WO2019045081A1 - 架橋ゼラチン誘導体粒子を含む創傷被覆材 - Google Patents

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田口　哲志
昭広 西口
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Definitions

  • the present invention relates to wound dressings, and in particular to wound dressings comprising particles of crosslinked gelatin derivative.
  • wound covering and protecting material topically managed wound covering made of hydrophilic polymer used for absorption of exudate, suppression of bleeding or fluid loss, and protection of the wound from abrasion, abrasion, dryness, contamination ⁇ It is defined as “Protective material” (Pharmaceutical Affairs Law, Medical Device Class Classification).
  • the wound dressings include gauze, polyurethane foam, hydrogel and the like, which are all in the form of a fabric.
  • Wound dressings are also beginning to be used in endoscopic submucosal dissection (ESD), which is a treatment for early cancer such as the stomach and large intestine.
  • ESD endoscopic submucosal dissection
  • the walls of the stomach and large intestine are composed of three layers: mucosal layer, submucosa layer and muscle layer, and cancer originates from the innermost layer, mucosal layer.
  • a stomach camera or a colon camera separates from the lumen of the alimentary canal to the submucosa layer including the mucosal layer, and collectively removes the lesion. If left undisturbed, the tissue contracts to cause adhesions and the like, and causes secondary disorders such as gastrointestinal obstruction. The tissue is then covered with a biodegradable wound dressing.
  • Wound dressings for ESD are required to be shapeable, that is, to be flexible along with the shape of the wound and to be biodegradable.
  • a polyglycolic acid non-woven fabric manufactured by Gunze Co., Ltd., NEOVEIL (registered trademark)
  • the polyglycolic acid non-woven fabric is excellent in biodegradability and the like, since it does not have adhesion to tissue, the non-woven fabric must be covered and fixed with a fibrin-based adhesive.
  • the adhesive is expensive and because it is a blood product it can not completely eliminate the risk of contamination.
  • the non-woven fabric is difficult to develop at the application site and lacks shape imparting ability at the site of complex shape.
  • the biodegradation product polyglycolic acid oligomer may cause inflammation in the tissue.
  • Gelatin is used in various medical applications because of its excellent biocompatibility and biodegradability.
  • an embolic agent for transarterial embolization therapy (Patent Document 1) and a sustained release carrier for drugs (Non-patent Document 1) are known.
  • Chemically modified gelatin has also been developed for medical use.
  • a tissue adhesive in which a hydrophobic group is bonded to gelatin via an imino group and exhibits high adhesiveness to wet tissue (Patent Document 2).
  • An object of the present invention is to provide a biodegradable wound dressing which can be applied to the shape of a wound site and exhibits high adhesion to a wet site.
  • the present invention is as follows: Containing particles of crosslinked gelatin derivative,
  • the gelatin derivative includes a structure represented by the following formula (1): GltnNH-CHR 1 R 2 (1)
  • Gltn is a gelatin residue
  • R 1 is an alkyl group having 1 to 17 carbon atoms
  • R 2 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 17 carbon atoms
  • the particle size of the particles is 1 to 1000 ⁇ m, Wound dressing.
  • the wound dressing described above contains particles of micron order, so even wounds with complicated shapes such as spray can be applied according to the shape.
  • the particles have an alkyl group and have high adhesion to wet tissues.
  • the particles can also be made without the use of dispersion media and crosslinkers, and can be applied to tissues without concern about their adverse effects on tissues due to residual or degradation.
  • FIG. 1 is an electron microscope (SEM) image of gelatin derivative particles.
  • FIG. 2 is a graph showing the change in adhesive strength with the applied amount of gelatin derivative particles.
  • FIG. 3 is a 13 C-NMR spectrum of a gelatin derivative.
  • FIG. 4 is an FT-IR spectrum at 2500-3500 cm ⁇ 1 of the gelatin derivative.
  • FIG. 5 is a SEM image of gelatin derivative particles after spray drying and before heat treatment.
  • FIG. 6 is a phase contrast photomicrograph observed by dispersing particles immediately after the heat treatment in water by changing the heat treatment time from 20 minutes to 3 hours.
  • FIG. 7 is a graph showing the solubility of the particles in saline according to the heat treatment time by an accelerated test in the presence of collagenase.
  • FIG. 1 is an electron microscope (SEM) image of gelatin derivative particles.
  • FIG. 2 is a graph showing the change in adhesive strength with the applied amount of gelatin derivative particles.
  • FIG. 3 is a 13 C-NMR
  • FIG. 8 is a graph obtained by plotting the amount of amino groups consumed when the particles obtained by spray drying from raw material gelatin are heat-treated at 150 ° C. with respect to time.
  • FIG. 9 is a graph showing the adhesive strength of gelatin derivative particles.
  • FIG. 10 is a graph showing the contact angles to water of gelatin (untreated) and gelatin derivative (hydrophobicized gelatin) particles.
  • FIG. 11 is a graph showing the survival rate of RAW264 cells in the presence of gelatin derivative particles.
  • FIG. 12 is a graph showing the growth behavior of Caco-2 cells on a film consisting of gelatin derivative particles.
  • FIG. 13 is a graph showing IL-6 production of RAW 264 cells in the presence of gelatin derivative particles FIG.
  • FIG. 14 is a photograph showing the wound healing process (upper part) and the remaining area of the wound (lower part) when gelatin derivative particles were applied onto the skin wound of a rat.
  • FIG. 15 is a photograph (upper) showing a ⁇ -smooth muscle actin-positive portion in the tissue at day 7 after application of gelatin derivative particles onto a skin wound of a rat (graph) and a graph showing the positive area (lower).
  • FIG. 16 is a SEM image of particles prepared by mechanical grinding using walleye gelatin as gelatin.
  • FIG. 17 is a graph showing the adhesive strength of cod gelatin derivative particles prepared by mechanical grinding.
  • the gelatin derivative includes a structure represented by the following formula (1).
  • GltnNH-CHR 1 R 2 (1)
  • “Gltn” is a gelatin residue
  • R 1 is an alkyl group having 1 to 17 carbon atoms
  • R 2 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 17 carbon atoms.
  • N is mainly derived from the ⁇ -amino group of lysine (Lys) in gelatin.
  • R 2 is a hydrogen atom.
  • the NH structure of the formula (1) can be detected, for example, by a band around 3300 cm ⁇ 1 in the FT-IR spectrum.
  • the FT-IR spectrum of the gelatin derivative of Example 7 is shown in FIG.
  • R 2 is an alkyl group having 1 to 17 carbon atoms, it may be the same as or different from R 1 .
  • the alkyl group may have a branch.
  • examples of the alkyl group include methyl group, ethyl group, propyl group, butyl group, hexyl group, octyl group (or capryl group), nonyl group (or pelargolyl group), decyl group, dodecyl group (or lauryl group), A tetradecyl group (or myristyl group) etc. are mentioned.
  • R 1 is a linear alkyl group having 1 to 11 carbon atoms, more preferably 1 to 9 carbon atoms
  • R 2 is a hydrogen atom.
  • the derivatization ratio in the gelatin derivative is 20 to 80 mole%, preferably 30 to 70 mole%, in terms of mole% of the alkyl group-bound imino group to the amount of amino groups in the raw material gelatin.
  • the imino group / amino group (molar ratio) in the obtained gelatin derivative is 20/80 to 80/20, preferably 30/70 to 70/30.
  • the derivatization ratio is determined by quantifying the amount of amino group in the raw material gelatin and the amount of amino group after binding the alkyl group by the 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid method (TNBS method), or NMR It can obtain
  • TNBS method 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid method
  • the raw material gelatin may be any of natural origin, gelatin obtained by synthesis, fermentation or genetic recombination, preferably animal origin such as pig and cow, and fish origin gelatin such as walleye pollack.
  • the acid-treated gelatin, the alkali-treated gelatin, and the recombinant gelatin may be used, but the alkali-treated gelatin is preferable, and the reduced endotoxin gelatin is more preferable.
  • the weight average molecular weight (Mw) of the gelatin is preferably 30,000 to 150,000, and more preferably 50,000 to 120,000.
  • the molecular weight can be measured by gel permeation chromatography (GPC) according to a conventional method.
  • FIG. 1 is a SEM image of an example (Example 7) of particles in the present invention. It can be seen that the particles are approximately spherical.
  • the particle diameter is approximately on the order of microns, that is, 1 to 1000 ⁇ m, and most of them are 1 to 50 ⁇ m, and the mode particle diameter (mode diameter) is 10 to 20 ⁇ m.
  • a predetermined particle size range can be selected by sieving or the like according to the application site of particles and application means. From the viewpoint of delivery and handling, the thickness is preferably 1 to 200 ⁇ m, and more preferably 1 to 50 ⁇ m.
  • the particle diameter is determined by SEM image analysis, but can also be determined by a laser diffraction method or the like.
  • the particles can be obtained by thermally drying a gelatin derivative solution, or after mechanical crushing of a solid gelatin derivative after drying, and then thermally crosslinking, and a spray drying method is preferred.
  • a spray drying method As described in Non-Patent Document 1, after gelatin aqueous solution is dropped into olive oil and gelled as water-in-oil emulsion, the obtained particles are added to glutaraldehyde aqueous solution and chemically cross-linked
  • the spray drying method since the dispersion medium and the curing agent are not used, there is no need to be concerned about the toxicity due to their residual or decomposition, and washing of the dispersion medium is also unnecessary. Is preferable in that there is no concern of aggregation between particles during drying.
  • Cross-linking of the gelatin derivative can be confirmed by dispersing the particles in water and observing that they are not dissolved by visual observation or by phase contrast microscope.
  • 6a-e particles obtained by spray drying (Example 7) are placed in a vacuum drier and treated under reduced pressure ( ⁇ 10 Pa) at 150 ° C. with heat treatment times varied from 20 minutes to 3 hours. It is the microscope picture which disperse
  • FIG. 8 shows the amount of amino groups consumed by cross-linking was determined by plotting the amount of amino groups consumed by crosslinking by measuring the amount of residual amino groups when particles obtained by spray-drying from raw material gelatin were heat-treated at 150 ° C. It is a graph. As can be seen from the figure, at 150 ° C., the crosslinking proceeded rapidly to 3 hours and gradually became gradual, almost reaching a level of about 40% of the crosslinkable amino group amount in 6 hours.
  • the wound dressing of the present invention may contain various additives in amounts that do not inhibit the object of the present invention.
  • the additives include coloring agents and preservatives.
  • various drugs may be included, and examples thereof include antithrombotic drugs, antibiotics, various growth factors, and the like.
  • the additives and agents may be supported or bound to the particles.
  • the method for preparing a wound dressing includes [1] gelatin derivative preparation step, [2] granulation step by mechanically crushing solid gelatin derivative after spray drying or drying, and [3] heat treatment step. Each step will be described below.
  • Step of Preparing Gelatin Derivative Preparation of Raw Material Gelatin Aqueous Solution
  • the gelatin of the starting material is dissolved in water or an aqueous solvent by heating at 40 to 90 ° C. in an amount of 5 to 50 wt / v%.
  • water ultrapure water, deionized water, or distilled water can be used.
  • aqueous solvent a mixture of water and a water-soluble organic solvent is used.
  • alcohols having 1 to 3 carbon atoms, esters and the like can be used, and ethanol is preferably used.
  • a derivatization agent having an alkyl group to be introduced is added to the gelatin solution obtained in step (1), and reaction is performed by stirring for a predetermined time.
  • the derivatizing agent an aldehyde or ketone having the alkyl group such as dodecanal, tetradecanal, decylethyl ketone is used.
  • the reaction temperature is 30 to 80 ° C.
  • the reaction time is 0.5 to 12 hours
  • the amount of aldehyde used is 1 to 4 times the stoichiometric amount corresponding to the desired derivatization rate. More preferably, it is 1 to 2 times.
  • the Schiff base is then reduced to the structure of formula (1) above.
  • known reducing agents such as sodium cyanoborohydride (NaBH 3 CN), sodium triacetoxyborohydride (NaBH (OAc) 3 ), 2-picoline borane, pyridine borane and the like can be used. Of these, 2-picoline borane is preferred. Picolinborane is stable, and it is possible to perform reductive amination reaction of aldehyde or ketone in an aqueous solvent in one step (one pot). Also, yields of 80 to 90% can be achieved.
  • the amount of 2-picoline borane used is preferably 1 to 3 equivalents based on the equivalent of the derivatized drug.
  • the order of adding the reducing agent and the aldehyde or the like may be arbitrary, and either may be added to the gelatin solution first or simultaneously.
  • step (3) Purification A large excess of a poor solvent such as cold ethanol is added to the reaction solution obtained in step (2), or the reaction solution is added to cold ethanol to precipitate a gelatin derivative. The precipitate is filtered off and washed with ethanol or the like to obtain the final product.
  • a poor solvent such as cold ethanol
  • Granulation process ⁇ spray dry method> It has been found that particle shape, particle size etc. depend on many variable factors such as gas flow rate. Mainly from the viewpoint of handleability as a wound covering material, in addition to the molecular weight of the raw material gelatin already mentioned, the concentration of gelatin derivative, and drying so that as many particles of several tens of ⁇ order as large as possible can be obtained in the above particle size range. The temperature, gas flow rate, solution flow rate, etc. were examined. Each factor is described below.
  • the spray dryer may be any of a disc type, a nozzle type, a cyclone collection type, a filter collection type, and the like.
  • Spray drying is performed by spraying a solution of a gelatin derivative in water and a mixed solvent of water and an organic solvent compatible with water under an inert gas such as nitrogen.
  • organic solvent alcohols having 1 to 3 carbon atoms, esters and the like can be used, and ethanol is preferably used.
  • the mixing ratio (volume) of water: organic solvent is 10: 0 to 3: 7, preferably 6: 4 to 4: 6.
  • an aqueous solution of gelatin is used, but in the case of a gelatin derivative according to the present invention, it is difficult to form particles in the aqueous solution, and sufficient adhesiveness can not be obtained.
  • the alkyl group in the gelatin derivative is accumulated at the gas-liquid interface by increasing the evaporation rate of the solvent using an organic solvent, so that the alkyl group appears on the surface of the sphere it is conceivable that.
  • the solution is added with water to a gelatin derivative and dissolved with gentle stirring at 50 to 90 ° C.
  • An organic solvent is added to the obtained aqueous solution to a concentration of 1 to 7 w / v%, preferably 3 to 5 w It is assumed that / v%. If the concentration in the solution is less than the lower limit, it is difficult to obtain the particles, and even if the upper limit is exceeded, the particles adhere to the glass wall of the spray dryer before reaching the recovery container and are collected according to the concentration. The improvement of the rate can not be obtained.
  • the drying temperature is 140 ° C to 220 ° C, preferably 160 to 200 ° C.
  • the particle diameter tends to be less than 1 ⁇ m, and when the temperature exceeds the upper limit, the particles tend to aggregate.
  • the flow rate of the inert gas is 400 to 500 L / h, preferably 400 to 480 L / h. Also, the flow rate of the gelatin derivative solution is 300 to 500 mL / h, preferably 350 to 450 mL / h.
  • the purified gelatin derivative is dissolved in ultrapure water to form a solution, dried at 40 to 60 ° C. to form a solid, and then ground using a pulverizer such as a roller mill, jet mill, hammer mill or the like.
  • a dispersion medium such as polyethylene glycol may be added in the solution state.
  • [3] Heat Treatment Step The particles obtained by the spray dry or mechanical pulverization method are heat treated to crosslink the gelatin derivative.
  • the heating temperature and time need to be defined and adjusted in accordance with the molecular weight of the raw material gelatin, the degree of derivatization, and the desired degree of crosslinking. For example, when the raw material gelatin molecular weight (Mw) is about 100,000, heat at 140 to 160 ° C. for at least 3 hours.
  • the wound dressing of the present invention is applied to incisions, skin wounds, etc. in various surgery such as wound surgery after respiratory surgery, especially after lung cancer surgery, digestive surgery, cardiovascular surgery, oral surgery, digestive medicine, etc. be able to.
  • ESD Evolved stent
  • a balloon a balloon
  • an endoscope Element-like device
  • the application amount can be appropriately adjusted depending on the application site and wound.
  • adhesion strength to tissues the application amount of particles on pig stomach inner wall tissue is changed by 1.6 to 32 mg / cm 2 in the same manner as used in the examples described later.
  • the measurement showed that it is preferable to be 10 to 20 mg / cm 2 per unit area of tissue (FIG. 2).
  • gelatin derivatives shown in Table 1 were prepared.
  • the eggplant-type flask was taken out from the oil bath and ethanol was distilled off at 40 ° C. by an evaporator.
  • the resulting reaction solution was dropped and reprecipitated into 1 L of ethanol in a beaker immersed in an ice bath. After stirring for 1 hour, after leaving still for 1 hour in a freezer, it filtered with a glass filter. The filtration residue was again dropped into 1 L of ethanol in a beaker to be reprecipitated, and after stirring for 1 hour, it was allowed to stand in a freezer for 1 hour. After filtering again with a glass filter, the filter residue was dried overnight or more in a vacuum drier to obtain an octyl group-introduced gelatin derivative in 83% yield.
  • the introduction rate of octyl group in the obtained gelatin derivative was determined by the following method.
  • Raw material gelatin and gelatin derivative were respectively dissolved in water / DMSO mixed solvent (volume ratio 1: 1, the same applies hereinafter) at 0.1 w / v%, and 100 ⁇ L was dispensed to a 48-well plate.
  • 100 ⁇ L of 0.1 v / v% of triethylamine (TEA, manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) dissolved in a mixed solvent of water and DMSO was added thereto, and the mixture was stirred with a plate shaker at 400 rpm for 1 minute.
  • TSA triethylamine
  • TNBS 0.1 w / v% trinitrobenzene sulfonic acid
  • a water / DMSO mixed solvent 100 ⁇ L was added, and the mixture was stirred at 400 rpm for 1 minute with a plate shaker.
  • the plate was shielded from light by aluminum foil and allowed to stand in a 37 ° C. incubator for 2 hours, then removed from the incubator, 50 ⁇ L of 6N HCl was added to stop the reaction, and the plate shaker was stirred at 400 rpm for 1 minute.
  • the 13 C-NMR and FT-IR of the obtained gelatin derivative were measured.
  • the 13 C-NMR was measured at 50 ° C. by dissolving the gelatin derivative and the raw material gelatin in heavy water (containing sodium 3- (trimethylsilyl) -1-propanesulfonate as internal standard) at 20 wt% each.
  • FIG. 3 shows the obtained 13 C-NMR spectrum. From the fact that a peak derived from primary carbon was observed at around 17-17.5 ppm in the gelatin derivative, it was confirmed that an octyl group was introduced into gelatin.
  • the FT-IR measurement was carried out by placing the gelatin derivative powder directly on the sample table.
  • FIG. 4 shows the 2500 to 3500 cm ⁇ 1 portion of the FT-IR spectrum. A peak derived from stretching vibration of methyl group (2868 cm -1 ), a peak derived from stretching vibration of methylene group (2929 cm -1 ) and a peak derived from N-H stretching vibration (3299 cm -1
  • gelatin derivatives were prepared in the same manner as described above, except that octanal was replaced with ethanal, butanal, hexanal or undecanal in an amount according to the target derivatization ratio. The yields were all 80 to 90%.
  • "75C8" represents a gelatin substituted by a C8 aldehyde at a substitution rate of 75% (in Formula (1), R 1 is a heptyl group and R 2 is a hydrogen atom).
  • Spray drying and heat treatment (150 ° C., 3 hours) were performed under the same conditions for gelatin derivatives 1 to 6 and 8 and the raw material gelatin to make each particle.
  • grains obtained from the gelatin derivative 7 is shown in FIG.
  • the particles were substantially spherical, and as a result of image analysis, the diameter was distributed in the range of about 1 ⁇ m to 1000 ⁇ m, and the mode particle diameter was 10 to 20 ⁇ m.
  • the adhesion test was performed using the inner wall tissue of pig stomach (Shibaura organ). The test method was performed in accordance with the standards of the American Society for Testing Materials (ASTM F-2258-05). The pig stomach was opened and the mucosal layer was removed. At this time, physiological saline was injected into the submucosal tissue, and the raised portion was removed to remove only the mucosal layer in a state where the submucosal tissue was rubbed to a certain extent. The obtained tissue was cut into 2.5 cm square tissue pieces, and fixed to each of the upper and lower jigs of the test apparatus using an instant adhesive.
  • the temperature of pig stomach inner wall tissue was maintained at 37 ° C. by using a hot plate. Excess water on the surface of the tissue was removed with a Kimwipe, and 100 mg (16 mg / cm 2 ) of gelatin particles were placed on the tissue. After pressure bonding was performed at 80 kPa for 3 minutes using an upper jig, adhesion was measured by pulling up to the upper portion.
  • Comparative Example 1 particles obtained from raw material gelatin were used, and as Comparative Example 2, NEOVEIL (trademark) was used. The control is a blank value without any sample. The results are shown in Table 2 and FIG.
  • ⁇ Hemostatic effect> One mL of whole blood collected from a rat (Wistar, 6 weeks old, female) was placed in a 5 mL vial, 50 mg of Example 7 (75C8) particles were added thereto, mixed gently, and allowed to stand. Whole blood without any addition was used as a control. Three minutes after mixing, blood coagulation was observed in the sample containing 75C8 particles, while the control did not clot. From this, it was shown that the gelatin derivative particles in the present invention have a hemostatic effect.
  • Comparative Example 1 was a material having a contact angle of 46 degrees and a hydrophilic surface, whereas in the gelatin particles of the example, the chain length of the alkyl group to be modified was increased. An increase in the contact angle was confirmed. In particular, in C6 to C12, a hydrophobic surface with a contact angle of more than 100 degrees was observed. That is, it became clear that particles having a more hydrophobic surface can be produced by modifying with a more hydrophobic group.
  • RAW264 cells that are mouse-derived macrophage-like cells.
  • RAW264 cells are seeded at a density of 6 ⁇ 10 4 cells / cm 2 in a 96-well plate, and incubated at 37 ° C., 5% CO 2 in RPMI 1640 medium (10% fetal bovine serum, 1% nonessential amino acids, 1% antibiotics) Culture for 24 hours.
  • Example 1 (C2), Example 2 (C4), Example 3 (C6), Example dispersed in the above medium at a concentration of 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10 mg / mL 100 ⁇ L of each particle of 6 (C8), Example 8 (C12) and Comparative Example 1 (ORG) was added to the cells and cultured for 24 hours. Thereafter, the number of cells was quantified by a cell number quantification kit (WST-8, Dojin Kagaku). The number of cells of each sample was shown in the graph (FIG. 11) when the number of cells in the wells to which no particles were added was 100%.
  • WST-8 Dojin Kagaku
  • Example 1 In the samples to which the particles of Example 1 (C2), Example 2 (C4), Example 3 (C6), Example 6 (C8) and Comparative Example 1 (ORG) were added, high cells were observed at all concentration ranges. The number is shown and high cell compatibility was confirmed. On the other hand, in the particles of Example 8 (C12), a decrease in cell number was confirmed at a concentration of 2.5 mg / mL or more. From this it can be said that it is preferable to apply particles with a long alkyl chain to the wound at a relatively low concentration.
  • Caco-2 cells are seeded at a density of 6 ⁇ 10 3 cells / cm 2 on the film after sterilizing the film by UV irradiation for 1 hour, and DMEM medium (20% fetal bovine serum, 1% non-essential amino acid, 1%) The cells were cultured in an incubator at 37 ° C., 5% CO 2 for 24 hours. Thereafter, the number of cells was quantified by a cell number quantification kit (WST-8, Dojin Kagaku). The results are shown in FIG.
  • the remaining area of the wound was significantly large in any of the examples except that in Example 8 (C12), closure of the wound was almost equal to that of CTR.
  • the in wound healing if wound closure occurs rapidly before the end of the inflammatory reaction, it is preferable that the remaining area of the wound be large, as it causes scar contracture that also causes stenosis. By applying the particles of the present invention, it has been shown that the residual area is increased and scar contracture is suppressed. On the 14th day, closure of the wound was confirmed in all samples.
  • the inflammation level was evaluated by performing tissue section observation after 7 days. Rats were sacrificed by using an excess amount of somnopentyl and wound tissue was collected. After paraffin embedding, thin sections were prepared and stained by staining for ⁇ -smooth muscle actin ( ⁇ -SMA), which is a protein expressed by inflammation. The quantification of the area of the ⁇ -SMA positive portion was performed using image processing software (ImageJ). As shown in the lower graph of FIG. 15, the particles of any of the examples suppressed the expression of ⁇ -SMA more than CTR, including Example 8 (C12), which was almost the same as CTR for closing the wound. It became clear that From these results, it is expected that the inflammatory reaction can be suppressed and wound healing can be promoted by using the particles of the present invention as a wound dressing.
  • ⁇ -smooth muscle actin ⁇ -smooth muscle actin
  • the solid gelatin derivative after air drying was repeatedly ground 3 times for 1 minute using a grinder (Wonder Crusher).
  • thermal crosslinking was performed at 150 ° C. for 3 hours under reduced pressure.
  • the obtained particles were particles having a particle diameter of about 20 to 50 ⁇ m as shown in the SEM image (FIG. 16). There was no significant difference in particle size depending on the presence or absence of PEG.
  • the adhesion strength to the pig stomach inner wall tissue was measured in the same manner as in Example 1 and the like. The results are shown in FIG.
  • the results of the adhesion test revealed that cod gelatin has the same adhesion strength as pig gelatin (15 to 20 kPa). In addition, it was found that particles excellent in adhesive strength can be obtained by drying and pulverizing treatment without using a dispersion medium.
  • the wound covering material of the present invention is very useful for application to wounds, blood vessel anastomoses and the like after surgical operations such as endoscopic mucoablation.

Abstract

架橋されたゼラチン誘導体を含む粒子を含み、　該ゼラチン誘導体は下記式（１）で示される構造を含み、　ＧｌｔｎＮＨ－ＣＨＲ１Ｒ２　（１） 上式において、Ｇｌｔｎはゼラチン残基であり、Ｒ１は炭素数１～１７のアルキル基であり、Ｒ２は水素原子又は炭素数１～１７のアルキル基であり、 該粒子の粒子径は１～１０００μｍである、 創傷被覆材。

Description

架橋ゼラチン誘導体粒子を含む創傷被覆材
　本発明は創傷被覆材に関し、詳細には架橋されたゼラチン誘導体の粒子を含む創傷被覆材に関する。
　創傷被覆材は、「創傷被覆・保護材：滲出液の吸収、出血又は体液損失の抑制、及び擦過、摩擦、乾燥、汚染からの創傷の保護のために用いる親水性ポリマー製の局所管理創傷被覆・保護材」と定義されている（薬事法、医療機器クラス分類）。創傷被覆材としては、ガーゼ、ポリウレタンフォーム、ハイドロゲル等があり、これらはいずれも布帛形態である。
　創傷被覆材は、胃や大腸等の早期がんの治療法である内視鏡的粘膜下層剥離術（ＥＳＤ：Endoscopic Submucosal Dissection）においても使用され始めている。胃や大腸等の壁は粘膜層、粘膜下層、筋層という3つの層からできており、癌は最も内側の層である粘膜層から発生する。ＥＳＤでは、胃カメラや大腸カメラで消化管の内腔から粘膜層を含めた粘膜下層までを剥離して、病変を一括切除する。切除後の組織は、そのままにしておくと収縮して癒着等を起こし、消化管閉塞等の二次障害を起こす。そこで、該組織を生分解性の創傷被覆材で覆う。
　ＥＳＤ用の創傷被覆材には形状付与性、即ち傷口の形状に沿う柔軟性に加え、生分解性であること等が要求される。現在使用されているのは、ポリグリコール酸不織布（グンゼ（株）製、ＮＥＯＶＥＩＬ（登録商標））である。該ポリグリコール酸不織布は生分解性等に優れるが、組織への接着性が無いので、フィブリン系の接着剤によって該不織布を覆って固定しなければならない。しかし、該接着剤は高価であり、血液製剤であるため、汚染の危険性を完全に取り除くことができない。また、該不織布は適用部位で展開し難く、複雑な形状の部位での形状付与性に欠ける。さらに、生分解物であるポリグリコール酸オリゴマーが組織に炎症を起こす懸念もある。
　ゼラチンは生体適合性及び生分解性に優れることから種々の医療用途に使用されている。その粒子製剤としては、経動脈的塞栓療法の塞栓剤（特許文献１）、薬剤の徐放性担体（非特許文献１）が知られている。また、化学的に修飾されたゼラチンも医療用に開発されている。例えば、ゼラチンにイミノ基を介して疎水性基が結合され、湿潤組織に高い接着性を示す組織接着剤が知られている（特許文献２）。
特開２０１０－８３７８８号公報 特許第５９９５１２８号公報
Biometerials第21巻、第４８９－４９９頁、２０００年
　本発明は、創傷部位の形状に合わせた適用が可能であり、湿潤部位への高い接着性を示す、生分解性の創傷被覆材を提供することを目的とする。
　即ち、本発明は下記のものである：
　架橋されたゼラチン誘導体からなる粒子を含み、
　該ゼラチン誘導体は下記式（１）で示される構造を含み、
 
ＧｌｔｎＮＨ－ＣＨＲ１Ｒ２　　　　　　　　（１）
 
上式において、Ｇｌｔｎはゼラチン残基であり、Ｒ１は炭素数１～１７のアルキル基であり、Ｒ２は水素原子又は炭素数１～１７のアルキル基であり、
該粒子の粒子径は１～１０００μｍである、
創傷被覆材。
　上記創傷被覆材は、ミクロンオーダーの粒子を含むので、噴霧等によって複雑な形状の創傷であっても、該形状に合わせて適用することができる。また、該粒子はアルキル基を有しており、湿潤組織にも高い接着性を有する。さらに、該粒子は、分散媒、及び架橋剤を使用せずに作ることもでき、これらの残留または分解による組織への悪影響を懸念することなく、組織に適用することができる。
図１は、ゼラチン誘導体粒子の電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像である。 図２は、ゼラチン誘導体粒子の適用量による接着強度の変化を示すグラフである。 図３は、ゼラチン誘導体の１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルである。 図４は、ゼラチン誘導体の２５００～３５００ｃｍ－１のＦＴ－ＩＲスペクトルである。 図５は、スプレードライ後熱処理前の、ゼラチン誘導体粒子のＳＥＭ画像である。 図６は、熱処理時間を２０分～３時間まで変えて、該熱処理直後の粒子を水に分散して観察した位相差顕微鏡写真である。 図７は、熱処理時間による粒子の生理食塩水への溶解性をコラゲナーゼの存在下での加速試験により調べたグラフである。 図８は、原料ゼラチンからスプレードライにより得られた粒子を１５０℃で熱処理したときの、消費されたアミノ基量を時間に対してプロットしたグラフである。 図９は、ゼラチン誘導体粒子の接着強度を示すグラフである。 図１０は、ゼラチン（未処理）及びゼラチン誘導体（疎水化ゼラチン）粒子の水に対する接触角を示すグラフである。 図１１は、ゼラチン誘導体粒子存在下でのＲＡＷ２６４細胞の生存率を示すグラフである。 図１２は、ゼラチン誘導体粒子からなるフィルム上でのＣａｃｏ－２細胞の増殖挙動を示すグラフである。 図１３は、ゼラチン誘導体粒子存在下での、ＲＡＷ２６４細胞のＩＬ－６産出量を示すグラフである 図１４は、ラットの皮膚創傷上にゼラチン誘導体粒子を施与したときの創傷治癒過程の写真（上段）と創傷残存面積を示すグラフである（下段）。 図１５は、ラットの皮膚創傷上にゼラチン誘導体粒子を施与して７日目の組織におけるα－平滑筋アクチン陽性部を示す写真（上段）と陽性面積を示すグラフ（下段）である。 図１６は、ゼラチンとしてスケトウダラゼラチンを用い、機械的粉砕法で調製した粒子のＳＥＭ画像である。 図１７は、機械的粉砕法で調製したタラゼラチン誘導体粒子の接着強度を示すグラフである。
＜ゼラチン誘導体＞
　本発明において、ゼラチン誘導体は下記式（１）で示される構造を含む。
 
ＧｌｔｎＮＨ－ＣＨＲ１Ｒ２　　　　　　　　（１）
 
上式において、「Ｇｌｔｎ」はゼラチン残基であり、Ｒ１は炭素数１～１７のアルキル基であり、Ｒ２は水素原子又は炭素数１～１７のアルキル基である。Ｎは、ゼラチン中の主としてリジン（Ｌｙｓ）のε－アミノ基由来である。好ましくは、Ｒ２が水素原子である。該式（１）のＮＨ構造は、例えばＦＴ‐ＩＲスペクトルにおいて３３００ｃｍ－１付近のバンドにより検出することができる。実施例７のゼラチン誘導体のＦＴ‐ＩＲスペクトルを図４に示す。
　Ｒ２が炭素数１～１７のアルキル基である場合、Ｒ１と同じでも互いに異なっていてもよい。該アルキル基は、分岐を有していてもよい。該アルキル基の例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ヘキシル基、オクチル基（又はカプリル基）、ノニル基（又はペラルゴルニル基）、デシル基、ドデジシル基（又はラウリル基）、テトラデシル基（又はミリスチル基）等が挙げられる。好ましくは、Ｒ１が炭素数１～１１、より好ましくは炭素数１～９の直鎖アルキル基であり、Ｒ２が水素原子である。
　該ゼラチン誘導体中の誘導化率は、アルキル基が結合されたイミノ基の、原料ゼラチン中のアミノ基量に対するモル％で、２０～８０モル％、好ましくは３０～７０モル％である。言い換えれば、得られたゼラチン誘導体におけるイミノ基／アミノ基（モル比）は、２０／８０～８０／２０であり、好ましくは３０／７０～７０／３０である。該誘導化率は、原料ゼラチン中のアミノ基と、アルキル基を結合した後のアミノ基量を、２，４，６-トリニトロベンゼンスルホン酸法（ＴＮＢＳ法）によって定量することで、或いは、ＮＭＲ等によりアルキル基の同定及び定量を行うことによって求めることができる。
　原料ゼラチンは、天然由来、合成、発酵又は遺伝子組換えにより得られるゼラチンのいずれであってもよく、好ましくはブタ、ウシ等の動物由来、スケトウダラ等の魚由来のゼラチンが使用される。また、酸処理ゼラチン、アルカリ処理ゼラチン、遺伝子組み換えゼラチンのいずれであってもよいが、好ましくはアルカリ処理ゼラチンであり、より好ましくは低エンドトキシン化ゼラチンである。また、該ゼラチンの分子量の範囲は、重量平均分子量（Ｍｗ）が３０，０００～１５０，０００が好ましく、５０，０００～１２０，０００であることがより好ましい。該分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により定法に従い測定することができる。
＜粒子＞
　図１は本発明における粒子の一例（実施例７）のＳＥＭ画像である。粒子が略真球状であることが分かる。粒子径は、略ミクロンオーダー、即ち１～１０００μｍであり、１～５０μｍのものが多く、最頻粒子径（モード径）は１０～２０μｍである。粒子の適用箇所、適用手段に応じて、篩分け等により所定の粒径範囲を選択することができる。デリバリ性及び取り扱い性の観点からは、１～２００μｍであることが好ましく、１～５０μｍであることがより好ましい。本発明において粒子径は、ＳＥＭ画像解析により求めたが、レーザー回折法等によっても求めることができる。
　粒子は、ゼラチン誘導体溶液をスプレードライした後、又は乾燥後に個体状のゼラチン誘導体を機械的に粉砕した後、熱架橋することによって得ることができ、スプレードライ法が好ましい。上記非特許文献１にあるように、ゼラチン水溶液をオリーブ油中に滴下して、油中水滴エマルジョンとしてゲル化した後、得られた粒子をグルタルアルデヒド水溶液中に加えて化学的に架橋する方法を用いることもできるが、スプレードライ法によれば、分散媒や硬化剤を使用しないので、これらの残留、または分解による毒性を懸念する必要が無い点、また分散媒の洗浄も不要であり、洗浄後の乾燥時における粒子間の凝集の懸念も無い点で、好ましい。
　ゼラチン誘導体が架橋されていることは、粒子を水に分散させて溶解しないことを目視または位相差顕微鏡で観察することで確認できる。図６a～eは、スプレードライにより得られた粒子（実施例７）を、減圧乾燥器に入れ、減圧下（＜１０Pa）、１５０℃で、熱処理時間を２０分～３時間まで変えて、処理直後の粒子を水に分散して位相差顕微鏡で観察した顕微鏡写真である。熱処理無し（図６a）、処理時間２０分（図６ｂ）では粒子が水に溶解し、１時間（図６ｃ）では一部不溶解の粒子が確認され、２時間（図６ｄ）で多くの粒子が確認され、３時間（図６e）では２時間処理より若干多くの粒子が確認された。
　上記１時間、３時間、又は６時間熱処理した粒子の体液への溶解性をコラゲナーゼの存在下での加速試験により調べた。各粒子２０ｍｇを、５μｇ／ｍＬのコラゲナーゼ／ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）溶液に分散し、1、２、４時間後に遠心回収し、乾燥後に重量を測定した。結果を図７に示す。同グラフに示すように、３時間の熱処理によって、創傷被覆材として適用した際に体液に溶解することなく、必要とされる初期の体液吸収を示すことができる。また、熱処理時間の増加と伴に溶解時間が長くなり、熱処理の時間により体液への溶解性を制御できることが分かった。
　架橋度については、誘導化率に依存して架橋反応に関与できるアミノ基の数が異なり、該アミノ基が全て反応した状態として定義される架橋度１００％が異なるため、その範囲を限定することはできない。図8は、原料ゼラチンからスプレードライにより得られた粒子を１５０℃で熱処理したときの残留アミノ基量をＴＮＢＳ法で測定し、架橋により消費されたアミノ基量を求め、時間に対してプロットしたグラフである。同図から分かるように、１５０℃では、架橋は３時間迄に急速に進み、徐々に緩やかとなって、６時間で架橋可能なアミノ基量の４０％程度でほぼ頭打ちとなった。ゼラチン誘導体の場合、誘導化されずに残留しているアミノ基量がより少ないので、より反応性が低いと考えられ、３時間の熱処理により、該アミノ基量の１０～３０％程度で頭打ちになるものと考えられる。しかし、上記実施例７の粒子のように誘導化率が７５％と高くても、３時間の熱処理によって、創傷被覆材としての使用には問題の無い耐溶解性を有し、これは疎水性のアルキル基の存在によるものと考えられる。
＜添加剤等＞
　本発明の創傷被覆材は、各種添加剤を本発明の目的を阻害しない量で含んでよい。該添加剤としては、着色料、保存剤がある。また、各種薬剤を含んでもよく、例えば抗血栓薬、抗生物質、各種成長因子等が挙げられる。添加剤、及び薬剤は、粒子に担持させ、或いは結合させてもよい。
＜創傷被覆材の調製法＞
　創傷被覆材の調製方法は、［１］ゼラチン誘導体調製工程、［２］スプレードライ又は乾燥後に個体状のゼラチン誘導体を機械的に粉砕することによる造粒工程、及び［３］熱処理工程を含む。以下、各工程について説明する。
［１］ゼラチン誘導体調製工程
（１）原料ゼラチン水性溶液の調製
　出発材料のゼラチンを５～５０ｗｔ／ｖ％となる量で、４０～９０℃で加熱して水又は水性溶媒に溶解する。水としては、超純水、脱イオン水、蒸留水を用いることができる。水性溶媒としては、水と水溶性有機溶媒との混合物を用いる。水性溶媒としては、炭素数１～３のアルコール、エステル等を用いることができ、好ましくはエタノールを用いる。
（２）誘導体化
　工程（１）で得られたゼラチン溶液に、導入するアルキル基を有する誘導体化薬剤を添加し、所定時間撹拌して反応させる。該誘導体化薬剤としては、該アルキル基を有するアルデヒドもしくはケトン、例えばドデカナール、テトラデカナール、デシルエチルケトンが使用される。反応温度は３０～８０℃、反応時間は０．５～１２時間であり、通常、撹拌するだけでゼラチンのアミノ基にシッフ塩基（～Ｎ＝ＣＲ１Ｒ２）を介してアルキル基が結合されたゼラチンを得ることができる。アルデヒドの使用量は、所望の誘導化率に相当する化学量論量に対して１～４倍とする。より好ましくは、１～２倍とする。
　次いで、該シッフ塩基を還元して上記式（１）の構造とする。還元剤としてはシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３）、２－ピコリンボラン、ピリジンボラン等の、公知の還元剤を使用することができる。これらのうち、２－ピコリンボランが好ましい。ピコリンボランは安定性があり、水性溶媒中でアルデヒドもしくはケトンの還元アミノ化反応を一段（ワンポット）で行うことが可能である。また、８０～９０％の収率を達成することができる。２－ピコリンボランの使用量は、誘導体化薬剤の当量に対して１～３当量であることが好ましい。なお、還元剤と、アルデヒド等を添加する順序は任意でよく、いずれを先にゼラチン溶液に添加しても、同時に添加しても構わない。
（３）精製
　工程（２）で得られた反応溶液に、大過剰の貧溶媒、例えば冷エタノールを加えて、或いは、該反応溶液を冷エタノールに加えて、ゼラチン誘導体を沈殿させる。該沈殿を濾別した後、エタノール等で洗浄して、最終生成物を得る。
［２］造粒工程
＜スプレードライ法＞
　粒子の形状、粒子径等は、ガスのフロー速度等多くの変量因子に依存することが見出された。主として創傷被覆材としての取扱い性の観点から、上述の粒径範囲においてできるだけ大きい、数十μオーダーの粒子を多く得ることができるよう、既に述べた原料ゼラチンの分子量に加え、ゼラチン誘導体濃度、乾燥温度、ガスのフロー速度、溶液のフロー速度等を検討した。以下、各因子について述べる。
　スプレードライヤーは、ディスク式、ノズル式、サイクロン捕集式、フィルタ捕集式等のいずれであってもよい。
　スプレードライは、ゼラチン誘導体を、水及び水と相溶性の有機溶媒との混合溶媒に溶解した溶液を、窒素等の不活性ガス下で噴霧して行う。有機溶媒としては、炭素数１～３のアルコール、エステル等を用いることができ、好ましくはエタノールが使用される。水：有機溶媒の混合割合（体積）は、１０：０～３：７であり、６：４～４：６が好ましい。特許文献１に記載の方法ではゼラチン水溶液が使用されているが、本発明におけるゼラチン誘導体の場合、水溶液では粒子となり難く、十分な接着性も得られない。種々検討した結果、上記混合溶媒とすることによって、組織への接着力に優れた粒子が得られることが分かった。本発明を限定する趣旨ではないが、有機溶媒を用いて溶媒の蒸発速度を高めることによって、ゼラチン誘導体中のアルキル基を気液界面に集積させたために、該アルキル基が球の表面に現れるものと考えられる。
　該溶液は、ゼラチン誘導体に水を加えて、５０～９０℃で穏やかに撹拌しながら溶解し、得られた水溶液に有機溶媒を加えて、濃度を１～７ｗ／ｖ％、好ましくは３～５ｗ／ｖ％とする。溶液中の濃度が前記下限値未満では粒子を得ることが困難であり、前記上限値を超えても、粒子が回収容器に到達する前にスプレードライヤーのガラス壁に付着して濃度に見合った収率の向上が得られない。
　乾燥温度は、１４０℃～２２０℃、好ましくは１６０～２００℃である。温度が前記下限値未満では粒子径が１μｍ未満となり易く、前記上限値を超えると粒子が凝集する傾向がある。
　不活性ガスの流速は、４００～５００L／ｈ、好ましくは４００～４８０L／ｈである。また、ゼラチン誘導体溶液の流速は、３００～５００ｍL／ｈ、好ましくは３５０～４５０ｍL／ｈである。
＜機械的粉砕法＞
　精製したゼラチン誘導体を、超純水に溶解して溶液状にし、４０～６０℃で乾燥させることによって固体状にした後、微粉砕機、例えばローラーミル、ジェットミル、ハンマーミル等によって粉砕する。溶液状にする際に、ポリエチレングリコール等の分散媒を添加してもよい。
［３］熱処理工程
　スプレードライ又は機械的粉砕法により得られた粒子を、加熱処理してゼラチン誘導体を架橋する。加熱温度及び時間は、原料ゼラチンの分子量、誘導化率、目的とする架橋度に応じて定義調整する必要がある。例えば原料ゼラチン分子量（Ｍｗ）が約１００,０００の場合、１４０～１６０℃で少なくとも３時間加熱する。
　熱処理後に、粒子の洗浄、乾燥及び篩分け、及び薬剤を担持等させる処置等を行ってもよい。
＜組織への適用方法＞
　本発明の創傷被覆材は、呼吸器外科、なかでも肺がん手術後の創部、消化器外科、心臓血管外科、口腔外科、消化器内科等、種々の外科手術における切開口、皮膚創傷等に適用することができる。ＥＳＤの場合、止血鉗子、ステント、バルーン、内視鏡等によって、ドライの状態で適用することができる。適用量は適用部位、創傷に依存して適宜調整することができる。組織への接着強度の観点からは、後述する実施例において用いたのと同様の方法で、ブタ胃内壁組織上への粒子の適用量を１．６～３２ｍｇ／ｃｍ２で変えて接着強度の測定を行ったところ、組織の単位面積当たり１０～２０ｍｇ／ｃｍ２であることが好ましいことが分かった（図２）。
　以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜ゼラチン誘導体の調製＞
　表１に示すゼラチン誘導体を調製した。例としてゼラチン誘導体７の調製について説明する。
　ブタ皮膚由来のアルカリ処理ゼラチン（Ｍｗ＝１００，０００、ｂｅＭａｔｒｉｘ（商品名）、新田ゼラチン（株）製）５ｇを、５０℃のオイルバスに浸したナス型フラスコ中の超純水５０ｍＬに加え、１時間程度撹拌しながら溶解して１０ｗｔ％水溶液を調製した。得られた水溶液に、５ｍＬのエタノール（和光純薬（株）製）に溶解した７７７ｍｇのピコリンボラン（オクタナールの約１．５倍当量に相当、純正化学（株）製）を加えた後、エタノール７０ｍＬに溶解したオクタナール（東京化成工業（株）製）を、約１００ｍＬ／ｈの速度で、ゼラチンのアミノ基に対して目標とする誘導化率７５モル％の約３倍当量に相当する６２１ｍｇを滴下した。ナス型フラスコに還流冷却器を取り付け、攪拌しながら５０℃で１７時間反応させた後、オイルバスからナス型フラスコを取り出し、エバポレーターによって４０℃でエタノールを留去した。得られた反応溶液を、氷浴に浸したビーカー中の１Ｌのエタノールに滴下し再沈殿させた。１時間攪拌後、冷凍庫にて１時間静置した後、ガラスフィルターでろ過した。ろ過残渣を、再びビーカー中の１Ｌのエタノールに滴下し再沈殿させ、１時間攪拌後、冷凍庫にて１時間静置した。再びガラスフィルターでろ過した後、ろ過残渣を減圧乾燥器で一晩以上乾燥させ、オクチル基が導入されたゼラチン誘導体を８３％の収率で得た。
　得られたゼラチン誘導体における、オクチル基の導入率を以下の手法によって行った。原料ゼラチンおよびゼラチン誘導体を各々０．１ｗ／ｖ％で水・ＤＭＳＯ混合溶媒（体積比１：１、以下同様）に溶解し、４８ウェルプレートに１００μＬ分注した。そこへ水・ＤＭＳＯ混合溶媒に溶解した０．１ｖ／ｖ％のトリエチルアミン（ＴＥＡ、ナカライテスク社製）を１００μＬ加え、プレートシェーカーで４００ｒｐｍ、１分間撹拌した。さらに、水・ＤＭＳＯ混合溶媒に溶解した０．１ｗ／ｖ％トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ、和光純薬（株）製）を１００μＬ加え、プレートシェーカーで４００ｒｐｍ、１分間撹拌した。アルミホイルで遮光し、３７℃のインキュベーター内で２時間静置した後、インキュベーターから取り出し６ＮＨＣｌを５０μＬ加えて反応を停止し、プレートシェーカーで４００ｒｐｍ、１分間撹拌した。遮光して１０分間静置後、３４０ｎｍの吸光度（Ａｂｓ）を吸光度計（ＴＥＣＡＮ社製、Ｓｐａｒｋ　１０Ｍ－ＮＭＳＴ）で測定した。測定された吸光度から、ゼラチンを含まない点でのみ異なるブランク試料の吸光度を引き、以下の計算式によって、ゼラチン誘導体のオクチル基導入率が７５モル％であることを求めた。
　導入率（％）＝［Ａｂｓ（原料ゼラチン）－Ａｂｓ（ゼラチン誘導体）］／［Ａｂｓ（原料ゼラチン）］×１００
　得られたゼラチン誘導体の１３Ｃ－ＮＭＲおよびＦＴ－ＩＲを測定した。１３Ｃ－ＮＭＲは、ゼラチン誘導体及び原料ゼラチンを、各々２０ｗｔ％で重水（内部標準として3-(トリメチルシリル)-1-プロパンスルホン酸ナトリウムを含む）に溶解し、５０℃で測定を行った。図３に、得られた１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを示す。該ゼラチン誘導体には、１７－１７．５ｐｐｍ付近に第一級炭素に由来するピークが観測されたことから、ゼラチンにオクチル基が導入されていることが確認された。ＦＴ－ＩＲ測定は、ゼラチン誘導体粉末を試料台にのせ直接測定した。図４に、ＦＴ－ＩＲスペクトルの２５００～３５００ｃｍ－１の部分を示す。メチル基の伸縮振動に由来するピーク（２８６８ｃｍ－１）およびメチレン基の伸縮振動に由来するピーク（２９２９ｃｍ－１）、Ｎ－Ｈ伸縮振動に由来するピーク（３２９９ｃｍ－１）を確認した。
　オクタナールに代えてエタナール、ブタナール、ヘキサナール、又はウンデカナールを、目的とする誘導化率に応じた量で用いたことを除き、上述の方法と同様の方法で、他のゼラチン誘導体を調製した。いずれも収率８０～９０％であった。なお表１等において、例えば「７５Ｃ８」は置換率７５％でＣ８アルデヒドによって置換されたゼラチン（式（１）においてＲ１がヘプチル基であり、Ｒ２が水素原子）を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜スプレードライ＞
（１）ゼラチン誘導体を５０℃で超純水に溶解し、６ｗｔ％水溶液を調製した。
（２）該水溶液に同体積のエタノールを加えて、３ｗｔ％溶液とした。
（３）該溶液の温度を５０℃に維持し、スプレードライヤー装置（ミニスプレードライヤー、Ｂ－２９０、ビュッヒ社製）に設置し、１８０℃で、窒素ガスの流速４４０Ｌ／ｈ、該溶液の流速４１０ｍＬ／ｈで、スプレードライし、粒子を得た。スプレードライ後熱処理前の、ゼラチン誘導体７から得られた粒子のＳＥＭ画像を図５に示す。比較例として誘導化しないゼラチンも同様にスプレードライした。
＜熱処理＞
　図６、７に関し上述した熱処理に関する検討結果に基づき、粒子を１５０℃で３時間熱処理した。
　ゼラチン誘導体１～６、８及び原料ゼラチンについても同じ条件でスプレードライ及び熱処理（１５０℃、３時間）を行い、各粒子を作った。
　図１にゼラチン誘導体７から得られた粒子のＳＥＭ画像を示す。粒子は略真球状であり、画像解析の結果、その径は約１μｍ～１０００μｍの範囲に分布し、最頻粒子径は１０～２０μｍであった。
＜粒子とブタ胃内壁組織との接着強度測定＞
　ブタ胃（芝浦臓器）の内壁組織を用いて接着試験を行った。試験方法は、米国試験材料協会の規格（ＡＳＴＭ　Ｆ－２２５８－０５）に従って行った。ブタ胃を開き、粘膜層を取り除いた。この際、生理食塩水を粘膜下組織へ注入し、隆起した部分を取り除くことで粘膜下組織をある程度のこした状態で粘膜層のみを切除した。得られた組織を２．５ｃｍ四方の組織片へと裁断し、試験装置の上下の治具それぞれに瞬間接着剤を用いて固定した。ホットプレートを用いることで測定中のブタ胃内壁組織の温度を３７℃に保った。キムワイプで該組織表面の余分な水分を取り除き、該組織上に１００ｍｇ（１６ｍｇ／ｃｍ２）のゼラチン粒子をのせた。上部の治具によって８０ｋＰａで３分間圧着した後、上部へと引っ張り上げることで接着力を測定した。比較例１として原料ゼラチンから得られた粒子を、比較例２として、ＮＥＯＶＥＩＬ（商標）を用いた。コントロールは、何も試料が無いブランク値である。結果を表２及び図９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜止血効果＞
　５ｍＬのバイアルにラット（Ｗｉｓｔａｒ、６週齢、メス）から採取した全血１ｍＬを入れ、そこに５０ｍｇの実施例７（７５Ｃ８）粒子を添加して軽く混合した後、静置した。コントロールとして何も添加しない全血を用いた。混合から３分後、コントロールが凝固していないのに対して、７５Ｃ８粒子を含む試料では血液凝固が確認された。このことから、本発明におけるゼラチン誘導体粒子には止血効果があることが示された。
＜接触角測定によるゼラチン誘導体粒子の疎水性評価＞
　実施例１（Ｃ２）、実施例２（Ｃ４）、実施例３（Ｃ６）、実施例６（Ｃ８）、実施例８（Ｃ１２）及び比較例１（ＯＲＧ）、の各粒子約１００ｍｇをスライドガラス上に置き、上から別のスライドガラスを置いて、手で粒子を圧縮することによってペレットを作製した。接触角測定装置（ＤＭ－７００，ＫＹＯＷＡ）を用いてペレットの表面上に超純水の液滴を滴下し、２００秒後に液滴と基板の間の角度を測定した。結果を図１０に示す。
　図１０に示すとおり、比較例１は接触角が４６度と親水的な表面を有する材料であったのに対して、実施例のゼラチン粒子においては、修飾するアルキル基の鎖長の増加に伴った接触角の増加が確認された。特に、Ｃ６からＣ１２においては、接触角が１００度を超える疎水的な表面が見られた。つまり、より疎水性の高い基で修飾することで、より疎水的な表面を有する粒子が作製できることが明らかとなった。 
＜細胞生存率評価＞
　マウス由来マクロファージ様細胞であるＲＡＷ２６４細胞を用いて、ゼラチン誘導体粒子が細胞生存率に与える影響を評価した。９６ウェルプレートに６ｘ１０４　ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度でＲＡＷ２６４細胞を播種し、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ウシ胎児血清、１％非必須アミノ酸、１％抗生物質）中で３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで２４時間培養した。０．６２５、１．２５、２．５、５、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で上記培地中に分散させた実施例１（Ｃ２）、実施例２（Ｃ４）、実施例３（Ｃ６）、実施例６（Ｃ８）、実施例８（Ｃ１２）及び比較例１（ＯＲＧ）の各粒子を１００μＬずつ細胞に加え、２４時間培養した。その後、細胞数定量キット（ＷＳＴ－８、同仁化学）によって細胞数を定量した。粒子を加えないウェル中の細胞数を１００％としたときの各サンプルの細胞数をグラフ（図１１）に示した。
　実施例１（Ｃ２）、実施例２（Ｃ４）、実施例３（Ｃ６）、実施例６（Ｃ８）及び比較例１（ＯＲＧ）の粒子を加えたサンプルにおいては、すべての濃度範囲で高い細胞数を示しており、高い細胞適合性が確認された。一方で、実施例８（Ｃ１２）の粒子においては、２．５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度において細胞数の減少が確認された。ここから、アルキル鎖中が長い粒子は比較的低い濃度で創傷に適用することが好ましいといえる。
＜ゼラチン誘導体粒子が細胞増殖に与える影響＞
　創傷治癒には、上皮細胞が新たに増殖することで創部を閉鎖する上皮化プロセスが含まれる。そこで、ゼラチン誘導体粒子が細胞増殖に与える影響を評価するために、ヒト結腸癌由来細胞株であるＣａｃｏ－２細胞の、ゼラチン粒子からなるフィルム上での増殖挙動を評価した。実施例１（Ｃ２）、実施例２（Ｃ４）、実施例３（Ｃ６）、実施例６（Ｃ８）、実施例８（Ｃ１２）及び比較例１（ＯＲＧ）の粒子を０．２ｍｇ／ｍＬの濃度で夫々超純水に懸濁し、９６ウェルプレートに１００μＬずつ添加した後、超純水を蒸発させることで粒子からなるフィルムを作製した。該フィルムを１時間のＵＶ照射によって滅菌した後に該フィルム上に６ｘ１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度でＣａｃｏ－２細胞を播種し、ＤＭＥＭ培地（２０％ウシ胎児血清、１％非必須アミノ酸、１％抗生物質）中で３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで２４時間培養した。その後、細胞数定量キット（ＷＳＴ－８、同仁化学）によって細胞数を定量した。結果を図１２に示す。
　図１２から分かるように実施例１（Ｃ２）、実施例２（Ｃ４）、実施例３（Ｃ６）及び比較例１（ＯＲＧ）の粒子からなるフィルム上で細胞は増殖し、特に実施例２（Ｃ４）及び実施例３（Ｃ６）の粒子においては、比較例１より顕著に高い増殖性を示し、上皮化プロセスを促進する可能性が示された。一方で、実施例６（Ｃ８）、実施例８（Ｃ１２）の粒子からなるフィルム上では、Ｃａｃｏ－２の増殖は抑制された。これは、上記細胞生存率評価の結果を考慮すると、フィルム上のアルキル鎖の粒子密度が影響している可能性がある。
＜ゼラチン誘導体粒子がサイトカイン産生に与える影響＞
　細胞数の定量に代えて、２４時間培養後の上清を回収し、ＥＬＩＳＡアッセイキット（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてマウスＩＬ－６の産生量を定量した点を除き、細胞生存率評価における手順と同様の手順でマウスＩＬ－６の産生量を定量した。結果を図１３に示す。同図において、「ＣＴＲ」は粒子を添加しなかった試料を表す。図１３に示すとおり、実施例６（Ｃ８）、実施例８（Ｃ１２）粒子の存在下で、ＩＬ－６の産生が見られ、特に、実施例８（Ｃ１２）の粒子で多く産生されていた。ＩＬ－６は望ましくない炎症状態からの回復に関与する急性期反応における発熱や血管新生などに関与し、様々な生理学的活性がある。実施例６（Ｃ８）、実施例８（Ｃ１２）の粒子を用いることで、創傷の治癒を促進することが期待される。
＜創傷治癒効果＞
　本粒子の創傷治癒促進効果を確認するために、ラットを用いた動物実験を行った。イソフルランを用いた吸入麻酔下において、ラット（メス、７週齢）の背部に８ｍｍのデルマパンチを用いることで皮膚全層欠損を作製した。そこに、実施例２（Ｃ４）、実施例３（Ｃ６）、実施例６（Ｃ８）、実施例８（Ｃ１２）及び比較例１（ＯＲＧ）の粒子を１０ｍｇずつ塗布した。コントロール（ＣＴＲ）として、粒子を塗布していないサンプルも作製した。その上にシリコーンシートをのせ、テープで固定することによって、サンプルを安定に保持した。７日後および１４日後の創傷部の写真撮影（図１４上段）と面積測定を行い（図１４下段）、７日後のサンプルに関しては組織切片観察を行った（図１５）。
　図１４に示すとおり、７日目においては、実施例８（Ｃ１２）がＣＴＲとほぼ同程度の創部の閉鎖が見られたことを除き、いずれの実施例においても顕著に創傷の残存面積が大きかった。創傷治癒においては、炎症反応が終わらないうちに急激に創部の閉鎖が起こると、狭窄の原因にもなる瘢痕拘縮を引き起こすため、創部の残存面積は大きい方が好ましい。本発明の粒子を塗布することで、残存面積が大きくなり、瘢痕拘縮が抑制されることが示された。１４日目においては、すべとのサンプルにおいて創部の閉鎖が確認された。
　７日後の組織切片観察を行うことで炎症レベルを評価した。過剰量のソムノペンチルを用いることでラットを屠殺し、創傷部の組織を回収した。パラフィン包埋後、薄切切片を作製し、炎症による発現する蛋白質である、α－平滑筋アクチン（α－ｓｍｏｏｔｈ　ｍｕｓｃｌｅ　ａｃｔｉｎ：α－ＳＭＡ）を染色して観察を行った。α－ＳＭＡ陽性部の面積の定量は、画像処理ソフト（ＩｍａｇｅＪ）を用いて行った。図１５下段のグラフに示すように、創部の閉鎖についてはＣＴＲとほぼ同程度であった実施例８（Ｃ１２）も含め、いずれの実施例の粒子もＣＴＲよりもα－ＳＭＡの発現を抑制していることが明らかとなった。これらの結果より、本発明の粒子を創傷被覆材として用いることで、炎症反応を抑制し、創傷治癒を促進できることが期待される。
＜機械的粉砕による粒子の調製＞
ブタ皮膚由来のアルカリ処理ゼラチンに代えて、アルカリ処理されたスケトウダラゼラチン（Ｍｗ＝３０ｋＤａ、新田ゼラチン（株）製、以下「タラゼラチン」と略す。）を用い、約２倍当量のオクタナールを用いた点を除き、実施例１～８と同様の手順でゼラチン誘導体を合成した。導入率は５８％であった（５８Ｃ８）。得られたゼラチン誘導体を超純水に溶解し、２０ｗｔ％および３０ｗｔ％の溶液を調製し、テフロン（登録商標）トレイに入れて４０℃で加熱することで乾燥させ、個体状のゼラチン誘導体を得た。この際、分散媒の有無を評価するために、風乾の前に１％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ、Ｍｗ＝１５００Ｄａ）を添加したサンプルも併せて調製した。風乾後の固体状のゼラチン誘導体を、粉砕機（Ｗｏｎｄｅｒ　Ｃｒｕｓｈｅｒ）を用いて、１分間の粉砕を３回繰り返した。最後に減圧下、１５０ｏＣ、３時間の熱架橋処理を行った。得られた粒子はＳＥＭ画像（図１６）に示すように、２０～５０μｍ程度の粒径を持つ粒子であった。ＰＥＧの有無による粒径の有意差は認められなかった。
実施例１等と同様に、豚胃内壁組織との接着強度を測定した。結果を図１７に示す。接着試験の結果より、タラゼラチンはブタゼラチンと同等の接着強度を有していることが明らかとなった（１５～２０ｋＰａ）。また、分散媒を使用しなくても、乾燥及び粉砕処理によって接着強度に優れる粒子を得られることが分かった。
　本発明の創傷被覆材は、内視鏡的粘膜剥離術等の外科手術後の創部、血管吻合部等への適用に大変有用である。

Claims (5)

  1. 　架橋されたゼラチン誘導体を含む粒子を含み、
    　該ゼラチン誘導体は下記式（１）で示される構造を含み、
     
    ＧｌｔｎＮＨ－ＣＨＲ１Ｒ２　　　　　　　　（１）
     
    上式において、Ｇｌｔｎはゼラチン残基であり、Ｒ１は炭素数１～１７のアルキル基であり、Ｒ２は水素原子又は炭素数１～１７のアルキル基であり、
    該粒子の粒子径は１～１０００μｍである、
    創傷被覆材。
  2. 該ゼラチンが、ブタ又はスケトウダラ由来のゼラチンをアルカリ処理したものである、請求項１記載の創傷被覆材。
  3. 該ゼラチンが低エンドトキシン化ゼラチンである、請求項２記載の創傷被覆材。
  4. 該ゼラチン誘導体中のイミノ基／アミノ基（モル比）が２０／８０～８０／２０である、請求項１～３のいずれか１項記載の創傷被覆材。
  5. ［１］上記式（１）で示される構造を含むゼラチン誘導体を調製する工程、
    ［２］該ゼラチン誘導体の溶液をスプレードライ又は固体状の該ゼラチン誘導体を機械的に粉砕して造粒する工程、及び
    ［３］造粒された粒子を１４０～１６０℃で少なくとも３時間加熱する熱処理工程、
    を含む請求項１～４のいずれか１項記載の創傷被覆材の調製方法。
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