CN1865429A

CN1865429A - 一种草菇菌种的低温保藏方法

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Publication number: CN1865429A
Application number: CNA2006100353117A
Authority: CN
Inventors: 朱红惠; 郭俊; 王永红; 李燕旋; 孙晓棠; 陈美标; 羊宋贞
Original assignee: Guangdong Institute of Microbiology
Current assignee: Guangdong Institute of Microbiology
Priority date: 2006-04-30
Filing date: 2006-04-30
Publication date: 2006-11-22
Anticipated expiration: 2026-04-30
Also published as: CN100371435C

Abstract

本发明提供一种草菇菌种长期低温保藏的方法，该方法的特点是：在草菇菌种接种的试管斜面中加入质量分数为10－40％的海藻糖溶液，使加入的海藻糖溶液完全覆盖住试管斜面中的培养基，然后将试管斜面放在4－6℃冷库中保存。本发明解决了草菇菌种不能低温保藏的问题，它方法简单、方便、成本低廉，适用于广大的草菇生产企业、科研单位和大专院校。

Description

一种草菇菌种的低温保藏方法

技术领域

本发明涉及到微生物技术领域，具体讲是涉及到微生物资源的保藏技术领域。

背景技术

草菇(Volvariella volvacea(Bull ex Fr.)Sing)属担子菌纲伞菌目光柄菇科，别名兰花菇、包脚菇、麻菇。鲜草菇肉质细嫩，干草菇香味浓郁，营养丰富，还含有抑制癌细胞生长的物质。通常供食用的草菇是未开伞的子实体。草菇的人工栽培始于中国广东、湖南等省。1981年世界产鲜草菇近6万吨，其中中国(含台湾省)产量达4万余吨，居世界首位。其他的出产国有泰国、印尼、菲律宾、印度等。草菇是广东栽培最多的食用菌，据不完全统计，1997年广州地区草菇产量超过1万吨，全省总产量超过2万吨。草菇是食用菌中生长最快的一种，从播种至采收只需10天左右，一般13天-20天完成一个生长周期，是目前广东经济效益最好的食用菌之一。

草菇是食用菌大家庭中需求温度最高的品种。草菇菌种不耐低温，较长时间保藏在10℃以下环境里会失去活力，甚至死亡，所以，它不能像其他品种的菌种一样利用冰箱在0-4℃条件下保藏。目前草菇菌种的保藏方法有：传代培养保藏法、液体石蜡覆盖保藏法、栽培保藏法、液态氮超低温保藏法、悬液保藏法、自然基质简易保藏法等。生产上最常用的保藏方法是传代培养保藏法。根据培养基成分的不同，传代培养保藏有两种方式：试管斜面接种培养保藏：将需要保藏的草菇菌种接到PDA试管斜面，在30℃下培养，菌丝长满培养基后，在20℃左右温度下存放，最低不要低于15℃。为减少保藏过程中基内水分的散失，通常将菌种放在塑料袋中，亦可用橡胶塞封紧管口。并每隔2-3个月转管1次。另一种是固体母种培养保藏：稻草粉(或麦草等)95％，，石膏2％，，麸皮或米糠3％，用石灰调节pH值8-9，含水量55-60％，。将配好的培养基装入直径25毫米、长250毫米的试管中，装料量为试管长度的2/3，用棉塞封管口。灭菌后，接上草菇菌种，在33℃条件下培养，待菌丝长满试管时，用橡胶塞代替棉塞封紧管口。置15-20℃条件下保藏，每隔3-6个月转管1次。但是多次转管会引起菌种退化或杂菌感染，质量得不到保证。而且需要的15-20℃的温度也比较难控制。采用液态氮超低温保藏法是最可靠和有效的方法，但由于其需要的设备昂贵，需要的液氮成本很高，因此这种方法在一般的食用菌生产企业是很难实施的。所以寻找其他的草菇菌种保藏方法是非常重要的。在这样的情况下，本发明所提供的低温保藏方法可以解决草菇菌种保藏上遇到的困难，使得本发明显得十分重要和有意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种草菇菌种长期低温保藏的方法，以解决草菇菌种不能低温保藏的问题，它方法简单、方便、成本低廉，适用于广大的草菇生产企业、科研单位和大专院校。

根据海藻糖可以保护动植物细胞和蛋白质不受冻，在冷冻、冷藏时防止蛋白质性质变化的特性，本发明采用海藻糖来实现对草菇菌种的低温保存。

本发明方法的特点是：

在草菇菌种接种的试管斜面中加入质量分数为10-40％的海藻糖溶液，使加入的海藻糖溶液完全覆盖住试管斜面中的培养基，然后将试管斜面放在4-6℃冷库中保存。

具体的，本发明方法包括以下步骤：

(1)草菇菌种的培养：将草菇菌种接种到新鲜的马铃薯斜面培养基上，培养7-14天；

(2)海藻糖溶液的准备：称取10-40克海藻糖，加入100mL纯水，溶解后配制成10-40％的海藻糖溶液，过滤灭菌；

(3)将过滤灭菌后的海藻糖溶液用灭菌的移液管转移到准备好的草菇菌种试管斜面中，使海藻糖溶液完全覆盖住试管斜面中的培养基，然后将试管斜面放在4-6℃冷库中保存。

本发明方法中加入草菇菌种试管斜面中的所述的海藻糖溶液的量可多可少，但均以使海藻糖溶液能完全覆盖住试管斜面中的培养基为准。

所述的培养基采用常规的综合马铃薯培养基配方。

采用本发明的方法保藏草菇的效果测试

1.生存活性测定结果：

1)综合马铃薯培养基的配制：20％Potato extract(马铃薯汁)1L，Glucose(葡萄糖)20g，KH₂PO₄ 3g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，Vitanib B1(硫胺素)Trace(微量)，Agar(琼脂)15g，pH 6，分装为250mL/瓶，15磅灭菌30分钟。灭菌后制备成平板备用。(注：取去皮马铃薯200克，切成小块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升，即为20％马铃薯汁。)

2)从保存的草菇试管斜面中挖取一小块菌块，放在准备好的综合马铃薯平板上，28℃培养箱中培养，观察草菇菌种的长势。

2.次生代谢产物测定结果：分别用无菌水和乙酸乙酯抽提菌株代谢产物进行HPLC分析。

1)水溶性和酯溶性次生代谢产物的提取：

取平板上生长的草菇菌体，用乙酸乙酯在80℃水浴中回流6h，进行提取离心取上清液；另1份用沸水进行提取015h，离心取上清液，反复多次，直至提取液色淡，并将几次沸水提取液混合。将乙酸乙酯、沸水提取液浓缩，并调节pH至7.0，然后用提取剂定容至2ml，放入4℃的冰箱中备用。

2)HPLC分析代谢产物：

色谱柱：HYPERSIL BDS 5μ，4.6×250mm

色谱仪：Waters 510

检测器：Waters 996 PDA(二极管阵列检测器)

进样量：10μL

检测波长：254nm

流动相：甲醇+0.02M磷酸盐缓冲液＝4+96(甲醇∶0.02M磷酸盐缓冲液＝0.04∶0.96)

0.02M磷酸缓冲液 pH5.6

甲醇∶水＝0.4∶0.6，流速1.0mL/min

3.遗传稳定性分析：采用ERIC-PCR分子指纹图谱分析

1)DNA的提取：

试剂：

溴化十六烷三甲基铵(CTAB)溶液：

酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)

氯仿∶异戊醇(24∶1)

70％乙醇

TE：10mM Tris-Hcl

1mM EDTA-Na pH8.0

方法：

A.将菌丝转移至灭过菌的研钵中，充分研磨。

B.加600ul 2×CTAB溶液，转入1.5ml离心管，振荡混匀。

C.65□水浴40min。

D.10,000r/min离心10min，取上清液。

E.用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，10,000rpm离心10分钟，将上清液移至干净离心管。

F.用等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，取上清液移至干净管中。

G.加0.6倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静止1小时，沉淀DNA。

H.14,000rpm离心20分钟，收集DNA沉淀。

I.DNA沉淀加500ul 70％醇漂洗，自然风干。

J.加20ul TE溶解DNA，-20□保存。

2)ERIC-PCR扩增：

ERIC-PCR的扩增引物为ERIClR(3’-CACTTAGGGGTCCTCGAATGTA25’)和ERIC2

(5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’)。引物合成由大连宝生物公司进行。进行ERIC-PCR扩增反应的试剂盒购买于大连宝生物公司。

PCR反应体系：

成分终浓度

浓缩反应缓冲液 1×工作浓度

dNTP混合物各0.2mmol/L

Taq DNA聚合酶 0.5～1.0U/50uL

氯化镁(MgCl₂) 1.5mmol/L

上游引物 1umol/L

下游引物 1umol/L

模板 102～105拷贝/50ul

无菌水将反应体积补足50ul

按图8所示程序流程进行PCR反应，

1％的琼脂糖凝胶电泳检测ERIC-PCR扩增结果。

采用本发明所述的方法保藏8个月后草菇菌种生存能力情况如图1、图2所示，其中：

图1是10-40％的海藻糖保藏；图2是清水对照。

采用本发明所述的方法保藏8个月后草菇菌种次生代谢产物情况如图3、图4、图5、图6所示，其中：

图3是用水提取次生代谢产物(清水对照)；图4是用水提取次生代谢产物(10-40％的海藻糖保藏)；图5是用乙酸乙酯提取次生代谢产物(清水对照)；图6是用乙酸乙酯提取次生代谢产物(10-40％的海藻糖保藏)。

采用本发明所述的方法保藏8个月后草菇菌种遗传指纹图谱的情况如图7所示，其中：

Line1、8：DLM-3000M；Line2-5：10-40％的海藻糖保藏；

Line6-7：清水对Line9：100bp M。

保藏效果分析：

对于菌种的保藏效果，一直以来，人们只把菌种的生存活性作为一个重要的标准来评价该菌种是否能用，从而评价某种保藏方法是否适合该菌种的保藏。但是这种评价标准具有一定的局限性，比如，无法洞察保藏过程中产生的变异。评价一种保藏方法对菌种的生理生化特征和遗传稳定的影响，包括培养特征、生长效率、次生代谢产物、酶和基因组。目前有两种方法能够评价保藏效果：一种是利用光学冷冻显微镜直接观察测试细胞在冷冻和冻融时的状态，评价指标主要包括细胞收缩、细胞外冰晶的形成、细胞内冰晶的形成、细胞膜的解体和细胞的破裂；另一种方法是设计试验来评价菌种低温保藏前后特性是否改变。这些特性包括基于PCR技术的基因指纹图谱(RAPD，AFLPs，SSR)、次生代谢产物、酶活性测定、蛋白分析、培养形态特征、生存活力、孢子形成能力等等。

我们以生存活力、厚垣孢子形成、次生代谢产物变化和基因指纹图方法分析了采用本发明设计的低温保藏方法保藏草菇菌种的效果，结果见图1-7。

图1是生存活性测试情况，从图1可以看出，采用本发明的保藏方法在4-6℃保藏草菇菌种8个月后，其生存活性与不采用低温保藏的草菇菌种的菌丝生长速率、厚垣孢子的形成没有差别。

图3-6是次生代谢产物测试结果，从图中可以看出，采用本发明的保藏方法在4-6℃保藏草菇菌种8个月后，其次生代谢产物没有发生改变。

图7是草菇菌种经低温保藏后的分子指纹图谱分析，从凝胶电泳图谱可以看出，采用本发明的保藏方法在4-6℃保藏草菇菌种8个月后，其遗传稳定性与对照相比没有发生改变。

从保藏效果看，采用本发明设计的方法，成功实现了草菇菌种在4-6℃的保藏。

本发明与现有技术相比，具有以下创新和优点：

(1)实现了草菇菌种的低温保藏，目前草菇菌种都只能在15-20℃保存，而且一般3-6个月就需要转接，菌种容易污染和退化。而采用本发明的方法可以将草菇放在4-6℃保藏，保藏时间达到8个月以上而不需要转管，且操作方法简单。

(2)采用本发明的保藏方法保藏草菇，其存活率高，存活菌的性质和功能稳定。采用本发明的方法保藏草菇，8个月后测定其遗传稳定性，次生代谢产物和生存活性，结果显示采用本发明的保藏方法保存草菇菌种，其分子指纹图谱(基因功能)、代谢指纹图谱(次生代谢产物)、生存活性都没有发生改变。

(3)本发明方法简单，对技术和设备要求相对较低，仅需要一些玻璃试管和常规冰箱。

(4)本发明成本低廉，海藻糖最先从酵母中提取制造，由于收获率低而价格很高。1993年，日本的林原发新了一种全新的海藻糖生成酵素，开发研制出从淀粉中直接提取制造海藻糖的技术，因此海藻糖的价格也大大下降，被广泛应用在各个领域。

本发明也可用于其他高温担子菌或一般担子菌菌种的保藏，比如姬松茸，蛹虫草，灵芝等。

本发明对食用菌行业的意义较大：食用菌是指松茸、蘑菇、香菇、木耳等可供食用的大型真菌及灵芝、虫草、天麻等可供药用或食药兼用的大型真菌。食用菌产业目前在世界各地都在迅猛发展，中国已成为世界上最大的的食用菌生产国和出口国，食用菌年产量占世界总产量的60％，占全球出口量的40％，占亚洲出口量的80％。食用菌产业已成为我国农业中的一个重要产业。但与市场需求形成强烈反差的是食用菌菌种的质量不稳定，严重影响食用菌的生产。菌种是食用菌产业的源头，食用菌同其他微生物一样繁殖速度快，变异频率高，菌种对最终产品的影响比一般农作物要大的多。因此，对食用菌来讲，保持菌种的形态型和基因型是非常重要的。目前食用菌菌种的保藏大多采用试管斜面，在4℃冰箱保藏，这些保藏方法都需要3-4个月转管1次，费时费力，且菌种容易污染和退化。而且有些高温食用菌由于不能忍受低温只能保藏在常温条件下，这对菌种的保藏也造成不便。因此寻找更有效、安全可靠的菌种保藏新技术是我国乃至世界食用菌产业急需解决的重大基础研究问题。本发明的方法虽然只是研究了对草菇的效果，但从理论上为食用菌菌种的保藏提供了新的方法，有望在今后用于整个食用菌菌种的保藏。

附图说明

图1是采用本发明所述的方法保藏8个月后草菇菌种的生存活性测试图；

图2是用水保藏草菇菌种的生存活性测试图(本发明的清水对照)；

图3显示用水提取草菇菌种次生代谢产物(清水对照保藏者)的情况；

图4显示用水提取草菇菌种次生代谢产物(10-40％的海藻糖保藏者)的情况；

图5显示用乙酸乙酯提取草菇菌种次生代谢产物(清水对照保藏者)的情况；

图6显示用乙酸乙酯提取草菇菌种次生代谢产物(10-40％的海藻糖保藏者)的情况；

图7是本发明所述的方法保藏8个月后草菇菌种遗传指纹图谱的情况；

图8是PCR反应程序流程图。

具体实施方式

实施例一

1.草菇菌种的培养：

1)综合马铃薯培斜面养基的配制：20％Potato extract(马铃薯汁)1L，Glucose(葡萄糖)20g，KH₂PO₄ 3g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，Vitanib B1(硫胺素)Trace(微量)，Agar(琼脂)15g，pH 6，分装为10mL/管，15磅灭菌30分钟后摆成斜面备用。

(注：取去皮马铃薯200克，切成小块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升，即为20％马铃薯汁。)

2)将草菇菌种接种到新鲜的综合马铃薯斜面培养基上，培养10天后备用。

2.海藻糖溶液的准备：配制30％的海藻糖溶液，称取30克海藻糖，加入100mL纯水，溶解后过滤灭菌。海藻糖从广州市华柏食品添加剂有限公司购买。

3.草菇菌种的低温保藏(本发明提供的方法)：将过滤灭菌后的海藻糖溶液用灭菌的移液管转移到准备好的草菇菌种试管斜面中，每管加入海藻糖溶液10mL，使之完全覆盖住试管斜面中的培养基。将试管斜面放在4℃冷库中保存。

实施例二

1.草菇菌种的培养：

1)综合马铃薯培斜面养基的配制：20％Potato extract(马铃薯汁)1L，Glucose(葡萄糖)20g，KH₂PO₄ 3g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，Vitanib B1(硫胺素)Trace(微量)，Agar(琼脂)15g，pH6，分装为10mL/管，15磅灭菌30分钟后摆成斜面备用。

2)将草菇菌种接种到新鲜的综合马铃薯斜面培养基上，培养8天后备用。

2.海藻糖溶液的准备：配制40％的海藻糖溶液，称取40克海藻糖，加入100mL纯水，溶解后过滤灭菌。海藻糖从广州市华柏食品添加剂有限公司购买。

3.草菇菌种的低温保藏(本发明提供的方法)：将过滤灭菌后的海藻糖溶液用灭菌的移液管转移到准备好的草菇菌种试管斜面中，每管加入海藻糖溶液10mL，使之完全覆盖住试管斜面中的培养基。将试管斜面放在5℃冷库中保存。

实施例三

1.草菇菌种的培养：

2)将草菇菌种接种到新鲜的综合马铃薯斜面培养基上，培养14天后备用。

2.海藻糖溶液的准备：配制15％的海藻糖溶液，称取15克海藻糖，加入100mL纯水，溶解后过滤灭菌。海藻糖从广州市华柏食品添加剂有限公司购买。

3.草菇菌种的低温保藏(本发明提供的方法)：将过滤灭菌后的海藻糖溶液用灭菌的移液管转移到准备好的草菇菌种试管斜面中，每管加入海藻糖溶液10mL，使之完全覆盖住试管斜面中的培养基。将试管斜面放在6℃冷库中保存。

Claims

1.一种草菇菌种的低温保藏方法，其特征在于：在草菇菌种接种的试管斜面中加入质量分数为10-40％的海藻糖溶液，使加入的海藻糖溶液完全覆盖住试管斜面中的培养基，然后将试管斜面放在4-6℃冷库中保存。

2.根据权利要求1所述的草菇菌种的低温保藏方法，其特征在于包括以下步骤：

(3)将过滤灭菌后的海藻糖溶液用灭菌的移液管转移到准备好的草菇菌种试管斜面中，将试管斜面放在4-6℃冷库中保存。