂盒中的所有浓缩液缓慢融解，用培养基（分离细胞所需的适应培养基，使用时需自行提供）做稀释液，按本发明试剂盒提供说明书所指定的稀释度稀释胶原酶浓缩液；然后将营养因子浓缩液按指定的比例添加到胶原酶稀释液中；最后，按指定的稀释度在加入抗生素浓缩液，最终配制成A消化液。胰蛋白酶EDTA浓缩液用BSS平衡液稀释，按说明书中的稀释度稀释后配制成B消化液。
使用本试剂盒，胶原酶使用终浓度为0.2mg/ml，细胞生长因子使用终浓度为10ng/ml，牛血清白蛋白使用终浓度为0.3%，转铁蛋白使用终浓度为2mg/ml，胰蛋白酶EDTA使用终浓度为0.25%:0.02%=1:1。
操作流程：将细胞组织加BSS平衡液（PBS或Dhank，s）进行机械致碎，离心去BSS平衡液，加上述消化液A，待消化液A浑浊后，离心出去，用BSS平衡液离心洗三次，加上述消化液B进行短暂消化离心除去，即可。
本实用新型的试剂盒操作简便，机械化的操作，无需摸索条件；所分离的细胞成活率高，贴壁迅速。
附图说明
图1是本实用新型试剂盒的结构组成示意图。
具体实施方式
为使本实用新型更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本实用新型。应理解，这些实施例仅用于说明本实用新型而不用于限制本实用新型的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
实施例1：本实用新型的细胞分离培养试剂盒的优选实施例
本实用新型的一种组织细胞分离培养试剂盒的优选实施例，包括试剂盒本体1，在所述试剂盒本体1内盛装胶原酶浓缩液试剂瓶2、胰蛋白酶EDTA浓缩液试剂瓶3、培养基浓缩液试剂瓶4、抗生素浓缩液试剂瓶5和5个5ml青霉素玻璃瓶6。培养基浓缩液试剂瓶4内盛装有多种细胞生长因子、牛血清白蛋白和转铁蛋白浓缩液。抗生素浓缩液试剂瓶5为抗细菌、霉菌等抗生素浓缩液试剂瓶。试剂盒1中还含有说明书7。
在本实施例中，胶原酶浓缩液试剂瓶2包含两个试剂瓶：肝脏类胶原酶浓缩液试剂瓶21和非肝脏类胶原酶浓缩液试剂瓶22。具体结构可见图1，图1是本实用新型试剂盒的结构组成示意图。
实施例2：利用本实用新型的试剂盒分离狗肾脏器官组织细胞
本实施例以分离狗肾脏器官组织细胞为例，说明本试剂盒在组织细胞分离中的应用。所用试剂盒为实施例1中所述的试剂盒。
分离步骤如下：
1、实验室购买的实验狗经解剖获得肾脏器官；
2、用医用剪刀剪成小块，至1克重，分装到5ml容量的青霉素玻璃瓶6中。
3、再在5ml容量的青霉素玻璃瓶6中加入1ml的BSS平衡液（Dhank，s或PBS），用眼科小剪剪至1mm3大小。
4、组织待剪至1mm3大小后，加入4ml BSS平衡液，用移液管移至15ml离心管中，以600转/min离心1分钟，弃上清，此步骤反复操作3次，由于细胞碎片含大量的胶原蛋白，所以此操作的目的是除去细胞碎片等蛋白成分，以免影响A消化液的消化作用。
5、以上操作经3次低速离心除去上清，加入A消化液，37℃恒温，直至含组织小块的消化液浑浊可终止消化。
注：通过浑浊程度辨别终止消化，可参照说明书彩图，脑、肝脏组织等软组织消化速度较快，一般为4-6小时，而软骨、表皮等硬组织消化速度较慢，可过夜消化。
6、终止A消化液消化，即使用15ml离心管1000转/min离心3分钟，以除去A消化液，加10ml BSS平衡液再次1000转/min离心3分钟，除去上清，以达到洗掉A消化液的目的，以免影响B消化液的作用。
注：A消化后细胞外残留大量的蛋白，影响B消化液的对组织细胞进一步消化的活性。
7、除去上清后加入B消化液，37℃消化5-15分钟后，1000转/min离心3分钟，除去B消化液。加入细胞培养适合的完全培养基5ml进行原代培养。
上述步骤可见，使用本试剂盒主要是机械致碎，换液加消化液A，浑浊终止，再换液加消化液B进行短暂消化，过程相当简单，能节省实验人员的操作时间。
按上述步骤，利用本试剂盒可分离培养狗脾脏原代细胞、狗脑原代细胞、狗肾原代细胞、兔软骨原代细胞、兔心脏细胞、兔肺细胞。可见，本试剂盒适用的器官是非常广泛的。
对上述分离细胞进行台盼蓝鉴定细胞成活率实验，台盼蓝鉴定细胞成活率实验结果见表1，表1的数据表明与现有多种消化法比较，P＜0.01，统计学差异显著。说明本发明所获得的细胞成活率明显高于现有的胰蛋白酶消化法及胶原酶消化法，本发明消化分离所得的原代细胞成活率高。
从形态学上，对传统胰蛋白酶消化、传统胶原酶消化法和本发明所分离的细胞的贴壁速度做比较。通过原代细胞出现贴壁集落及贴壁细胞汇合度达70%以上所需要的时间的比较（比较结果见表2），结果证实利用本发明试剂盒所分离的原代细胞具有贴壁优势；与现有多种消化法比较，P＜0.01，统计学差异显著；说明本发明所分离的细胞的贴壁速度明显快于现有多种消化法。
表1
表2
注：-表示15天内观察不到超过40%汇合细胞，汇合度随细胞衰老而减少。
本实用新型的试剂盒利用胶原酶只消化胶原蛋白的特性，加入多种细胞生长因子和必须蛋白组成的无血清培养基，使其细胞在分离过程中得到充足营养；同时使用胰蛋白酶做进一步分离，可使组织细胞分离得更透彻。本实用新型的试剂盒操作简便，机械化的操作，无需摸索条件；所分离的细胞成活率高，贴壁迅速。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本实用新型的技术方案而非对本实用新型保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本实用新型作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本实用新型的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本实用新型技术方案的实质和范围。
Claims (4)
1.一种组织细胞分离培养试剂盒，包括试剂盒本体，其特征在于，在所述试剂盒本体内盛装胶原酶浓缩液试剂瓶、胰蛋白酶EDTA浓缩液试剂瓶、营养因子浓缩液试剂瓶、抗生素浓缩液试剂瓶、青霉素玻璃瓶。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述胶原酶浓缩液试剂瓶为肝脏类胶原酶浓缩液试剂瓶或非肝脏类胶原酶浓缩液试剂瓶中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗生素浓缩液试剂瓶为抗细菌、霉菌浓缩液试剂瓶。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述青霉素玻璃瓶为5个5ml容量小玻璃瓶。
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| CN104894056A (zh) * | 2015-06-19 | 2015-09-09 | 中国长江三峡集团公司中华鲟研究所 | 一种达氏鲟脾脏组织细胞系的构建方法 |
| CN111378613A (zh) * | 2018-12-27 | 2020-07-07 | 深圳华大生命科学研究院 | 一种两栖类动物细胞解离试剂盒 |
| CN112725262A (zh) * | 2021-02-25 | 2021-04-30 | 武汉博尔夫生物科技有限公司 | 一种提取乳鼠肾原代细胞的方法 |
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2011
- 2011-12-05 CN CN 201120500341 patent/CN202415563U/zh not_active Expired - Lifetime
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