CN109234269B

CN109234269B - 从甲醛固定的微量样品中提取并扩增dna片段的方法

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Publication number: CN109234269B
Application number: CN201811108069.0A
Authority: CN
Inventors: 张根; 张霞; 徐锦前
Original assignee: Shenzhen Jinpumai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Jinpumai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-09-21
Filing date: 2018-09-21
Publication date: 2021-10-12
Anticipated expiration: 2038-09-21
Also published as: CN109234269A

Abstract

本发明提出了从甲醛固定的微量样品中提取并扩增DNA片段的方法，通过先去除甲醛，利用蛋白酶K和胰蛋白酶两种酶充分消解样品提取DNA，再通过PCR技术修复断裂的DNA片段，最终再以此为PCR模版扩增目的基因片段，最终建立了一个适用于甲醛固定后的微量样品，步骤清晰，DNA提取效率高，质量好的提取并扩增DNA的方法。与现有技术相比，本发明的有益效果是可在微量样品中较为有效地提取DNA，再利用PCR扩增目的片段，从而达到获取我们想要的目的基因的效果。

Description

从甲醛固定的微量样品中提取并扩增DNA片段的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及DNA提取和PCR扩增技术，具体地说是一种从甲醛固定后的微量样品中提取DNA并扩增DNA片段的方法的建立。

背景技术

组织固定是一种常见的生物保存技术，它能防止细菌的腐蚀和组织的自溶，保存细胞固有的物质；能凝固或沉淀细胞内或组织液，糖原等，使细胞或组织基本上保持与生活时的物质一样，使组织硬化，便于切块。

应用于固定试剂的种类较多，它们对于固定不同的组织成分起着不同的作用，根据Bencroft的分类法，将不同的固定剂分为四种类型：Ⅰ类：醛类，甲醛，戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛，已二醛，丙二醛等；Ⅱ类：氧化剂类，四氧化锇（奥酸），高锰酸钾，重铬酸钾等；Ⅲ类：蛋白变性类，甲醇，乙醇，醋酸等；Ⅳ类：其他，氯化汞，苦味酸等。

甲醛由于组织收缩较少,损伤少,保存固有物质好、固定均匀,穿透力强、能保存脂肪及脂类物质、成本较低等优点，被广泛应用于医学研究中组织标本的制备和科学研究中浮游生物的保存。甲醛固定样品DNA的常见提取方法有：酚氯仿抽提法、改良Trizol法以及试剂盒法。

酚氯仿抽提法利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。在氯仿作用下有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在NaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐。

改良Trizol法主要利用TRizol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物。加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中，蛋白质在有机相中，利用乙醇沉淀中间层可回收DNA。

试剂盒法比较简单，甲醛固定组织通过独特裂解液热处理和蛋白酶K共同作用迅速裂解细胞释放出基因组DNA，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗一离心的步骤，抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。

以上三种方法均有成功提取甲醛固定组织DNA的实例，以酚氯仿法最为简便有效，所用试剂价格低廉，是一种经济实用的甲醛固定组织DNA提取方法。但是以上方法通常对样品量要求较高，一般为几十至几百毫克不等。从甲醛固定后的微量样品（微克级别）中提取DNA并扩增DNA片段，由于样品量极少，难度更高，其相关方法仍未见诸报道。

发明内容

本发明提出了从甲醛固定的微量样品中提取并扩增DNA片段的方法，特点是可在微量样品中较为有效地提取DNA，再利用PCR扩增目的片段，从而达到获取我们想要的目的基因的效果。

本发明的技术方案如下：

从甲醛固定的微量样品中提取并扩增DNA片段的方法，包括以下步骤：

S1，去除甲醛固定的微量样品中的游离甲醛；

S2，加入过量蛋白酶K、胰蛋白酶和缓冲液对甲醛固定的微量样品进行消化；

S3，抽提甲醛固定的微量样品中的蛋白、脂肪等杂质；

S4，加入糖原和异丙醇，使微量DNA与糖原颗粒结合后沉淀，离心获得DNA沉淀；

S5，洗涤DNA沉淀，并使其溶于纯水中；

S6，使用Taq酶对DNA进行断裂修复，获得更高质量的DNA;

S7，以此DNA为模版，扩增目的基因片段。

作为本发明的进一步改进，S1中，将甲醛固定的微量样品经反复水洗、离心步骤从而去除游离甲醛。

作为本发明的进一步改进，S2中，采用20 μg/μl蛋白酶K、2.5%胰蛋白酶的溶液以及TE缓冲液对甲醛固定的微量样品进行消化6个小时。

作为本发明的进一步改进，S3中，使用Tris饱和酚：氯仿：异戊醇混合液等体积混匀抽提蛋白、脂肪等杂质。

作为本发明的进一步改进，S4中，先高速离心后取水相，再加入糖原和异丙醇，使微量DNA结合于糖原颗粒后离心沉淀DNA。

作为本发明的进一步改进，S5中，采用70%乙醇洗涤DNA沉淀一次，溶于10 ul纯水。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

（1）现有技术单独使用蛋白酶K对样品进行消化处理。本发明通过采用蛋白酶K联合胰蛋白酶对样品进行消化，消化的效果更好。

（2）现有技术中往往采用通过离心柱法进行离心，将大量样品中的DNA吸附在DNA吸附住上再洗脱获得。该方法不适用于微量样品，微量样品通过离心柱后无法有效吸附，最后也无法获得DNA。本技术用酚-氯仿-异丙醇对样品进行分层抽提，能高效保留DNA在水相中，再通过后续步骤获得DNA。

（3）现有技术中往往未涉及微量DNA的沉淀步骤，导致无法提取微量样品中的DNA。本技术在后续的异丙醇沉淀DNA操作中加入了糖原，有利于DNA的析出和沉淀。

综上，本方法通过先去除甲醛，利用蛋白酶K和胰蛋白酶两种酶充分消解样品提取DNA，酚仿抽提，糖原促进沉淀，再通过PCR技术修复断裂的DNA片段，最终再以此为PCR模版扩增目的基因片段，可在微量样品中较为有效地提取DNA，再利用PCR扩增目的片段，从而达到获取我们想要的目的基因的效果。

附图说明

图1为分别对三个轮虫样品进行测试获得的（A）COI和（B）ITS电泳图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面结合具体实施例对本发明进一步说明。

轮虫是典型的浮游动物，在浮游动物学、水生态学和环境科学研究领域，经常使用甲醛来固定保存轮虫。萼花臂尾轮虫单个体体长为0.2-0.35毫米，宽约0.2毫米，质量约为0.5-1.5微克。

本施例采用经甲醛固定1年的萼花臂尾轮虫作为研究对象。采用本发明的方法，包括以下具体步骤：

步骤1，尾轮虫的甲醛固定样品经4000 rpm离心 5 min，水洗3次以去除游离甲醛。

步骤2显微镜下挑取单只轮虫放入每个1.5 ml EP管中（附带10 μl水）；

加入10 μl含有20 μg/μl蛋白酶K和2.5%胰蛋白酶的溶液，20 μl 2× TE缓冲液(10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA ,pH=8.0)，于37 ℃消化6小时。

本步骤通过采用蛋白酶K联合胰蛋白酶对样品进行消化，消化的效果更好。

步骤3，加入40 μl【Tris饱和酚：氯仿：异戊醇（25:24: 1）】混合试剂，剧烈混匀，-20 ℃静置30 min后10000 rpm 4 ℃离心10 min。

本步骤用酚-氯仿-异丙醇对样品进行分层抽提，能高效保留DNA在水相中，再通过后续步骤获得DNA。

步骤4，将水相转移至新EP管中，加入1 μl糖原(10 μg/μl)，混匀后加入等体积冰冷的异丙醇，混匀后4 ℃静置30 min，于15000 rpm，4℃离心30 min。

本步骤在异丙醇沉淀DNA操作中加入了糖原，有利于DNA的析出和沉淀。

步骤5，去除上清液后，使用70%乙醇洗涤沉淀一次以去除异丙醇；室温自然干燥5分钟以去除乙醇，之后加入10 μl超纯水, 加热到50-60℃，保持5分钟，促进DNA溶解。

步骤6，10000 rpm离心10分钟后，转移上清液至0.2 ml的PCR管中，加入5 μl 5×PrimeSTAR Buffer (Mg2+ Plus，Takara公司生产)、2 μl dNTP Mixture （2.5 nM每种）和1.2 U PrimeSTAR HS DNA Polymerase,不加引物，补纯水到25 μl总体系；混匀后放入PCR仪器中，95℃ 30 s，72℃ 10 min，循化10次。该步骤的目的是通过无引物PCR对断裂的DNA进行修复，从而获得更高质量的DNA；

步骤7，以上述获得的产物作为DNA模版，扩增目的片段（以COI和ITS两个基因为例）。

7.1 COI基因PCR反应体系

10 μl PrimeSTAR HS Premix (Takara公司生产)，2 μl DNA模板，两条引物各1 μl （引物序列为LCO1490: 5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3和HCO2198: 5'-TGATTTTTTGGTCACCCTGAAGTTTA-3'，引物浓度为10 μM），补充6 μl超纯水到20 μl；

COI基因PCR扩增条件如下：94 ℃ 5 min预变性； 94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1min，循环35次；72 ℃延伸10分钟，最后4 ℃恒温保存。

7.2 ITS基因PCR反应体系

10 μl PrimeSTAR HS Premix (Takara公司生产)，2 μl DNA模板，两条引物各1 μl（LH2引物：5'-GTCGAATTCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCA-3'和Dlam引物：5'-CCTGCAGTCGACAKATGCTTAARTTCAGCRGG-3'，引物浓度为10 μM），补充6 μl超纯水到20 μl；

ITS基因PCR扩增条件如下：94 ℃ 5 min预变性； 94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72℃1 min，循环35次；72 ℃延伸10分钟，最后4 ℃恒温保存。

步骤8，经琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，检测结果如图1所示，图1为分别对三个轮虫样品进行测试获得的COI和ITS电泳图。箭头所示为（A）COI和（B）ITS产物的条带。1、2和3表示三个轮虫样品；M表示DL2000 DNA marker。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.从甲醛固定的微量样品中提取并扩增DNA片段的方法，其特征在于，所述甲醛固定的微量样品为轮虫，所述甲醛固定的微量样品中提取并扩增DNA片段的方法包括以下步骤：

S1，去除甲醛固定的微量样品中的游离甲醛；

S2，加入过量蛋白酶K、胰蛋白酶和缓冲液对甲醛固定的微量样品于37℃进行消化；

S3，抽提甲醛固定的微量样品中的蛋白、脂肪杂质；

S5，洗涤DNA沉淀，并使其溶于纯水中；

S6，使用PrimeSTAR HS DNA Polymerase对DNA进行断裂修复，获得更高质量的DNA；

S7，以此DNA为模版，扩增目的基因片段。

2.根据权利要求1所述的从甲醛固定的微量样品中提取并扩增DNA片段的方法，其特征在于，S1中，将甲醛固定的微量样品经反复水洗、离心步骤从而去除游离甲醛。

3.根据权利要求1所述的从甲醛固定的微量样品中提取并扩增DNA片段的方法，其特征在于，S2中，采用20 μg/μl蛋白酶K、2.5%胰蛋白酶的溶液以及TE缓冲液对甲醛固定的微量样品进行消化6个小时。

4.根据权利要求1所述的从甲醛固定的微量样品中提取并扩增DNA片段的方法，其特征在于，S3中，使用Tris饱和酚：氯仿：异戊醇混合液等体积混匀抽提蛋白、脂肪杂质。

5.根据权利要求1所述的从甲醛固定的微量样品中提取并扩增DNA片段的方法，其特征在于，S4中，先高速离心后取水相，再加入糖原和异丙醇，使微量DNA结合于糖原颗粒后离心沉淀DNA。

6.根据权利要求1所述的从甲醛固定的微量样品中提取并扩增DNA片段的方法，其特征在于，S5中，采用70%乙醇洗涤DNA沉淀一次，溶于10 μl纯水。