CN106399132A - 一株白囊耙齿菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株白囊耙齿菌，命名为白囊耙齿菌(Irpex lacteus)PR2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.13190。本发明系首次从大兴安岭野生蓝莓根部中分离、纯化出一种白囊耙齿菌，利用液体有氧发酵获得白囊耙齿菌的大量菌丝，以乙醇作为提取溶剂，通过超声提取得到能够促进作物根系生长、提高抗逆性、促进开花、提高产量和作物品质的天然物质，有利于进一步开发具有超高促生活性的天然化合物；而且整个生产过程中无三废产生，低成本高效益，符合环保、粮食安全生产的社会需求。

Description

一株白囊耙齿菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株白囊耙齿菌及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
随着人口的增加和耕地的减少，我国粮食安全与资源消耗和环境保护的矛盾日益尖锐。肥料在农业生产中占据重要地位，但是在使用过程中存在一些不合理的因素，导致肥料的生产性能没有得到有效地发挥，使得土壤肥力下降，肥料利用率降低，农业生产成本增加，效益降低，导致农产品品质下降，污染生态环境，加速土壤质量衰退，直接影响粮食持续增产、农业提质增效、农民节本增收和农产品质量安全。
近年来，随着微生物代谢工程的兴起，植物基因表达调控方面的一些高活性化合物被不断地从微生物中发现，这些化合物揭示了植物与微生物之间长期共同进化关系。通过调整逆境中植物基因的表达，使植物得以在逆境中健康生长，解决农业生态系统中土壤退化、气候剧变等问题。
白囊耙齿菌(Irpex lacteus)是一种腐生真菌，子实体一般生长在阔叶树的枯木或腐朽木上，该菌种含有许多营养物质，如蛋白质、多糖、多肽等，具有免疫调节功能。该菌主要分布在吉林省的长白山、黑龙江、河北、山西、江西、甘肃、云南、福建、西藏等省区。目前，对于白囊耙齿菌的研究主要集中在其耐缺氧作用(CN104138395A)、抗疲劳作用(CN104138396A)和降解木质素的作用(CN105754881A)等；而对于白囊耙齿菌在促进作物生长、提高抗病性和肥料利用率方面还未见报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一株白囊耙齿菌及其应用。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
根据本发明的第一方面，提供一株白囊耙齿菌，命名为白囊耙齿菌(Irpexlacteus)PR2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，菌种保藏号为CGMCCNO.13190。
该菌株是从大兴安岭野生蓝莓根部中分离得到，菌株在PDA培养基上，25℃培养一周，直径80-85mm，菌落平坦，菌丝白色，平铺，绳状，边缘羊毛状。两周后菌丝变成淡黄色，有宜人的水果香味。菌丝直径2-4mm，菌丝有隔膜，着色深，均匀，且多分支，呈网状。
根据本发明的第二方面，提供一种植物诱抗剂，其活性成分为上述白囊耙齿菌(Irpex lacteus)PR2的发酵后菌丝体的乙醇提取物。
本发明还提供上述植物诱抗剂的制备方法，包括：发酵上述的白囊耙齿菌(Irpexlacteus)PR2，将发酵液离心过滤，得到菌丝体的步骤；以及将菌丝体采用乙醇进行提取的步骤。
上述制备方法中，发酵采用的发酵培养基的原料组成为：马铃薯提取液1000ml、酵母膏1.0g、蛋白胨3.0g、葡萄糖15.0g、琼脂17.0g。
所述马铃薯提取液的制备方法为：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升。
上述制备方法中，发酵的条件为：接种量为5-15％(体积百分数)、发酵培养温度为20-30℃，培养4-6天；优选的，发酵的条件为：接种量为10％、发酵培养温度为25℃，培养5天。
上述制备方法中，乙醇提取的操作为：将菌丝体干燥、粉碎，加入乙醇冷浸20-30h，然后超声提取0.5-1.5h；重复提取2-4次，合并滤液，即得。
优选的，所述乙醇提取的操作为：将菌丝体在50℃下干燥、粉碎，加入乙醇冷浸24小时，然后超声提取2h；重复提取2次，合并滤液。
所述乙醇的加入量为菌丝体(干燥后)重量的15-30％；每次提取加入乙醇的量相同。
根据本发明的第三方面，提供上述白囊耙齿菌(Irpex lacteus)PR2和/或植物诱抗剂在促进农作物生长或者促进农作物增产中的应用。
上述应用中，所述农作物为马铃薯、水稻或大姜。
上述应用中，促进马铃薯增产的应用方法为：播种时，以本发明的植物诱抗剂10ml/亩喷沟；膨大期，以本发明的植物诱抗剂50ml/亩加氨基酸水溶肥，随水滴灌。
本发明的有益效果：
本发明系首次从大兴安岭野生蓝莓根部中分离、纯化出一种白囊耙齿菌，利用液体有氧发酵获得白囊耙齿菌的大量菌丝，以乙醇作为提取溶剂，通过超声提取得到能够促进作物根系生长、提高抗逆性、促进开花、提高产量和作物品质的天然物质，有利于进一步开发具有超高促生活性的天然化合物；而且整个生产过程中无三废产生，低成本高效益，符合环保、粮食安全生产的社会需求。
附图说明
图1：PR2菌株菌落形态。
图2：PR2菌种的菌丝形态(40×0.65和100×1.4)。
图3：菌株PR2通过ITS序列分析建立的系统发育树。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1：菌株的分离和鉴定
1.菌株的分离与筛选：
(1)菌株的分离
取新鲜的大兴安岭野生蓝莓根样分别用流水冲洗干净，用滤纸吸干水分，剪成适当大小，用无菌水冲洗3次，在10％的H2O2中消毒10min，用无菌水冲洗3遍，转入6％的次氯酸钠溶液中浸泡2min，然后用无菌水冲洗3～5遍，放在无菌的滤纸片上，吸干表面水分。用无菌剪刀剪成1cm左右的根段，接种到121℃高温高压灭菌30min后的PDA培养基上。置于23℃度培养箱培养3～10天后，即可见样品切割过的边缘长出菌丝，经平板反复分离、纯化；直至每个平板上只含有统一特征的单一菌落。最后得到一株菌，编号为PR2；
PDA培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml。
2.菌株PR2的形态及生物学特性测定
将菌株PR2在PDA培养基上，25℃培养一周，直径80-85mm，菌落平坦，菌丝白色，平铺，绳状，边缘羊毛状。两周后菌丝变成淡黄色，有宜人的水果香味。菌丝直径2-4mm，菌丝有隔膜，着色深，均匀，且多分支，呈网状。该菌具有耙齿菌属的特征，初步判定为白囊耙齿菌(Irpex lacteus)；(该菌的菌落形态如图1所示，不同放大倍率下的菌株的菌丝形态如图2所示(左图放大倍率为40×0.65，右图放大倍率为100×1.4)。
3.菌株PR2的分子生物学鉴定
以ITS1和ITS4为引物，对从野生蓝莓根部中分离的真菌PR2菌株进行了扩增，并对扩增产物进行了测序；
ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；
ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。
扩增产物的序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
基于blast搜索，选取与研究菌株序列最接近的种或最靠近的进化分支代表菌株的序列进行比对，利用Mega6.0软件通过ML算法，利用bootstrap 1000次建树结果建立进化树(如图3所示)。
结果表明PR2真菌与白囊耙齿菌(Irpex lacteus)的同源相似性达到99％，氨基酸序列的相似性也达到了94％。
通过形态学鉴定和分子生物学鉴定，最终鉴定结果菌株PR2为白囊耙齿菌(Irpexlacteus)。
将筛选分离得到的菌株命名为白囊耙齿菌(Irpex lacteus)PR2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，菌种保藏号为CGMCC NO.13190。
实施例2：植物诱抗剂的制备
具体制备方法如下：
1.发酵培养：
将4℃下保存在试管斜面上的实施例1分离保藏的白囊耙齿菌(Irpex lacteus)PR2的菌种，接到PDA培养基上，25℃培养一周，琼脂挖块接种于装有50mLPDA培养液的250mL三角烧瓶，于25℃，180r/min下旋转摇床上培养3天作为种子，以10％量接种入装有150mL发酵培养基的500mL三角瓶中，同样条件下培养5天，终止发酵，得种子液。
PDA培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml。
发酵培养基配方：马铃薯提取液1.0L，酵母膏1.0g，蛋白胨3.0g，葡萄糖15.0g，琼脂17.0g。
马铃薯提取液的制备：取去皮马铃薯200克，切成小块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升。
2.乙醇提取：
将发酵液离心过滤，得菌丝体，将菌丝体在50℃下干燥、粉碎，加入乙醇冷浸24小时，然后超声提取2h；重复提取2次，合并滤液，即得植物诱抗剂。所述乙醇的加入量为菌丝体干燥后重量的20％；每次提取加入乙醇的量相同。
实施例3：植物诱抗剂在马铃薯促生和增产中的应用
1.试验方法：
马铃薯播种日期为2015年4月18-19日，播种密度为3300-3500株/亩，垄距55cm，株距35cm，切块播种，种植时施用氨基酸水溶肥。实施过程中，马铃薯生长季农事操作与大田种植相同。
处理1：常规处理，即：播种时，未添加内生菌提取液(即实施例2制备的植物诱抗剂)喷沟；膨大期，氨基酸水溶肥，随水滴灌。
处理2：播种时，内生菌提取液(即实施例2制备的植物诱抗剂)10ml/亩喷沟；膨大期，氨基酸水溶肥，随水滴灌。
处理3：播种时，内生菌提取液(即实施例2制备的植物诱抗剂)10ml/亩喷沟；膨大期，内生菌提取液(即实施例2制备的植物诱抗剂)50ml/亩加氨基酸水溶肥，随水滴灌。
每个处理重复3次。
2.试验结果：
对苗期马铃薯出苗、株高、根系发育情况进行田间调查。在不同地段连续5m测产，重复5次。计算亩产量和增产率，结果如表1。
表1不同处理对马铃薯生物性状及产量的影响
处理 株高(cm) 根长(cm) 茎粗(cm) 平均亩产(kg) 增产
处理1 29.5 13 0.79 3587 /
处理2 31 15.4 0.80 3767 5.02％
处理3 33 17 0.91 3980 10.96％
由表1可知，处理3中马铃薯的生物性状，比如株高、根长、茎粗，均比处理2和处理1有明显增加，长势旺盛。测产过程中，处理2比处理1增产5.02％，处理3的马铃薯增产幅度最大，达到10.96％。结果说明，内生菌提取液对马铃薯植株的生长和产量影响较大，效果明显。
实施例4：植物诱抗剂在水稻促生和增产中的应用
1.试验方法：
本实验于黑龙江省农垦总局进行，4月10日播种，10月5日成熟收获。采用小区试验法，不设重复，各处理单排单灌。试验设计2个处理，每个处理100盘，具体安排如下：
处理1、常规对照，苗床按常规管理正常施肥，不另施其他叶面调节肥；
处理2、水稻秧苗2叶1心施用一次添加内生菌提取液(即实施例2制备的植物诱抗剂)的水溶性肥料，用量：每袋(5g/袋)兑水15L喷洒100个秧盘；移栽后15天喷施，4袋/亩。其他施肥时期和施肥量按常规管理。
2.试验结果：
整理水稻生长指标、考种结果、产量和增产率，结果如表2、表3所示。
表2水稻生长指标和考种结果的比较
由表2可以看出，添加内生菌提取液水溶性肥料能明显增加水稻分蘖，通过增加水稻穗数，达到提高产量的目的。
表3不同处理对水稻产量构成因素的影响
处理 理论产量(公斤/亩) 实际产量(公斤/亩) 增产(公斤/亩) 增产率％
处理1 620.93 603.64 - -
处理2 661.17 636.23 32.59 5.40％
由表3可以看出，处理2与处理1比较，增产32.59公斤/亩，增产率高达5.40％。说明该内生菌提取物对水稻生长有促进作用，提高水稻的接穗数和结实率，从而提高水稻亩产量和增产率。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 泰安市煜达生物科技有限公司
<120> 一株白囊耙齿菌及其应用
<130> 2016
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 643
<212> DNA
<213> PR2菌株
<400> 1
tatgcttaag ttcagcgggt agtcctacct gatttgagct cagattgtca aatgattgtc 60
tcggcaagga gacggttcga agcatgaaca ccataaatac ttcaacacca cagcgcagat 120
aattatcaca ctgaaggcga tccgtaagat tcacgctaat gcatttcaga ggagtcgacc 180
gacaagggcc gacacaacct ccaagtccaa gcccgctaaa ccttcattac aaaagtttag 240
gggttgagaa taccatgaga ctcaaacagg catactcctc ggaataccaa ggagtgcaag 300
gtgcgttcaa agattcgatg attcactgaa ttctgcaatt cacattactt atcgcatttc 360
gctgcgttct tcatcgatgc gagagccaag agatccgttg ctgaaagttg tatataaatg 420
tgttatacac agttgacatt ctataactga agcgtttgta gtaaaacata agaaagaaaa 480
acggcttgtt caaccgaaga cctctcgcga gatcctggaa gcttccacca tttttttctc 540
ttacataaag tgcacagagg ttaagagtgg atgagccagg cgtgcacatg cctcgtgaga 600
ggccagctac aacccgttca aaactcgata atgatccttc cgc 643

Claims (10)

1.一株白囊耙齿菌，命名为白囊耙齿菌(Irpex lacteus)PR2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.13190。
2.一种植物诱抗剂，其活性成分为权利要求1所述的白囊耙齿菌(Irpex lacteus)PR2的发酵后菌丝体的乙醇提取物。
3.权利要求2所述的植物诱抗剂的制备方法，其特征在于，包括：发酵上述的白囊耙齿菌(Irpex lacteus)PR2，将发酵液离心过滤，得到菌丝体的步骤；以及将菌丝体采用乙醇进行提取的步骤。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，发酵采用的发酵培养基的原料组成为：马铃薯提取液1000ml、酵母膏1.0g、蛋白胨3.0g、葡萄糖15.0g、琼脂17.0g。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述马铃薯提取液的制备方法为：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，发酵的条件为：接种量为5-15％、发酵培养温度为20-30℃，培养4-6天；优选的，发酵的条件为：接种量为10％、发酵培养温度为25℃，培养5天。
7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，乙醇提取的操作为：将菌丝体干燥、粉碎，加入乙醇冷浸20-30h，然后超声提取0.5-1.5h；重复提取2-4次，合并滤液，即得；优选的，所述乙醇提取的操作为：将菌丝体在50℃下干燥、粉碎，加入乙醇冷浸24小时，然后超声提取2h；重复提取2次，合并滤液。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述乙醇的加入量为菌丝体重量的15-30％；每次提取加入乙醇的量相同。
9.权利要求1所述的白囊耙齿菌(Irpex lacteus)PR2和/或权利要求2所述的植物诱抗剂在促进农作物生长或者促进农作物增产中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述农作物为马铃薯、水稻或大姜。
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