CN101802610A - 用于评估针对厌氧微生物的杀生物剂的高通量测试法 - Google Patents

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Abstract

提供用于确定杀生物剂针对厌氧生物体的杀生物功效的高通量方法。该方法包括以下步骤：在多道移液管可以进入的第一组多个容器中提供一份以上厌氧菌样品；在多道移液管可以进入的第二组多个容器中提供一份以上已知浓度的杀生物剂样品；通过多道移液管形成所述一份以上杀生物剂样品和厌氧菌样品的混合物；温育所述混合物从而容许所述杀生物剂样品和所述厌氧菌样品之间反应；以选定时间间隔确定所述一份以上杀生物剂样品中的每份杀死所述厌氧菌的(杀生物)效力，其中每个步骤，除所述提供一份以上杀生物剂样品的步骤以外，均在厌氧条件下进行。

Description

用于评估针对厌氧微生物的杀生物剂的高通量测试法
本申请要求2007年9月20日提交的美国临时申请系列号60/973,909的优先权，通过参考将其内容作为整体引入本文。
发明领域
本发明涉及用于测试针对常见厌氧环境，诸如石油和天然气田中存在的厌氧生物体的杀生物剂的杀生物功效的高通量测试法。
发明背景
厌氧菌是不需要氧来生长并甚至可能在存在氧的条件下死亡的生物体。在厌氧生物体中报告了不同的氧-耐受水平。专性厌氧菌被认为在严格无氧条件下生存，并且它们中的大部分在氧暴露过程中不存活超过几小时。在甚至很短时间的氧应激下，专性厌氧菌可以经历代谢变化、形态学变化，或死亡。
将硫酸盐还原菌(SRB)分类为专性厌氧菌。SRB使用硫酸盐作为末端电子接受剂并产生硫化氢。SRB普遍存在于许多其中存在厌氧条件的环境中。在工业上，SRB可以在水性或水接触环境，特别是石油和天然气储层(oil and gas reservoirs)，石油和天然气井，石油/天然气作业、分离、储存、和运输系统，石油/天然气管道，石油/天然气罐，冷却塔，环境水，废水和处理系统，纸和纸浆厂储存&混合罐和处理水(process water)，压载水，其他工业处理水(industrial process water)，等中引起许多问题。
作为可以由厌氧生物体，诸如厌氧菌引起的问题的结果，存在对有效控制厌氧菌生长的杀生物剂的需要。然而，杀生物剂的功效取决于多种因素，包括厌氧菌生长的化学环境和厌氧菌的类型或具体菌株。因此，可以有效针对微生物物种的一种菌株的杀生物剂可能不类似地有效针对不同的微生物物种或甚至相同物种的不同菌株，或在不同的环境条件下可能不类似有效。
测试法因此广泛用于确定针对来自特定环境的微生物的杀生物剂的功效。例如，API RP-38是美国石油组织(American Petroleum Institute)推荐用于SRB评估的最普遍使用的工业标准方法。在API RP-38测试中，在密封的血清瓶中用测试杀生物剂处理SRB污染的样品。该瓶用隔膜(septa)和铝制钳口盖(crimp caps)密封，从而减少氧在该测试法中的干扰。然后连续稀释样品，以进行细菌计数。使用针注射器接种和转移等分试样，以进行连续稀释。SRB生长的温育时间典型为28天。
然而，用于针对厌氧菌的杀生物剂评估的常规测试法经受若干缺点。例如，它们费时费力；如上所示，API测试的温育时间是28天。另外，部分由于缺少排除氧的彻底性和未能为厌氧菌生长提供有利的大气条件，已知的方法不提供高度的准确性和再现性。作为常规方法的复杂性和局限性的结果，存在对新型快速更有效和更可再现的测试技术的需要。
发明概述
本发明提供由于测试针对厌氧菌的杀生物剂的杀生物功效的方法。该方法包括：在多道移液管可以进入的第一组容器中提供一份以上厌氧菌样品；在多道移液管可以进入的第二组容器中提供一份以上已知浓度的杀生物剂样品；通过多道移液管形成一份以上杀生物剂样品和厌氧菌样品的混合物；温育该混合物从而容许杀生物剂样品和厌氧菌样品之间反应；以选定时间间隔确定一份以上杀生物剂样品中的每份杀死厌氧菌的效力，其中每个步骤，除提供一份以上杀生物剂样品的步骤以外，均在厌氧条件下进行。
发明详述
如上所示，本发明提供用于测量针对厌氧生物体，诸如SRB的杀生物剂的杀生物功效的高通量(HTP)测试法。该方法允许测试在不同处理时间间隔后，厌氧条件下，和随着时间实现完全的或一定水平的生物体杀死所需的具体试剂的最小杀生物剂浓度(MBC)。在一些实施方案中，该方法使用连续稀释技术，多道移液管可以进入的多孔或多管容器，和完全功能性厌氧操作系统来测试杀生物剂的功效。
本发明的HTP测试法与常规方法相比，提供若干优势。例如，由于其高效率，该方法容许短期内同时彻底评估和比较多种杀生物剂和试剂组合，从而导致快速的结果生成和劳力成本和测试材料的减少。测试大量样品的能力还容许对每种样品进行另外的重复，和在单次测试中并行比较每种试剂，这增加测试的准确性并避免由单独测试中的可变测试条件所引起的实验偏差。
另外，本发明的HTP测试程序提供严格的厌氧生长条件，这避免氧在整个测试期间内对厌氧菌的存活、生长、形态学和生理学状态的影响，并导致厌氧菌在计数过程中的迅速恢复。因此，HTP法需要短得多的温育时间并进一步增加测试的准确性。例如，与对于API RP-38常规测试所需的28天相比，为了在本发明中测试SRB，只需要约3天的温育时间。
另外，与许多现有技术测试的最小抑制浓度(MIC)数据相反，本发明的方法能够提供关于在以不同时间间隔研究下的杀生物剂化合物的功效数据。本发明的方法测量杀生物剂在测试中和随着时间流逝杀死微生物能力，而MIC方法仅确定杀生物剂在一个固定时间点的抑制作用，而不提供关于致命效果所需剂量的信息。
仅受杀生物剂抑制的生物体，在该试剂的活性由于，例如，环境中存在钝化剂而降低或该试剂降解时，仍可以健壮生长。而且，处于连续抑制处理的生物体可以容易地发展为杀生物剂抗性/耐受性并可以幸免于将来使用相同或相似类型的杀生物剂的处理。因此，关于杀死微生物所需的杀生物剂剂量的数据在需要消除而非仅抑制生物体的情况下特别重要。
本发明的方法还可以提供关于杀生物剂功效比MIC法更可靠的数据。在MIC测试中，杀生物剂与微生物的接触发生在培养基中。培养基中的一些常用成分，诸如蛋白质或铵化合物，可以灭活某些杀生物化合物，因此人工干扰杀生物剂化合物的浓度。在本发明的方法中，培养基只在生物体计数步骤中需要，其中不希望存在剩余杀生物剂的持续活性。因此，本发明的方法可以提供实际杀生物剂功效的更可靠评估。
本发明提供高通量测试杀生物剂针对厌氧菌的杀死功效的方法。该方法包括：在多道移液管可以进入的第一组容器中提供一份以上厌氧菌样品；在多道移液管可以进入的第二组容器中提供一份以上已知浓度的杀生物剂样品；通过多道移液管形成一份以上杀生物剂样品和厌氧菌样品的混合物；温育该混合物从而容许杀生物剂样品和厌氧菌样品之间反应；以选定时间间隔确定一份以上杀生物剂样品中的每份杀死厌氧菌的效力，其中每个步骤，除提供一份以上杀生物剂样品的步骤以外，均在厌氧条件下进行。
本发明的HTP法适合于测试来自任何这样的环境的厌氧生物体，所述环境中存在该生物体，其包括，例如，石油和天然气田水，基于石油和天然气田水的流体，石油和天然气储层，石油和天然气作业、分离和运输系统，石油和天然气井和储存罐，石油和天然气管道，石油和天然气罐，燃料，冷却塔，环境水，土壤，废水和处理系统，纸和纸浆厂，压载水，工业设备，混合和储存罐，和处理水，油漆，胶乳，涂料，金属切削液，水基浆和分散的颜料，粘合剂，墨汁，带条粘接缝混料(tape joint compounds)，个人护理和家用产品，其他含水流体，生物膜，医疗和保健领域中的诊断和治疗设备和工具，和临床样品。含厌氧菌的样品可以包含单一或混合的生物体物种。优选的厌氧生物体是微生物，更优选地，细菌，最优选地，SRB。其他合适的厌氧菌包括，但不仅限于，工业环境和临床样品中普遍存在的厌氧菌，诸如梭菌属(Clostridium)，消化链球菌属(Peptostreptococci)，拟杆菌属(Bacteroides)，放线菌属(Actinomyces)，普雷沃氏菌属(Prevotella)，梭杆菌属(Fusobacterium)，纤毛菌属(Leptotrichia)，真杆菌属(Eubacterium)，双歧杆菌属(Bifidobacterium)，乳杆菌属(Lactobacillus)，或硝酸盐和亚硝酸盐还原菌(NRB)。
术语“厌氧菌样品”在本说明书中指具有适合于测试的粘度的水性厌氧菌样品。该样品可以天然地以适合于测试的状态存在，即，发现该厌氧菌存在于具有合适粘度的含水培养基中，或该样品可以通过将培养的厌氧菌悬浮在含水培养基中来人工制备。人工悬浮的厌氧菌样品的含水培养基可以本身是生物体典型地在其中存在或污染的区域环境，或它可以是人工制备的。天然存在的含水培养基优选是以上列举的多种环境，其中生物体存在于包括，但不仅限于，石油和天然气田水，基于石油和天然气田水的流体，石油和天然气储层，燃料，冷却塔水，环境水，废水和处理水，纸和纸浆厂中使用的水，压载水，工业处理水，油漆，胶乳，涂料，金属切削液，水基浆和分散的颜料，含水的粘合剂，墨汁和带条粘接缝混料，个人护理和家用产品，其他含水流体，和临床样品。当用于制备培养的目的厌氧菌的混悬液时，含水培养基在使用前优选是无菌的。
当厌氧菌天然存在于低粘度液体环境(且因此可以利用移液管转移)时，典型地不需要进一步处理所述材料，且厌氧菌样品可以直接进行本发明的测试。直接测试厌氧菌样品是特别有利的，其中测试可以在紧密接近样品收集位点处进行，或其中可能在厌氧条件下运输厌氧菌样品。
当存在在运输过程中维持厌氧条件的困难时，优选首先在处于密封培养瓶中的合适培养基中分离厌氧菌和再稍后进行运输。备选地，可以在运输前，将含有收集的厌氧菌的样品添加到处于密封瓶中的合适厌氧菌培养基中。所述培养基含有还原剂是优选的。生物体可以在实验室中进一步富集并然后重新悬浮在脱气缓冲液或具有适合于测试的粘度的培养基中或可以将其储存，以在将来评估。可以容易地分离在非液体环境诸如硬表面或高粘度材料诸如带条粘接缝混料中存在的厌氧菌并再将其重新悬浮在脱气缓冲液或具有适合于测试的粘度的含水培养基中或储存，以在将来评估。备选地，厌氧生物体可以获自商业来源或实验室收集，并培养。
将厌氧菌样品分配到用于杀生物剂测试的容器中。这个步骤在厌氧室中进行。厌氧室容许这个步骤和本发明的多个其他步骤在厌氧环境下进行，这避免了氧对厌氧生物体生长的影响并为厌氧菌生长提供有利的大气条件(约90％N2，5％CO2和5％H2的大气)，并因此极大地缩短生长温育时间。而且，因为在氧应激和毒性作用下，厌氧菌可以经历形态学和生理学变化或死亡，这可以导致厌氧菌针对杀生物剂的易感性的改变或高估杀生物剂的功效，所以如本发明中使用的厌氧条件导致更可靠的结果。
所述室可以是，例如，具有工作台的手套盒或戴或不戴手套的手可以接近并含有工作台的其他类型的氧排出罩。有利地，所述室应该能够去除氧优选达到低于2.5％，更优选低于0.4％的水平。最优选地，去除痕量的氧。惰性气体，诸如氮或氩，可以用于提供有效的氧排出。
所述室优选包含内置式温育箱，尽管不是必需的。特别优选的是这样的厌氧室，其是具有工作台、温度和冷凝控制器、循环厌氧气体、痕量氧去除能力、和内置式温育箱的单元。这样的室可以商购获得。例如，优选的室是可由美国俄勒冈谢尔登制造公司(Sheldon Manufacturing，Inc.Oregon，USA)获得的Bactron厌氧室。
如所注意到地，在厌氧室中将含有大约已知量厌氧菌的含厌氧菌的样品分配到多道移液管可以进入的容器中。优选的容器是多孔板。多孔板包含多个循环的孔的行和列，以用于容纳各个样品等分试样。存在不同孔数和孔体积的板，诸如6-96孔/板和300ul-2mL/孔。利用移液管，诸如多道移液管系统将样品置于所述板的孔中。备选地，可以将自动或半自动装置置于厌氧室中，从而代替多道移液管用于本发明方法的这个和其他步骤，包括培养基加载，连续稀释，接种和试剂分散或转移。
任选地，厌氧菌样品可以以不同的厌氧菌浓度来测试。这可以通过关于厌氧菌样品的连续稀释来进行。所述稀释优选利用多道移液管和作为稀释样品和其他溶液诸如对照溶液的容器的多孔板来进行。在典型的连续稀释程序中，将处于特定厌氧菌浓度的厌氧菌样品置于多孔板的最上一行孔中。在每一列的第二行中，将相同的厌氧菌样品稀释，例如，一半。在多孔板的另外的行中重复稀释。多孔板的每一列因此容纳处于多种浓度的厌氧菌。
待测的一份以上杀生物剂样品(即，溶液或基质中存在的杀生物剂)直接在多道移液管可以进入的第二组容器(优选多孔板)中制备或被转移到多道移液管可以进入的第二组容器(优选多孔板)中。杀生物剂样品可以在厌氧室外制备并随后被引入厌氧室中；然而，优选的是它们直接在厌氧室中制备。多种溶剂和基质可以用于制备所述样品，包括水和有机溶剂。在一些实施方案中，使用如上所述的含水培养基作为杀生物剂的基质是有利的，因为这可以提供良好的近似于杀生物剂会起作用的条件。典型地，该培养基是无菌的或在用于制备杀生物剂样品前灭菌。
如果测试多种杀生物剂浓度或测量MBC，则应该对此进行杀生物剂样品的多重连续稀释。所述稀释优选利用多道移液管和作为稀释样品以及任何其他溶液，诸如对照溶液的容器的多孔板来进行。在典型的连续稀释程序中，将每份处于特定浓度的目的杀生物剂样品置于多孔板的最上一行孔中。在每一列的第二行中，将相同的杀生物剂样品稀释，例如，一半。在多孔板的另外的行中重复稀释。多孔板的每一列因此容纳处于多种浓度的特定杀生物剂。
本发明不局限于任何特殊的杀生物剂来测试，且具有杀死目的厌氧菌的潜力的任何一种被认为是特别适合的。实例包括，但不仅限于，醛诸如戊二醛、甲醛、鏻化合物诸如四羟甲基硫酸鏻(THPS)，铵化合物诸如烷基二甲基苯基氯化铵，2，2-二溴-3-次氮基丙酰胺(DBNPA)，2-溴-2-硝基丙烷-1，3-二醇(Bronopol)，噻唑酮类(thiazolones)诸如5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(CMIT/MIT)，三(羟甲基)硝基甲烷，苯并异噻唑啉酮(BIT)，1-(3-氯烯丙基)-3，5，7-三氮杂-1-氮鎓-氯化金刚烷，2，6-二甲基-间-二噁烷-4-醇乙酸酯，邻-苯二醛，噁唑烷，三嗪，和其他释放甲醛的杀生物剂，和其中两种以上的混合物。
制备杀生物剂样品后，使用多道移液管转移和混合已知量的杀生物剂样品和厌氧菌样品。优选地，这通过将较小体积的样品转移到装有较大体积样品的容器中实现。
任选地，可以将其他的目的化学品包括，例如，阻蚀剂、去氧剂、阻垢剂、聚合物添加剂加入到杀生物剂样品或厌氧菌样品或这二者的混合物中。
一旦接触，杀生物剂样品和厌氧菌样品混合并在厌氧条件下温育，从而容许厌氧菌和杀生物剂之间反应。温育时间和/或温度由操作者选择，以达到具体的目的需要。优选地，将温育温度设置为接近由其中获得被测试的厌氧菌或计划将杀生物剂用于其中的环境的温度。温育时间范围取决于估计的杀生物剂开始作用所需的时间和估计的杀生物剂活性在测试条件下将持续的时间。温育时间可以在数秒到数月的范围内。
尽管不要求在厌氧室中进行，但是该室中存在温育箱通过避免样品暴露于氧而极大地促进本发明的温育步骤并帮助增加测试的准确性以及缩短生物体计数时间。在温育期间内，如果需要，以不同时间间隔再接种样品。再接种可以例如每小时，每日，每周进行，这取决于使用者试图模拟的场地条件的类型。
杀生物剂的效力可以在整个过程中(在杀生物剂样品与厌氧菌样品混合后)，和/或所选的温育时间期间结束时确定。例如，可以通过凭借活细胞计算技术测量存活生物体的减少而定量地；或通过检查生物体的完全杀伤而定性地确定效力。定量和定性的活微生物测量法是本领域中公知的，且所选的具体方法对本发明不是关键的。
通过举例，一种合适的定量测量技术涉及使用基于培养基的连续稀释法。将适合于生长测试厌氧菌的培养液的等分试样置于排列的多孔或多管，优选多孔板中。为了增加测试的灵敏性或特异性，可以将关于具体生物体或生物体组的生长指示剂加入到培养液中。例如，可以将硫酸亚铁铵加入到硫酸盐还原菌(SRB)的培养基中。当硫酸亚铁铵与SRB在细菌生长过程中产生的H2S反应时，会形成黑色沉淀，由此提供生长和代谢活性的可视指示剂。而且，可以将可以中和剩余杀生物剂杀生物活性但对生物体生长无消极作用的中和剂加入到培养液中，从而除去剩余杀生物剂对厌氧菌的任何抑制作用。不同的温育时间间隔后，或在温育结束时，利用多道移液管将部分厌氧菌-杀生物剂样品混合物和任何未处理的对照样品从每个孔中取出，并转移到另一个装有用于进一步连续稀释的培养液的多孔板的孔中。备选地，代替培养液，多孔板可以装有水或缓冲溶液。然后对沿每列向下进行连续稀释(一次以上)，从而进一步进行细胞计数。
连续稀释后，再温育多孔板，从而容许每个孔中的任何活细菌达到可视的生长。尽管不要求在厌氧室中进行，但是该室中存在温育箱极大地促进本发明的这个步骤并帮助增加测试的准确性和缩短生物体计数时间。优选地，将温育温度设置为最适生长温度，其典型地与由其中收集到测试厌氧菌的环境温度近似，或设置为由提供商业测试菌株的机构建议的生长温度。温育时间应该短于未处理对照达到可视生长所需的时间，且可以由本领域中的普通技术人员容易地确定。
温育后，操作者记录每列(由第一排到最后一排计算)中显示可视生长或生长指示的最后的孔的孔数。由此，可以再计算初始混合物中的厌氧菌总数。然后，通过从非-杀生物剂处理对照样品的厌氧菌总数中减去杀生物剂处理样品中的厌氧菌总数来计算由连续稀释浓度的各种杀生物剂的杀生物作用引起的活厌氧菌的减少。如果预期培养液中的剩余杀生物剂由于杀生物剂的剩余杀生物活性而对计数结果有影响，则可以在计数之前或过程中应用利用中和剂的中和步骤，从而中和剩余的杀生物活性。
当用水或缓冲溶液代替培养液来连续稀释，从而进行厌氧菌计数时，每孔中的厌氧菌数量可以进一步利用，例如，菌落形成单位测试法，在固体营养表面(诸如琼脂板)上测量。
如通过以下实施例证明地，计数步骤允许确定哪份被测杀生物剂样品表现出针对厌氧菌的功效，以及在不同处理时间间隔后实现完全或一定水平的厌氧菌杀伤所需的试剂最小浓度。
作为计数的备选方案，可以使用定性技术来确定杀生物剂的功效。通过举例，一种涉及使用基于培养基的方法的合适定性测量技术与上述定量方法类似的方式运行，区别仅在于不需要连续稀释。因此，结果被读作完全杀死而非活厌氧菌细胞的减少量。
除了基于培养基的技术以外，可以用于定量或定性检测活生物体，且特别适合于检测不可培养的生物体的其他技术包括细胞ATP(三磷酸腺苷)检测，荧光分子技术，免疫测定，核酸检测技术，和检测细胞生存力或活性的其他技术。
本发明方法中的多种步骤在厌氧环境下进行。除上述厌氧操作系统外，进一步优选的是，特别是当测试专性厌氧菌时，用于制备厌氧菌样品，杀生物剂样品和连续稀释这些样品的多种溶剂，溶液，培养基，诸如缓冲液，基质，和水在使用前进行脱气。当代替含厌氧菌的野外液体样品而测试厌氧菌分离群时，脱气的水/缓冲液/基质是特别适合的。脱气极大地减小这些试剂存在的氧对测试结果的影响。
脱气技术是本领域中技术人员公知的，且包括，例如，惰性气体置换氧，冷冻-泵-解冻程序，氧净化，等。为了测试针对SRB的杀生物功效，优选地，脱气水/缓冲液/基质的氧浓度低于10ppm，更优选低于0.5ppm。对于其他细菌，最大氧水平可以较高，这取决于该细菌对氧的耐受性和该细菌所需的最适大气生长条件。
适合于在本发明的不同实施方案中使用的培养基是本领域中公知的。例如，关于SRB，优选的培养基包括Starkey培养基、硫酸盐API培养基、和Postgate培养基。同样关于SRB，优选地，硫酸亚铁铵在SRB接种物制备培养基中的浓度是0.5-20ppm，优选1-10ppm。硫酸亚铁铵在SRB恢复培养基(用于计数)中的浓度优选是20-1000ppm，更优选25-100ppm。
如本领域中的普通技术人员应该理解地，本发明方法的多种步骤的顺序是可以改变的。例如，将厌氧菌样品提供到第一组多个容器中可以在将一份以上杀生物剂样品提供到第二组多个容器中之后，之前，或同时进行。
提供以下实施例来进一步例证本发明。这些实施例不意欲限制本发明的范围。
实施例
实施例1
本发明的高通量测试法用于评估油田中的8种常用杀生物剂(表1)在控制野外分离的SRB中的效力。杀生物剂以8种不同的剂量水平，一式三份地测试。杀生物剂功效以9天期间内的9种时间间隔来测量。表2显示被测杀生物剂在9天测试期间内针对SRB的杀生物功效(三次重复的平均值)。
表1.选择的杀生物剂
 产品   化学说明
 UCARCIDE 250   50％的戊二醛溶液
 AQUCAR THPS 75   75％的四羟甲基硫酸鏻溶液
UCARSAN 442   42.5％的戊二醛和7.5％烷基二甲基苯基氯化铵溶液
 Barquat MB-80   80％的烷基二甲基苯基氯化铵(ADBAC)溶液
DOWAM 7287   20％的2，2-二溴-3-次氮基丙酰胺(DBNPA)溶液
BIOBAN BP-30   30％的2-溴-2-硝基丙烷-1，3-二醇(Bronopol)溶液
 CANGUARDCM14   14％的5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮，2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮溶液
 TRIS NITRO 50％   50％的三(羟甲基)硝基甲烷溶液
制备细菌混悬液和处理板。SRB最初在改良的Starkey培养基A培养液中由-80℃冷冻储液厌氧生长(37℃)2-3天，所述改良的Starkey培养基A培养液在1L水中包含乳酸钠(3.5g)，氯化铵(1.0g)，正磷酸氢二钾(0.5g)，硫酸镁(2.0g)，硫酸钠(0.5g)，氯化钙(0.1g)，巯基乙酸(0.1g)，酵母提取物(0.5g)，硫酸亚铁铵(0.001g)。温育在Bactron III厌氧室(美国俄勒冈谢尔登制造公司(Sheldon Manufacturing，Inc.Oregon，USA))中的温育箱中进行。制备无菌盐溶液(在1L水中：1.2490g NaCl，2.9290g NaHCO3，0.1910gNa2CO3，0.0060g Na2SO4，0.033g CaCl2，和0.0590g MgCl2·6H2O)，对其进行脱气(重复真空吸出空气并供应氮气的步骤)并在测试前至少1天时置于厌氧室内。SRB通过以2000g离心培养液15-30分钟来收集。将细菌沉淀重新悬浮在脱气的盐缓冲液中，以达到最终细菌浓度～107CFU/mL。然后将该混悬液以900μL/孔，加入到96-深孔板(处理板)中。
制备杀生物剂溶液和杀生物剂板。使用单独的96-深孔板(杀生物剂板)制备具有8种浓度的杀生物剂溶液，如下：将1ml具有初始浓度(在该情形中1000ppm)的各种杀生物剂溶液加入到板的第一排中，一式三份，并沿每列向下进行1∶2连续稀释，由此关于每种杀生物剂产生8种梯度水平的杀生物剂浓度。
用杀生物剂处理细菌混悬液。将100μL来自杀生物剂板的各种杀生物剂溶液转移到处理板和混合孔。用无菌96-孔板垫覆盖处理板并在所述室内以37℃温育。
细菌计数。利用连续稀释法，在9天期间内的9种时间间隔来计算每孔中的活细菌。以由2小时开始的每种时间间隔，20μL等分试样是来自处理板每个孔中的样品并被转移到充满改良的Starkey培养基A培养液2(180μL/孔)的96-孔微滴定板的第一排中，所述改良的Starkey培养基A培养液2在1L水中包含乳酸钠(3.5g)，氯化铵(1.0g)，正磷酸氢二钾(0.5g)，硫酸镁(2.0g)，硫酸钠(0.5g)，氯化钙(0.1g)，巯基乙酸(0.1g)，硫酸亚铁铵(0.025g)。然后，沿每列向下进行1∶10连续稀释，并将该板在所述室中以37℃温育。在第7天的当天细菌计数后，用处于最终SRB水平～107CFU/mL的SRB混悬液再接种处理板。温育3天后，记录每列中显示生长和黑色沉淀(指示SRB生长)的最后孔的孔数。由每种杀生物剂的杀生物作用引起的细菌减少的对数通过从非-杀生物剂处理对照样品的最后生长孔数中减去关于杀生物剂处理样品记录的最后生长孔数来计算。
该实施例的整个测试可以在厌氧室内进行。表2显示8种杀生物剂在9天测试期间内针对SRB野外培养物的杀生物功效。
表2.在9天测试期间内实现至少SRB减少的对数为3所需的杀生物剂浓度(ppm，活性的)
Figure GPA00001111850100121
实施例1的研究证明本发明的HTP测试法在评估和比较多种杀生物剂及其混合物中的一些优势。总之，实施例1生成1728个数据点，包括由处于8种剂量水平的8种杀生物剂，以9种时间间隔，一式三份地处理的SRB的减少的对数。如果利用常规API RP-38测试法进行相同的测试，则需要约78天，包括适当训练的技术人员的约280个工时来获得最终结果。相反，如实施例1实施地，利用本发明的HTP测试法仅需要约16天，包括适当训练的技术人员的约12个工时。
实施例2
为了比较的目的，利用常规血清瓶稀释测试法，在两次单独的测试中对戊二醛(UCARCIDE 250)进行重复测试，以获得针对油田产生的水中的SRB的杀生物功效。水样品用12.5ppm和25.0ppm戊二醛，在GasPak厌氧罐中处理3天。处理后，通过连续稀释法计算活的SRB细菌。利用针式注射器将1mL混合物转移到处于用隔膜和铝制钳口盖密封的SRB培养瓶中的9mLSRB培养基中。然后，温育培养瓶14天。将SRB减少的对数记录在表3中。
表3.利用常规玻璃瓶稀释法在两个独立的测试中测试的戊二醛(UCARCIDE 250)的功效
Figure GPA00001111850100131
实施例3
在另一项研究中，利用本发明的高通量测试法，在两次单独的测试中对戊二醛(UCARCIDE 250)进行重复测试，以获得针对SRB培养物的杀生物功效。使用与实施例1中所述的相同的测试程序。由处于5种梯度剂量水平的戊二醛处理3小时后的SRB减少的对数显示在表4中。如可以看到地，本发明的HTP法产生具有与常规测试法相比更高再现性的数据。
表4.利用HTP法，在2个单独的测试中测试的戊二醛(UCARCIDE250)的功效
Figure GPA00001111850100141
尽管本发明已经根据其优选实施方案如上记述，但是可以在本发明的精神和范围内改进。本发明因此意欲涵盖利用本文中公开的一般原则的任何变化、应用、或适应。此外，本发明意欲涵盖本发明公开内容的这样的偏差，所述偏差在本发明所属技术领域已知或常规实践的范围内且在以下权利要求的范围内。

Claims (17)

1.用于测试杀生物剂针对厌氧菌的杀生物功效的方法，所述方法包括：
在多道移液管可以进入的第一组多个容器中提供一份以上厌氧菌样品；
在多道移液管可以进入的第二组多个容器中提供一份以上已知浓度的杀生物剂样品；
通过多道移液管形成所述一份以上杀生物剂样品和厌氧菌样品的混合物；
温育所述混合物从而容许所述杀生物剂样品和所述厌氧菌样品之间反应；
以选定时间间隔确定所述一份以上杀生物剂样品中的每份杀死所述厌氧菌的效力，
其中每个步骤，除所述提供一份以上杀生物剂样品的步骤以外，均在厌氧条件下进行。
2.权利要求1的方法，其中所述在第二组多个容器中提供一份以上杀生物剂样品的步骤在厌氧条件下进行。
3.权利要求1-2的方法，其中所述确定所述一份以上杀生物剂样品中的每份的效力的步骤在整个所述温育步骤中以不同的时间间隔进行或在所述温育步骤结束时进行。
4.权利要求1-3的方法，其中所述确定所述一份以上杀生物剂样品中的每份的杀死效力的步骤通过定量测量活厌氧菌或通过定性测量厌氧菌杀死是否完全来进行。
5.权利要求1-4的方法，其中所述一份以上杀生物剂样品和厌氧菌样品的混合物在所述温育步骤过程中用厌氧菌样品再接种。
6.权利要求1-5的方法，其中所述一份以上杀生物剂样品包含处于天然存在或人工制备的含水培养基中的杀生物剂。
7.权利要求1-6的方法，其中所述一份以上杀生物剂样品以多种浓度提供。
8.权利要求7的方法，其中所述一份以上杀生物剂样品在一组多个容器中通过连续稀释技术直接制备。
9.权利要求1-8的方法，其中所述厌氧菌的来源是石油和天然气田水，基于石油和天然气田水的流体，石油和天然气储层，石油和天然气井，石油和天然气作业、分离、储存和运输系统，石油和天然气管道，石油和天然气罐，燃料，冷却塔，环境水，土壤，废水和处理系统，纸和纸浆厂，压载水，工业设备，混合和储存罐，和工业处理水，油漆，胶乳，涂料，金属切削液，水基浆和分散的颜料，粘合剂，墨汁，带条粘接缝混料，生物膜，个人护理和家用产品，其他含水流体，硬表面，和医疗和保健领域中的诊断和治疗设备和工具，或临床样品。
10.权利要求1-8的方法，其中所述用于制备厌氧菌或杀生物剂样品的含水培养基的来源是石油和天然气田水，基于石油和天然气田水的流体，石油和天然气储层，燃料，冷却塔水，环境水，废水和处理水，纸和纸浆厂中使用的水，压载水，工业处理水，油漆，胶乳，涂料，金属切削液，水基浆和分散的颜料，含水的粘合剂，墨汁和带条粘接缝混料，个人护理和家用产品，其他含水流体，或临床样品。
11.权利要求1-10的方法，其中所述厌氧菌样品中的厌氧菌是厌氧生物体的单一物种或混合物种。
12.权利要求1-11的方法，其中所述厌氧菌样品中的厌氧菌是以下的单一物种或混合物种：梭菌属(Clostridium)，消化链球菌属(Peptostreptococci)，拟杆菌属(Bacteroides)，放线菌属(Actinomyces)，普雷沃氏菌属(Prevotella)，梭杆菌属(Fusobacterium)，乳杆菌属(Lactobacillus)，纤毛菌属(Leptotrichia)，真杆菌属(Eubacterium)，双歧杆菌属(Bifidobacterium)，来自硫酸盐还原菌的物种，或来自硝酸盐和/或亚硝酸盐还原菌的物种。
13.权利要求1-12的方法，其中所述一份以上厌氧菌样品是含天然存在的厌氧菌的液体材料或通过混合含厌氧菌的材料或厌氧菌培养物和天然存在或人工制备的含水培养基制备的。
14.权利要求1-13的方法，其中所述一份以上厌氧菌样品以多种厌氧菌浓度提供。
15.权利要求1-14的方法，其中所述杀生物剂是一种以上醛诸如戊二醛，甲醛，鏻化合物诸如四羟甲基硫酸鏻(THPS)，铵化合物诸如烷基二甲基苯基氯化铵，2，2-二溴-3-次氮基丙酰胺(DBNPA)，2-溴-2-硝基丙烷-1，3-二醇(Bronopol)，噻唑酮类诸如5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(CMIT/MIT)，三(羟甲基)硝基甲烷，苯并异噻唑啉酮(BIT)，1-(3-氯烯丙基)-3，5，7-三氮杂-1-氮鎓-氯化金刚烷，2，6-二甲基-间-二噁烷-4-醇乙酸酯，邻-苯二醛，噁唑烷，三嗪，和其他释放甲醛的杀生物剂，和其中两种以上的混合物。
16.权利要求1-15的方法，其中所述第一组多个容器和所述第二组多个容器独立地是多孔容器或多管。
17.权利要求1-16的方法，其中所述第一组多个容器和所述第二组多个容器是多孔板。
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