CN114891783A - 一种FastM粪便DNA快速提取试剂盒及提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种FastM粪便DNA快速提取试剂盒及提取方法，包括试剂1、试剂2、试剂3、EB溶液和搅拌珠；试剂1含有如下组分：1mM的NaOH、质量浓度为0.5％的SDS、5mM的EDTA、质量浓度为1％的CTAB、0.5M的NaCl；试剂2的pH值为3且其含有如下组分：质量浓度为10mg/mL的蛋白酶K、1mM的Tris‑HCl、H2O；试剂3为质量浓度为50％的乙醇，同时公开了利用该试剂盒进行DNA提取的方法。该发明的试剂盒操作简便，提取纯化的DNA核酸得率高、纯度好，不含核酸酶及PCR抑制剂，有利于DNA核酸的保存与后续PCR检测等分子生物学实验。

Description

一种FastM粪便DNA快速提取试剂盒及提取方法
技术领域
本发明涉及医疗检测领域，尤其是一种FastM粪便DNA快速提取试剂盒及提取方法。
背景技术
粪便样本或肠道内容物样本是肠道疾病研究和肠道临床检测的重要样本来源。粪便样本成分复杂，样本中食物残渣、脱落细胞等杂质较多，并且含有大量蛋白酶、核酸酶、胆盐、胆红素和腐殖质等各种PCR抑制剂，影响后续分子生物学实验。现有大多数常规分离提纯核酸技术并不能有效地去除抑制剂等物质，且操作步骤繁杂，因此常规方法分离提纯的粪便样本核酸浓度和纯度较低，易降解，保存时间短，不利于操作，并且检测抑制剂常常随着DNA分离提纯一起被分离和浓缩，对后续核酸检测造成不利影响，导致PCR扩增实验的失败。
发明内容
针对现有的不足，本发明提供一种FastM粪便DNA快速提取试剂盒及提取方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种FastM粪便DNA快速提取试剂盒，包括试剂1、试剂2、试剂3、EB溶液和搅拌珠；
所述试剂1含有如下组分：1mM的NaOH、质量浓度为0.5％的SDS、5mM的EDTA、质量浓度为1％的CTAB、0.5M的NaCl；
所述试剂2的pH值为3且其含有如下组分：质量浓度为10mg/mL的蛋白酶K、1mM的Tris-HCl、H2O；
所述试剂3为质量浓度为50％的乙醇。
作为优选，所述EB溶液的pH值为8且其中还含有如下组分：10mM的Tris-HCl、2mM的EDTA。
作为优选，所述搅拌珠是玻璃珠或磁珠。
一种FastM粪便DNA快速提取方法，使用如前任意一项所述的试剂盒，其步骤如下：
S1，采集粪便样本；
S2，往粪便样品中加入搅拌珠，随后加入试剂1并进行破碎处理形成溶液1；
S3，往溶液1中加入试剂2并混匀后进行离心，提取上清形成溶液2；
S4，往溶液2中加入预冷的无水乙醇混匀静置形成溶液3，所加入的无水乙醇和溶液2的体积比是2:1；
S5，将溶液3离心去除上清形成沉淀1；
S6，往沉淀1中加入试剂3，离心并去除上清形成沉淀2；
S7，将沉淀2进行干燥制得DNA。
作为优选，所述步骤S7后还有步骤S8，所述步骤S8是，往步骤S7制得的DNA中加入EB溶液获得待检测的溶液。
作为优选，所述步骤S2的处理条件是，先利用破壁机在转速为2000rpm的状态下破碎5min，然后在温度为70℃的水浴或金属浴下处理10min，最后室温静置5min。
作为优选，所述步骤S3是在溶液1冷却至室温下加入试剂2的，其离心条件是10000rpm，离心2min。
作为优选，所述步骤S5的离心条件是12000rpm，离心10min，离心温度为4℃。
作为优选，所述步骤S6的离心条件是12000rpm，离心5min。
作为优选，所述步骤S7的干燥时间是10min。
本发明的有益效果在于：该发明的试剂盒操作简便，提取纯化的DNA核酸得率高、纯度好，不含核酸酶及PCR抑制剂，有利于DNA核酸的保存与后续PCR检测等分子生物学实验。
附图说明
图1是本发明实施例部分样本电泳测试结果图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明实施例的目的、技术方案和优点，下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
本发明实施例如图1中所示，一种FastM粪便DNA快速提取试剂盒及提取方法，包括试剂1、试剂2、试剂3、EB溶液和搅拌珠；
所述试剂1含有如下组分：1mM的NaOH、质量浓度为0.5％的SDS、5mM的EDTA、质量浓度为1％的CTAB、0.5M的NaCl；
所述试剂2的pH值为3且其含有如下组分：质量浓度为10mg/mL的蛋白酶K、1mM的Tris-HCl、H2O；
所述试剂3为质量浓度为50％的乙醇；
所述EB溶液的pH值为8且其中还含有如下组分：10mM的Tris-HCl、2mM的EDTA。
高浓度的EDTA和碱性条件下能确保离体后的粪便中DNA的完整性，同时利用SDS和CTAB的双重作用来有效去除杂质，提高DNA的纯度，Tris-HCl(pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中，蛋白酶K则能更好的使DNA游离出来，进一步提高DNA的纯度。此时就根据使用情况，搅拌珠选择是玻璃珠或磁珠。
提取方法的步骤如下：
S1，使用2mL离心管在电子天平中称量粪便样本约110mg；
S2，向粪便样品加入约0.5g玻璃珠，随后加入500μL试剂1，使用破壁机破碎5min，速度2000，水浴或者金属浴70℃处理10min后，室温静置5min，处理完成后形成溶液1；
S3，在溶液1冷却至室温后加入500μL试剂2，充分混匀，10000rpm离心2min，取上清至新的2mL管子中形成溶液2；
S4，往溶液2中加入预冷的无水乙醇混匀静置形成溶液3，所加入的无水乙醇和溶液2的体积比是2:1，静置5min；
S5，将溶液3离心去除上清形成沉淀1，离心条件是12000rpm离心10min，离心温度为4℃；
S6，往沉淀1中加入试剂3，离心并去除上清形成沉淀2，离心条件是12000rpm离心5min；
S7，将沉淀2进行干燥制得DNA，干燥时间10min，干燥时是将离心管的盖子去掉进行干燥的。
步骤S8是，往制得的DNA中加入加入50μL EB溶液溶解DNA从而获得用于检测的溶液。
将步骤S8中形成的待检测的溶液进行DNA核酸的浓度、纯度及荧光定量PCR扩增检测。利用上述方法进行DNA核酸提取，对20个样品进行测试，测试结果如下：表1是NanoDrop纯度测试结果，表2是Qubit浓度测试结果，表3是荧光PCR测试结果；
样品名称 核酸(ng/uL) A260/A280 A260/A230 A260 A280
1 62.589 1.702 2.413 1.52 0.893
2 56.681 1.812 2.112 1.274 0.703
3 40.576 1.887 2.217 0.921 0.546
4 55.965 1.755 2.311 1.351 0.77
5 38.801 1.757 1.994 0.875 0.498
6 41.793 1.637 2.013 1.023 0.625
7 512.544 1.779 1.921 11.551 6.493
8 60.589 1.721 2.413 1.520 0.883
9 56.772 1.859 2.002 1.363 0.733
10 52.285 1.733 1.906 1.182 0.682
11 46.914 1.694 1.836 0.998 0.589
12 55.389 1.807 2.592 1.424 0.788
13 77.774 1.707 2.306 1.937 1.135
14 104.743 1.898 2.16 2.544 1.498
15 10.565 1.665 2.237 0.258 0.155
16 0.726 0.714 0.625 0.005 0.007
17 50.389 1.778 2.292 1.645 0.925
18 52.389 1.805 2.002 1.807 1.001
19 0.686 0.484 0.524 0.015 0.031
20 0.701 0.563 0.441 0.009 0.016
表1
Figure BDA0003694743160000051
Figure BDA0003694743160000061
表2
Figure BDA0003694743160000062
Figure BDA0003694743160000071
表3
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种FastM粪便DNA快速提取试剂盒，其特征在于：包括试剂1、试剂2、试剂3、EB溶液和搅拌珠；
所述试剂1含有如下组分：1mM的NaOH、质量浓度为0.5％的SDS、5mM的EDTA、质量浓度为1％的CTAB、0.5M的NaCl；
所述试剂2的pH值为3且其含有如下组分：质量浓度为10mg/mL的蛋白酶K、1mM的Tris-HCl、H2O；
所述试剂3为质量浓度为50％的乙醇。
2.根据权利要求1所述FastM粪便DNA快速提取试剂盒，其特征在于:所述EB溶液的pH值为8且其中还含有如下组分：10mM的Tris-HCl、2mM的EDTA。
3.根据权利要求1所述FastM粪便DNA快速提取试剂盒，其特征在于:所述搅拌珠是玻璃珠或磁珠。
4.一种FastM粪便DNA快速提取方法，其特征在于:使用权利要求1至3中任意一项所述的试剂盒，其步骤如下：
S1，采集粪便样本；
S2，往粪便样品中加入搅拌珠，随后加入试剂1并进行破碎处理形成溶液1；
S3，往溶液1中加入试剂2并混匀后进行离心，提取上清形成溶液2；
S4，往溶液2中加入预冷的无水乙醇混匀静置形成溶液3，所加入的无水乙醇和溶液2的体积比是2:1；
S5，将溶液3离心去除上清形成沉淀1；
S6，往沉淀1中加入试剂3，离心并去除上清形成沉淀2；
S7，将沉淀2进行干燥制得DNA。
5.根据权利要求4所述FastM粪便DNA快速提取方法，其特征在于:，所述步骤S7后还有步骤S8，所述步骤S8是，往步骤S7制得的DNA中加入EB溶液获得待检测的溶液。
6.根据权利要求4所述FastM粪便DNA快速提取方法，其特征在于:所述步骤S2的处理条件是，先利用破壁机在转速为2000rpm的状态下破碎5min，然后在温度为70℃的水浴或金属浴下处理10min，最后室温静置5min。
7.根据权利要求4所述FastM粪便DNA快速提取方法，其特征在于:所述步骤S3是在溶液1冷却至室温下加入试剂2的，其离心条件是10000rpm，离心2min。
8.根据权利要求4所述FastM粪便DNA快速提取方法，其特征在于:所述步骤S5的离心条件是12000rpm，离心10min，离心温度为4℃。
9.根据权利要求4所述FastM粪便DNA快速提取方法，其特征在于:所述步骤S6的离心条件是12000rpm，离心5min。
10.根据权利要求4所述FastM粪便DNA快速提取方法，其特征在于:所述步骤S7的干燥时间是10min。
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