CN117645994A - 一种植物基因组dna快速提取试剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种植物基因组DNA快速提取试剂及其应用，属于核酸提取技术领域。所述提取试剂的组分包括：盐酸胍0.3‑1M，尿素3‑5M，Tris‑HCl 0.08‑0.12M，乙二胺四乙酸二钠0.03‑0.07M，余量为水。本发明提供的提取试剂中的盐酸胍浓度低，安全风险小，无需纯化去除，且对后续的扩增反应没有抑制作用；添加尿素抑制盐酸胍水解，延长试剂保存期。盐酸胍在0.3‑1M的工作浓度条件下不仅保留了盐酸胍快速裂解细胞、释放核酸的优点，待测样本在粗提取后可直接添加核酸扩增反应体系中，在24‑80mM浓度条件下还可加速核酸扩增反应进程，缩短检测时间，更能满足简单快速的现场检测需求。

Description

一种植物基因组DNA快速提取试剂及其应用
技术领域
本发明涉及核酸提取技术领域，具体涉及一种植物基因组DNA快速提取试剂及其应用。
背景技术
转基因作物的推广和种植产生了可观的经济和生态环境效益，其潜在风险却也饱受争议，因此，快速、准确地对转基因进行鉴定对转基因产品标识和市场监管具有十分重要的意义。基于蛋白分析的转基因检测试纸条法是目前转基因检测的主流方法，操作简单，可以快速判读结果，但是试纸条法需要特异性抗体，往往只能检测有限种类的转基因产品，例如抗虫转基因检测试纸只能检测抗虫转基因；抗除草剂转基因检测试剂盒只能检测抗除草剂转基因。
基因是DNA中真正能够发挥遗传效应的DNA片段，不同基因的碱基组成不同。基于核酸分析的转基因检测方法通过检测某基因上特定的DNA序列，即可得知检测样本中是否含有此基因。与基于蛋白分析方法相比，基于核酸分析的方法可检测靶点更宽泛，除了可以检测转入的表达基因，还可以检测转基因的通用元件，如CaMV35S启动子、NOS终止子等。这种方法可以用于转基因产品快速筛选，判断样品中是否含有转基因成分，或者为进一步鉴定转基因提供线索，缩小检测范围，具有更高的通用性。
获得高纯度核酸样品是保证核酸分析准确性的前提，目前植物基因组DNA提取方法主要是CTAB法和硅胶柱吸附法。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)作为阳离子去污剂，可溶解细胞膜并与核酸形成复合物，可使核酸沉淀出来，随后将沉淀溶于高盐溶液中，通过有机溶剂抽提去除蛋白等杂质后加入乙醇沉淀，可使核酸分离出来。但是该方法需要用到氯仿、异丙醇等毒性有机溶剂，且操作繁琐。
硅胶柱吸附法是首先细胞破裂后释放DNA分子到溶液中，通常细胞裂解液中含有高浓度的盐酸胍(工作浓度为4-8M)，盐酸胍是强蛋白变性剂，可以使缠绕在DNA上的蛋白变性，将纯的DNA释放出来，同时提供高盐离子环境，促使DNA在高盐低pH的条件下特异性结合到硅胶膜上，漂洗去除蛋白质等杂质，最后在低盐高pH条件下洗脱得到高纯度的基因组DNA。但是该方法也比较费时费力，不适合大批量样本的核酸提取。另外，高浓度的盐酸胍会抑制后续的核酸扩增反应，需要经过纯化去除；还增加了裂解试剂的经济成本；不小心接触皮肤时，存在安全风险。
上述方法无法满足快速、大批量的转基因作物现场检测需求。因此，如何简化植物基因组DNA提取工艺，加快核酸扩增反应进程是本领域技术人员需要解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物基因组DNA快速提取试剂和基于环介导等温扩增的核酸检测方法，广泛适用于各种农作物的DNA提取和核酸检测，能够快速有效、低成本无污染地实现现场快速检测，解决现有方法存在的DNA提取过程繁琐、使用毒性有机试剂、核酸扩增检测耗时等问题。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种植物基因组DNA快速提取试剂，所述提取试剂的组分包括：盐酸胍0.3-1M，尿素3-5M，Tris-HCl 0.08-0.12M，乙二胺四乙酸二钠0.03-0.07M，余量为水。
各组分的作用机理说明：
0.3-1M盐酸胍：盐酸胍作为一种离液盐，能快速破坏细胞膜，释放核酸；能使蛋白质变性，抑制DNase的活性，减少DNA的降解，且能减少缠绕在DNA上的蛋白。目前，市面上的盐酸胍裂解液中盐酸胍的工作浓度为4-8M，这种高浓度的盐酸胍会抑制后续的核酸扩增反应，需要经过纯化去除。本发明提出了0.3-1M的浓度作为盐酸胍在裂解液中的工作浓度。试验结果表明，该工作浓度条件下可实现植物细胞的有效裂解以及核酸物质释放；裂解上清液无需经过纯化可直接用于后续的等温扩增反应。具体的，以1:12.5的比例将含0.3-1M盐酸胍的提取粗产物加入等温扩增反应体系中，此时扩增体系中盐酸胍的浓度为24-80mM，相较于不含盐酸胍的体系，核酸扩增速度显著提高，其中，使用含0.5M盐酸胍提取试剂提取得到的上清液在体系中的加速作用最好。在相同的裂解时间下，随着裂解液中盐酸胍浓度升高，更高浓度的盐酸胍(3M以上)甚至抑制了后续的扩增反应。因此，本发明提供的工作浓度不仅保留了盐酸胍快速裂解细胞、释放核酸的优点，还加速了核酸扩增检测，能大大提升核酸扩增现场检测的进度。
3-5M尿素：具有较强的蛋白质变性能力，并且能破坏蛋白质内部的氢键和疏水作用力，有利于蛋白质的裂解。这一作用可以抑制DNase的活性，减少DNA的降解，且能减少缠绕在DNA上的蛋白。尿素在本发明提取试剂中的第二个作用是避免盐酸胍的水解。盐酸胍在水溶液中不稳定，会水解为氨和尿素，在提取试剂中加入尿素，可以抑制盐酸胍的水解，提高提取试剂的稳定性，延长保存时间。
0.08-0.12M Tris-HCl(pH＝8.0±0.5)：提供缓冲环境，防止核酸被破坏；使乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)处于高pH环境，螯合更多的金属离子。
0.03-0.07M EDTA-2Na：螯合剂，能与金属离子形成稳定的络合物。在pH值较高(pH＞7)时，可以螯合多种金属离子，抑制DNase的活性，减少DNA的降解。
进一步的，所述提取试剂的组分包括：盐酸胍0.5M，尿素4M，Tris-HCl 0.1M，乙二胺四乙酸二钠0.05M，余量为水。
本发明提供了所述的植物基因组DNA快速提取试剂在植物基因组DNA提取中的应用。
所述应用包括：首先将待测植物组织样本研磨后加入所述的植物基因组DNA快速提取试剂进行裂解，然后收集上清液，分离获得植物基因组DNA。
所述植物组织样本可以为但不限于植物叶片。与果实、根茎等部位相比，叶片中DNA含量高、样本获取更为容易、不易损伤植株、更易研磨。
本发明还提供了所述的植物基因组DNA快速提取试剂在快速检测植物靶标DNA片段中的应用。
所述应用包括：首先将待测植物叶片研磨后加入所述的植物基因组DNA快速提取试剂进行裂解，收集上清液；再将上清液加入到环介导等温扩增反应体系中，所述反应体系中含有特异性扩增所述靶标DNA片段的引物；然后将反应体系置于恒温条件下进行等温扩增反应；最后对反应产物进行分析。
本发明中，植物样本经所述植物基因组DNA快速提取试剂粗提取后可直接进行扩增反应，经测试，裂解得到的上清液中的蛋白等杂质不影响后续的扩增检测。
进一步的，环介导等温扩增反应体系中盐酸胍的浓度为24-80mM。在该浓度条件下，对核酸扩增反应均有加速作用。
更进一步的，环介导等温扩增反应体系中盐酸胍的浓度为40mM左右。
本发明还提供了一种转基因作物的快速检测方法，包括以下步骤：
(1)取待测转基因作物的叶片，充分研磨后加入所述的植物基因组DNA快速提取试剂进行裂解，或者在研磨前加入所述的植物基因组DNA快速提取试剂，再边研磨边裂解，得到裂解液，静置后收集上清液；
(2)将上清液加入到环介导等温扩增反应体系中，使得反应液中盐酸胍的浓度为24-80mM，所述环介导等温扩增反应体系中含有特异性扩增转基因靶标元件的引物；
(3)将反应体系置于恒温条件下进行等温扩增反应；
(4)根据LAMP反应结果判定样本是否为转基因作物。
进一步的，步骤(1)中，取5-30mg叶片进行研磨，添加100μL的植物基因组DNA快速提取试剂进行裂解，裂解时间为3-5min。
步骤(2)中，以25μL环介导等温扩增反应体系计，快速裂解得到的上清液添加量为1-5μL。
所述环介导等温扩增反应体系的组成可采用本领域常规试剂，包括底物dNTPs或dUTPs、引物、Bst DNA聚合酶及其缓冲液，亦可含有荧光染料、荧光探针。
进一步的，所述环介导等温扩增反应体系组成包括1×LAMP缓冲液、Bst DNA聚合酶4-8U、dNTP/dUTP混合物1.0-1.4mM、外引物0.2-0.4μM、内引物1.5-2.0μM、环引物0.3-0.6μM。
进一步的，步骤(3)中，等温扩增反应条件为65℃下反应30-40min。
与现有技术相比，本发明具备的有益效果：
(1)本发明提供的基因组DNA快速提取试剂成分简单，成本低，不含有机溶剂，相对安全，不含酶，可室温运输和保存。
(2)本发明提供的基因组DNA快速提取试剂中的盐酸胍浓度低，安全风险小，无需纯化去除，且对后续的扩增反应没有抑制作用。本发明的提取试剂中还添加了盐酸胍水解的抑制剂(尿素)，延长了提取试剂的保存期。
(3)本发明提供的基因组DNA快速提取试剂中盐酸胍在0.3-1M的工作浓度条件下不仅保留了盐酸胍快速裂解细胞、释放核酸的优点，待测样本在粗提取后可直接添加核酸扩增反应体系中，在24-80mM浓度条件下还可加速核酸扩增反应进程，缩短检测时间，更能满足简单快速的现场检测需求。
(4)利用本发明的基因组DNA快速提取试剂进行植物基因组DNA提取，无需进行纯化，经测试，裂解得到的上清液中的蛋白等杂质不影响后续的扩增检测，因此，粗提取后可直接进行扩增反应，不需要借助离心机等设备，操作简单，所需时间短，10分钟以内即可得到高浓度的基因组DNA，满足后续检测的需求，能实现大批量样本的检测。
附图说明
图1为以水稻叶片为样本，探究提取试剂中盐酸胍的浓度对后续LAMP反应扩增效率的影响。
图2为本发明的提取试剂与商业化基因组DNA提取试剂盒提取水稻叶片中DNA的效果对比，其中1：本发明的提取和检测方法；2：商业化试剂盒提取和相同的检测过程。
图3为用实施例2的提取方法提取玉米叶片，提取后进行LAMP检测得到的扩增曲线，其中1：玉米样本组；2：阴性对照组。
图4为用实施例3的提取方法提取大豆叶片，提取后进行LAMP检测得到的扩增曲线，其中1：大豆样本组；2：阴性对照组。
图5为用实施例4的提取方法提取棉花叶片，提取后进行LAMP检测得到的扩增曲线，其中1：棉花样本组；2：阴性对照组。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
一、本实施例以液氮研磨配合本发明提取试剂提取水稻叶片中基因组DNA及LAMP扩增法快速检测含T-Nos的转基因水稻为例。T-Nos是常见的转基因标志物之一，属于终止子元件。本实施例以含有T-Nos的转基因水稻TT51-1品系作为检测样本。
1、基因组DNA快速提取试剂组分：0.5M盐酸胍(GuHCl)、4M尿素、0.1M Tris-HCl(pH8.0)、0.05M乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)。
上述配方中，盐酸胍设置不同浓度0.1、0.3、0.5、1、1.5M，以不含盐酸胍的提取试剂作为对照。
2、基因组DNA提取：取5-30mg水稻叶片放入研钵中，加入液氮后进行研磨。研磨成粉末后加入100μL上述基因组DNA快速提取试剂，裂解3-5分钟，静置2-3min，收集上清液。
3、LAMP扩增法快速检测转基因水稻，以转基因通用元件(T-Nos)为靶标。
LAMP扩增体系：在25μL T-Nos LAMP反应体系中加入2μL裂解后的上清液。反应体系如表1所示。
表1.转基因水稻LAMP扩增体系
采用引物序列为：
FIP：5’-GCATGACGTTATTTATGAGATTTTTCGCGCTATATTTTGTTTTCTA-3’；
BIP：5’-CATGCTTAACGTAATTCAACATTTTTGAATCCTGTTGCCGGTC-3’；
F3：5’-CGCGATAATTTATCCTAGTTTG-3’；
B3：5’-CGTTCAAACATTTGGCAAT-3’；
LF：5’-GATTAGAGTCCCGCAATTATAC-3’；
LB：5’-AAATTATATGATAATCATCGCAA-3’；
扩增片段如SEQ ID NO.1所示。
LAMP扩增条件：将LAMP扩增体系置于实时荧光定量PCR仪，设定程序65℃加热30min。
4、通过荧光读取装置获取LAMP反应扩增曲线，根据LAMP反应结果判定样本是否转基因作物。若反应体系的荧光值随着反应时间的增加未升高，则初步判定该水稻样本为非转基因水稻；若反应体系的荧光值随着反应时间的增加升高，即反应时间对应荧光值为S形扩增曲线，则初步判定该水稻样本为转基因水稻。
SPSS25软件(IBM Corp，Armonk，NY，USA)被用于分析数据。收集的数据采用单因素方差分析和邓肯多重极差检验进行统计分析。如图1所示，统计分析结果表明，使用含0.3、0.5或1M盐酸胍的提取试剂比使用含0.1、1.5M或不含盐酸胍时，具有显著更低的Ct值(P<0.05)。其中使用含0.5M盐酸胍提取试剂比使用含0.3或1M盐酸胍时，具有显著更低的Ct值(P<0.05)。因此，本专利以0.3-1M的浓度作为盐酸胍在提取试剂中的工作浓度。当以1:12.5的比例将含0.3-1M盐酸胍的提取上清液加入等温扩增反应体系中，此时扩增体系中盐酸胍的浓度为24-80mM，相较于不含盐酸胍的体系，核酸扩增速度显著提高。其中，使用含0.5M盐酸胍提取试剂提取得到的上清液在体系中的加速作用最好，此时扩增体系中盐酸胍的浓度为40mM。
二、用商业化基因组DNA提取试剂盒(天根)提取同等质量水稻叶片中的DNA，作为本发明提取试剂提取效果和转基因检测效果的对照组。
1、提取过程如下：
(1)取同等质量水稻叶片放入研钵中，加入液氮进行研磨。
(2)研磨成粉末后转移至1.5mL离心管中，加入700μL缓冲液GP1和0.1％的巯基乙醇。颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20分钟，水浴过程中颠倒离心管数次以混合样品。
(3)加入700μL氯仿，充分混匀，12000rpm离心5分钟。
(4)将上一步所得上层水相转移至一个新的离心管中，加入700μL缓冲液GP2，充分混匀。
(5)将混匀的液体转入吸附柱中，12000rpm离心30秒，弃掉废液。
(6)向吸附柱中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30秒，弃掉废液，将吸附柱放回收集管中。
(7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30秒，弃掉废液，将吸附柱放回收集管中。
(8)重复操作步骤(7)。
(9)将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2分钟，弃掉废液，将吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中的漂洗液。
(10)将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空加100μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中，得到100μL水稻叶片的基因组DNA溶液。
2、按照表1的反应体系，在25μL T-Nos LAMP反应体系中加入2μL提取得到的水稻叶片的基因组DNA溶液。将LAMP扩增体系置于实时荧光定量PCR仪，设定程序65℃加热30min。
3、通过荧光读取装置获取LAMP反应扩增曲线，将上述含0.5M盐酸胍提取试剂提取得到的上清液为模板进行LAMP反应的扩增曲线与对照组的扩增曲线进行对比。如图2所示，本发明提取试剂和商业化基因组DNA提取试剂盒提取后扩增的扩增曲线均为S形曲线。检测结果为阳性，均检测出该水稻样本为转基因水稻。本发明提取试剂提取后在扩增检测过程中的时间阈值(Tt值)是13.6；而用商业化基因组DNA提取试剂盒提取后扩增的Tt值是17.7。说明本发明提取试剂的叶片DNA提取、转基因检测方法的效果优于商业化基因组DNA提取试剂盒。
本实施例的优势还体现在DNA提取过程简单，无需纯化；提取时间短，仅需10分钟，商业化试剂盒需要1小时。
实施例2
本实施例以湿法手动研磨配合本发明提取试剂提取玉米叶片中基因组DNA及LAMP扩增法快速检测含CaMV35S启动子的转基因玉米为例。CaMV35S启动子是常见的转基因标志物之一，属于启动子元件。本实施例以含有CaMV35S启动子的转基因玉米MON810品系作为检测样本。
1、基因组DNA提取：取5-30mg玉米叶片放入研钵中，加入100μL实施例1的基因组DNA快速提取试剂，研磨3-5分钟，静置1-2分钟，收集上清液。
2、LAMP扩增法快速检测转基因玉米，以转基因通用元件(CaMV35S启动子)为靶标。
LAMP扩增体系：在25μL CaMV35S启动子LAMP反应体系中加入2μL裂解后的上清液。用2μL ddH2O代替裂解后上清液，添加到LAMP反应体系中，作为阴性对照组。反应体系如表2所示。
表2.转基因玉米LAMP扩增体系
反应组分 浓度
10×ThermoPol buffer(包含2mM Mg2+) 1×
Bst 2.0 DNA polymerase 0.64U/μL
MgSO4 2mM
dNTP 0.35mM each
SYTO9染料 2μM
CaMV35S启动子FIP/BIP引物 1.6μM/1.6μM
CaMV35S启动子F3/B3引物 0.2μM/0.2μM
CaMV35S启动子LF/LB引物 0.4μM/0.4μM
玉米叶片裂解后的上清液 2μL
采用引物序列为：
FIP：5’-GGCAGAGGCATCTTCAACGAGGAAGGTGGCTCCTACAA-3’；
BIP：5’-CACGAGGAGCATCGTGGAAACGTCAGTGGAGATATCACATC-3’；
F3：5’-CTCCTCGGATTCCATTGC-3’；
B3：5’-GTCTTGCGAAGGATAGTGG-3’；
LF：5’-TTTCCTTTATCGCAATGATGGC-3’；
LB：5’-AGAAGACGTTCCAACCACG-3’；
扩增片段如SEQ ID NO.2所示。
LAMP扩增条件：将LAMP扩增体系置于实时荧光定量PCR仪，设定程序65℃加热30min。
3、根据LAMP反应结果判定样本是否转基因作物。若反应体系的荧光值随着反应循环数的增加未升高，则初步判定该玉米样本为非转基因玉米；若反应体系的荧光值随着循环数的增加升高，即反应时间对应荧光值为S形扩增曲线，且阴性对照组未扩增，则初步判定该玉米样本为转基因玉米。
检测结果如图3所示，添加玉米叶片裂解上清液的组从13.8分钟开始扩增，且扩增曲线为S形，而阴性对照组没有扩增，说明该玉米样本为转基因玉米。
实施例3
本实施例以自动研磨仪研磨配合本发明提取试剂提取大豆叶片中基因组DNA及LAMP扩增法快速检测含pat基因的转基因大豆为例。pat是一种常用的抗除草剂基因，属于表达基因。本实施例以含有pat基因的转基因大豆A2704-12品系作为检测样本。
1、基因组DNA提取：取5-15mg大豆叶片放入2mL离心管中，加入100μL DNA快速提取试剂(1M盐酸胍、5M尿素、0.12M Tris-HCl,pH 8.0)、0.07M乙二胺四乙酸二钠)，放入自动研磨仪中研磨3-5分钟。取出离心管后静置1-2分钟，收集上清液。
2、LAMP扩增法快速检测转基因大豆，以pat基因为靶标。
LAMP扩增体系：在25μL pat基因LAMP反应体系中加入1μL裂解后的上清液。用1μLddH2O代替裂解后上清液，添加到LAMP反应体系中，作为阴性对照组。反应体系如表3所示。
表3.转基因玉米LAMP扩增体系
反应组分 浓度
10×ThermoPol buffer(包含2mM Mg2+) 1×
Bst 2.0DNA polymerase 0.64U/μL
MgSO4 2mM
dNTP 0.35mM each
SYTO9染料 2μM
pat基因FIP/BIP引物 1.6μM/1.6μM
pat基因F3/B3引物 0.2μM/0.2μM
pat基因LF/LB引物 0.4μM/0.4μM
大豆叶片裂解后的上清液 1μL
采用引物序列为：
FIP：5’-GCCACAACACCCTCAACCTCACAAGAGTGGATTGATGATCT-3’；
BIP：5’-CCTGGAAGGCTAGGAACGCTTGATGCCTATGTGACACG-3’；
F3：5’-CGTTAACCATTACATTGAGACG-3’；
B3：5’-TGCGCCTCCATAGACTTA-3’；
LF：5’-GCAACCAACCAAGGGTATCTA-3’；
LB：5’-ACGATTGGACAGTTGAGAGTAC-3’；
扩增片段如SEQ ID NO.3所示。
LAMP扩增条件：将LAMP扩增体系置于实时荧光定量PCR仪，设定程序65℃加热30min。
3、根据LAMP反应结果判定样本是否转基因作物。若反应体系的荧光值随着反应时间的增加未升高，则初步判定该大豆样本为非转基因大豆；若反应体系的荧光值随着反应时间的增加升高，即反应时间对应荧光值为S形扩增曲线，且阴性对照组未扩增，则初步判定该大豆样本为转基因大豆。
检测结果如图4所示，添加大豆叶片裂解上清液的组从12分钟开始扩增，且扩增曲线为S形，而阴性对照组没有扩增，说明该大豆样本为转基因大豆。
实施例4
本实施例以手持式研磨仪(或匀浆机)配合本发明提取试剂提取棉花叶片中基因组DNA及LAMP扩增法快速检测含cry1Ac基因的转基因棉花为例。cry1Ac是一种棉花中常用的抗虫蛋白基因，属于表达基因。本实施例以含有cry1Ac基因的转基因棉花品系中棉所9B01作为检测样本。
1、基因组DNA提取：取5-30mg棉花叶片放入1.5mL离心管中，加入100μL实施例1基因组DNA快速提取试剂。用手持式研磨仪(或匀浆机)研磨3-5分钟，研磨后静置1-2分钟，收集上清液。
2、LAMP扩增法快速检测转基因棉花，以抗虫蛋白基因cry1Ac为靶标。
LAMP扩增体系：在25μL Bt基因LAMP反应体系中加入2μL裂解后的上清液。用2μLddH2O代替裂解后上清液，添加到LAMP反应体系中，作为阴性对照组。反应体系如表4所示。
表4.转基因棉花LAMP扩增体系
反应组分 浓度
10×ThermoPol buffer(包含2mM Mg2+) 1×
Bst 2.0DNApolymerase 0.64U/μL
硫酸镁(MgSO4) 2mM
dNTP 0.35mM each
SYTO9染料 2μM
cry1Ac基因FIP/BIP引物 1.6μM/1.6μM
cry1Ac基因F3/B3引物 0.2μM/0.2μM
cry1Ac基因LF/LB引物 0.4μM/0.4μM
棉花叶片裂解后的上清液 2μL
采用引物序列为：
FIP：5’-GGCGTGGATCATGGCGATGTTGCTTTGTTCGGGAACTCCCA-3’；
BIP：5’-ACGTGTGCACAGCATTCGTGAGTTCCTCGAAGATGGCAGC-3’；
F3：5’-GAGGCCAAAGAGTCCGTG-3’；
B3：5’-GCGGTAAAGATACGTCCCTC-3’；
LF：5’-GTGTCGGCTTGCAACTGATCATA-3’；
LB：5’-CCTGAGTTGTCCGTGATCCCTG-3’；
扩增片段如SEQ ID NO.4所示。
LAMP扩增条件：将LAMP扩增体系置于实时荧光定量PCR仪，设定程序65℃加热40min。
3、根据LAMP反应结果判定样本是否转基因作物。若反应体系的荧光值随着反应时间的增加未升高，则该棉花样本为非转基因棉花；若反应体系的荧光值随着反应时间的增加升高，即反应时间对应荧光值为S形扩增曲线，且阴性对照组未扩增，则该棉花样本为转基因棉花。
检测结果如图5所示，添加棉花叶片裂解上清液的组从15.6分钟开始扩增，且扩增曲线为S形，而阴性对照组没有扩增，说明该棉花样本为转基因棉花。

Claims (10)

1.一种植物基因组DNA快速提取试剂，其特征在于，所述提取试剂的组分包括：盐酸胍0.3-1M，尿素3-5M，Tris-HCl 0.08-0.12M，乙二胺四乙酸二钠0.03-0.07M，余量为水。
2.如权利要求1所述的植物基因组DNA快速提取试剂，其特征在于，所述提取试剂的组分包括：盐酸胍0.5M，尿素4M，Tris-HCl 0.1M，乙二胺四乙酸二钠0.05M，余量为水。
3.如权利要求1或2所述的植物基因组DNA快速提取试剂在植物基因组DNA提取中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用包括：首先将待测植物组织样本研磨后加入所述的植物基因组DNA快速提取试剂进行裂解，然后收集上清液，分离获得植物基因组DNA。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物组织样本为叶片。
6.如权利要求1或2所述的植物基因组DNA快速提取试剂在快速检测植物靶标DNA片段中的应用，其特征在于，包括：首先将待测植物叶片研磨后加入所述的植物基因组DNA快速提取试剂进行裂解，收集上清液；再将上清液加入到环介导等温扩增反应体系中，所述反应体系中含有特异性扩增所述靶标DNA片段的引物；然后将反应体系置于恒温条件下进行等温扩增反应；最后对反应产物进行分析。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，环介导等温扩增反应体系中盐酸胍的浓度为24-80mM。
8.一种转基因作物的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取待测转基因作物的叶片，充分研磨后加入如权利要求1或2所述的植物基因组DNA快速提取试剂进行裂解，或者在研磨前加入如权利要求1或2所述的植物基因组DNA快速提取试剂，再边研磨边裂解，得到裂解液，静置后收集上清液；
(2)将上清液加入到环介导等温扩增反应体系中，使得反应液中盐酸胍的浓度为24-80mM，所述环介导等温扩增反应体系中含有特异性扩增转基因靶标元件的引物；
(3)将反应体系置于恒温条件下进行等温扩增反应；
(4)根据环介导等温扩增反应结果判定样本是否为转基因作物。
9.如权利要求8所述的转基因作物的快速检测方法，其特征在于，步骤(1)中，取5-30mg叶片进行研磨，添加100μL的植物基因组DNA快速提取试剂进行裂解，裂解时间为3-5min。
10.如权利要求8所述的转基因作物的快速检测方法，其特征在于，步骤(3)中，等温扩增反应条件为65℃下反应30-40min。
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