KR20130061662A - ａＲＮＡ의 조제방법 및 유전자 발현의 해석방법 - Google Patents

ａＲＮＡ의 조제방법 및 유전자 발현의 해석방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고정액에 의해 고정된 조직 또는 세포로부터 추출된 RNA 샘플로부터 유전자 발현 해석에 사용하는 aRNA를 조제하는 방법으로서 역전사 및 인비트로 전사에 의한 RNA 샘플의 증폭 공정에 있어서 인비트로 전사에서 사용하는 뉴클레오티드 시약 중의 아미노알릴우리딘5'-3인산(AA-UTP)의 비율을 우리딘5'-3인산(UTP)과 AA-UTP의 총합에 대하여 5몰% 이상 25몰% 미만으로 한다.

Description

ａＲＮＡ의 조제방법 및 유전자 발현의 해석방법{METHOD FOR PREPARING aRNA AND METHOD FOR ASSAYING GENE EXPRESSION}
본 발명은 고정된 조직 또는 세포로부터 추출된 RNA 샘플의 유전자 발현 해석을 행할 때에 사용되는 aRNA의 조제방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 고정된 조직 또는 세포로부터 추출된 RNA 샘플로부터 조제된 aRNA를 사용하는 유전자 발현의 해석방법에 관한 것이다.
최근, 병원이나 연구 기관 등에서 막대한 수의 검체가 보관되어 있는 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직으로 대표되는 고정액에 의해 고정된 조직, 세포에 포함되는 유전자를 해석하는 기술에 대해서 많은 기대가 높아지고 있다. 특히, FFPE 조직에 대해서는 과거의 방대한 질환 데이터가 축적되어 있기 때문에 FFPE 조직으로부터 유전자를 추출하고, 그것들의 발현을 해석할 수 있는 기술을 확립하면 장기간 보존된 조직을 사용한 소급적인 연구가 가능해져서 장래적으로는 질환의 치료나 예방에 크게 공헌할 수 있다.
그러나, FFPE 샘플 등의 고정 조직이나 고정 세포로부터 추출한 RNA는 일반적인 고정 조건, 보관 조건에서는 분해, 단편화가 진행되기 때문에 유전자 발현 해석을 행하는 것은 어렵다고 생각되고 있었다. 또한, 고정액으로서 가장 일반적으로 사용되고 있는 포름알데히드(포르말린)에 의해 RNA-RNA 사이, RNA-단백질 사이가 가교되거나 포름알데히드가 RNA에 부가, 수식되거나 하는 경우가 있고, 그러한 상태의 RNA 샘플에 있어서는 효소 반응 및/또는 화학 반응이 진행하기 어려워서 유전자 발현 해석이 곤란해지는 경우가 있었다. 그래서, 분해, 단편화가 진행된 RNA 샘플이나 가교, 부가, 수식이 이루어진 RNA 샘플로부터도 유전자 발현 해석을 가능하게 하는 기술이 요구되고 있었다.
FFPE 샘플로부터 유전자 발현 해석에 제공되는 RNA 샘플을 조제하는 것을 목적으로 한 몇가지의 RNA 증폭용 시약 키트가 시판되고 있다. 구체적으로는, cDNA를 증폭하는 NuGen사의 "WT-Ovation FFPE RNA Amplification System", aRNA를 증폭하는 AmpTec사의 "ExpressArt TRinucleotide mRNA amplification Kit", MDS Analytical Technologies사의 "Paradise Plus 2 Round-Aminoallyl" 등을 예시할 수 있다. 이들 키트는 소량의 RNA로부터 대량의 증폭 산물을 얻는 것을 주목적으로 한 제품이고, 그 때문에 증폭 반응을 2회 이상 행하는 것이 표준적이다. 그러나, mRNA의 분해 거동은 일정하지 않기 때문에 특히 FFPE 샘플로부터 추출한 분해, 단편화가 진행된 RNA 샘플을 증폭할 경우에는 증폭 조작에 의한 바이어스가 생길 가능성이 매우 높고, 증폭 조작을 복수회 반복함으로써 더욱 바이어스가 증대된다. 따라서, 상술한 키트를 사용해서 유전자 발현 해석을 행했을 경우 얻어진 결과가 원래의 RNA의 존재량으로부터 크게 빗나가는 경우가 있어서 정량성을 갖는 해석방법이나 시약, 키트의 개발이 요구되고 있었다.
RNA 샘플을 증폭하는 방법으로서 인비트로 전사 반응을 이용하는 방법이 알려져 있다. 이 방법에 있어서는 증폭 산물을 형광 표식하는 것을 목적으로 해서 증폭 조작에 있어서의 인비트로 전사 반응시에 아미노알릴기, 비오틴기 등의 관능기를 갖는 뉴클레오티드를 사용해서 증폭 산물에 관능기를 도입하는 경우가 있다. 이때, 형광 색소의 표식 효율을 될 수 있는 한 높게 하기 위해서는 관능기를 갖지 않는 뉴클레오티드에 대하여 관능기를 갖는 뉴클레오티드의 비율을 많게 한다. 고정액에 의한 고정 조작이 이루어져 있지 않은 동결 조직이나 동결 절편으로부터 추출된 RNA 샘플을 사용하는 예로서, 예를 들면 특허문헌 1의 실시예에서는 2회 증폭의 2라운드째에 있어서 뉴클레오티드의 1종인 우리딘5'-3인산(UTP)의 일부에 아미노알릴기에 의해 수식된 5-(3-아미노알릴)우리딘5'-3인산(AA-UTP)을 사용하고 있지만, AA-UTP와 UTP의 비율을 AA-UTP:UTP=3:1(AA-UTP의 비율이 75몰%)로 하고 있다. 또한, 비특허문헌 1에 있어서는 AA-UTP에 의한 표식 효율을 높이기 위한 AA-UTP와 UTP의 비율을 검토하여 AA-UTP:UTP=1:1(AA-UTP의 비율이 50몰%)이 최적인 비율이라고 기재되어 있다.
일본 특허공개 2009-131262호 공보
Peter A.C.'t Hoen, Floor de Kort, G.J.B. van Ommen and Johan T. den Dunnen: Fluorescent labelling of cRNA for microarray applications; Nucleic Acids Research 31(5), e20, 2003
상술한 바와 같이, RNA의 증폭 조작을 복수회 행하는 것은 소량의 RNA 샘플로부터 유전자 발현 해석을 행하는데 충분한 양의 RNA 샘플을 얻을 수 있는 메리트가 있다. 그러나, 고정된 조직이나 세포로부터 추출된 RNA 샘플은 분해, 단편화나 수식, 가교 등이 발생되어 있고, 증폭되기 쉬운 것과 증폭되기 어려운 것이 혼재하고 있다. 그 때문에, 증폭 조작을 반복해서 증폭 배율이 커질수록 증폭 바이어스가 생겨 정량적인 평가가 곤란했다.
한편, RNA를 역전사 반응과 인비트로 전사 반응을 조합시켜서 증폭하는 방법은 비교적 증폭 바이어스가 생기기 어렵다고 여겨지고 있다. 그러나, 이 방법에 있어서 증폭 산물에 형광 표식을 행하기 위한 관능기를 도입할 경우 인비트로 전사 반응에 있어서 아미노알릴기 등의 관능기를 갖는 뉴클레오티드 시약을 사용할 필요가 있지만, 이 관능기를 갖는 뉴클레오티드의 비율이 많으면 증폭 반응이 저해되어버린다. 그 때문에, 분해, 단편화 등이 진행된 고정된 조직 또는 세포로부터 추출된 RNA 샘플을 사용할 경우에는 유전자 발현의 해석을 행하는데 충분량의 증폭 산물이 얻어지지 않는다고 하는 것이 과제였다. 이 경우 충분량의 증폭 산물을 확보하기 위해서 증폭 반응을 반복하면 증폭 바이어스가 증대한다고 하는 문제가 있었다.
상기 과제를 해결하기 위해서 발명자들은 예의 검토한 결과 고정된 조직 또는 세포로부터 추출된 RNA 샘플의 유전자 발현 해석을 행할 때에 인비트로 전사 반응에서 사용하는 뉴클레오티드 시약 중의 아미노알릴기를 갖는 뉴클레오티드의 비율을 특정 범위로 설정함으로써 인비트로 전사 반응의 저해가 억제되고, 또한 유전자 발현 해석에 필요하게 되는 충분한 증폭 산물량을 확보할 수 있는 것을 찾아냈다. 그리고, 이 방법으로 조제된 증폭 RNA(aRNA) 샘플을 사용해서 유전자 발현 해석을 행하면 고정된 조직, 세포로부터 추출한 RNA 샘플을 사용할 경우에도 동결 조직으로부터 추출한 분해 등이 거의 없는 손상되지 않은(인택트한) RNA 샘플을 사용했을 경우와 동등한 정량성이 높은 해석 결과가 얻어지는, 즉 증폭 바이어스의 영향을 저감시킬 수 있는 것을 찾아내서 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 다음 (1)∼(5)로 구성된다.
(1) 고정된 조직 또는 세포로부터 추출된 RNA 샘플의 유전자 발현 해석에 사용하는 aRNA의 조제방법으로서, 역전사 공정 및 인비트로 전사 공정을 포함하는 RNA의 증폭 공정을 포함하고, 상기 인비트로 전사 공정에서 사용하는 뉴클레오티드 시약에 포함되는 5-(3-아미노알릴)우리딘5'-3인산(AA-UTP)의 비율이 우리딘5'-3인산(UTP)과 5-(3-아미노알릴)우리딘5'-3인산(AA-UTP)의 총합에 대해서 5몰% 이상 25몰% 미만인 것을 특징으로 하는 aRNA의 조제방법.
(2) (1)에 있어서,
상기 고정된 조직 또는 세포가 파라핀 포매되어서 이루어지는 것을 특징으로 하는 aRNA의 조제방법.
(3) (1) 또는 (2)에 있어서,
상기 aRNA의 뉴클레오티드 길이의 평균값이 200 뉴클레오티드 이상인 것을 특징으로 하는 aRNA의 조제방법.
(4) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 aRNA의 조제방법에 의해 조제된 aRNA를 사용하는 것을 특징으로 하는 고정된 조직 또는 세포로부터 추출된 RNA 샘플의 유전자 발현의 해석방법.
(5) (4)에 있어서,
마이크로 어레이를 사용하는 것을 특징으로 하는 고정된 조직 또는 세포로부터 추출된 RNA 샘플의 유전자 발현의 해석방법.
(발명의 효과)
본 발명의 aRNA의 조제방법을 사용함으로써 고정된 조직 또는 세포로부터 추출된 RNA 샘플을 사용하는 유전자 발현 해석을 행할 경우에 필요하게 되는 충분량의 aRNA를 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 aRNA의 조제방법에 의하면 증폭 바이어스의 영향이 저감된 aRNA가 얻어지기 때문에 원래의 RNA 샘플 중의 유전자의 존재량이 상당 정도 정확하게 반영된 정량성이 높은 유전자 발현 해석이 가능해진다.
도 1은 (1): 생쥐 소뇌, 간장의 FFPE(A)로부터 추출된 RNA(A)의 전기 영동상. (2): FFPE(B)로부터 추출된 RNA(B)의 전기 영동상. (3): FFPE(C)로부터 추출된 RNA(C)의 전기 영동상. (4): 생쥐 소뇌, 간장의 동결 조직 샘플로부터 추출된 RNA(D)의 전기 영동상.
도 2는 (1): RNA(A)로부터 조제된 aRNA의 전기 영동상. (2): RNA(D)로부터 조제된 aRNA의 전기 영동상.
도 3은 실시예 1에 있어서 DNA 칩 해석에 의해 동결 조직 샘플(D), FFPE 샘플(A)과 함께 발현이 확인된 공통 유효 유전자에 대해서 동결 조직에 있어서의 소뇌와 간장의 시그널비(소뇌/간장)를 세로축에, FFPE 샘플에 있어서의 소뇌와 간장의 시그널비(소뇌/간장)를 가로축에 플로트한 산포도.
도 4는 비교예 1에 있어서 DNA 칩 해석에 의해 동결 조직 샘플(D), FFPE 샘플(A)과 함께 발현이 확인된 공통 유효 유전자에 대해서 동결 조직에 있어서의 소뇌와 간장의 시그널비(소뇌/간장)를 세로축에, FFPE 샘플에 있어서의 소뇌와 간장의 시그널비(소뇌/간장)를 가로축에 플로트한 산포도.
이하에, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
본 발명은 고정된 조직 또는 세포(이하, 「고정 조직 또는 세포」라 하는 경우가 있다)로부터 추출된 RNA 샘플(이하, 「RNA 샘플」이라 하는 경우가 있다)을 유전자 발현 해석할 때의 aRNA의 조제방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 aRNA는 원래의 RNA를 증폭 공정에 제공함으로써 증폭 산물로서 얻어지는 증폭 RNA(amplified RNA)를 의미한다.
본 발명의 aRNA의 조제방법에서는 고정 조직 또는 세포로부터 추출된 RNA 샘플을 증폭 공정에 제공하여 RNA 샘플 중의 메신저 RNA(mRNA)를 증폭한다. 본 발명의 증폭 공정은 RNA의 역전사와 얻어지는 DNA의 인비트로 전사를 조합시켜서 RNA의 증폭을 행하여 증폭 산물로서 aRNA를 얻는 것이다. 여기서, 역전사는 단일쇄 RNA를 주형으로 하여 역전사 효소를 사용해서 역전사 반응을 행하여 cDNA(상보적 DNA)를 얻는 것이다. 또한, 일반적으로 인비트로 전사는 인비트로에 있어서 주형이 되는 DNA로부터 RNA 폴리메라아제에 의해서 전사 산물로서 RNA를 얻는 것이다. 역전사 반응에 의해 RNA 샘플로부터 cDNA를 얻어서 이중쇄 DNA를 합성한 후 인비트로 전사를 행함으로써 안티센스쇄의 aRNA가 합성된다.
역전사 공정 전에 미리 역전사 반응의 시작점이 되는 프라이머를 RNA에 어닐링시킨다. 여기서 사용하는 프라이머는 RNA 폴리메라아제가 RNA를 합성할 때에 3'-OH를 공급하는 역할을 갖는 짧은 핵산의 단편이다. 본 발명에 있어서는 mRNA의 3'-말단에 존재하는 폴리 A라 불리는 서열에 대해서 상보적인 쇄를 갖는 올리고dT 프라이머나 mRNA의 모든 영역에서 cDNA를 합성하는 통상 6∼9 염기의 랜덤 프라이머가 적합하게 이용된다. 또한, 본 발명에서 사용하는 프라이머는 프로모터 영역이라 불리는 서열을 갖는 것이 바람직하다. 프로모터 영역이란 RNA를 증폭할 때에 RNA 폴리메라아제를 결합시킬 수 있는 프로모터의 염기서열로 이루어지는 영역을 말한다. 본 발명에서 이용할 수 있는 프로모터로서는, 예를 들면 T7 프로모터, T3 프로모터, SP6 프로모터 등을 예시할 수 있다. 프라이머를 어닐링시킬 때의 반응 온도는 30∼80℃가 바람직하고, 40∼75℃가 보다 바람직하다. 또한 반응 시간은 5∼120분이 바람직하고, 10∼90분이 보다 바람직하다.
이어서, 역전사 공정으로서 상기에서 얻어지는 프라이머를 어닐링한 RNA를 주형으로 하여 역전사 효소, 디옥시뉴클레오티드를 사용해서 역전사 반응을 행하여 단일쇄 cDNA(퍼스트 스트랜드 cDNA)를 합성한다.
역전사 효소는 역전사 반응을 진행시키기 위해서 필수이다. 본 발명에 있어서는, 예를 들면 AMV(Avian Myeloblastosis Virus) 유래, MMLV(Moloney Murine Leukemia Virus) 유래의 효소가 이용 가능하고, 이들 포인트 뮤테이션, 딜레이션 뮤테이션을 넣음으로써 내열성이나 염기의 신장성을 높인 것도 바람직하게 이용할 수 있다. 본 발명에 있어서 바람직하게 사용되는 역전사 효소 제품으로서는, 예를 들면 SuperScript Ⅲ(Invitrogen사), SuperScript Ⅱ(Invitrogen사), MegaScript(Ambion사), PrimeScript(등록상표, Takara Bio Inc.), ReverTra Ace(등록상표, Toyobo Co., Ltd.), Transcriptor Reverse Transcriptase(Roche사)를 예시할 수 있다. 고정된 조직 또는 세포로부터 추출된 RNA 샘플은 가교나 수식을 받아서 조잡한 이차 구조를 형성하고 있는 것이 많고, 그러한 구조를 무너뜨리기 위해서 고온에서 처리하는 것이 필요한 경우가 있기 때문에 고온 하에서도 높은 활성을 갖는 SuperScript Ⅲ이 특히 바람직하게 사용된다.
역전사 공정에서 사용되는 뉴클레오티드는 디옥시아데노신3인산(dATP), 디옥시구아노신3인산(dGTP), 디옥시티미딘3인산(dTTP), 디옥시시티딘3인산(dCTP)의 4종의 디옥시뉴클레오티드3인산(dNTP)이다. 이것들은 역전사 반응으로 합성되는 cDNA의 근원이 된다.
역전사 공정에서는 역전사 효소가 산화해서 활성이 저하하는 것을 억제하기 위해서 반응 용액에 환원제를 첨가할 수 있다. 환원제로서는, 예를 들면 디티오트레이톨(DTT)이 적합하게 사용된다. 또한, 주형이 되는 RNA를 보호하기 위해서 반응 용액에 RNase 인히비터(inhibitor)를 첨가하는 것이 바람직하다. 또한, 반응 용액의 pH를 역전사 반응에 적합한 pH 7∼9로 조정하기 위해서 완충액을 사용할 수 있다. 예를 들면, 트리스-염산 완충액, 인산 완충액이 바람직하게 사용된다. 또한, 반응 용액에는 칼륨염, 마그네슘염이 포함되는 것이 바람직하다.
역전사 반응의 온도는 25∼60℃가 바람직하고, 30∼50℃가 보다 바람직하며, 35∼45℃가 더욱 바람직하다. 또한, 역전사 반응의 시간은 30∼180분이 바람직하고, 60∼150분이 보다 바람직하다. 역전사 반응 후 얼음 상에 옮기거나 해서 급냉함으로써 반응을 정지시킨다.
역전사 반응의 종료 후 리보뉴클레아제(RNase)에 의해서 역전사 반응의 주형이 된 RNA의 일부를 분해시킨다. 여기서 사용하는 시약으로서는 RNase H가 적합하다. 역전사 반응 후의 반응액에 RNase H를 첨가하여 가열 반응시킴으로써 RNA를 분해시킬 수 있다. 본분해 반응의 온도는 10∼50℃가 바람직하고, 15∼40℃가 보다 바람직하다. 또한, 본분해 반응 후에 역전사 효소를 실활시키는 공정으로서, 예를 들면 90∼100℃에서 1∼10분간 가열하는 공정을 추가해도 좋다.
이어서, 상기 역전사 공정에 의해서 얻어진 단일쇄 cDNA(퍼스트·스트랜드 cDNA)를 주형으로 하여 이것에 상보적인 DNA(세컨드 스트랜드 cDNA)를 합성한다. 프라이머로서는 역전사 공정에 있어서 분해되지 않은 일부의 RNA를 프라이머로 해도 좋고, 필요에 따라 외인성 프라이머를 어닐링하여 그것을 프라이머로서 이용해도 좋다. 주형이 되는 cDNA에 dNTP를 첨가하고, 효소로서 DNA 폴리메라아제를 첨가해서 반응을 개시하면 퍼스트 스트랜드 cDNA를 주형으로 해서 세컨드 스트랜드 cDNA가 합성된다. 이 세컨드 스트랜드 cDNA의 합성 반응의 결과 프로모터 서열을 갖는 이중쇄 DNA가 합성된다.
세컨드 스트랜드 cDNA 합성 반응으로 얻어진 프로모터 서열을 갖는 이중쇄 DNA는 다음 인비트로 전사 공정에 있어서 반응을 저해하는 염이나 불순물을 제거하기 위해서 정제하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 에탄올 침전이나 시판의 DNA 정제용 스핀 칼럼을 사용하는 당업자에 공지의 방법에 의해 정제할 수 있다.
정제된 프로모터 서열을 갖는 이중쇄 DNA를 사용해서 인비트로 전사(IVT) 공정을 행하여 RNA를 증폭시키면 목적으로 하는 aRNA가 얻어진다. 인비트로 전사 공정은 프로모터 서열을 갖는 이중쇄 DNA에 아데노신5'-3인산(ATP), 구아노신5'-3인산(GTP), 시티딘5'-3인산(CTP), 우리딘5'-3인산(UTP) 및 5-(3-아미노알릴)우리딘5'-3인산(AA-UTP)을 포함하는 뉴클레오티드 시약, 및 프로모터 서열을 인식하는 RNA 폴리메라아제를 사용해서 인비트로 전사 반응을 행하여 aRNA가 얻어진다. 여기서, 인비트로 전사의 반응 온도는 30∼50℃가 바람직하고, 35∼45℃가 보다 바람직하다. 또한, 인비트로 전사의 반응 시간은 1∼20시간이 바람직하고, 2∼16시간이 보다 바람직하다. 인비트로 전사에 있어서는 적당하게 RNase 인히비터(디티오트레이톨 등), 환원제 등을 사용해도 좋다.
상기 인비트로 전사 공정에서 사용하는 뉴클레오티드 시약에는 조제되는 aRNA를 형광 표식하기 위해서 아미노알릴기를 갖는 뉴클레오티드로서 우리딘5'-3인산(UTP)을 아미노알릴기로 수식한 5-(3-아미노알릴)우리딘5'-3인산(AA-UTP)을 사용한다. 본 발명에서는 UTP와 AA-UTP의 총합에 대한 AA-UTP의 함량 비율, 즉 「AA-UTP의 몰량/(UTP의 몰량+AA-UTP의 몰량)」으로 구해지는 비율이 5몰% 이상 25몰% 미만이다. 이 AA-UTP의 함량 비율의 하한은 바람직하게는 6몰% 이상, 보다 바람직하게는 8몰% 이상, 더욱 바람직하게는 10몰% 이상이다. 또한, 이 AA-UTP의 함량 비율의 상한은 바람직하게는 24몰% 이하, 보다 바람직하게는 23몰% 이하이다. 또한, 이 AA-UTP의 함량 비율의 범위는 바람직하게는 6몰% 이상 24몰% 이하, 보다 바람직하게는 10몰% 이상 23몰% 이하이다. AA-UTP의 함량 비율이 25몰% 이상이면 인비트로 전사 반응의 진행을 저해시켜 유전자 발현 해석에 필요하게 되는 충분량의 aRNA가 얻어지지 않는 경우가 있다. 또한, AA-UTP의 비율이 5몰% 미만이면 뉴클레오티드에 대한 형광 표식량이 적어져서 검출 감도가 저하되는 결과, 유전자 발현 해석에 있어서 얻어지는 유전자 발현의 정보가 부족해져 버리는 경우가 있다.
인비트로 전사 반응 후 aRNA 용액에 잔존하는 이중쇄 DNA를 제거하기 위해서 DNase를 사용해서 이 DNA를 분해시킨다. DNase의 첨가량은 잔존 DNA를 충분하게 분해시킬 수 있는 양이면 특별히 한정은 없다. 예를 들면, DNase로서 RNase-Free DNase I(1MBU/㎕)(MBU: Molecular Biology Unit)(Epicentre사)을 사용할 경우는 1㎍의 DNA를 분해하기 위해서 37℃에서 10분간의 처리 조건에 있어서 1㎕를 사용하면 좋다. DNase 처리는 통상 15∼40℃에서 10∼60분 가온함으로써 DNA를 분해시킬 수 있다.
이상과 같이 해서 조제된 aRNA는 DNase 처리 후 유전자 발현 해석에 제공하기 전에 정제하는 것이 바람직하다. aRNA의 정제 방법으로서는, 예를 들면 실리카멤브레인의 스핀 칼럼을 사용해서 aRNA를 멤브레인에 흡착시키고, 세정해서 불필요물을 흘려 제거한 후 흡착된 aRNA를 용출시키는 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 이 경우의 세정액은 구아니디움염 및 알콜류를 포함하는 용액을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 용출액으로서는, 예를 들면 뉴클레아제프리워터(Nuclease-Free Water), TE 완충액이 적합하게 사용된다. 용출액은 실온인 채로 사용해도 좋고, 가열해서 사용해도 좋다.
본 발명의 조제방법에 의해 얻어진 aRNA의 형광 표식은 유전자 발현 해석에 있어서의 하이브리다이제이션 반응 전에 행해도 좋고, 후에 행해도 좋다. 본 발명의 방법에 의해서 도입된 아미노알릴기에 대하여 N-히드록시숙신이미드(NHS)기를 말단에 가지는 형광 색소와 용이하게 커플링시킬 수 있다. 여기서 사용할 수 있는 형광 색소의 예로서는 Cy3, Cy5, Hyper5(GE health care사), Alexa Fluor(등록상표) 시리즈(Molecular Probes사), Oyster 시리즈(Denovo Biolabels사), DyLight 시리즈(Pierce사), Fluolid-W 시리즈(IST. Co., Ltd.), HyLite Fluor 시리즈(Anaspec사), MegaStokes Dye(Dyomics사) 등을 예시할 수 있지만, 이것들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 aRNA의 조제방법에 적용되는 고정 조직 또는 세포는 고정화된 것이다. 조직 또는 세포의 고정에 사용하는 고정액으로서는 포름알데히드 용액, 파라포름알데히드 용액, 에탄올 등의 알콜, 아세톤, 클로로포름을 포함하는 용액, 피크르산이나 중크롬산칼륨 등의 산을 포함하는 용액, 아세트산 아연, 염화 아연, 황산 아연 등의 금속을 포함하는 용액을 예시할 수 있지만 포름알데히드 용액, 파라포름알데히드 용액이 적합하게 사용된다. 포름알데히드 용액은 시판의 포르말린(포름알데히드 농도 37%)을 물로 희석시킨 것을 사용해도 좋고, 물로 희석시킨 포르말린 용액을 탄산 칼슘, 탄산 마그네슘 등을 첨가해서 pH를 중성으로 조정한 것이나, 인산 완충액으로 희석해서 pH를 중성으로 조정한 것을 사용하는 것도 바람직하다. 포름알데히드 용액 중의 포름알데히드 함량은 1∼30%가 바람직하고, 2∼20%가 보다 바람직하다.
고정 조직 또는 세포는 파라핀으로 포매되어 있어도 좋다. 예를 들면, 포르말린 고정된 파라핀 포매(FFPE) 조직 또는 세포를 바람직하게 사용할 수 있다. 고정 조직 또는 세포는 당업자에 공지인 일반적인 방법으로 파라핀 포리할 수 있다. 예를 들면, 고정 조직 또는 세포를 알콜로 치환해서 탈수하고, 이어서 크실렌, 벤젠 등으로 치환한 후 가열해서 액화한 파라핀을 흘려넣은 형틀에 조직 또는 세포를 넣어서 포매하여 파라핀 블록으로 한다. 파라핀 포매된 조직 또는 세포로부터 RNA 샘플을 추출할 경우에는 회전식 마이크로톰, 활주식 마이크로톰 등의 마이크로톰을 사용해서 박절한 것을 사용할 수 있다. 이 경우의 박절편의 두께는 특별히 한정되지 않지만 1∼100㎛가 바람직하고, 2∼50㎛가 보다 바람직하다. 고정 조직 또는 세포의 포매는 파라핀 대신에 주로 동결 조직 절편 제작에 사용되는 OCT(Optimal Cutting Temperature) 컴파운드를 사용해도 좋다.
또한, 파라핀 포매된 고정 조직 또는 세포는 1∼20㎛의 두께로 박절하고, 슬라이드 글래스에 부착한 것을 제작해서 일부의 조직 또는 세포만을 잘라내어 사용해도 좋다. 이 방법에 의해 유전자 발현 해석의 대상으로서 의도하는 목적의 조직 또는 세포만을 해석할 수 있기 때문에 바람직하다. 특히, 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직 또는 세포의 경우 조직 또는 세포가 고정되어 있기 때문에 상기 조작에 적합한 검체라 할 수 있다. 조직 또는 세포를 잘라내는 방법으로서는 레이저 캡쳐 현미 해부(LCM)가 사용된다. LCM에 의해 조직 또는 세포를 채취할 경우, 통상 채취되는 조직 또는 세포의 양이 적기 때문에 추출할 수 있는 RNA 양도 적어지므로 소량의 RNA로부터 해석할 수 있는 것이 바람직하다.
고정 조직 또는 세포는 특히 상기와 같이 유전자 발현 해석의 대상으로서 의도하는 목적의 조직 또는 세포만을 채취할 때는 조직 또는 세포의 형상이나 성질 등을 판별할 수 있게 하기 위해서 염색이 되어 있어도 좋다. 염색액으로서는 예를 들면 크레실 바이올렛, 톨루이딘 블루, 헤마톡실린, 뉴클레아 퍼스트 레드가 바람직하게 사용된다.
본 발명의 aRNA의 조제방법에 적용되는 고정 조직 또는 세포는 외과 수술에 의해 적출된 장기·조직, 생체 조직 진단 등을 위해 침생검으로 채취된 장기·조직, 각종 실험 동물의 장기·조직, 초대 배양 세포, 세포주 등을 예시할 수 있다.
고정 조직 또는 세포로부터 RNA를 추출하는 방법으로서는 탈파라핀을 행하기 위한 시약(예를 들면 크실렌, 리모넨), 알콜류(예를 들면 에탄올), 조직 또는 세포의 단백질을 소화하기 위한 효소(예를 들면 프로테이나아제 K), 및 추출된 RNA의 정제 수단(예를 들면 실리카계 칼럼)을 이용하는 공지의 방법을 적용할 수 있다. 또한, 시판품으로는, 예를 들면 "RecoverAll(™) Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE"(Ambion사 제품), "RNeasy FFPE Kit"(Qiagen사 제품), "ISOGEN PB Kit"(Nippon Gene Co., Ltd. 제품), "FFPE RNA Purification Kit"(Norgen사 제품), "PureLink(™) FFPE RNA Isolation Kit"(Invitrogen사 제품), "High Pure FFPE RNA Micro"(Roche Applied Science사 제품) 등의 포르말린 고정 파라핀 포매 조직용 RNA 추출 키트를 적합하게 사용할 수 있다.
본 발명의 aRNA의 조제방법에 있어서 RNA 증폭 공정에 제공되는 RNA의 양은 상기와 같이 해서 추출된 토탈 RNA로서 10∼2000ng이 바람직하고, 50∼1500ng이 보다 바람직하다.
또한, 본 발명의 aRNA의 조제방법에 있어서 증폭 공정의 실시 횟수는 1회로 하는 것이 바람직하다. 증폭 반응을 2회 이상 반복하면 1회째의 증폭 반응에 의해 증폭 산물에 약간이라도 바이어스가 생겼을 경우 2회째 이후 그 바이어스가 증대하는 경우가 있다.
본 발명의 aRNA의 조제방법에 있어서 사용하는 고정된 조직 또는 세포로부터 추출된 RNA 샘플로서는 상기와 같은 분해, 단편화 또는 수식, 가교의 발생이 비교적 적은 어느 정도의 품질을 유지하고 있는 것을 사용하는 것이 유전자 발현 해석에 의해 유용한 결과를 얻을 수 있다는 점에서 바람직하다. 예를 들면, 추출한 RNA 샘플을 바이오애널라이저 2100(애질런트·테크놀러지사)을 사용해서 전기 영동했을 때의 사이즈 분포에 있어서 1000∼4000 뉴클레오티드의 비율 A(%)와 4000 뉴클레오티드를 초과하는 사이즈의 비율 B(%)를 비교했을 때 A≥B인 RNA 샘플을 사용하는 것이 바람직하다. RNA 샘플이 이 조건을 충족할 경우 수식, 가교된 RNA의 비율이 상대적으로 적어서 유용한 해석 결과가 얻어질 가능성이 높아진다. 또한, 예를 들면 추출한 RNA 샘플을 바이오애널라이저 2100을 사용해서 전기 영동했을 때의 사이즈 분포에 있어서 1000∼4000 뉴클레오티드의 비율 A(%)가 클수록 수식, 가교나 분해, 단편화가 생긴 RNA의 비율이 적은 RNA이고, 손상되지 않은(인택트한) RNA 샘플에 보다 가까운 상태라고 할 수 있기 때문에 유용한 해석 결과가 얻어질 가능성이 높아진다. 구체적으로는 1000∼4000 뉴클레오티드의 비율 A(%)는 바람직하게는 15% 이상, 보다 바람직하게는 20% 이상, 더욱 바람직하게는 25% 이상인 RNA 샘플을 사용할 수 있다.
상기 RNA 샘플의 사이즈 분포를 측정하기 위해서는, 예를 들면 RNA 6000 나노칩 또는 RNA 6000 피코칩(모두 애질런트·테크놀러지사)을 사용해서 취급 설명서에 기재된 방법으로 RNA의 전기 영동을 행한 후 전용 소프트웨어에 구비된 스미어(Smear) 해석의 기능을 이용하여 얻어진 영동 패턴을 해석함으로써 특정한 분자량 범위에 있어서의 RNA의 존재 비율을 구할 수 있다. 또한, 이 방법에 있어서 분해가 일어나 있지 않은 RNA(인택트한 RNA)를 분석했을 경우 약 4700 뉴클레오티드라 말해지고 있는 S28 리보솜 RNA가 4000 뉴클레오티드보다 다소 작은 분자량을 피크로 한 밴드로서 나타내어지는 경우가 있다. 이것은 28S의 분자에는 이중쇄 영역이 많이 포함되어 있기 때문에 구조가 콤팩트해져 있고, 전기 영동에 있어서는 실제의 분자량보다 영동 속도가 빨라지기 때문이라고 생각된다. 이 현상에 관해서 애질런트·테크놀러지사 홈페이지의 FAQ에 있어서도 같은 기재가 보여진다. 따라서, 본 방법에 있어서는 리보솜 RNA의 28S는 전기 영동에 있어서의 1000∼4000 뉴클레오티드의 범위에 실질상 포함되는 것으로 간주한다. 또한, 18S의 분자량은 1874 뉴클레오티드이고, 전기 영동에 있어서도 1000∼4000 뉴클레오티드의 범위에 밴드가 발견되므로 상기 범위에 포함된다.
본 발명의 RNA 샘플의 유전자 발현의 해석방법은 상기 본 발명의 조제방법에 의해서 조제된 aRNA를 사용하는 것이다. 이 해석은 형광 표식된 aRNA를 발현 해석을 행하고 싶은 목적 RNA와 직접적 또는 간접적으로 선택적으로 결합할 수 있는 물질인 선택 결합성 물질의 결합 반응에 의해서 행해질 수 있다. 예를 들면, 선택 결합성 물질이 표면에 고정화된 마이크로 어레이를 사용하는 것이 바람직하다. 선택 결합성 물질로서는 핵산 또는 다른 항원성 화합물을 예시할 수 있다. 여기서 말하는 핵산에는 디옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 펩티드핵산(PNA), 상보적 DNA(cDNA), 상보적 RNA(cRNA) 등이 포함된다. 선택 결합성 물질로서는 핵산이 바람직하고, aRNA 중의 해석 목적 유전자와 상보적인 서열의 일부를 갖는 DNA 또는 RNA의 올리고머가 보다 바람직하며, RNA보다 강고하게 결합하는 DNA 올리고머가 더욱 바람직하다. DNA 올리고머의 길이는 20∼100mer가 바람직하고, 40∼80mer가 보다 바람직하다. 선택 결합성 물질은 시판의 것이여도 좋고, 합성한 것, 생체 조직 또는 세포 등의 천연원으로부터 조제한 것이여도 좋다. 또한, 마이크로 어레이를 사용할 경우 어레이 상에 고정화된 선택 결합성 물질은 모두 다른 서열을 갖는 것이 바람직하다.
RNA 샘플의 유전자 발현의 해석에 있어서는 상기 선택 결합성 물질과 해석 목적 RNA의 결합성을 높이기 위해서 aRNA는 단편화되어 있는 것이 바람직하다. 단편화된 aRNA의 사이즈는 평균값이 100∼200 뉴클레오티드인 것이 바람직하다.
aRNA와 마이크로 어레이에 고정화된 선택 결합성 물질을 결합시키는 방법으로서는, 특히 선택 결합성 물질이 핵산인 경우 하이브리다이제이션 반응에 의해서 결합시키는 것이 바람직하다. 하이브리다이제이션에서 사용되는 반응액으로는 용액의 pH를 안정시키기 위한 완충 성분(예를 들면 인산 완충액, SSC 등)이나 융해 온도(Tm)를 낮추는 작용을 가지는 포름아미드, 계면활성제(라우릴 황산염, 라우로일사르코신염 등), 비특이 결합을 막는 블록킹제(덴하르트 시약, 단편화 연어 정자 DNA, Cot 1 DNA, tRNA 등)가 포함되는 것이 바람직하다. 형광 표식된 aRNA를 포함하는 반응액을 마이크로 어레이에 어플라이해서 하이브리다이제이션 반응을 할 경우, 사용하는 마이크로 어레이에 적합한 조건으로 실시하는 것이 바람직하다. 또한, 마이크로 어레이에 고정화된 선택 결합성 물질과 결합한 aRNA의 핵산량을 검출하는 방법으로서는 마이크로 어레이용의 형광 스캐너 장치, 예를 들면 GenePix(등록상표) 4000B(Molecular Devices), ScanArray(등록상표) Lite, ScanArray(등록상표) Express(이상, Parkin Elmer), CRBIO Ⅱe(등록상표)(Hitachi Software Engineering Co., Ltd.), 3D-Gene(등록상표) Scanner(Toray Industries, Inc.) 등에 의해 핵산에 표식된 형광의 강도를 읽어냄으로써 검출·측정할 수 있다. 검출된 형광 강도로부터 각 유전자의 발현량이 정량된다.
aRNA를 마이크로 어레이로 해석할 경우에 사용되는 마이크로 어레이로서는 유리, 세라믹스, 규소 등의 무기 재료, 스테인레스, 금(도금) 등의 금속류, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 아세트산 셀룰로오스, 폴리카보네이트, 폴리스티렌, 폴리디메틸실록산, 규소 고무 등의 고분자 재료로 이루어지는 기판에 선택 결합성 물질이 결합되어서 이루어지는 마이크로 어레이를 사용할 수 있다. 또한, 시판의 마이크로 어레이도 이용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 마이크로 어레이의 바람직한 예로서는 기판 표면에 요철부를 구비하고 있어도 좋고, 또한 볼록부의 상면에 커버가 구비되어 있어도 좋다. 이때, 커버에는 액체를 주입하기 위해서 공극에 연통하는 1개 이상의 관통 구멍을 구비하는 것이 바람직하다. 마이크로 어레이와 커버 사이의 공극에 미립자가 봉입된 마이크로 어레이는 공극에 검체 용액을 어플라이하여 마이크로 어레이에 진동, 진탕, 회전, 자력, 중력 등을 가해서 봉입한 미립자를 검체 용액 내에서 이동시킴으로써 검체 용액을 교반할 수 있고, 그 결과 하이브리다이제이션 반응이 촉진되기 때문에 특히 바람직하다. 여기서, 미립자의 재질은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 유리, 세라믹스(예를 들면 이트리아 안정화 지르코니아), 금속류(예를 들면 스테인레스), 폴리머(예를 들면 나일론, 폴리스티렌), 자성체 등이 적합하게 사용된다.
증폭 공정의 실시 횟수는 1회로 하는 것이 바람직하다. 증폭 반응을 2회 이상 반복하면 1회째의 증폭 반응에 의해 증폭 산물에 약간이라도 바이어스가 생겼을 경우 2회째 이후 그 바이어스가 증대하는 경우가 있다.
aRNA를 마이크로 어레이에 의해 해석할 경우 aRNA의 증폭 배율은 2∼20배인 것이 바람직하다. 증폭 배율이 2배 미만인 증폭 산물밖에 얻을 수 없는 RNA는 RNA의 분해, 단편화가 심하여 RNA 쇄길이가 매우 짧아져 있기 때문에, 또는 RNA 분자 사이 또는 RNA와 단백질 사이에서 생기는 가교나, 고정할 때에 포름알데히드 등의 고정액 유래 물질이 RNA에 결합함으로써 생기는 부가·수식물의 영향으로 증폭 반응이 저해되기 때문에 증폭하지 않거나 또는 증폭 반응이 불충분하게 될 가능성이 있고, 그 결과로서 정확한 마이크로 어레이 해석을 할 수 없는 것이 있다. 또한, 증폭 산물이 20배를 초과하는 증폭 배율인 경우 분해 등의 정도의 차에 의한 영향으로서 증폭 바이어스가 현저하게 나타날 가능성이 있다.
증폭 배율을 2∼20배로 하는 방법으로서는 RNA의 증폭 공정에 사용하는 효소나 프라이머, 기질 등의 농도를 증감시킴으로써 시약의 조성을 최적화하는 방법이 예시될 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다. 또한, 반응 시간을 조정하는 방법도 있다. 예를 들면, 비교적 증폭 배율이 큰 시약을 사용해서 고정 조직 또는 세포로부터 추출한 RNA 샘플을 증폭할 경우 반응 시간을 소정의 시간보다 짧게 하면 좋다.
본 발명의 증폭 공정에 의해서 RNA 샘플을 증폭한 결과의 증폭 배율은 증폭 전후에 있어서의 RNA 중량비로서 구할 수 있다. 구체적으로는 광로 길이 10mm의 셀을 사용해서 분광 광도계로 측정했을 때의 파장 260nm에 있어서의 형광 강도값 및 용액량으로부터 하기 식 A로부터 증폭 전후의 용액 중의 RNA 중량을 구하고, 하기 식 B로부터 증폭 배율을 산출하면 좋다.
식 A: RNA 중량=(260nm의 형광 강도값)×40(ng/㎕)×용액량(㎕)
식 B: 증폭 배율=(증폭 후의 RNA 중량)/(증폭 전의 RNA 중량).
본 발명의 aRNA의 조제방법에 의해서, 고정된 조직 또는 세포로부터 추출된 RNA 샘플로부터 분해가 없고 손상되지 않은(인택트한) RNA에 가까운 유전자 발현 해석의 결과가 얻어지는 aRNA를 조제할 수 있었는지의 여부를 판단하는 기준의 하나로서 aRNA의 사이즈를 확인하는 방법을 예시할 수 있다. RNA 샘플이 심하게 분해되어 있거나, RNA에 수식, 가교가 생겨 있거나 하면 역전사 반응으로 얻어지는 cDNA의 쇄 길이가 짧아지고, 그 결과 얻어지는 aRNA의 쇄 길이도 짧아진다. 이러한 RNA 샘플은 증폭 배율이 상당히 낮아지는 경향이 있고, 또한 유전자 발현 해석을 행했을 경우 분해가 없고 손상되지 않은(인택트한) RNA와 비교해서 유효 스폿수가 적으며, 또한 양자 간의 상관 관계가 나빠지는 경향이 있다. aRNA의 사이즈는 전기 영동, 액체 크로마토그래피 등을 사용함으로써 확인할 수 있다. 예를 들면, "Agilent 2100 바이오애널라이저"(애질런트·테크놀러지사)와 같은 칩 전기 영동 시스템을 사용해서 측정하는 것이 바람직하다. 이 방법에 의해 증폭 산물인 aRNA의 사이즈 분포를 조사해서 분포의 피크에 맞는 사이즈(뉴클레오티드의 길이)를 확인하고, 그것이 200 뉴클레오티드([nt]) 이상이면 분해가 없고 손상되지 않은(인택트한) RNA의 경우와 상관성이 높은 유전자 발현 해석을 할 수 있는 가능성이 높다고 할 수 있다. 반대로, 분포의 피크가 200[nt]을 하회할 경우는 원래의 RNA 샘플의 품질이 나빴던 것이 시사되어서 유전자 발현 해석에 제공해도 타당성이 높은 결과가 얻어지지 않을 가능성이 높다.
(실시예)
본 발명을 이하의 실시예에 의해서 더욱 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
(참고예 1) AA-UTP, UTP의 정량
5-(3-아미노알릴)우리딘5'-3인산(AA-UTP) 및 UTP의 함량은 이하와 같이 LC/MS 분석에 의해 정량했다.
AA-UTP(Ambion사), UTP(Roche사)의 표준품을 사용해서 각각 농도 희석 계열을 작성했다. HPLC 장치로서 프로미넌스 HE-UV(Shimadzu Corporation), 질량 분석계로서 LCMS-IT-TOF(Shimadzu Corporation)를 각각 사용하고, 칼럼은 CapcelPak C18 AQ(Shiseido Co., Ltd.)를 사용해서 LC/MS/MS 측정을 행했다. LC에 있어서 검출되는 UTP, AA-UTP로부터 유래되는 피크의 유지 시간의 질량 스펙트럼에 있어서 UTP 유래의 이온 이론 m/z값=482.9607, 및 AA-UTP 유래의 이온 이론 m/z값=538.0029에 가까운 값의 피크 면적값으로부터 검량선을 작성했다. 그리고, 측정 대상의 시료를 사용해서 같은 질량 크로마토그램을 그려서 피크의 면적값을 구함으로써 검량선으로부터 시료 중의 UTP 농도, AA-UTP 농도를 정량했다.
(참고예 2) FFPE 샘플로부터 RNA의 추출 및 품질의 확인
(1) RNA 샘플(A)∼(C)
생쥐(7주령, 수컷, Slc: ICR)의 간장 및 소뇌 조직의 고정 파라핀 포매(FFPE) 블록의 샘플로서 이하의 FFPE(A)∼(C)를 준비했다.
FFPE(A): 10% 중성 완충 포르말린 용액으로 2일간 고정 후 파라핀 포매하여 실온에서 약 6개월간 보관시킨 것
FFPE(B): 10% 중성 완충 포르말린 용액으로 2일간 고정 후 파라핀 포매하여 실온에서 약 1년간 보관시킨 것
FFPE(C): 4% 파라포름알데히드 용액으로 1일간 고정 후 파라핀 포매하여 실온에서 약 6개월간 보관시킨 것.
상기 FFPE(A)∼(C)의 파라핀 블록(간장, 소뇌)으로부터 마이크로톰을 사용해서 10㎛ 두께의 박절편을 간장은 2매, 소뇌는 10매 채취하여 각각 1.5㎖의 튜브에 넣었다. 크실렌 1㎖를 첨가해서 교반하고, 파라핀을 용해시켰다. 16,000xg으로 5분간 원심한 후 피펫으로 크실렌을 제거했다. 이어서, 에탄올 1㎖를 첨가해서 교반하고, 16,000xg으로 2분간 원심한 후 피펫으로 에탄올을 충분하게 제거하는 조작을 2회 반복했다. 튜브의 뚜껑을 연 상태에서 약 10분간 풍건시켜 각 조직에 포함되는 에탄올을 제거했다. 프로테이나아제 K 용액(500㎍/㎖) 100㎕를 첨가해서 각 조직을 현탁시키고, 37℃에서 16시간 정치했다. 16,000xg으로 2분간 원심해서 잔사를 제거한 후 실리카 칼럼을 사용해서 RNA를 정제했다.
상기와 같이 해서 FFPE(A), FFPE(B), FFPE(C)로부터 각각 RNA(A), RNA(B), RNA(C)를 얻었다.
RNA(A)∼(C)의 순도(파장 280nm에서의 강도에 대한 파장 260nm에서의 강도비)를 분광 광도계(Nano Drop사)에 의해 측정한 결과 표 1에 각각 나타내는 바와 같이 이들 RNA 샘플의 순도가 높은 것을 알 수 있었다. 또한, Agilent 2100 바이오애널라이저 RNA 6000 나노칩(애질런트·테크놀러지사)을 사용해서 전기 영동을 행한 결과 도 1의 (1)∼(3)에 나타내는 바와 같이 샘플에 의해서 RNA의 분해 거동은 차이가 났다.
상기에 의해 추출된 RNA(A)∼(C)의 품질을 다음과 같이 해서 평가했다. Agilent 2100 바이오애널라이저의 전용 소프트웨어에 구비된 스미어 해석의 기능을 사용해서 각 RNA 샘플의 전기 영동의 패턴에 있어서의 1000∼4000 뉴클레오티드의 비율 A(%) 및 4000 뉴클레오티드를 초과하는 비율 B(%)를 각각 구하고, 그 Ａ와 B의 비(B/A)를 산출하여 이것들을 품질의 지표로 했다. 여기서, A가 클수록 품질이 높다고 할 수 있고, 또한 B/A가 1이하이면 RNA의 품질은 비교적 높다고 할 수 있다. 그 결과를 표 1에 나타낸다. RNA(A)∼(C)의 품질은 양호했다.
Figure pct00001
(2) 대조용 RNA 샘플(D)
대조로서 생쥐(7주령, 수컷, Slc: ICR)의 간장, 소뇌 각각의 신선 동결 조직으로부터 대조용 RNA 샘플로서 RNA(D)를 추출했다. 상기 (1)과 마찬가지로 해서 RNA 샘플의 순도 및 품질을 평가한 결과를 표 2에 나타낸다. 또한, 상기 (1)과 마찬가지로 해서 전기 영동을 행한 결과 도 1의 (4)에 나타내는 바와 같이 간장, 소뇌와 함께 리보솜 RNA의 18S, 28S의 밴드를 명확하게 확인할 수 있는 매우 품질이 좋은 것이었다.
Figure pct00002
(3) RNA 샘플(A')∼(C')
FFPE(A)∼(C)의 각 파라핀 블록으로부터 10㎛ 두께의 절편을 제작하여 레이저 현미 해부 전용의 슬라이드 글래스에 부착했다. 탈파라핀해서 상법에 의해 크레실 바이올렛으로 염색한 후 레이저 현미 해부(LMD) 장치(Leica사 제품)로 조직의 일부를 채취했다. 이때, 채취 면적은 약 10,000,000㎛2이였다. 프로테이나아제 K 용액의 첨가량을 25㎕로 한 것 이외에는 상기 (1)과 마찬가지로 해서 RNA를 추출하고, 각각 RNA 샘플로서 RNA(A'), RNA(B'), RNA(C')를 얻었다. 상기 (1)과 마찬가지로 해서 이들 RNA 샘플의 순도 및 품질의 측정을 행했다. 순도 및 품질은 표 3에 나타내는 바와 같이 대응하는 각 RNA(A)∼(C)와 거의 동등했다. 또한, RNA(A')∼(C')에 대해서 Agilent 2100 바이오애널라이저 RNA 6000 피코칩(애질런트·테크놀러지사)을 사용해서 전기 영동을 행한 결과(도시하지 않음) 각각 RNA(A)∼(C)의 경우[도 1의 (1)∼(3)]와 거의 같은 결과였다.
Figure pct00003
(실시예 1)
(1) aRNA의 조제(추출한 RNA의 증폭 공정)
참고예 2에서 추출한 생쥐 간장, 소뇌의 RNA(A) 및 RNA(D) 각 1㎍을 PCR용 튜브에 넣고, T7 프로모터 영역을 포함하는 프라이머를 첨가해서 70℃에서 1시간 반응시켜 어닐링했다. 역전사 효소(SuperScript Ⅲ(Invitrogen사)), dNTP(dATP, dGTP, dTTP, dCTP), RNase 인히비터, DTT를 첨가해서 충분하게 혼합하고, 42℃에서 90분 반응시켜서 퍼스트 스트랜드 cDNA를 합성했다. 반응 후 얼음 상에서 급냉함으로써 반응을 정지시켰다. RNase H를 첨가해서 혼합하여 37℃에서 30분 인큐베이트하고, 또한 95℃에서 5분 인큐베이트했다. 이어서, DNA 합성 효소, dNTP를 첨가해서 퍼스트 스트랜드 cDNA에 상보적인 세컨드 스트랜드 cDNA 합성을 행했다. 실리카겔 베이스의 칼럼으로 합성한 cDNA를 정제한 후 뉴클레오티드 시약(ATP, GTP, CTP, UTP 및 AA-UTP의 혼합물), RNase 인히비터, DTT, 및 T7 프로모터 서열을 인식하는 RNA 폴리메라아제를 첨가해서 부드럽게 혼화한 후 42℃에서 10시간 반응시킴으로써 T7 RNA 폴리메라아제를 사용한 인비트로 전사 반응을 행하고, 아미노알릴기를 도입한 aRNA의 증폭 반응을 행했다. 참고예 1의 방법에 의해 본 인비트로 전사 반응에 사용한 뉴클레오티드 시약에 포함되는 AA-UTP의 비율「AA-UTP의 몰량/(UTP의 몰량+AA-UTP의 몰량)」을 정량한 결과 16%였다. 증폭한 aRNA를 실리카겔 베이스의 칼럼을 사용해서 정제하여 분광 광도계(Nano Drop사)에 의해 수량(收量)을 구한 결과 간장 FFPE: 3.5㎍, 소뇌 FFPE: 4.8㎍, 간장 동결 조직: 10.9㎍, 소뇌 동결 조직: 12.7㎍이었다[각 증폭 배율은 3.5, 4.8, 10.9, 12.7(배)](표 4). Agilent 2100 바이오애널라이저(애질런트·테크놀러지사)를 사용해서 aRNA의 사이즈를 전기 영동에 의해 확인한 결과 FFPE(A) 유래의 RNA(A)로부터 얻어진 aRNA는 도 2의 (1)과 같이 간장, 소뇌 모두 200∼300[nt]에, 동결 조직 유래의 RNA(D)로부터 얻어진 aRNA는 도 2의 (2)와 같이 간장, 소뇌 모두 약 500[nt]에 피크가 보여지는 분포를 각각 나타냈다.
(2) aRNA의 형광 표식, 단편화
원심 농축기[MV-100(Tomy Seiko Co., Ltd.)]를 사용해서 각 증폭 aRNA 용액을 농축하여 약 1㎕로 했다. 거기에 "3D-Gene(등록상표) 혼성화 완충액"(Toray Industries, Inc.)의 키트에 첨부된 탄산수소나트륨 완충액을 2.5㎕ 첨가해서 피펫팅에 의해 교반하고, 또한 DMSO에 용해시킨 Cy5-NHS(GE health care사)를 2.5㎕ 첨가해서 피펫팅에 의해 교반하고, 40℃에서 1시간 인큐베이트함으로써 커플링 반응시켰다. 겔 여과 스핀 칼럼(Bio-Rad사)을 사용해서 미반응의 Cy5를 제거해서 각 반응 용액을 정제한 후 뉴클레아제프리워터에서 32㎕로 메스업했다. 거기에 3D-Gene 혼성화 완충액(Toray Industries, Inc.)의 키트에 첨부된 5×단편화 완충액을 각각 8㎕ 첨가하고, 가볍게 피펫팅해서 교반하여 94℃에서 15분간 처리했다. 각 샘플을 분쇄한 얼음으로 3분간 급냉하여 마이크로콘 YM-10(Millipore사)으로 정제했다.
(3) 마이크로 어레이 해석
표식, 정제 후의 각 aRNA에 대해서 이하의 조작에 의해 마이크로 어레이 해석을 행했다. 각 1000ng 분의 RNA를 포함하는 용액을 뉴클레아제프리워터에 의해 16㎕로 조제하고, "3D-Gene"(등록상표) 혼성화 완충액(Toray Industries, Inc.)의 혼성화 완충액 A를 2㎕ 첨가해서 95℃에서 5분간 열처리했다. 분쇄한 얼음으로 3분간 급냉시킨 후 혼성화 완충액 B를 232㎕ 첨가해서 온건하게 피펫팅으로 교반해서 250㎕의 검체 용액을 조제했다. 검체 용액을 감압 하에서 탈기한 후 "3D-Gene" 생쥐 전체 유전자형 DNA칩(Toray Industries, Inc.)에 210㎕ 어플라이했다. 커버의 구멍 4개소를 밀봉해서 막아 바이오 셰이커(Tokyo Rikakikai Co., Ltd.; MMS-210)의 천판에 고정한 하이브리다이제이션 챔버(Takara Bio Inc.; TX711)에 세트했다. 챔버 고내의 온도를 37℃로 하고, 250rpm으로 선회 회전시켜 교반하면서 16시간 하이브리다이제이션 반응을 행했다.
(4) 형광 시그널값의 측정
하이브리다이제이션 반응 후 분석용 칩의 커버 부재를 이탈시켜서 기판을 세정, 건조했다. DNA 칩용의 스캐너(Axon Instruments사 제품 GenePix 4000B)에 상기 기판을 세트하고, 레이저 출력 33%, 포토 멀티플라이어의 전압 설정을 500으로 한 상태에서 하이브리다이제이션 반응한 형광 표식 RNA의 시그널값(형광 강도), 백그라운드 노이즈를 측정했다. 전체 스폿 중 1750개를 백그라운드 형광값 측정용의 네가티브 컨트롤 스폿으로 하고, 각각의 시그널값으로부터 백그라운드 시그널값을 빼서 각 스폿의 참시그널값을 산출했다. 여기서, 참시그널값이 양인 경우를 「유효 스폿」이라 했다. 유효 스폿수는 표 4와 같이 간장 FFPE: 15571, 소뇌 FFPE: 14897, FFPE의 공통 유효 스폿: 12597, 간장 동결 조직: 17937, 소뇌 동결 조직: 19582, 동결 조직의 공통 유효 스폿: 16671이었다. FFPE 샘플(A), 동결 조직 각각에 대해서 각 유전자의 소뇌, 간장의 시그널비(소뇌/간장)를 구하고, 공통 유효 유전자 11985종에 대해서 동결 조직에 있어서의 시그널비를 세로축에, FFPE 샘플(A)에 있어서의 시그널비를 가로축에 플롯해서 작성한 산포도를 도 3에 나타냈다.
FFPE(A) 유래의 RNA(A)로부터 얻어진 aRNA와 대조인 동결 조직 유래의 RNA(D)로부터 얻어진 aRNA 사이의 상기 공통 유효 유전자에 있어서의 시그널비의 상관계수 R은 0.905였다(표 4).
여기서, 상관계수 R은 2개의 데이터군의 상호 관계의 강도를 정량적으로 나타내는 지표로서 -1에서 1 사이를 취하고, 양의 값이면 양의 상관, 음의 값이면 음의 상관, 제로일 때는 무상관이라 한다. 일반적으로, 절대값이 0.5이상이면 상관이 있고, 0.5미만이면 상관이 없다고 판단할 수 있으며, 2개의 데이터군의 상관의 정도가 강할수록 그 절대값은 1에 가깝다. 또한, 상관계수를 "마이크로소프트 오피스 엑셀"(Microsoft사)로 구할 경우는 「correl」이라 하는 함수를 사용하면 좋다. 본 발명에 있어서는 상기 고정된 조직 또는 세포로부터 추출된 RNA 샘플로부터 조제된 aRNA와 대조인 동결 조직 유래의 RNA 샘플로부터 얻어진 aRNA의 양자 사이에서 공통으로 발현이 확인된 유전자에 대해서 상기 시그널비(소뇌/간장)의 상관계수 R이 0.7이상일 때에 상관이 높다고 판단했다. 상관계수 R은 0.8이상인 것이 바람직하고, 0.9이상인 것이 더욱 바람직하다.
본 실시예 1에 있어서는 양자의 상관이 매우 높았기 때문에 본 발명의 방법에 의해 고정된 FFPE 샘플에 있어서도 증폭 바이어스의 영향이 저감된 aRNA가 얻어지고, 그 결과 정량성이 높은 유전자 발현 해석이 가능하다는 것을 알 수 있었다.
(실시예 2)
뉴클레오티드 시약에 포함되는 AA-UTP의 비율「AA-UTP의 몰량/(UTP의 몰량+AA-UTP의 몰량)」을 23몰%로 한 것 이외에는 실시예 1과 같은 방법으로 FFPE(A)(간장, 소뇌)로부터 추출된 RNA(A), 동결 조직(간장, 소뇌)으로부터 추출된 RNA(D) 각 1㎍으로부터 각각 aRNA를 조제했다. 얻어진 aRNA의 수량은 간장 FFPE: 2.1㎍, 소뇌 FFPE: 2.9㎍, 간장 동결 조직: 8.5㎍, 소뇌 동결 조직: 10.1㎍이었다[각 증폭 배율은 2.1, 2.9, 8.5, 10.1(배)](표 4). aRNA의 사이즈를 실시예 1과 마찬가지로 해서 확인한 바 FFPE의 경우는 간장, 소뇌 모두 200∼300[nt]의 사이에, 동결 조직의 경우는 간장, 소뇌 모두 약 500[nt]에 각각 피크가 보여졌다(도시하지 않음).
실시예 1과 같은 조건에서 마이크로 어레이 해석을 실시하고, 각 유전자의 시그널값을 산출했다. 표 4에 나타내는 바와 같이 유효 스폿수는 간장 FFPE: 15910, 소뇌 FFPE: 16229, FFPE의 공통 유효 스폿: 13391, 간장 동결 조직: 18601, 소뇌 동결 조직: 20186, 동결 조직의 공통 유효 스폿: 17109였다. RNA(A)로부터 얻어진 aRNA와 동결 조직 유래의 RNA(D)로부터 얻어진 aRNA 사이의 공통 유효 유전자에 있어서의 시그널비(소뇌/간장)의 상관계수 R은 0.863이고, 양자의 상관이 매우 높았다(표 4).
(실시예 3)
RNA 샘플로서 RNA(A) 대신에 RNA(A')를 사용하고, 뉴클레오티드 시약에 포함되는 AA-UTP의 비율「AA-UTP의 몰량/(UTP의 몰량+AA-UTP의 몰량)」을 10몰%로 한 것 이외에는 실시예 1과 같은 방법으로 FFPE(A)(간장, 소뇌)로부터 추출한 RNA(A'), 동결 조직(간장, 소뇌)으로부터 추출된 RNA(D) 각 250ng으로부터 각각 aRNA를 조제했다. 얻어진 aRNA의 수량은 간장 FFPE: 1.9㎍, 소뇌 FFPE: 2.4㎍, 간장 동결 조직: 3.5㎍, 소뇌 동결 조직: 4.3㎍이었다[각 증폭 배율은 7.6, 9.5, 14.1, 17.3(배)](표 4). aRNA의 사이즈를 실시예 1과 마찬가지로 해서 확인한 결과 FFPE의 경우는 간장, 소뇌 모두 200∼300[nt]의 사이에, 동결 조직의 경우는 간장, 소뇌 모두 약 500[nt]에 각각 피크가 보여졌다(도시하지 않음).
실시예 1과 같은 조건에서 마이크로 어레이 해석을 실시하고, 각 유전자의 시그널값을 산출했다. 표 4에 나타내는 바와 같이 유효 스폿수는 간장 FFPE: 12385, 소뇌 FFPE: 13960, FFPE의 공통 유효 스폿: 11401, 간장 동결 조직: 16832, 소뇌 동결 조직: 17968, 동결 조직의 공통 유효 스폿: 15598이었다. RNA(A')로부터 얻어진 aRNA와 동결 조직 유래의 RNA(D)로부터 얻어진 aRNA 사이의 공통 유효 유전자에 있어서의 시그널비(소뇌/간장)의 상관계수 R은 0.809이고, 양자의 상관이 높았다(표 4).
Figure pct00004
(실시예 4)
RNA 샘플로서 RNA(A) 대신에 FFPE(B)(간장, 소뇌)로부터 추출된 RNA(B)를 사용하고, 실시예 1과 마찬가지로 해서 뉴클레오티드 시약에 포함되는 AA-UTP의 비율「AA-UTP의 몰량/(UTP의 몰량+AA-UTP의 몰량)」을 16몰%로 해서 RNA(B), RNA(D) 각 1㎍으로부터 각각 aRNA를 조제했다. 얻을 수 있는 aRNA의 수량은 간장 FFPE: 2.9㎍, 소뇌 FFPE: 3.9㎍, 간장 동결 조직: 10.5㎍, 소뇌 동결 조직: 12.6㎍이었다[각 증폭 배율은 2.9, 3.9, 10.5, 12.6(배)](표 5). aRNA의 사이즈를 실시예 1과 마찬가지로 해서 확인한 결과 FFPE의 경우는 간장, 소뇌 모두 200∼300[nt]의 사이에, 동결 조직의 경우는 간장, 소뇌 모두 500[nt] 부근에 각각 피크가 보여졌다.
실시예 1과 같은 조건에서 마이크로 어레이 해석을 실시하고, 각 유전자의 시그널값을 산출했다. 표 5에 나타내는 바와 같이 유효 스폿수는 간장 FFPE: 15910, 소뇌 FFPE: 16229, FFPE의 공통 유효 스폿: 13391, 간장 동결 조직: 18601, 소뇌 동결 조직: 20186, 동결 조직의 공통 유효 스폿: 17109였다. RNA(B)로부터 얻어진 aRNA와 동결 조직 유래의 RNA(D)로부터 얻어진 aRNA 사이의 공통 유효 유전자에 있어서의 시그널비(소뇌/간장)의 상관계수 R은 0.863이고, 양자의 상관이 매우 높았다(표 5).
(실시예 5)
뉴클레오티드 시약에 포함되는 AA-UTP의 비율「AA-UTP의 몰량/(UTP의 몰량+AA-UTP의 몰량)」을 23몰%로 한 것 이외에는 실시예 4과 마찬가지로 해서 FFPE(B)(간장, 소뇌)로부터 추출된 RNA(B), 동결 조직(간장, 소뇌)으로부터 추출된 RNA(D) 각 1㎍으로부터 각각 aRNA를 조제했다. 얻어진 aRNA의 수량은 간장 FFPE: 2.0㎍, 소뇌 FFPE: 2.7㎍, 간장 동결 조직: 9.6㎍, 소뇌 동결 조직: 10.5㎍이었다[각 증폭 배율은 2.0, 2.7, 9.6, 10.5(배)](표 5). aRNA의 사이즈를 실시예 1과 마찬가지로 해서 확인한 결과 FFPE의 경우는 간장, 소뇌 모두 200∼300[nt]의 사이에, 동결 조직의 경우는 간장, 소뇌 모두 500[nt] 부근에 각각 피크가 보여졌다(도시하지 않음).
실시예 1과 같은 조건에서 마이크로 어레이 해석을 실시하고, 각 유전자의 시그널값을 산출했다. 표 5에 나타내는 바와 같이 유효 스폿수는 간장 FFPE: 14287, 소뇌 FFPE: 15816, FFPE의 공통 유효 스폿: 12814, 간장 동결 조직: 18821, 소뇌 동결 조직: 20105, 동결 조직의 공통 유효 스폿: 17501이었다. RNA(B)로부터 얻어진 aRNA와 동결 조직 유래의 RNA(D)로부터 얻어진 aRNA의 사이의 공통 유효 유전자에 있어서의 시그널비(소뇌/간장)의 상관계수 R은 0.851이고, 양자의 상관이 매우 높았다(표 5).
(실시예 6)
RNA 샘플로서 RNA(B) 대신에 RNA(B')를 사용하고, 뉴클레오티드 시약에 포함되는 AA-UTP의 비율「AA-UTP의 몰량/(UTP의 몰량+AA-UTP의 몰량)」을 10몰%로 한 것 이외에는 실시예 4와 마찬가지로 해서 FFPE(B)(간장, 소뇌)로부터 추출한 RNA(B'), 동결 조직(간장, 소뇌)으로부터 추출된 RNA(D) 각 250ng으로부터 각각 aRNA를 조제했다. 얻어진 aRNA의 수량은 간장 FFPE: 1.6㎍, 소뇌 FFPE: 2.0㎍, 간장 동결 조직: 3.8㎍, 소뇌 동결 조직: 4.2㎍이었다[각 증폭 배율은 6.3, 8.1, 15, 16.9(배)](표 5). aRNA의 사이즈를 실시예 1과 마찬가지로 해서 확인한 결과 FFPE의 경우는 간장, 소뇌 모두 200∼300[nt]의 사이에, 동결 조직의 경우는 간장, 소뇌 모두 500[nt] 부근에 각각 피크가 보여졌다(도시하지 않음).
실시예 1과 같은 조건에서 마이크로 어레이 해석을 실시하고, 각 유전자의 시그널값을 산출했다. 표 5에 나타내는 바와 같이 유효 스폿수는 간장 FFPE: 11984, 소뇌 FFPE: 13107, FFPE의 공통 유효 스폿: 10835, 간장 동결 조직: 16914, 소뇌 동결 조직: 17819, 동결 조직의 공통 유효 스폿: 15681이었다. RNA(B')로부터 얻어진 aRNA와 동결 조직 유래의 RNA(D)로부터 얻어진 aRNA 사이의 공통 유효 유전자에 있어서의 시그널비(소뇌/간장)의 상관계수 R은 0.803이고, 양자의 상관이 높았다(표 5).
Figure pct00005
(실시예 7)
RNA 샘플로서 RNA(A) 대신에 FFPE(C)(간장, 소뇌)로부터 추출된 RNA(C)를 사용하고, 실시예 1과 마찬가지로 해서 뉴클레오티드 시약에 포함되는 AA-UTP의 비율「AA-UTP의 몰량/(UTP의 몰량+AA-UTP의 몰량)」을 16몰%로 해서 RNA(C), RNA(D) 각 1㎍으로부터 각각 aRNA를 조제했다. 얻어진 aRNA의 수량은 간장 FFPE: 3.9㎍, 소뇌 FFPE: 5.1㎍, 간장 동결 조직: 10.3㎍, 소뇌 동결 조직: 12.1㎍이었다[각 증폭 배율은 3.9, 5.1, 10.3, 12.1(배)](표 6). aRNA의 사이즈를 실시예 1과 마찬가지로 해서 확인한 결과 FFPE의 경우는 간장, 소뇌 모두 200∼300[nt]의 사이에, 동결 조직의 경우는 간장, 소뇌 모두 500[nt] 부근에 각각 피크가 보여졌다(도시하지 않음).
실시예 1과 같은 조건에서 마이크로 어레이 해석을 실시하고, 각 유전자의 시그널값을 산출했다. 표 6에 나타내는 바와 같이 유효 스폿수는 간장 FFPE: 15328, 소뇌 FFPE: 16540, FFPE의 공통 유효 스폿: 14309, 간장 동결 조직: 17899, 소뇌 동결 조직: 19316, 동결 조직의 공통 유효 스폿: 16850이었다. RNA(C)로부터 얻어진 aRNA와 동결 조직 유래의 RNA(D)로부터 얻어진 aRNA 사이의 공통 유효 유전자에 있어서의 시그널비(소뇌/간장)의 상관계수 R은 0.925이고, 양자의 상관이 매우 높았다(표 6).
(실시예 8)
뉴클레오티드 시약에 포함되는 AA-UTP의 비율「AA-UTP의 몰량/(UTP의 몰량+AA-UTP의 몰량)」을 23몰%로 한 것 이외에는 실시예 7과 마찬가지로 해서 FFPE(C)(간장, 소뇌)로부터 추출된 RNA(C), 동결 조직(간장, 소뇌)로부터 추출된 RNA(D) 각 1㎍으로부터 각각 aRNA를 조제했다. 얻어진 aRNA의 수량은 간장 FFPE: 2.9㎍, 소뇌 FFPE: 3.8㎍, 간장 동결 조직: 10.3㎍, 소뇌 동결 조직: 12.1㎍이었다[각 증폭 배율은 2.9, 3.8, 10.3, 12.1(배)](표 6). aRNA의 사이즈를 실시예 1과 마찬가지로 해서 확인한 결과 FFPE의 경우는 간장, 소뇌 모두 200∼300[nt]의 사이에, 동결 조직의 경우는 간장, 소뇌 모두 500[nt] 부근에 각각 피크가 보여졌다(도시하지 않음).
실시예 1과 같은 조건에서 마이크로 어레이 해석을 실시하고, 각 유전자의 시그널값을 산출했다. 표 6에 나타내는 바와 같이 유효 스폿수는 간장 FFPE: 15944, 소뇌 FFPE: 17027, FFPE의 공통 유효 스폿: 14895, 간장 동결 조직: 18782, 소뇌 동결 조직: 20799, 동결 조직의 공통 유효 스폿: 17244였다. RNA(C)로부터 얻어진 aRNA와 동결 조직 유래의 RNA(D)로부터 얻어진 aRNA 사이의 공통 유효 유전자에 있어서의 시그널비(소뇌/간장)의 상관계수 R은 0.893이고, 양자의 상관이 매우 높았다(표 6).
(실시예 9)
RNA 샘플로서 RNA(C) 대신에 RNA(C')를 사용하고, 뉴클레오티드 시약에 포함되는 AA-UTP의 비율「AA-UTP의 몰량/(UTP의 몰량+AA-UTP의 몰량)」을 10몰%로 한 것 이외에는 실시예 7과 마찬가지로 해서 FFPE(C)(간장, 소뇌)로부터 추출한 RNA(C'), 동결 조직(간장, 소뇌)으로부터 추출된 RNA(D) 각 250ng으로부터 각각 aRNA를 조제했다. 얻어진 aRNA의 수량은 간장 FFPE: 2.2㎍, 소뇌 FFPE: 2.5㎍, 간장 동결 조직: 3.7㎍, 소뇌 동결 조직: 4.3㎍이었다[각 증폭 배율은 8.5, 10.1, 14.8, 17(배)](표 6). aRNA의 사이즈를 실시예 1과 마찬가지로 해서 확인한 결과 FFPE의 경우는 간장, 소뇌 모두 200∼300[nt]의 사이에, 동결 조직의 경우는 간장, 소뇌 모두 500[nt] 부근에 각각 피크가 보여졌다(도시하지 않음).
실시예 1과 같은 조건에서 마이크로 어레이 해석을 실시하고, 각 유전자의 시그널값을 산출했다. 표 6에 나타내는 바와 같이 유효 스폿수는 간장 FFPE: 12543, 소뇌 FFPE: 14139, FFPE의 공통 유효 스폿: 11734, 간장 동결 조직: 16640, 소뇌 동결 조직: 17693, 동결 조직의 공통 유효 스폿: 15342였다. RNA(C')로부터 얻어진 aRNA와 동결 조직 유래의 RNA(D)로부터 얻어진 aRNA 사이의 공통 유효 유전자에 있어서의 시그널비(소뇌/간장)의 상관계수 R은 0.861이고, 양자의 상관이 높았다(표 6).
Figure pct00006
(비교예 1)
뉴클레오티드 시약에 포함되는 AA-UTP의 비율「AA-UTP의 몰량/(UTP의 몰량+AA-UTP의 몰량)」을 34몰%로 하고, RNA의 증폭 공정을 2회 행한 것 이외에는 실시예 1과 같은 방법으로 FFPE(A)(간장, 소뇌)로부터 추출된 RNA(A), 동결 조직(간장, 소뇌)으로부터 추출된 RNA(D) 각 1㎍으로부터 다음과 같이 해서 각각 aRNA를 조제했다.
생쥐 소뇌, 간장의 RNA(A) 각 10ng으로부터 역전사 효소[SuperScript Ⅲ(Invitrogen사)]을 사용해서 퍼스트 스트랜드 cDNA를 합성하고, 이어서 DNA 합성 효소를 첨가해서 퍼스트 스트랜드 DNA에 상보적인 세컨드 스트랜드 cDNA 합성을 행했다. 실리카겔 베이스의 칼럼을 사용해서 합성한 cDNA를 정제한 후 T7 RNA 폴리메라아제를 사용한 인비트로 전사 반응을 42℃, 8시간 행하고, aRNA의 증폭 반응을 행했다. 여기서 얻어진 증폭 산물을 사용해서 마찬가지로 퍼스트 스트랜드 cDNA 합성, 세컨드 스트랜드 cDNA 합성을 행하고, AA-UTP를 포함하는 시약을 사용해서 인비트로 전사 반응을 42℃, 10시간 행하며, 아미노알릴기를 도입한 aRNA의 증폭 반응을 행했다. 본 인비트로 전사 반응에 사용한 뉴클레오티드 시약에 포함되는 UTP+AA-UTP에 대한 AA-UTP의 비율「AA-UTP의 몰량/(UTP의 몰량+AA-UTP의 몰량)」은 34%였다. 증폭한 aRNA를 실리카겔 베이스의 칼럼을 사용해서 정제하고, 분광 광도계(Nano Drop사)에 의해 수량을 구한 결과 간장 FFPE: 37.1㎍, 소뇌 FFPE: 36.6㎍, 간장 동결 조직: 53.5㎍, 소뇌 동결 조직: 70.7㎍이었다[각 증폭 배율은 3710, 3660, 5350, 7070(배)](표 7). aRNA의 사이즈를 실시예 1과 마찬가지로 해서 확인한 결과 FFPE의 경우는 간장, 소뇌 모두 100∼200[nt]의 사이에, 동결 조직의 경우는 간장, 소뇌 모두 400∼500[nt]의 사이에 각각 피크가 보여졌다(도시하지 않음).
실시예 1과 같은 조건에서 마이크로 어레이 해석을 실시하고, 각 유전자의 시그널값을 산출했다. 표 7에 나타내는 바와 같이 유효 스폿수는 간장 FFPE: 13457, 소뇌 FFPE: 14138, FFPE의 공통 유효 스폿: 10852, 간장 동결 조직: 15824, 소뇌 동결 조직: 16699, 동결 조직의 공통 유효 스폿: 13647이었다. 또한, FFPE, 동결 조직 각각에 대해서 각 유전자의 소뇌, 간장의 시그널비(소뇌/간장)를 구하고, 공통 유효 유전자 9556종에 대해서 동결 조직에 있어서의 시그널비를 세로축에, FFPE 샘플(A)에 있어서의 시그널비를 가로축에 플롯해서 작성한 산포도를 도 4에 나타냈다. RNA(A)로부터 얻어진 aRNA와 동결 조직 유래의 RNA(D)로부터 얻어진 aRNA 사이의 공통 유효 유전자에 있어서의 시그널비(소뇌/간장)의 상관계수 R은 0.495이고, 양자의 상관이 낮았다(표 7).
(비교예 2)
뉴클레오티드 시약에 포함되는 AA-UTP의 비율「AA-UTP의 몰량/(UTP의 몰량+AA-UTP의 몰량)」을 50몰%로 한 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 해서 FFPE(A)(간장, 소뇌)로부터 추출된 RNA(A), 동결 조직(간장, 소뇌)으로부터 추출된 RNA(D) 각 1㎍으로부터 각각 aRNA를 조제했다. 그러나, RNA(A)에 있어서는 1㎍의 RNA로부터 증폭을 개시해도 충분량의 aRNA를 얻을 수 없었기 때문에 RNA 양을 3㎍으로 변경해서 증폭 공정을 행했다. 얻어진 aRNA의 수량은 간장 FFPE: 3.6㎍, 소뇌 FFPE: 5.1㎍, 간장 동결 조직: 5.4㎍, 소뇌 동결 조직: 7.7㎍이었다[각 증폭 배율은 1.2, 1.7, 5.4, 7.7(배)](표 7). aRNA의 사이즈를 실시예 1과 마찬가지로 해서 확인한 결과 FFPE의 경우는 간장, 소뇌 모두 100∼200[nt]의 사이에, 동결 조직의 경우는 간장, 소뇌 모두 400∼500[nt]의 사이에 각각 피크가 보여졌다.
실시예 1과 같은 조건에서 마이크로 어레이 해석을 실시하고, 각 유전자의 시그널값을 산출했다. 유효 스폿수는 표 7에 나타내는 바와 같이 간장 FFPE: 15091, 소뇌 FFPE: 16209, FFPE의 공통 유효 스폿: 13622, 간장 동결 조직: 18669, 소뇌 동결 조직: 20871, 동결 조직의 공통 유효 스폿: 17049였다. RNA(A)로부터 얻어진 aRNA와 동결 조직 유래의 RNA(D)로부터 얻어진 aRNA 사이의 공통 유효 유전자에 있어서의 시그널비(소뇌/간장)의 상관계수 R은 0.687이고, 양자의 상관이 낮았다(표 7).
(비교예 3)
뉴클레오티드 시약에 포함되는 AA-UTP의 비율 「AA-UTP의 몰량/(UTP의 몰량+AA-UTP의 몰량)」을 3몰%로 한 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 해서 FFPE(A)(간장, 소뇌)로부터 추출된 RNA(A), 동결 조직(간장, 소뇌)으로부터 추출된 RNA(D) 각 1㎍으로부터 각각 aRNA를 조제했다. 얻어진 aRNA의 수량은 간장 FFPE: 9.5㎍, 소뇌 FFPE: 13.0㎍, 간장 동결 조직: 18.8㎍, 소뇌 동결 조직: 21.3㎍이었다[각 증폭 배율은 9.5, 13, 18.8, 21.3(배)](표 7). aRNA의 사이즈를 실시예 1과 마찬가지로 해서 확인한 결과 FFPE는 간장, 소뇌 모두 100∼200[nt]의 사이에, 동결 조직은 간장, 소뇌 모두 400∼500[nt]의 사이에 각각 피크가 보여졌다.
실시예 1과 같은 조건에서 마이크로 어레이 해석을 실시하고, 각 유전자의 시그널값을 산출했다. 유효 스폿수는 표 7에 나타내는 바와 같이 간장 FFPE: 6036, 소뇌 FFPE: 7312, FFPE의 공통 유효 스폿: 5011, 간장 동결 조직: 12789, 소뇌 동결 조직: 14871, 동결 조직의 공통 유효 스폿: 11049였다. 본 비교예에서 유효 스폿수가 적었던 원인으로서 인비트로 전사 반응에 있어서의 아미노알릴기의 도입량이 적었기 때문에 형광 표식체인 Cy5의 표식량이 적어지고, 백그라운드값이 높아졌다는 것을 생각할 수 있었다. RNA(A)로부터 얻어진 aRNA와 동결 조직 유래의 RNA(D)로부터 얻어진 aRNA 사이의 공통 유효 유전자에 있어서의 시그널비(소뇌/간장)의 상관계수 R은 0.653이고, 양자의 상관이 낮았다.
Figure pct00007
(산업상의 이용 가능성)
본 발명의 aRNA의 조제방법은 고정된 조직 또는 세포로부터 추출된 RNA 샘플을 사용하는 유전자 발현 해석에 있어서 증폭 바이어스의 영향이 저감된 aRNA를 얻는 방법을 제공한다. 본 발명은 정량성이 높은 유전자 발현 해석을 가능하게 하는 것이고, 특히 의료 분야에 있어서 유용하다.

Claims (5)

  1. 고정된 조직 또는 세포로부터 추출된 RNA 샘플의 유전자 발현 해석에 사용하는 aRNA의 조제방법으로서:
    역전사 공정 및 인비트로 전사 공정을 포함하는 RNA의 증폭 공정을 포함하고, 상기 인비트로 전사 공정에서 사용하는 뉴클레오티드 시약에 포함되는 5-(3-아미노알릴)우리딘5'-3인산(AA-UTP)의 비율은 우리딘5'-3인산(UTP)과 5-(3-아미노알릴)우리딘5'-3인산(AA-UTP)의 총합에 대해서 5몰% 이상 25몰% 미만인 것을 특징으로 하는 aRNA의 조제방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 고정된 조직 또는 세포는 파라핀 포매되어서 이루어지는 것을 특징으로 하는 aRNA의 조제방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 aRNA의 뉴클레오티드 길이의 평균값은 200 뉴클레오티드 이상인 것을 특징으로 하는 aRNA의 조제방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 aRNA의 조제방법에 의해 조제된 aRNA를 사용하는 것을 특징으로 하는 고정된 조직 또는 세포로부터 추출된 RNA 샘플의 유전자 발현의 해석방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    마이크로 어레이를 사용하는 것을 특징으로 하는 고정된 조직 또는 세포로부터 추출된 RNA 샘플의 유전자 발현의 해석방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11091810B2 (en) * 2015-01-27 2021-08-17 BioSpyder Technologies, Inc. Focal gene expression profiling of stained FFPE tissues with spatial correlation to morphology
CN106198952A (zh) * 2016-07-01 2016-12-07 清华大学 一种抑制核酸分子对传感界面非特异性吸附的封闭方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002236524A1 (en) * 2000-11-28 2002-06-11 Rosetta Inpharmatics, Inc. In vitro transcription method for rna amplification
ATE503023T1 (de) 2001-06-18 2011-04-15 Rosetta Inpharmatics Llc Diagnose und prognose von brustkrebspatientinnen
US7364846B2 (en) * 2002-10-11 2008-04-29 Molecular Devices Corporation Gene expression profiling from FFPE samples
BRPI0414553A (pt) * 2003-09-19 2006-11-07 Arcturus Bioscience Inc previsão do resultado de tratamento contra o cáncer de mama
ATE498022T1 (de) * 2003-12-23 2011-02-15 Genomic Health Inc Universelle vervielfältigung von fragmentierter rns

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