CN110358762A - 一种提取植物叶片基因组dna的试剂盒及其提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，涉及基于全自动磁珠提取纯化仪提取植物叶片基因组DNA的试剂盒及其提取方法，基于全自动磁珠提取纯化仪从植物叶片中提取基因组DNA的试剂盒，其包括：Lysis A、Lysis B、Lysis C、磁珠悬浮液、Binding Buffer、Washing Buffer、Elution Buffer。利用本发明试剂盒提取植物叶片基因组DNA速度快、得率高、无降解、无PCR抑制物质。DNA提取从裂解、沉淀、纯化到洗脱的全过程均由仪器完成，自动化程度高。完成所有步骤只需要min即可，节约了时间。同时，本发明所有试剂不含氯仿等有机溶剂，不会对人体造成伤害。
Description
技术领域
本发明专利属于分子生物学技术领域，涉及一种从植物叶片中提取基因组DNA的试剂盒和提取方法。
背景技术
随着分子生物学的不断发展，基因组学已在动植物的遗传机理、基因组功能分析以及病害诊断等各个领域广泛应用。而基因组DNA作为基因组学研究的重要基础物质，其浓度、纯度、完整性以及提取方法的灵敏度和速度将直接决定PCR特异性扩增以及后续基因组测序等试验的成败。
对于植物基因组DNA来说，传统的提取方法主要有CTAB和SDS法，提取步骤主要包括细胞裂解、去除杂质、DNA沉淀、漂洗和洗脱等过程。其主要是以CTAB或SDS等去污剂对细胞进行裂解后，释放出细胞中的基因组DNA；再通过氯仿苯酚抽提或高盐沉淀的方法，去除蛋白质、多酚和多糖等杂质；然后在提取的上清液中加入适量体积的无水乙醇、异丙醇或PEG等有机溶剂将DNA沉淀或吸附在硅胶柱、离子交换柱等介质上；最后用漂洗液进行漂洗后，用低浓度盐溶液溶解或从介质上洗脱下来。传统基因组DNA提取方法存在离心和上清液转移过程繁多、费时费力、回收率低等问题，并且在提取过程中需使用苯酚、氯仿等有毒试剂，影响人体健康。
磁珠分离纯化技术是近年来发展起来的固相提取新方法，其主要原理是指核酸在高盐低PH环境下，通过静电作用、疏水作用和氢键作用特异性吸附到二氧化硅表面，并与硅羟基形成磁珠核酸复合物，经洗涤后，最后将核酸从氧化硅表面洗脱下来，从而实现对核酸的纯化和提取。由于磁珠法操作简便、不使用有毒试剂、易于实现自动化提取、核酸提取纯度高等优点，目前该方法已应用到了大部分生物材料的DNA或RNA的提取中，并出现了相应的试剂盒。
现有大部分磁珠法提取DNA试剂盒多依托磁力架，整合到全自动磁珠纯化仪上时，存在基因组DNA降解或回收率偏低的情况。其次，市售的大部分植物叶片的基因组DNA提取试剂盒多适用于玉米、大豆、水稻以及烟草等大宗作物，用于蔬菜作物后，由于多糖、蛋白、多酚等杂质含量高，利用现有磁珠试剂盒提取基因组DNA回收率较低，不能满足进一步的实验要求。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术不足，提供了一种提取植物叶片基因组DNA的试剂盒及其提取方法。
一种提取植物叶片基因组DNA的试剂盒，该试剂盒由Pretreat、Lysis A、Lysis B、磁珠悬浮液、Binding Buffer、Washing Buffer和Elution Buffer组成；
所述Pretreat的组分为：0.1～0.3M Tris-Hcl、0.04～0.06M EDTA、1～3% β-巯基乙醇、1～2% PVP；
所述Lysis A 的组分为：0.8～1.2M KAC、0.04～0.06M EDTA、4～6M GHCL、5～20mMsodium citrate、1～2%Tween 20；
所述Lysis B的组分为：20～30mg/ml蛋白酶K；
所述磁珠悬浮液的组分为：磁珠浓度为100mg/ml;
所述Binding Buffer 的组分为：15～25%PEG6000、1.0～2.0M NaCl，PH=4.0～5.0；
所述Washing Buffer的组分为：70～80%乙醇；
所述Elution Buffer的组分为：无菌超纯水，PH=7.0。
进一步优选的是，所述磁珠颗粒直径为1μm，磁珠为Fe3O4纳米磁珠表面包被硅羟基。
一种基于所述的试剂盒提取植物叶片基因组DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：取植物叶片，分别加入400ul的Pretreat和Lysis A进行破碎预处理，再加入10ul的Lysis B后，转入65℃水浴30-60min；
步骤二：12000rpm常温离心10min，取上清50～60ul，分别加入100～120ul的BindingBuffer和10ul的磁珠悬浮液；
步骤三：将磁珠转移到Washing Buffer中清洗3～4次；
步骤四：将清洗后的磁珠转移到Elution Buffer中洗脱，得到纯化的基因组DNA。
进一步优选的是，所述步骤一中，
若所取植物叶片为新鲜植物叶，取量为100～150mg；
若所取植物叶片为干燥组织，取量为30～50mg。
进一步优选的是，所述步骤一中，破碎前处理在细胞破碎仪中进行，加入钢珠或陶瓷珠后，破碎处理1～2min。
进一步优选的是，所述步骤一中，在研钵中加入液氮研磨后，再分别加入Lysis A和Lysis B试剂。
进一步优选的是，所述步骤二中，上清液与Binding Buffer的体积比为1:2；所述步骤三中参与基因组DNA提取的磁珠与Washing Buffer体积比为1:20。
进一步优选的是，所述步骤一与步骤二间还包括加样步骤，上清液和各试剂按提取程序加在与仪器配套的96孔板内，各微孔中加入的溶液总量不超过200ul，避免提取过程中溶液溢出。
本发明的有益效果在于：
1）本发明提取基因组DNA只需经过裂解、沉淀、清洗和洗脱几个步骤，且均可通过仪器完成，自动化程度高，完全无需人工干预和加入有毒试剂，可最大程度避免对人体的伤害。
2）本发明试剂盒采用盐酸胍作为细胞裂解液，其为强变性剂，裂解效果远好于CTAB和SDS。
3）提取的基因组DNA得率高、纯度高、片段完整、无PCR抑制物，使用本试剂盒提取100mg花椰菜、白菜、苦瓜、番茄、莴笋等植物叶片时，分别纯化获得了9.8mg、9.5mg、15.8mg、9.6mg和7.2mg的高纯度基因组DNA，纯度A260/280=1.8-2.0之间。
附图说明
图1为是本发明试剂盒及其提取方法提取苦瓜、番茄以及花椰菜等植物成熟叶片基因组DNA的琼脂糖水平电泳对比图；
图2是本发明的试剂盒与市售试剂盒提取花椰菜嫩叶基因组DNA的琼脂糖水平电泳对比图；
图中，其中M泳道为标记泳道，1泳道为改良CTAB方法提取的花椰菜新鲜成熟叶片基因组DNA条带，2泳道为索莱宝植物DNA提取试剂盒提取的花椰菜新鲜成熟叶片基因组DNA条带，3泳道为天根植物DNA提取试剂盒提取的花椰菜新鲜成熟叶片基因组DNA条带，4泳道为新百基磁珠法植物DNA提取试剂盒提取的花椰菜新鲜成熟叶片基因组DNA条带，5泳道为本发明提取的花椰菜新鲜成熟叶片基因组DNA条带。
具体实施方式
下面结合具体的实施案例来进一步阐述本发明，这些实例主要用于解释说明本发明，但不仅限于此。
1、试剂盒
一种基于全自动磁珠纯化仪提取植物叶片基因组DNA的试剂盒，其包括：包括：Pretreat、Lysis A、Lysis B、磁珠悬浮液、Binding Buffer、Washing Buffer、ElutionBuffer。
Pretreat：0.2M Tris-Hcl、0.05M EDTA（乙二胺四乙酸）、2% β-巯基乙醇、2% PVP（聚乙烯吡咯烷酮）；
Lysis A：0.1M KAC（醋酸钾）、0.05M EDTA（乙二胺四乙酸）、6M GHCL（盐酸胍）、0.01Msodium citrate（柠檬酸钠）、2%Tween 20（聚氧乙烯去水山梨醇单月桂酸酯）；
Lysis B：25mg/ml蛋白酶K；
Binding Buffer：22% PEG6000（聚乙二醇6000）、1.0M NaCl，PH=4.7；
磁珠悬浮液：磁珠浓度为100mg/ml;
Washing Buffer：80%乙醇。
Elution Buffer：无菌超纯水，PH=7.0。
其中Tris采用上海生工生物工程公司的#TT1492，PVP采用上海生工生物工程公司的#G0507，EDTA-Na2采用上海生工生物工程公司的#TT0503，KAC采用天津风船化学试剂公司的#T1782，sodium citrate采用天津风船化学试剂公司的T16493，Tween-20采用天津风船化学试剂公司的#J350，NaCl采用天津风船化学试剂公司的#T473，无水乙醇采用天津风船化学试剂公司的#T678，GHCL采用德国BioFroxx生物技术公司的1330GR500，PEG6000采用德国BioFroxx生物技术公司的1518GR500，蛋白酶K采用德国BioFroxx生物技术公司的1124MG100。
2、基因组DNA提取方法：
步骤一，取成熟叶片（新鲜植物叶片100～150mg，干燥叶片30～50mg），分别加入400ulLysis A和Pretreat，放入多通道均质器（OMNI BeadRuptor24）中，速度6.3，破碎2min，加入10ul的Lysis B后，转入65℃中水浴45min；
步骤二，冷却到室温后，12000rpm常温离心10min，取上清备用。
步骤三，分别取60ul上清液，加入到与Kingfisher磁珠纯化仪配套的96孔板的A、B、C排内，再分别加入120ul的Binding Buffer和10ul的磁珠悬浮液；D、E、F排均加入200ul的Washing Buffer；G排加入50ul的Elution Buffer，H排空置，不加入任何试剂。
步骤四，将加好的96孔板和磁头套装入Kingfisher磁珠纯化仪中，运行程序，程序步骤设置如下：
步骤六，吸取G排洗脱液转移至PCR管中，即提取的基因组DNA，置于4℃冰箱中备用。
运用多功能酶标仪（TECAN Spark 10M）的Nano Quant核酸微量检测模块分别测定基因组DNA浓度和纯度，测定5组提取结果，求平均值。
实验1
分别称取100mg苦瓜、番茄、花椰菜以及白菜等成熟叶片，用本发明的试剂盒和DNA提取方法分别提取叶片基因组DNA。
实验结果的数据对比如如表所示：
实验结果的图像对比如图1所示（1%琼脂糖凝胶电泳）。
实验结论：从以上结果可以看出，本发明的试剂盒提取莴笋、番茄、花椰菜白菜以及苦瓜等植物叶片的基因组DNA，片段完成，无蛋白质、RNA等PCR抑制物，其得率分别为7.2mg、9.6mg、9.8mg、9.5mg和15.8mg，符合后续PCR和基因组测序试验。
实验2
选用100mg花椰菜新鲜成熟叶片进行基因组DNA的提取，同时用其它3种常规商品试剂盒和改良CATB法的提取结果作为对照，测定5组提取结果，求平均值。
实验结果的数据对比如如表所示：
实验结果的图像对比如图2所示（1%琼脂糖凝胶电泳）。
实验结论：从以上结果可以看出，本发明的试剂盒与CTAB法相比，速度快，DNA片段完整，无蛋白质、RNA等PCR抑制物。同时在与市售植物基因组DNA提取试剂盒相比，本发明DNA得率更高，DNA纯度更好。
Claims (8)
1.一种提取植物叶片基因组DNA的试剂盒，其特征在于，该试剂盒由Pretreat、LysisA、Lysis B、磁珠悬浮液、Binding Buffer、Washing Buffer和Elution Buffer组成；
所述Pretreat的组分为：0.1～0.3M Tris-Hcl、0.04～0.06M EDTA、1～3% β-巯基乙醇、1～2% PVP；
所述Lysis A 的组分为：0.8～1.2M KAC、0.04～0.06M EDTA、4～6M GHCL、5～20mMsodium citrate、1～2%Tween 20；
所述Lysis B的组分为：20～30mg/ml蛋白酶K；
所述磁珠悬浮液的组分为：磁珠浓度为100mg/ml;
所述Binding Buffer 的组分为：15～25%PEG6000、1.0～2.0M NaCl，PH=4.0～5.0；
所述Washing Buffer的组分为：70～80%乙醇；
所述Elution Buffer的组分为：无菌超纯水，PH=7.0。
2.如权利要求1所述的一种提取植物叶片基因组DNA的试剂盒，其特征在于，所述磁珠颗粒直径为1μm，磁珠为Fe3O4纳米磁珠表面包被硅羟基。
3.一种基于权利要求1或2所述的试剂盒提取植物叶片基因组DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：取植物叶片，分别加入400ul的Pretreat和Lysis A进行破碎预处理，再加入10ul的Lysis B后，转入65℃水浴30-60min；
步骤二：12000rpm常温离心10min，取上清50～60ul，分别加入100～120ul的BindingBuffer和10ul的磁珠悬浮液；
步骤三：将磁珠转移到Washing Buffer中清洗3～4次；
步骤四：将清洗后的磁珠转移到Elution Buffer中洗脱，得到纯化的基因组DNA。
4.如权利要求3所述的提取植物叶片基因组DNA的方法，其特征在于，所述步骤一中，
若所取植物叶片为新鲜植物叶，取量为100～150mg；
若所取植物叶片为干燥组织，取量为30～50mg。
5.如权利要求3所述的提取植物叶片基因组DNA的方法，其特征在于，所述步骤一中，破碎前处理在细胞破碎仪中进行，加入钢珠或陶瓷珠后，破碎处理1～2min。
6.如权利要求3所述的提取植物叶片基因组DNA的方法，其特征在于，所述步骤一中，在研钵中加入液氮研磨后，再分别加入Lysis A和Lysis B试剂。
7.如权利要求3所述的提取植物叶片基因组DNA的方法，其特征在于，所述步骤二中，上清液与Binding Buffer的体积比为1:2；所述步骤三中参与基因组DNA提取的磁珠与Washing Buffer体积比为1:20。
8.如权利要求3所述的提取植物叶片基因组DNA的方法，其特征在于，所述步骤一与步骤二间还包括加样步骤，上清液和各试剂按提取程序加在与仪器配套的96孔板内，各微孔中加入的溶液总量不超过200ul，避免提取过程中溶液溢出。
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