CN1422962A - 生物品种基因组dna指纹图谱 - Google Patents

Abstract

生物品种基因组DNA指纹图谱。本发明应用分子遗传标记技术构建生物品种包括人、植物、动物、微生物等基因组DNA指纹图谱,根据DNA指纹图谱的特征,建立DNA指纹数据库,对待鉴定生物品种与标准生物品种DNA指纹图谱和数据进行自动比较和判别分析,明确待鉴定生物品种。本发明具有重复性好、稳定可靠、灵敏度高的优点,实现了生物品种DNA分子水平鉴定分析的自动化,为生物品种的准确鉴定提供了强有力的工具,亦为大规模DNA指纹数据库的建立提供支持系统,在医疗、药检、农业、林业、畜牧业、海关、法医等部门有重要应用价值。

Description

生物品种基因组DNA指纹图谱

[技术领域]本发明涉及一种生物品种包括植物、动物、微生物及人类基因组DNA指纹图谱的构建方法及指纹图谱的应用。

[背景技术]生物品种包括植物、动物、微生物及人类等的鉴定和识别，目前主要根据其来源、性状、显微及理化等方法来鉴定，尚缺乏一种科学、客观、快速的鉴定手段。扩增片段长度多态性DNA(amplified fragmentlength polymorphism，AFLP)是Vos等于1995年在Zabeau的基础上发展的用于构建DNA指纹图的技术，属于第三代分子遗传标记新技术。与第一代分子遗传标记—限制性片段长度多态性(restriction fragment lengthpolymorphism，RFLP)及第二代分子遗传标记—随机扩增多态性DNA(randomamplification polymorphism DNA，RAPD)构建的DNA指纹图相比，该技术结合了RFLP的可靠性及RAPD的高效性特点，具有重复性好、稳定可靠、多态性丰富及灵敏度高的优点，展示了AFLP技术特别适合生物品种鉴定的应用价值和广阔前景。

[发明内容]为了开辟生物品种鉴定自动化的新途径、新技术，广泛用于植物、动物、微生物品种和法医鉴定，特提出本发明。

本发明应用分子遗传标记技术—扩增片段长度多态性DNA(AFLP)构建生物品种包括人、植物、动物、微生物等基因组DNA指纹图谱，根据DNA指纹图谱的特征，建立相应的数学模型，采用计算机技术建立DNA指纹图谱数据库，设计计算机支撑软件，实现生物品种DNA分子水平自动识别。

具体技术方案如下：筛选和鉴定生物标准品(植物、动物、微生物等)，提取与纯化生物品种基因组DNA，设计和合成含限制性核酸内切酶，即同时含稀有切割酶如EcoRI等和频繁切割酶如MseI等酶切位点的人工合成的DNA双链接头，用稀有切割酶和频繁切割酶如EcoRI/MseI等联合酶切生物品种基因组DNA，并与已设计相应的人工合成的DNA双链接头连接以制备AFLP模板DNA，根据人工合成的DNA接头碱基的序列，设计3′端带有3个选择碱基的引物作放射5′末端标记，进行PCR扩增，PCR产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，获取放射自显影DNA指纹图谱，经计算机图像扫描仪扫描，获取DNA指纹数据和DNA指纹图谱，使用数据库系统建立DNA指纹数据库，建立DNA指纹图谱相似系数数学模型，设计DNA指纹图谱数据处理软件并建立自动识别支撑环境，对待鉴定生物品种与标准生物品种DNA指纹图谱和数据进行自动比较和判别分析，明确待鉴定生物品种为何标准品。

原始图像的获取

对本发明中经由放射自显影产生的DNA指纹图谱照片由计算机图像扫描仪进行扫描存入磁盘中。由于获得的图像质量较好，图像的分辨率和信噪比较高，因此只需进行简单的图像预处理，包括图像校正、灰度线性变换、去除噪声等。将最后处理好的图像存入原始图像数据库中。

数学模型的建立

根据构建的DNA指纹图谱的特征，建立生物品种标准品与待鉴定生物品种之间的相似系数模型。假设DNA指纹图谱条带的迁移距离为D，则根据DNA指纹图谱条带的顺序和位置，比较两个样品DNA指纹图谱条带是相同条带的判别公式为： $\frac{|D_i-{D_i}^{\&prime;}|}{D_i}<T$ 其中，T：可接受的相似度系数阀值；

  D_i：某种生物品种标准样品DNA指纹图谱第i带的迁移距离；

  D_i’：待鉴定生物品种样品DNA指纹图谱第i带的迁移距离。

两个样品的DNA指纹图谱相似度系数(T)被理解为两个样品的DNA指纹位置相同的条带数与两者总条带数的比值，用公式表示为： $\frac{{2n}_{\mathrm{1,2}}}{n_1+n_2}$ 其中，n_1，2：两个生物品种样品DNA指纹图谱相同条带的个数；

  n₁：某种生物品种标准样品DNA指纹图谱的总条带数；

  n₂：待鉴定生物品种样品DNA指纹图谱的总条带数。

标准品条带数与位置的识别

对生物品种鉴定必须基于标准样品。通过收集若干生物品种标准样品，制备其DNA指纹图谱，形成标准品的DNA指纹图谱数据库。通过图像标记与识别，计算其条带的位置和总数，并将它们存入对应的图谱数据库中。每一幅指纹图谱图像中含有样品的若干个指纹谱带，每个谱带上又有数量不等的条带，本方法提供的识别软件一一找出其中每个条带的位置，并加以标记。

待鉴定品条带位置、条带数的计算与标准品的标记和识别是一样的。

待鉴定品的自动识别

对生物品种的鉴定归结为待鉴定品与标准品相似度系数大小的计算，通过对相似度系数范围的定义，从而可以作出对鉴定品的自动识别。

计算机程序流程描述

整个程序流程是：首先扫描生物品种基因组DNA指纹图谱，把它们保存到图谱数据库中，然后分为三个部分对图谱进行处理：

(1)图谱图像的预处理。把处理好的图像再次保存到图谱数据库中；

(2)图谱图像的参数获取。首先读入要处理的图谱文件，对读入的图像定义操作区域，在指定的区域内识别谱带的边界，依靠程序自动标识出条带，同时还可以依靠手工方式标出程序无法自动识别的条带，以弥补自动识别时产生的误差的影响，将识别的条带有关参数保存到图谱数据库中；

(3)待鉴定生物品种的识别，读入待识别生物品种基因组DNA指纹图谱及其参数，然后比对标准品并按程序建立的数学模型计算两个品种的相似度，最后显示或打印有关处理结果。

本发明应用吸收分子生物学、计算机、植物学、生药学、微生物学、动物学、数学等多学科的理论和技术，应用AFLP技术构建出具有重要商业价值的生物品种包括人、植物、动物、微生物的基因组DNA指纹图谱；根据DNA指纹图谱的特征，建立相应的数学模型，采用计算机技术建立DNA指纹图谱数据库，设计计算机支撑软件，研制出生物品种DNA分子水平自动识别系统。

本发明具有重复性好、稳定可靠、灵敏度高的优点，实现了生物品种DNA分子水平鉴定分析的自动化。为生物品种包括人、植物、动物、微生物等的准确鉴定提供了强有力的工具，亦为大规模DNA指纹数据库的建立提供支持系统，在医疗、药检、农业、林业、畜牧业、海关、法医等部门有重要应用价值。该高技术系统投入市场将创造出巨大的经济和社会效益。

[附图说明]

图1：药用植物基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果。其中1～6分别为山参(新鲜)、人参(新鲜根)、人参(干燥根)、西洋参(干燥根)、引种西洋参(干燥根)、三七(干燥根)、M为λDNA EcoRI+HindIII分子量标准。

图2：药用植物AFLP指纹分析。其中1～7分别为山参(新鲜)、人参(新鲜根)、人参(干燥根)、西洋参(干燥根)、引种西洋参(干燥根)、三七(干燥根)、拟南芥。

[具体实施方式]

实施例1：(1)材料  人参、西洋参、引种西洋参及三七的新鲜或干燥根分别原产于我国吉林省、美国威斯康星州、我国吉林省，云南省。

(2)植物基因组DNA的分离  挑选无霉变和虫蛀人参、西洋参及三七的新鲜或干燥根用75％乙醇消毒，刮弃表皮，取1g组织，置小研钵中，加入液氮研磨成粉，将其转移到50ml塑料离心管中，立即加入保温60℃的6×CTAB提取液(6％ CTAB，100mmol·L^-1 Tris-HCl pH8.0，20mmol·L^-1EDTA，1.4mol·L^-1NaCl，2％巯基乙醇，5％ PVP)混匀，60℃保温1h，并不时振摇。冷却至室温后加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)抽提，轻轻颠倒混匀，14,000r·min^-1离心10min，吸取上清液加入1/10体积预热65℃的10％ CTAB/NaCl溶液(10％ CTAB，0.7mol·L^-1NaCl)，室温下孵育10min，加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)重复抽提一次，吸取上清液加入等体积的1×CTAB沉淀缓冲液(1％ CTAB，50mmol·L^-1 Tris-HCl pH8.0，10mmol·L^-1EDTA，1％疏基乙醇)，轻轻颠倒混匀，60℃保温30min，9000r·min^-1离心10min，小心去上清液，后加入1ml高盐TE溶液(10mmol·L^-1Tris-HCl pH8.0，0.1mmol·L^-1 EDTA pH8.0，1mol·L^-1NaCl)溶解CTAB-DNA沉淀复合物，加入2.5倍体积的无水乙醇，室温下放置1h，9000r.min^-1离心10min，去上清液后，分别用65％和85％乙醇各洗涤二次，弃洗液，自然干燥后并溶于TE溶液(10mmol·L^-1Tris-HC pH8.0，0.1mmol·L^-1EDTA)400uL中。加入2μL RNase(1mg.L^-1)，37℃反应15min，分别加等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)及氯仿-异戊醇(24∶1)各抽提一次，重复无水乙醇沉淀和乙醇清洗步，离心收集DNA，重悬于400uL TE溶液。

(3)DNA琼脂糖凝胶电泳及DNA浓度的测定和纯度的分析  取样品DNA 10μL与上样缓冲液2μL混匀，上样于0.8％琼脂糖凝胶上，用1×TBE电泳缓冲液，5v.cm^-1电泳30min，0.5μg.mL^-1溴化乙  染色后，紫外灯下观察结果并照相，如图1所示；取一定量样品DNA，稀释100倍，用紫外分光光度计测定A₂₆₀和A₂₈₀值，并计算A₂₆₀/A₂₈₀之比值。DNA纯度根据A₂₆₀/A₂₈₀比值判断，结果如表1所示。表1：紫外分光光度计测得的药用植物DNA A₂₆₀、A₂₈₀及A₂₆₀/A₂₈₀标本                   A₂₆₀           A₂₈₀          A₂₆₀/A₂₈₀

                 ( x±s，n＝3)  ( x±s，n＝3)山参(新鲜根)          0.132±0.004    0.075±0.002    1.76人参(新鲜根)          0.100±0.003    0.052±0.002    1.92人参(干燥根)          0.048±0.002    0.027±0.003    1.78西洋参(干燥根)        0.064±0.004    0.037±0.004    1.73引种西洋参(干燥根)    0.045±0.004    0.025±0.003    1.80三七(干燥根)          0.050±0.002    0.028±0.001    1.79

(4)基因组DNA的EcoRI/MseI酶切  反应体系25μL中含有5×反应缓冲液5μL，人参、西洋参、引种西洋参基因组均为250ng，对照拟南芥菜(Arabidopsis thaliana，Ara)DNA 250ng，EcoRI/MseI 2.5U，37℃反应2h后，70℃孵育15min以灭活限制酶活性，离心反应管收集反应体系，并置于冰上。

(5)EcoRI/MseI基因组DNA片段与人工接头的连接  在上述EcoRI/MseI酶切后产物中，加入人工接头溶液[EcoRI/MseI人工接头，ATP0.4mmol·L^-1，Tris-HCl(pH7.5)10mmol·L^-1，Mg(Ac)₂10mmol·L^-1，KAc 50mmol·L^-1]24μL，T4 DNA连接酶1U。室温轻轻混匀，作为AFLP预扩增反应的模板，余下的连接产物于-20℃反应2h，并取连接反应产物10μL用TE稀释10倍，混匀，作为AFLP预扩增反应的模板，余下的连接产物于-20℃保存。

(6)AFLP PCR预扩增反应  反应体系50μL含上述稀释模板5μL，预扩增引物混合物(含dNTPs)40μL，10×PCR反应缓冲液[Tris-HCl(pH8.4)200mmol·L^-1，MgCl₂ 15mmol·L^-1，KCl 500mmol·L^-1]，Taq DNA聚合酶1U。离心混匀，并在反应体系表面覆盖2～3滴矿物油。94℃ 30S，52℃ 1min，72℃ 1min，循环20次。以作为下一步选择性AFLP扩增反应的模板。

(7)选择性AFLP PCR扩增反应  混合体系150μL含EcoRI引物(E-AA)5μL(用γ³²PdATP进行5′末端标记)，MseI引物(M-CAG)(含dNTPs)45μL；混合体系2(Mix2)100μL含消毒蒸馏水79μL，10×PCR缓冲液20μL，TaqDNA聚合酶2.5U；选择性AFLP扩增反应体系20μL含Mix1 5μL，Mix2 10μL，预扩增反应产物5μL。离心混匀，反应体系表面覆盖2～3滴矿物油。94℃ 1min，65℃ 1min，72℃ 1min 30s，接着每循环一次降低退火温度1℃，循环9次；再接着94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min，循环23次。

(8)聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影  选择性AFLP扩增产物分别加入等体积(20μL)甲酰胺染料(甲酰胺98％，EDTA 10mmol·L^-1，溴酚蓝，二甲苯菁)，离心混匀，94℃加热变性3min，立即置于冰上。取上样缓冲液3μL于6％聚丙烯酰胺凝胶(20∶1丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺，尿素7.5mmol·L^-1，1×TBE电泳缓冲液)，40W恒功率预电泳20min后，再取PCR产物10μL上样于凝胶孔中，40W恒功率电泳，直到二甲苯菁迁移至凝胶2/3长度，停止电泳，时间约2h。然后将玻板与凝胶分离，将聚丙烯酰胺凝胶置干胶仪烘干，经放射自显影，阅片灯下照相，如图2所示。

Claims (2)

1.生物品种基因组DNA指纹图谱，其特征在于：本发明应用分子遗传标记技术一扩增片段长度多态性DNA(AFLP)构建生物品种包括人、植物、动物、微生物等基因组DNA指纹图谱，具体技术方案如下：

筛选和鉴定生物标准品，提取与纯化生物品种基因组DNA，设计和合成含限制性核酸内切酶，即同时含稀有切割酶如EcoRI等和频繁切割酶如MseI等酶切位点的人工合成的DNA双链接头，用稀有切割酶和频繁切割酶如EcoRI/MseI等联合酶切生物品种基因组DNA，并与已设计相应的人工合成的DNA双链接头连接以制备AFLP模板DNA，根据人工合成的DNA接头碱基的序列，设计3′端带有3个选择碱基的引物作放射5′末端标记，进行PCR扩增，PCR产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，获取放射自显影DNA指纹图谱，经计算机图像扫描仪扫描，获取DNA指纹数据和DNA指纹图谱。

2.一种权利要求1所述指纹图谱的使用方法，其特征在于：本发明根据DNA指纹图谱的特征，使用数据库系统建立DNA指纹数据库，建立DNA指纹图谱相似系数数学模型，设计DNA指纹图谱数据处理软件并建立自动识别支撑环境，对待鉴定生物品种与标准生物品种DNA指纹图谱和数据进行自动比较和判别分析，明确待鉴定生物品种。

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