CN111065421A - 含有交联明胶衍生物粒子的伤口敷料 - Google Patents

Abstract

一种伤口敷料，其含有粒子，所述粒子包含交联的明胶衍生物，该明胶衍生物包含由下述式(1)所示的构造，GltnNH‑CHR¹R²(1)在上式中，Gltn为明胶残基，R¹为碳原子数1～17的烷基，R²为氢原子或碳原子数1～17的烷基，该粒子的粒径为1～1000μm。

Description

含有交联明胶衍生物粒子的伤口敷料

技术领域

本发明涉及一种伤口敷料，详细而言，涉及一种含有交联的明胶衍生物的粒子的伤口敷料。

背景技术

伤口敷料被定义为“覆盖/保护伤口的材料：用于吸收渗出液、抑制出血或体液损失以及保护伤口免受擦拭、摩擦、干燥、污染，由亲水性聚合物制成的对局部进行管理的覆盖/保护伤口材料”(日本药事法、医疗设备类别分类)。作为伤口敷料，有纱布、聚氨酯泡沫、水凝胶等，这些均为布帛形态。

伤口敷料也开始被用于胃、大肠等的早期癌症的治疗法、即内窥镜下的粘膜下层剥离术(ESD：Endoscopic Submucosal Dissection(内镜粘膜下剥离术))中。胃、结肠等的壁由粘膜层、粘膜下层、肌层这三层组成，癌症从位于最内侧的层即粘膜层产生。在ESD中，使用胃镜、大肠镜从消化道的内腔剥离包含粘膜层的粘膜下层，将病变一并切除。切除后的组织如果置之不理，则会收缩而引起粘连等，从而引发消化道梗阻等并发症。因此，用可生物降解性的伤口敷料对该组织进行覆盖。

要求ESD用的伤口敷料除了具有赋形性、即沿着伤口的形状的柔软性以外，还要具有可生物降解性等。目前使用的是一种聚羟基乙酸无纺布(Gunze(株)制造、NEOVEIL(注册商标))。该聚羟基乙酸无纺布虽然可生物降解性等优异，但与组织不具有粘合性，因此必须通过纤维蛋白系的粘合剂来覆盖并固定该无纺布。但是，该粘合剂的价格高，并且为血液制剂，因此无法完全消除污染的危险性。另外，该无纺布在应用部位难以展开，从而欠缺在复杂形状的部位上的赋形性。而且，还担心作为可生物降解物质的聚羟基乙酸低聚物会引起组织发炎。

明胶因为生物相容性和可生物降解性优异，而被用于各种医疗用途。作为其粒子制剂，已知有经动脉的栓塞治疗法的栓塞剂(专利文献1)、药剂的缓释性载体(非专利文献1)。另外，化学改性的明胶也被开发用于医疗。例如，已知一种在明胶上通过亚氨基来键合疏水性基，而显示出与湿润组织的高粘合性的组织粘合剂(专利文献2)。

【现有技术文献】

【专利文献】

专利文献1：日本发明专利公开公报特开2010-83788号

专利文献2：日本发明专利授权公报第5995128号

【非专利文献】

非专利文献1：Biometerials第21卷、第489-499页、2000年

发明内容

【发明所要解决的技术问题】

本发明的目的在于，提供一种能够实现与伤口部位的形状吻合的应用、显示出与湿润部位的高粘合性的可生物降解性的伤口敷料。

【用于解决技术问题的技术方案】

即，本发明为一种伤口敷料，其含有包含交联的明胶衍生物的粒子，

该明胶衍生物包含由下述式(1)所示的构造，

GltnNH-CHR¹R² (1)

在上式中，Gltn为明胶残基，R¹为碳原子数1～17的烷基，R²为氢原子或碳原子数1～17的烷基，

该粒子的粒径为1～1000μm。

【发明效果】

由于上述伤口敷料含有微米级的粒子，因此，即使复杂形状的伤口，也能够通过喷雾等与该形状吻合应用。另外，该粒子具有烷基，与湿润组织也具有高粘合性。而且，不使用分散介质和交联剂也能够制备该粒子，从而能够将其应用于组织，而无需担心因分散介质和交联剂的残留或者分解对组织造成的不良影响。

附图说明

图1是明胶衍生物粒子的电子显微镜(SEM)图像。

图2是表示明胶衍生物粒子的应用量所带来的粘合强度的变化的图表。

图3是明胶衍生物的¹³C-NMR图谱。

图4是明胶衍生物的2500～3500cm^-1的FT-IR图谱。

图5是喷雾干燥后热处理前的明胶衍生物粒子的SEM图像。

图6是在20分钟～3小时的范围改变热处理时间，将该热处理后的粒子立即分散于水中进行观察的相位差显微镜照片。

图7是通过在胶原酶存在下的加速试验来研究根据热处理时间的粒子在生理盐水中的溶解性的图表。

图8是将由原料明胶通过喷雾干燥所得到的粒子在150℃下进行热处理时消耗的氨基量相对于时间进行描点的图表。

图9是表示明胶衍生物粒子的粘合强度的图表。

图10是表示明胶(未处理)和明胶衍生物(疏水化明胶)粒子相对于水的接触角的图表。

图11是表示在明胶衍生物粒子存在下的RAW264细胞的存活率的图表。

图12是表示Caco-2细胞在由明胶衍生物粒子形成的膜上的增殖行为的图表。

图13是表示在明胶衍生物粒子存在下的RAW264细胞的IL-6产量的图表。

图14是表示在大鼠的皮肤伤口上施用明胶衍生物粒子时的伤口愈合过程的照片(上段)和伤口残留面积的图表(下段)。

图15是表示在大鼠的皮肤伤口上施用明胶衍生物粒子，第7天的组织中的α-平滑肌肌动蛋白阳性部分的照片(上段)和阳性面积的图表(下段)。

图16是使用黄线狭鳕明胶作为明胶，通过机械粉碎法制备成的粒子的SEM图像。

图17是表示通过机械粉碎法制备成的狭鳕明胶衍生物粒子的粘合强度的图表。

具体实施方式

<明胶衍生物>

在本发明中，明胶衍生物包含由下述式(1)所示的构造。

GltnNH-CHR¹R² (1)

在上式中，“Gltn”为明胶残基，R¹为碳原子数1～17的烷基，R²为氢原子或碳原子数1～17的烷基。N源自赖氨酸(Lys)的ε-氨基，在明胶中为主要成分。优选R²为氢原子。该式(1)的NH构造例如能够在FT-IR图谱中由3300cm^-1附近的带来检测。实施例7的明胶衍生物的FT-IR图谱在图4中示出。

在R²为碳原子数1～17的烷基的情况下，既可以与R¹相同，又可以彼此不同。该烷基也可以具有支链。作为该烷基的例子，可列举出甲基、乙基、丙基、丁基、己基、辛基(或辛烷基)、壬基(或壬烯基)、癸基、十二烷基(或月桂基)、十四烷基(或肉豆蔻基)等。优选R¹为碳原子数1～11，更优选碳原子数1～9的直链烷基，R²为氢原子。

该明胶衍生物中的衍生化率为，以键合了烷基的亚氨基与原料明胶中的氨基量的摩尔％计，为20～80摩尔％，优选为30～70摩尔％。换言之，所得到的明胶衍生物中的亚氨基/氨基(摩尔比)为20/80～80/20，优选为30/70～70/30。该衍生化率可以通过利用2，4，6-三硝基苯磺酸法(TNBS法)来定量原料明胶中的氨基和键合了烷基以后的氨基量，或者利用NMR等来进行烷基的鉴定和定量来求得。

原料明胶也可以为通过源自天然、合成、发酵或基因重组而得到的明胶中的任一种，优选使用源自猪、牛等动物、源自黄线狭鳕等鱼的明胶。另外，虽然可以为酸处理明胶、碱处理明胶、基因重组明胶中的任一种，但优选为碱处理明胶，更优选为低内毒素化明胶。另外，在该明胶的分子量范围中，优选重均分子量(Mw)为30000～150000，更优选为50000～120000。该分子量可以通过凝胶渗透色谱法(GPC)按照常规方法进行测定。

<粒子>

图1是本发明中的粒子的一例(实施例7)的SEM图像。可知粒子大致为正球形。粒径大致为微米级，即为1～1000μm，大多为1～50μm，最频粒径(众数径)为10～20μm。可以根据粒子的应用部位、应用手段，通过筛分等来选择规定的粒径范围。从输送性和操作性的观点出发，优选为1～200μm，更优选为1～50μm。在本发明中，虽然粒径通过SEM图像解析来求得，但也可以通过激光衍射法等来求得。

可以通过在对明胶衍生物溶液进行喷雾干燥以后，或者干燥后机械粉碎固态明胶衍生物以后，进行热交联而获得粒子，优选喷雾干燥法。如上述非专利文献1所述，也可以使用将明胶水溶液滴加于橄榄油中，作为油包水滴乳液凝胶化以后，将获得的粒子加入戊二醛水溶液中进行化学交联的方法，但根据喷雾干燥法，由于不使用分散介质、固化剂，因此不需要担心由于它们的残留或者分解而产生的毒性，并且也不需要分散介质的清洗，从而也不用担心清洗后干燥时的粒子间的凝聚，在这些方面上优选该方法。

通过使粒子分散于水中并且目视或者用相位差显微镜来观察粒子不溶解的情况，能够确认明胶衍生物的交联。图6a～e是将通过喷雾干燥所获得的粒子(实施例7)放入减压干燥器中，在减压下(＜10Pa)、在150℃下，将热处理时间在20分钟～3小时的范围进行改变，将处理后的粒子立即分散于水中，用相位差显微镜观察后的显微镜照片。无热处理(图6a)、处理时间为20分钟时(图6b)粒子在水中溶解，处理时间为1小时时(图6c)确认到一部分不溶解的粒子，处理时间为2小时时(图6d)确认到大量粒子，处理时间为3小时时(图6e)确认到比2小时处理时稍多的粒子。

通过胶原酶存在下的加速试验来研究上述1小时、3小时以及6小时热处理后的粒子在体液中的溶解性。将各粒子20mg分散于5μg/mL的胶原酶/PBS(pH＝7.4)溶液中，1、2、4小时后进行离心回收，干燥后测量重量。结果在图7中示出。如该图表所示，通过3小时的热处理，在用作伤口敷料时不会溶解于体液，而能够示出所需的初始体液吸收。并且，可知随着热处理时间的增加，溶解时间变长，能够通过热处理的时间来控制在体液中的溶解性。

关于交联度，由于依赖于衍生化率并且可参与交联反应的氨基数不同，并且作为该氨基全部发生反应的状态所定义的交联度100％不同，因此无法限定其范围。图8是利用TNBS法来测定将由原料明胶通过喷雾干燥所得到的粒子在150℃下进行热处理时的残留氨基量，求得因交联所消耗的氨基量，将其相对于时间进行描点的图表。根据该图可知，在150℃下，交联在3小时以前迅速进行，而后逐渐变缓，在6小时处达到可交联的氨基量的40％左右，几乎达到最高限度。在明胶衍生物的情况下，残留而未衍生化的氨基量更少，因此认为反应性更低，认为通过3小时的热处理，在该氨基量的10～30％左右达到最高限度。但是，如上述实施例7的粒子所示，即使衍生化率高达75％，通过3小时的热处理，也具有对用作伤口敷料不存在问题的耐溶解性，认为这是由于存在疏水性的烷基。

<添加剂等>

本发明的伤口敷料可以含有不阻碍本发明的目的的量的各种添加剂。作为该添加剂，有着色料、保存剂。另外，也可以含有各种药剂，例如可列举出抗血栓药、抗生素、各种生长因子等。可以使粒子担载添加剂和药剂，或者与其键合。

<伤口敷料的制备法>

伤口敷料的制备方法包括[1]明胶衍生物制备工序、[2]喷雾干燥或干燥后机械粉碎固态明胶衍生物的造粒工序以及[3]热处理工序。下面，说明各工序。

[1]明胶衍生物制备工序

(1)原料明胶水性溶液的制备

使用5～50wt/v％的量的原始材料的明胶，在40～90℃下进行加热，使其在水或水性溶剂中溶解。作为水，可以使用超纯水、去离子水、蒸馏水。作为水性溶剂，可以使用水与水溶性有机溶剂的混合物。作为水性溶剂，可以使用碳原子数1～3的醇、酯等，优选使用乙醇。

(2)衍生物化

在由工序(1)所得到的明胶溶液中，添加具有导入的烷基的衍生物化药剂，搅拌规定时间使其反应。作为该衍生物化药剂，可使用具有该烷基的醛或酮，例如十二烷醛、十四烷醛、癸基乙基酮。反应温度为30～80℃，反应时间为0.5～12小时，通常，仅仅通过搅拌就可以获得在明胶的氨基上通过席夫碱(～N＝CR¹R²)键合有烷基的明胶。醛的使用量为相当于所希望的衍生化率的化学计量的1～4倍。更优选为1～2倍。

接着，将该席夫碱还原为上述式(1)的构造。作为还原剂，可以使用氰基硼氢化钠(NaBH₃CN)、三乙酰氧基硼氢化钠(NaBH(OAc)₃)、2-甲基吡啶硼烷、吡啶硼烷等公知的还原剂。其中，优选2-甲基吡啶硼烷。甲基吡啶硼烷具有稳定性，能够在水性溶剂中一步(一锅)进行醛或酮的还原胺化反应。并且，能够实现80～90％的产率。优选2-甲基吡啶硼烷的使用量相对于衍生物化药剂的当量为1～3当量。此外，添加还原剂和醛等的顺序可以任意，可以将任一者先添加于明胶溶液，也可以同时进行添加。

(3)纯化

在由工序(2)所得到的反应溶液中，加入大量过量的不良溶剂，例如冷乙醇，或者将该反应溶液加入冷乙醇中，使明胶衍生物沉淀。在过滤该沉淀以后，用乙醇等进行清洗，获得最终产物。

[2]造粒工序

＜喷雾干燥法＞

已经发现粒子的形状、粒径等依赖于气流速度等许多的变量因子。主要从作为伤口敷料的操作性的观察出发，为了能够大量获得在上述粒径范围内尽可能大的、几十微米级的粒子，除了已经说明的原料明胶的分子量以外，对明胶衍生物浓度、干燥温度、气流速度、溶液的流动速度等进行了研究。下面，针对各因子进行说明。

喷雾干燥器可以为盘式、喷嘴式、旋风捕集式、过滤器捕集式等的任一种。

喷雾干燥是将明胶衍生物溶解于水和与水具有相容性的有机溶剂的混合溶剂中所形成的溶液，在氮气等惰性气体下进行喷雾来进行的。作为有机溶剂，可以使用碳原子数1～3的醇、酯等，优选使用乙醇。水:有机溶剂的混合比例(体积)为10:0～3:7，优选为6:4～4:6。虽然在专利文献1所记载的方法中使用明胶水溶液，但在本发明的明胶衍生物的情况下，使用水溶液难以形成粒子，也无法获得充分的粘合性。进行各种研究的结果，得知通过使用上述混合溶剂，能够获得与组织的粘合力优异的粒子。虽然并不是限定本发明的主旨，但认为由于使用有机溶剂而提高溶剂的蒸发速度，使明胶衍生物中的烷基聚集于气液界面，因此该烷基出现在球的表面。

该溶液为，在明胶衍生物中加入水，在50～90℃下一边温和搅拌一边进行溶解，在所获得的水溶液中加入有机溶剂，使浓度为1～7w/v％，优选为3～5w/v％。溶液中的浓度小于所述下限值则难以获得粒子，即使大于所述上限值，粒子在到达回收容器前附着于喷雾干燥器的玻璃壁上，也无法获得与浓度相匹配的产率的提高。

干燥温度为140℃～220℃，优选为160～200℃。温度小于所述下限值则粒径容易小于1μm，若大于所述上限值，则粒子有凝聚的倾向。

惰性气体的流速为400～500L/h，优选为400～480L/h。另外，明胶衍生物溶液的流速为300～500mL/h，优选为350～450mL/h。

<机械粉碎法>

通过使纯化后的明胶衍生物在超纯水中溶解而成为溶液状态，在40～60℃下使其干燥而成为固态以后，使用微粉碎机、例如辊磨机、喷射磨机、锤磨机等进行粉碎。在使其成为溶液状态时，也可以添加聚乙二醇等分散介质。

[3]热处理工序

对通过喷雾干燥或机械粉碎法所获得的粒子进行加热处理而使明胶衍生物交联。加热温度和时间需要按照原料明胶的分子量、衍生化率、作为目标的交联度来进行定义调整。例如在原料明胶分子量(Mw)为约100000的情况下，在140～160℃下至少加热3小时。

也可以在热处理后进行粒子的清洗、干燥和筛分以及使其担载药剂等的处理等。

<应用于组织的方法>

本发明的伤口敷料可以应用于呼吸外科，尤其是肺癌术后的创面、消化外科、心血管外科、口腔外科、消化内科等各种外科手术的切口、皮肤伤口等。在ESD的情况下，能够通过止血钳、支架、气囊、内窥镜等，在干燥的状态下应用。应用量可以依赖于应用部位、伤口来适当调整。从与组织的粘合强度的观点出发，通过与在后述的实施例中使用的同样的方法，将粒子应用于猪胃内壁组织上的量在1.6～32mg/cm²的范围进行改变而进行粘合强度的测定，结果可知优选为组织的每单位面积10～20mg/cm²(图2)。

实施例

下面，通过实施例来说明本发明，但本发明并不限定于此。

<明胶衍生物的制备>

制备出表1所示的明胶衍生物。作为例子，说明明胶衍生物7的制备。

将5g源自猪皮的碱处理明胶(Mw＝100000、beMatrix(商品名)、新田明胶(株)制造)加入至浸入在50℃的油浴中的茄型烧瓶中的50mL超纯水中，一边搅拌1小时左右一边进行溶解而制备成10wt％水溶液。在所获得的水溶液中，加入溶解于5mL乙醇(和光纯药(株)制造)的777mg甲基吡啶硼烷(相当于辛醛的约1.5倍当量、纯正化学(株)制造)，之后以约100mL/h的速度滴加621mg溶解于70mL乙醇的辛醛(东京化成工业(株)制造)，该621mg相当于对于明胶的氨基作为目标的衍生化率75摩尔％的约3倍当量。在茄型烧瓶上安装回流冷凝器，一边搅拌一边在50℃下反应17小时以后，将茄型烧瓶从油浴中取出，利用蒸发器在40℃下蒸馏除去乙醇。将所获得的反应溶液滴加于浸入在冰浴中的烧杯中的1L乙醇中，使其再沉淀。搅拌1小时后，在冷冻机中静置1小时，之后用玻璃过滤器进行了过滤。将过滤残渣再次滴加于烧杯中的1L乙醇中而使其再沉淀，搅拌1小时后，在冷冻机中静置了1小时。再次用玻璃过滤器进行了过滤以后，利用减压干燥器将过滤残渣干燥一夜以上，以83％的产率获得了导入有辛基的明胶衍生物。

所获得的明胶衍生物中的辛基的导入率通过以下的方法来得到。原料明胶和明胶衍生物分别以0.1w/v％溶解于水-DMSO混合溶剂(体积比1：1、以下相同)，向48孔板分注100μL。向其中加入溶解于水-DMSO混合溶剂的0.1v/v％的三乙胺(TEA、Nacalai Tesque Co.,Ltd.制造)100μL，利用板振荡器在400rpm下搅拌1分钟。然后，加入溶解于水-DMSO混合溶剂的0.1w/v％三硝基苯磺酸(TNBS、和光纯药(株)制造)100μL，利用板振荡器在400rpm下搅拌1分钟。用铝箔遮光，在37℃的培养箱内静置2小时后，从培养箱取出，加入50μL 6NHCl使反应停止，利用板振荡器在400rpm下搅拌1分钟。遮光静置10分钟后，利用分光光度计(TECAN公司制造、Spark 10M-NMST)测定340nm的吸光度(Abs)。从所测定出的吸光度中减去仅仅在不含有明胶的方面不同的空白试样的吸光度，通过以下的计算公式，求得明胶衍生物的辛基导入率为75摩尔％。

导入率(％)＝[Abs(原料明胶)-Abs(明胶衍生物)]/[Abs(原料明胶)]×100

测定了所获得的明胶衍生物的¹³C-NMR和FT-IR。¹³C-NMR是将明胶衍生物和原料明胶分别以20wt％溶解于重水(作为内部标准含有3-(三甲基甲硅烷基)-1-丙烷磺酸钠)，在50℃下进行的测定。在图3中示出所得到的¹³C-NMR图谱。在该明胶衍生物中，于17-17.5ppm附近观测到源自伯碳的峰，从而确认到在明胶中导入了辛基。FT-IR测定是将明胶衍生物粉末放置于试样台而直接进行的测定。在图4中，示出FT-IR图谱的2500～3500cm^-1的局部。确认到源自甲基的伸缩振动的峰(2868cm^-1)和源自亚甲基的伸缩振动的峰(2929cm^-1)、源自N-H伸缩振动的峰(3299cm^-1)。

除了按照与作为目标的衍生化率相对应的量使用乙醛、丁醛、己醛或十一醛来代替辛醛以外，利用与上述的方法相同的方法制备出其他的明胶衍生物。产率均为80～90％。此外，在表1等中，例如“75C8”表示以75％的取代率被C8醛取代的明胶(在式(1)中R¹为庚基，R²为氢原子)。

[表1]

<喷雾干燥>

(1)将明胶衍生物在50℃下溶解于超纯水中，制备成6wt％水溶液。

(2)在该水溶液中加入相同体积的乙醇，制成3wt％溶液。

(3)将该溶液的温度维持于50℃，设置于喷雾干燥器装置(迷你喷雾干燥器、B-290、Buchi公司制造)，在180℃下，以氮气的流速440L/h、该溶液的流速410mL/h进行喷雾干燥，得到了粒子。将喷雾干燥后热处理前由明胶衍生物7获得的粒子的SEM图像在图5中示出。作为比较例，未衍生化的明胶也同样进行了喷雾干燥。

<热处理>

在图6、7中，根据与上述的热处理相关的研究结果，对粒子在150℃下进行了3小时热处理。

针对明胶衍生物1～6、8和原料明胶也以相同条件进行喷雾干燥和热处理(150℃、3小时)，制成了各粒子。

在图1中示出由明胶衍生物7所获得的粒子的SEM图像。粒子为大致正球形，图像解析的结果为，其粒径分布于约1μm～1000μm的范围，最频粒径为10～20μm。

<粒子与猪胃内壁组织的粘合强度测定>

使用猪胃(芝浦内脏)的内壁组织进行了粘合试验。试验方法按照美国试验材料协会的标准(ASTM F-2258-05)执行。打开猪胃，将粘膜层去除。此时，将生理盐水注入粘膜下组织，通过去除隆起的部分，而以一定程度保留粘膜下组织的状态仅仅将粘膜层切除。将所获得的组织切割为2.5cm见方的组织片，使用瞬时粘合剂分别固定于试验装置的上下夹具上。通过使用热板将测定中的猪胃内壁组织的温度保持于37℃。用擦拭纸(kimwipe)将该组织表面多余的水分去除，将100mg(16mg/cm²)的明胶粒子置于该组织上。通过上部夹具以80kPa压接3分钟以后，向上部牵拉来测定粘合力。使用由原料明胶所获得的粒子作为比较例1，使用NEOVEIL(商标)作为比较例2。对照是没有任何试样的空白值。结果在表2和图9中示出。

[表2]

<止血效果>

在5mL的小瓶中放入从大鼠(Wistar、6周龄、雌性)采集的全血1mL，向其中添加50mg实施例7(75C8)的粒子并轻轻地进行混合，之后静置。使用了没有任何添加的全血作为对照。混合3分钟后，对照没有凝固，与此相对，含有75C8粒子的试样确认到血液凝固。由此显示出本发明的明胶衍生物粒子具有止血效果。

<根据接触角测量的明胶衍生物粒子的疏水性评价>

将实施例1(C2)、实施例2(C4)、实施例3(C6)、实施例6(C8)、实施例8(C12)和比较例1(ORG)的各粒子约100mg放置于载玻片上，从上放置另一载玻片，用手对粒子进行压缩，从而制成粒料。使用接触角测定装置(DM-700、KYOWA)在粒料的表面上滴加超纯水的液滴，200秒后测定了液滴与基板之间的角度。将结果在图10中示出。

如图10所示，比较例1为接触角是46度的具有亲水性表面的材料，而相对于此，在实施例的明胶粒子中，确认到接触角随着改性烷基链长的增加而增加。尤其，在从C6至C12中，观察到接触角超过100度的疏水性表面。即，可知通过由疏水性更高的基团进行改性，能够制成具有更疏水的表面的粒子。

<细胞存活率评价>

使用源自小鼠的作为巨噬细胞样细胞的RAW264细胞，来评价明胶衍生物粒子对细胞存活率的影响。在96孔板中以6x10⁴cells/cm²的密度接种RAW264细胞，在RPMI1640培养基(10％胎牛血清、1％非必需氨基酸、1％抗生素)中于37℃下、5％CO₂的培养箱培养了24小时。将以0.625、1.25、2.5、5、10mg/mL的浓度分散于上述培养基中的实施例1(C2)、实施例2(C4)、实施例3(C6)、实施例6(C8)、实施例8(C12)和比较例1(ORG)的各粒子分别以100μL加入细胞，培养了24小时。然后，通过细胞数定量试剂盒(WST-8、同仁化学)对细胞数进行了定量。将以没有加入粒子的孔中的细胞数设为100％时的各样品的细胞数在图表(图11)中示出。

在加入了实施例1(C2)、实施例2(C4)、实施例3(C6)、实施例6(C8)和比较例1(ORG)的粒子的样品中，在所有的浓度范围中显示出高细胞数，确认到高细胞相容性。另一方面，在实施例8(C12)的粒子中，在2.5mg/mL以上的浓度中确认到细胞数减少。由此可以说优选烷基链中长的粒子以比较低的浓度应用于伤口。

<明胶衍生物粒子对细胞增殖的影响>

伤口愈合包含上皮化过程，即通过新增殖上皮细胞而闭合创面。因此，为了评价明胶衍生物粒子对细胞增殖的影响，对作为源自人结肠癌细胞株的Caco-2细胞在由明胶粒子形成的膜上的增殖行为进行了评价。将实施例1(C2)、实施例2(C4)、实施例3(C6)、实施例6(C8)、实施例8(C12)和比较例1(ORG)的粒子以0.2mg/mL的浓度分别悬浮于超纯水，向96孔板分别添加100μL以后，使超纯水蒸发，由此制成由粒子形成的膜。通过对该膜进行1小时的UV照射来灭菌以后，在该膜上以6x10³cells/cm²的密度接种Caco-2细胞，在DMEM培养基(20％胎牛血清、1％非必需氨基酸、1％抗生素)中于37℃下、5％CO2的培养箱培养了24小时。然后，通过细胞数定量试剂盒(WST-8、同仁化学)对细胞数进行了定量。结果在图12中示出。

如根据图12可知，在由实施例1(C2)、实施例2(C4)、实施例3(C6)和比较例1(ORG)的粒子形成的膜上进行细胞增殖，尤其在实施例2(C4)和实施例3(C6)的粒子中，显示出显著高于比较例1的增殖性，从而表示能够促进上皮化过程。另一方面，在由实施例6(C8)、实施例8(C12)的粒子形成的膜上，Caco-2的增殖被抑制。若考虑上述细胞存活率评价的结果，则这有可能是膜上的烷基链的粒子密度的影响。

<明胶衍生物粒子对细胞因子产生的影响>

代替细胞数的定量，除了回收培养24小时后的上清液，使用ELISA分析试剂盒(R&Dsystems)来定量小鼠IL-6的产生量的方面以外，以与细胞存活率评价中的步骤相同的步骤来定量小鼠IL-6的产生量。结果在图13中示出。在该图中，“CTR”表示没有添加粒子的试样。如图13所示，在实施例6(C8)、实施例8(C12)的粒子存在下，观察到产生IL-6，尤其，在实施例8(C12)的粒子中IL-6大量产生。IL-6参与急性期反应的发热、血管生成等，具有各种生理学的活性，其中，急性期反应参与从不希望的炎症状态中的恢复。通过使用实施例6(C8)、实施例8(C12)的粒子，可以期待促进伤口的愈合。

<伤口愈合效果>

为了确认本粒子的伤口愈合促进效果，使用大鼠进行了动物实验。在使用异氟烷的吸入麻醉下，在大鼠(雌性、7周龄)的背部使用8mm的穿孔器(dermapunch)来制作皮肤全层缺损。在其上分别涂布10mg实施例2(C4)、实施例3(C6)、实施例6(C8)、实施例8(C12)和比较例1(ORG)的粒子。作为对照(CTR)，还制作了没有涂布粒子的样品。在其上放置硅酮薄片，用胶带进行固定，由此来稳定保持样品。在7天后和14天后拍摄伤口部的照片(图14上段)和进行面积测定(图14下段)，对7天后的样品进行了组织切片观察(图15)。

如图14所示，发现在第7天，除了实施例8(C12)与CTR呈大致相同程度的伤口闭合以外，所有的实施例中伤口的残留面积均非常大。在伤口愈合时，若在炎症反应未结束的期间发生伤口急剧闭合，则会引起也导致缩窄的疤痕挛缩，因此优选伤口的残留面积较大。通过涂布本发明的粒子，显示出残留面积变大，从而抑制疤痕挛缩。在第14天，在所有的样品中均确认到伤口的闭合。

通过进行7天后的组织切片观察，对炎症等级进行了评价。通过使用过量的戊巴比妥来灭杀大鼠，对伤口部的组织进行了回收。在石蜡包埋后，制作薄切切片，染色作为由炎症表达的蛋白质的α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin：α-SMA)进行了观察。使用图像处理软件(ImageJ)进行了α-SMA阳性部分的面积的定量。如图15下段的图表所示，可知针对伤口的闭合，也包括与CTR成大致相同程度的实施例8(C12)，所有实施例的粒子均比CTR抑制α-SMA的表达。根据这些结果，通过将本发明的粒子用作伤口敷料，可以期待抑制炎症反应，能够促进伤口愈合。

<通过机械粉碎制备粒子>

代替源自猪皮的碱处理明胶，使用碱处理后的黄线狭鳕明胶(Mw＝30kDa、新田明胶(株)制造、下面简称为“狭鳕明胶”)，除了使用约2倍当量的辛醛的方面以外，按照与实施例1～8相同的步骤合成了明胶衍生物。导入率为58％(58C8)。将所获得的明胶衍生物溶解于超纯水，制备20wt％和30wt％的溶液，放入特氟隆(注册商标)托盘中，在40℃下进行加热而使其干燥，获得固态的明胶衍生物。此时，为了评价有无分散介质，还一并制备了在风干前添加了1％的聚乙二醇(PEG、Mw＝1500Da)的样品。使用粉碎机(Wonder Crusher)对风干后的固态明胶衍生物进行1分钟的粉碎，并且重复三次。最后在减压下，于150℃进行了3小时的热交联处理。所获得的粒子如SEM图像(图16)所示，为具有20～50μm左右粒径的粒子。没有发现因有无PEG所引起的粒径的显著差异。

与实施例1等同样地测定了与猪胃内壁组织的粘合强度。将结果在图17中示出。根据粘合试验的结果可知，狭鳕明胶具有与猪明胶同等的粘合强度(15～20kPa)。并且可知，即使不使用分散介质，通过干燥和粉碎处理也能够获得粘合强度优异的粒子。

产业上的可利用性

本发明的伤口敷料在内窥镜粘膜剥离术等外科手术后的伤口、血管吻合口等的应用中非常有用。

Claims (5)

1.一种伤口敷料，其特征在于，

含有粒子，所述粒子包含交联的明胶衍生物，

该明胶衍生物包含由下述式(1)所示的构造，

GltnNH-CHR¹R² (1)

在上式中，Gltn为明胶残基，R¹为碳原子数1～17的烷基，R²为氢原子或碳原子数1～17的烷基，

该粒子的粒径为1～1000μm。

2.根据权利要求1所述的伤口敷料，其特征在于，

该明胶是对源自猪或黄线狭鳕的明胶进行碱处理而获得的物质。

3.根据权利要求2所述的伤口敷料，其特征在于，

该明胶为低内毒素化明胶。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的伤口敷料，其特征在于，

该明胶衍生物中的亚氨基/氨基(摩尔比)为20/80～80/20。

5.一种伤口敷料的制备方法，其特征在于，

用于制备权利要求1至4中任一项所述的伤口敷料，其包括以下工序：

[1]制备包含上述式(1)所示的构造的明胶衍生物的工序；

[2]对该明胶衍生物的溶液进行喷雾干燥或对固态的该明胶衍生物进行机械粉碎，从而进行造粒的工序；和

[3]将造粒后的粒子在140～160℃下至少加热3小时的热处理工序。

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