CN108315327A - 核酸保存液及其制备方法、应用该保存液保存核酸的方法 - Google Patents

核酸保存液及其制备方法、应用该保存液保存核酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种核酸保存液及其制备方法、应用该保存液保存核酸的方法，属于核酸保存技术领域，以100mL保存液计，包括如下组分：柠檬酸三钠5.8‑5.95g；生物缓冲剂19.56‑20.21g；乙二胺四乙酸二钠0.173‑0.192g；酸度调节剂8.2‑9.0ml；防腐剂28‑33μL；余量为纯水；保存液的pH值为3.5‑4.0；缓冲液包括盐酸三乙醇胺、N,N‑双(2‑羟乙基)‑2‑氨基乙磺酸中的至少一种；酸度调节剂包括冰乙酸、聚丙烯酸中的至少一种。本发明中的保存液具有在常温下保持核酸的组织结构稳定的优点。

Description

核酸保存液及其制备方法、应用该保存液保存核酸的方法
技术领域
本发明涉及核酸保存技术领域，更具体地说，它涉及一种核酸保存液及其制备方法、应用该保存液保存核酸的方法。
背景技术
核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内，生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸(简称RNA)和脱氧核糖核酸(简称DNA)。
核酸的性能不稳定，容易变性，因此，在研究过程中，通常将核酸置于超低温(-70℃)下进行长期保存，然而，该保存方式易对核酸的结构造成影响，且研究过程中进行检测的获得的结果不准确。
授权公告号为CN105145545B、授权公告日为2017年11月03日的中国专利公开了一种核酸保护液，按照以下方法制备：将包括以下组分的配方溶于水中使每升所述核酸保护液含有：D-葡萄糖4100-4300mg，4-羟乙基哌嗪乙磺酸2400-2500mg；NaC13700-3900mg，NaHCO32000-2200mg，NaH2PO4110-125mg，KC1350-400mg，CaC12180-210mg，MgC1270-85mg；L-赖氨酸盐酸盐135-150mg，L-组氨酸盐酸盐75-85mg，L-异亮氨酸90-110mg，L-亮氨酸90-110mg，L-苏氨酸85-95mg，L-苯丙氨酸60-70mg，L-缬氨酸85-95mg，L-酪氨酸65-75mg；氯化胆碱3-5mg，叶酸3-5mg，烟酰胺3-5mg，肌醇3-5mg，维生素A0.15-0.2mg，维生素H0.15-0.2mg，维生素E0.15-0.2mg；Holo-人转铁蛋白90-110mg，牛血清蛋白90-110mg，丙谷二肽400-450mg，胰岛素15-20mg；肾上腺酮1.5-2.0mg，亚油酸3.5-4.0mg，亚麻酸2.5-3.0mg，黄体酮0.07-0.13mg；青霉素(0.9-1.0)×105单位，链霉素90-100mg，两性霉素B0.2-0.3mg。
现有技术中采用了大量组分进行相互配合，最终获得的保存液可在室温下保存核酸。然而，现有技术中使用的组分的数量非常多，易造成保存液的生产成本过高；且在制备过程中，数量繁多的组分在配备时，易出现工作量大、操作繁琐等弊端。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的一在于提供一种核酸保存液，具有在常温下保持核酸的组织结构稳定的优点。
为实现上述目的一，本发明提供了如下技术方案：
一种核酸保存液，以100mL保存液计，包括如下组分：
柠檬酸三钠5.8-5.95g；
生物缓冲剂19.56-20.2lg；
乙二胺四乙酸二钠0.173-0.192g；
酸度调节剂8.2-9.0ml；
防腐剂28-33μL；
余量为纯水；
所述保存液的pH值为3.5-4.0；
所述缓冲液包括盐酸三乙醇胺、N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸中的至少一种；所述酸度调节剂包括冰乙酸、聚丙烯酸中的至少一种。
通过上述技术方案，生物缓冲剂中，盐酸三乙醇胺、N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸易溶于纯水中并形成相应的缓冲液，当外界的温度、压强等因素发生变化时，盐酸三乙醇胺与纯水形成的缓冲液，当与碱性试剂反应时可以有效防止核酸析出，可保护被保存的核酸不易受外界因素的影响，进而保持核酸处于较好的状态。
乙二胺四乙酸二钠作为一种金属螯合剂，能与Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+等二价金属离子结合，从而达到去除保存液中不可避免出现的二价金属离子，进而起到保护核酸免受金属离子影响的作用。当将保存液中的Mg2+螯合后，从而有助于抑制多数依靠Mg2+作用的核酸酶的生长，进而降低核酸酶对核酸降解的风险，使核酸维持原始的组织结构，在检测核酸的过程中，可使检测结果较为准确。
核酸本身带有负电荷，柠檬酸三钠溶于纯水后，存在于溶液中的钠盐离子，包覆在核酸的外部，从而使核酸可在纯水中分散但不易溶解在纯水中。此外，柠檬酸三钠与酸度调节剂同时使用，可起到一定的酸度调节剂作用，使保存液的pH值保持在3.5-4.0的范围内。
保存液的pH值保持在3.5-4.0的范围内，可有效减少核酸水解的可能，使核酸维持原有的组织结构，且对核酸的保存的时间较长，12个月后，对被保存的核酸进行检测时，被保存后的核酸仍然具有12个月之前的组织结构特征。且值得注意的是：本申请中的保存液对核酸的保存时间超过12个月。
此外，本申请中的组分数量较少，且生产成本较低。
进一步优选为：所述生物缓冲剂为盐酸三乙醇胺和N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸，所述盐酸三乙醇胺的浓度为400-600mmo1/L，所述盐酸三乙醇胺的使用量为9-9.5g；所述N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸的浓度为400-600mmo1/L，所述N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸的使用量为10.56-10.7lg。
通过上述技术方案，盐酸三乙醇胺与N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸配合所形成的生物缓冲液，比单独使用盐酸三乙醇胺或N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸形成的缓冲液具有更好的稳定体系以及保护核酸不被降解的作用，使被保存的核酸具有更加稳定的作用。
进一步优选为：所述酸度调节剂为冰乙酸和聚丙烯酸，所述冰乙酸的浓度为0.7-0.9mol/L，所述冰乙酸的使用量为4.4-4.7mL；所述聚丙烯酸的浓度为3-5wt％，所述聚丙烯酸的使用量为3.8-4.3mL。
进一步优选为：所述防腐剂为Proclin-300。
通过上述技术方案，Proclin-300具有优异的抑制微生物生长的作用，从而使本申请中的保存液的整体环境维持较为稳定，进而有助于减少微生物等对核酸的降解影响。
本发明的目的二在于提供一种核酸保存液的制备方法，使获得的核酸保存液具有均匀、稳定的质地的效果。
为实现上述目的二，本发明提供了如下技术方案：
一种核酸保存液的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，将柠檬酸三钠、生物缓冲剂、乙二胺四乙酸二钠与30ml纯水充分混合直至完全溶解，形成第一混合物；
步骤二，向步骤一中获得的第一混合物中加入酸碱调节剂，充分混合，调节pH值为3.5-4.0，再加入防腐剂，最后加入纯水定容至100ml，获得核酸保存液。
通过上述技术方案，先将柠檬酸三钠、生物缓冲剂、乙二胺四乙酸二钠与纯水混合充分，再加入酸碱调节剂进行pH值调节，有助于提高形成的核酸保存液中的各组分混合的均匀性，进而使获得的pH值更为准确。
进一步优选为：所述步骤二中，加入酸碱调节剂时，先加入冰乙酸，再加入聚丙烯酸，添加聚丙烯酸时，添加流速为25-30ml/min。
通过上述技术方案，添加冰乙酸，可较为快速地将液相体系的pH值降低，再加入聚丙烯酸进行pH值的微调，从而有助于使pH值在3.5-4.0的范围内浮动，对被保存的核酸具有更好的稳定和保存的作用。
针对现有技术存在的不足，本发明的目的三在于提供一种应用保存液保存核酸的方法，具有长期有效保存核酸的优点。
为实现上述目的三，本发明提供了如下技术方案：
一种应用保存液保存核酸的方法，将核酸加入权1中所述的核酸保存液中，置于2-8℃的环境中保存。
通过上述技术方案，现有技术中，通常将核酸置于超低温下进行保存，保存的要求较为苛刻，低温冷冻的成本较高。然而，无论是在冷冻过程中，还是在取出核酸进行后续试验操作时的解冻操作过程中，均会对核酸的原始组织结构造成影响，造成核酸的保存率以及合格率降低，不利于后续的试验操作。本申请，只需将需要被保存的核酸置于本申请中获得的保存液中，置于2-8℃的环境下即可达到维持核酸组织结构稳定的作用，降低了保存所需的成本，并且核酸的稳定的状态可以保持12个月及以上。
进一步优选为：所述保存液适用于保存的核酸包括双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RAN、RNA-DNA杂合体中的一种。
通过上述技术方案，本申请中的保存液可适用于保存双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RAN、RNA-DNA杂合体，且保存的时间可达12个月及以上。
进一步优选为：以碱基数计，所述核酸的长度为10-10000个碱基。
通过上述技术方案，本申请中的保存液，对在上述碱基数量范围内的核酸的保存效果较佳，可有效保存12个月及以上。
进一步优选为：以碱基数计，所述核酸的长度为5000-8000个碱基。
通过上述技术方案，在上述碱基数量范围内的核酸，在本申请中的保存液中，保存的状态更加稳定，核酸的组织结构得到更好的保持，最终获得的检测效果更加准确。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1.本申请中的保存液所采用原料的成本较低，且生产成本较低；
2.本申请中的保存液中，组分的数量较少，制备过程较为方便，从而便于准确控制添加的使用量；
3.在2-8℃的条件下保存，且保存12个月后，仍然可使核酸保持原来的组织结构，即保存后的核酸的合格率较高。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进行详细描述。
实施例1：核酸保存液，所包括的组分及其相应的用量如表1所示，且通过如下步骤制备获得：
步骤一，将柠檬酸三钠、生物缓冲剂、乙二胺四乙酸二钠与30ml纯水充分混合直至完全溶解，形成第一混合物；
步骤二，向步骤一中获得的第一混合物中加入酸碱调节剂，充分混合，调节pH值为3.5-4.0，再加入防腐剂Proclin-300，最后加入纯水定容至100ml，获得核酸保存液。
其中，盐酸三乙醇胺的浓度为400mmol/L，N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸的浓度为600mmol/L；冰乙酸的浓度为0.7mol/L，聚丙烯酸的浓度为5wt％。以碱基数计，核酸的长度为10000个碱基。
此外，柠檬酸三钠、盐酸三乙醇胺、N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸、乙二胺四乙酸二钠、冰乙酸购自上海国药集团化学试剂有限公司；聚丙烯酸购自Polysciences；Proclin-300购自Sigma。
表1实施例1-4中所包括的组分及其相应的用量
实施例2-4：核酸保存液，与实施例1的区别在于，所包括的组分及其相应的用量如表1所示。
实施例5：核酸保存液，与实施例1的区别在于，生物缓冲液中，盐酸三乙醇胺的浓度为500mmol/L，N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸的浓度为500mmol/L。
实施例6：核酸保存液，与实施例1的区别在于，生物缓冲液中，盐酸三乙醇胺的浓度为600mmol/L，N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸的浓度为400mmol/L。
实施例7：核酸保存液，与实施例1的区别在于，生物缓冲剂全部为盐酸三乙醇胺。
实施例8：核酸保存液，与实施例1的区别在于，生物缓冲剂全部为生物缓冲剂全部为N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸。
实施例9：核酸保存液，与实施例1的区别在于，冰乙酸的浓度为0.9mol/L，聚丙烯酸的浓度为3wt％。
实施例10：核酸保存液，与实施例1的区别在于，冰乙酸的浓度为0.8mol/L，聚丙烯酸的浓度为4wt％。
实施例11：核酸保存液，与实施例1的区别在于，在制备过程中，步骤二中，加入酸碱调节剂时，先加入冰乙酸，再加入聚丙烯酸，添加聚丙烯酸时，添加流速为25ml/min。
实施例12：核酸保存液，与实施例1的区别在于，步骤二中，加入酸碱调节剂时，先加入冰乙酸，再加入聚丙烯酸，添加聚丙烯酸时，添加流速为30ml/mm。
实施例13：以碱基数计，核酸的长度为5000个碱基。
实施例14：以碱基数计，核酸的长度为8000个碱基。
对比例1：核酸保护液，与实施例1的区别在于，具体见授权公告号为CN105145545B、授权公告日为2017年11月03日的中国专利中的实施例1，具体如下：
取配方量的以下各组分加入到灭菌后的容器中：
D-葡萄糖4100mg，4-羟乙基哌嗪乙磺酸2500mg；
NaCl3700mg，NaHCO32200mg，NaH2PO4110mg，KCl400mg，CaCl2180mg，MgCl285mg；
L-赖氨酸盐酸盐135mg，L-组氨酸盐酸盐85mg，L-异亮氨酸90mg，L-亮氨酸110mg，L-苏氨酸85mg，L-苯丙氨酸70mg，L-缬氨酸85mg，L-酪氨酸75mg；氯化胆碱3mg，叶酸5mg，烟酰胺3mg，肌醇5mg，维生素A0.15mg，维生素H0.2mg，维生素E0.15mg；
Holo-人转铁蛋白90mg，牛血清蛋白110mg，丙谷二肽400mg，胰岛素20mg；肾上腺酮1.5mg，亚油酸4.0mg，亚麻酸2.5mg，黄体酮0.13mg；
青霉素0.9×105单位，链霉素100mg，两性霉素B0.2mg；
再补充水定容至1L即得。
试验：
试验样品：选取实施例1-14中获得的蛋白保存液作为试验样1-14，选取对比例1中获得的保存液作为对照样1。
试验方法：
采用双链RNA作为蛋白进行试验，分别采用试验样1-14、对照样1进行保存，分组编号为1-13；将试验样1-14、对照样1分别稀释至0.1μg/mL，在8℃的条件下分别保存样品12个月后，记录各个试验样品中保存后的双链RNA和DNA杂交检测的效果。
试验结果：双链RNA在保存前后与DNA杂交检测的效果如表2所示。
表2双链RNA在保存前后与DNA杂交检测的效果
由表2可知，在1-14中，刚稀释后与保存12个月后的双链RNA具有一致的杂交检测效果，说明分别经试验样1-14的保存后，双链RNA保持了较好的原始组织结构。而经对照样1保存双链RNA的效果则远不如试验样1-14的保存效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种核酸保存液，其特征在于，以100mL保存液计，包括如下组分：
柠檬酸三钠5.8-5.95g；
生物缓冲剂19.56-20.21g；
乙二胺四乙酸二钠0.173-0.192g；
酸度调节剂8.2-9.0ml；
防腐剂28-33μL；
余量为纯水；
所述保存液的pH值为3.5-4.0；
所述缓冲液包括盐酸三乙醇胺、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸中的至少一种；
所述酸度调节剂包括冰乙酸、聚丙烯酸中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的核酸保存液，其特征在于，所述生物缓冲剂为盐酸三乙醇胺和N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸，所述盐酸三乙醇胺的浓度为400-600mmol/L，所述盐酸三乙醇胺的使用量为9-9.5g；所述N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸的浓度为400-600mmol/L，所述N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸的使用量为10.56-10.71g。
3.根据权利要求1所述的核酸保存液，其特征在于，所述酸度调节剂为冰乙酸和聚丙烯酸，所述冰乙酸的浓度为0.7-0.9mol/L，所述冰乙酸的使用量为4.4-4.7mL；所述聚丙烯酸的浓度为3-5wt%，所述聚丙烯酸的使用量为3.8-4.3mL。
4.根据权利要求1所述的核酸保存液，其特征在于，所述防腐剂为Proclin-300。
5.权利要求1所述的一种核酸保存液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，将柠檬酸三钠、生物缓冲剂、乙二胺四乙酸二钠与30ml纯水充分混合直至完全溶解，形成第一混合物；
步骤二，向步骤一中获得的第一混合物中加入酸碱调节剂，充分混合，调节pH值为3.5-4.0，再加入防腐剂，最后加入纯水定容至100ml，获得核酸保存液。
6.根据权利要求8所述的核酸保存液的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，加入酸碱调节剂时，先加入冰乙酸，再加入聚丙烯酸，添加聚丙烯酸时，添加流速为25-30ml/min。
7.一种应用保存液保存核酸的方法，其特征在于，将核酸加入权1-9中任意一项所述的核酸保存液中，置于2-8℃的环境中保存。
8.根据权利要求7所述的应用保存液保存核酸的方法，其特征在于，所述保存液适用于保存的核酸包括双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RAN、RNA-DNA杂合体中的一种。
9.根据权利要求7或8所述的应用保存液保存核酸的方法，其特征在于，以碱基数计，所述核酸的长度为10-10000个碱基。
10.根据权利要求9述的应用保存液保存核酸的方法，其特征在于，以碱基数计，所述核酸的长度为5000-8000个碱基。
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