WO2023181563A1

WO2023181563A1 - 癒着防止材、及び癒着防止材の製造方法

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Publication number: WO2023181563A1
Application number: PCT/JP2022/047729
Authority: WO
Inventors: 哲志田口
Original assignee: 国立研究開発法人物質・材料研究機構
Priority date: 2022-03-23
Filing date: 2022-12-23
Publication date: 2023-09-28

Abstract

粒子を含む癒着防止材であって、前記粒子は、第１ゼラチンと、第１ゼラチンに炭化水素基が導入されている第２ゼラチンとのゼラチン混合物の架橋物を含み、前記ゼラチン混合物の炭化水素基導入率が、３０ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％であり、第２ゼラチンが、下記式（１）で表される構造を有する癒着防止材は、組織上での接着性、及び水環境下での接着安定性に優れ、簡便な操作性を有し、更に、工業的大量生産も容易となる。式（１）において、Ｇｌｔｎはゼラチンの残基を表し、Ｌは単結合、又は２価の連結基を表し、Ｒ１は炭素数１～２０のアルキル基であり、Ｒ２は水素原子又は炭素数１～２０のアルキル基である。

Description

癒着防止材、及び癒着防止材の製造方法

　本発明は、癒着防止材、及び癒着防止材の製造方法に関する。

　外科手術後において、術部の治癒過程や感染症によって臓器が腹壁に接着する術後癒着が高頻度で生じる。その発生率は６７％～９３％と高く、再手術を要するものは１５％～１８％であるとされる。術後癒着は痛みや腸閉塞を引き起こし、再手術を困難にする。その結果、再手術の時間が平均で１８分も長くなるという報告もある。従って、術後癒着を防止するための新しい戦略が必要とされている。

　術後癒着は、創傷部の激しい炎症反応によりフィブリンが過剰に腹膜と臓器間に沈着し、その後３日～５日で線維芽細胞やマクロファージを含む炎症細胞が遊走することで引き起こされる。従って、術後癒着を防ぐには、フィブリン沈着と、他の創傷部位からの炎症細胞の遊走とを防ぐ、物理的バリア材の導入が有望な戦略の一つである。報告されている癒着防止材（物理的バリア材）は、（１）溶液型、（２）フィルム型、（３）ハイドロゲル型の３種類に大きく分類される。

　ヒアルロン酸溶液をはじめとする（１）溶液型癒着防止材（剤）は、腹膜への臓器の癒着防止効果が認められており、（２）フィルム型癒着防止材も臨床の現場で広く使用されている。例えば、カルボキシメチルセルロース／ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ／ＣＭＣ）からなるフィルムは、術後の癒着防止によく用いられる。また、（３）ハイドロゲル型癒着防止材は、優れた注入性、ｉｎ　ｓｉｔｕでの迅速なゲル化挙動、組織形状への適合性を有することが特徴である。ハイドロゲル型癒着防止材としては、カルボキシメチルデキストリン、アミノ基・アルデヒド修飾ヒアルロン酸等が報告されている。

　ところで、発明者は、デシル基修飾スケトウダラゼラチンを用いた組織接着性微粒子（ゼラチン誘導体微粒子）を報告している（例えば、特許文献１）。本粒子は、創傷被覆材等に適用した場合に、生体組織への優れた接着力を有することから、癒着防止材への応用が期待されている。

国際公開第２０２０／１３７９０３号

　しかし、従来から知られている癒着防止材は様々な課題を有していた。例えば、（１）溶液型癒着防止材は、組織上での安定性が低く、早期に吸収されてしまう。（２）フィルム型癒着防止材は、柔軟性に欠け、手術グローブに張り付く。特に腹腔鏡手術では、その脆弱性により腹腔内への導入は困難であることが報告されている。また、（３）ハイドロゲル型癒着防止材は、デュアルシリンジを用いて２つの溶液を混合することにより、ｉｎ　ｓｉｔｕでハイドロゲルを形成する。ハイドロゲルの調製にはプレゲル溶液と架橋溶液の２液を必要とし、専用のシリンジが必要であることから、調製方法が煩雑であった。

　このため、組織上での接着性、及び水環境下での接着安定性に優れ、簡便な操作性を有する、新たな癒着防止材が求められていた。
　特許文献１では、ゼラチン誘導体微粒子が、組織接着性、水中安定性等に優れることが開示されている。しかし、癒着防止材への応用を考えた場合には、更なる改良が必要であった。また、癒着防止材には、工業的に容易に大量生産可能な特性も求められていた。

　本発明は上記課題を解決するものである。即ち、本発明は、組織上での接着性、及び水環境下での接着安定性に優れ、簡便な操作性を有し、更に工業的大量生産が容易な新しい癒着防止材を提供することを目的とする。

　本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意検討した結果、以下の構成により上記課題を達成することができることを見出した。

［１］粒子を含む癒着防止材であって、
　前記粒子は、第１ゼラチンと、第１ゼラチンに炭化水素基が導入されている第２ゼラチンとのゼラチン混合物の架橋物を含み、
　前記ゼラチン混合物の炭化水素基導入率が、３０ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％であり、
　第２ゼラチンが、後述する式（１）で表される構造を有する、癒着防止材。
［２］式（１）において、Ｌは単結合、又は－Ｃ（Ｏ）－である、［１］の癒着防止材。
［３］式（１）において、Ｌは単結合である、［２］の癒着防止材。
［４］　式（１）において、Ｒ^１は直鎖のアルキル基であり、Ｒ^２は水素原子である、［１］～［３］のいずれかに記載の癒着防止材。
［５］第２ゼラチンの炭化水素基導入率が、前記ゼラチン混合物の炭化水素基導入率より高い、［１］～［４］のいずれかに記載の癒着防止材。
［６］第２ゼラチンの炭化水素基導入率が、３５ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％である、［１］～［５］のいずれかに記載の癒着防止材。
［７］前記ゼラチン混合物の炭化水素基導入率が、３５ｍｏｌ％～４５ｍｏｌ％である、［１］～［６］のいずれかに記載の癒着防止材。
［８］第１ゼラチンと第２ゼラチンとの合計質量に対する、第２ゼラチンの質量の割合が３５質量％～９０質量％である、［１］～［７］のいずれかに記載の癒着防止材。
［９］第１ゼラチンがアルカリ処理済みゼラチンである、［１］～［８］のいずれかに記載の癒着防止材。
［１０］第１ゼラチンが低エンドトキシン化処理済みゼラチンである、［１］～［９］のいずれかに記載の癒着防止材。
［１１］第１ゼラチンが冷水魚由来である、［１］～［１０］のいずれかに記載の癒着防止材。
［１２］生体の患部に噴霧システムを用いて付与可能である、［１］～［１１］のいずれかに記載の癒着防止材。
［１３］［１］～［１２］のいずれかに記載の癒着防止材の製造方法であって、
　第１ゼラチンと第２ゼラチンとの前記ゼラチン混合物を良溶媒に溶解させて、ゼラチン混合物溶液を調製することと、
　前記ゼラチン混合物溶液に貧溶媒を加え、前記ゼラチン混合物を含有する第１中間体粒子を前記ゼラチン混合物溶液中に析出させることと、
　第１中間体粒子を含む前記ゼラチン混合物溶液を凍結乾燥し、第２中間体粒子を得ることと、
　前記第２中間体粒子の前記ゼラチン混合物を架橋して、架橋された前記ゼラチン混合物の粒子を得ることを含む、癒着防止材の製造方法。
［１４］前記第２中間体粒子を加熱し、前記ゼラチン混合物を架橋させる、［１３］に記載の癒着防止材の製造方法。

　本発明の癒着防止材は、組織上での接着性、及び水環境下での接着安定性に優れ、簡便な操作性を有し、更に工業的大量生産が容易である。

本実施形態の癒着防止材（粒子）の構成、及び製造方法を説明する模式図である。本実施形態の癒着防止材（粒子）の機能を説明する模式図である。生体（ラット）内における、本実施形態の癒着防止材（粒子）の機能を説明する模式図である。本実施形態の癒着防止材（粒子）のスプレーシステムを用いた付与について説明する模式図である。実施例で作製した粒子のＳＥＭ（Ｓｃａｎｎｉｎｇ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）画像である。スケールバーは、１０μｍを示す。実施例で作製した粒子の粒度分布を示す図である。実施例で作製した粒子を内視鏡用スプレーデバイスで噴霧している写真である。実施例で作製した粒子のコロイドゲルの含水率の時間依存性（水和時間と含水率との関係）を示すグラフである。実施例で作製した粒子の凝集挙動を示す明視野顕微鏡写真である。スケールバーは２０μｍを示す。実施例におけるＩｎ　ｖｉｔｒｏでの組織接着・非接着試験の手順を説明する模式図である。実施例におけるＩｎ　ｖｉｔｒｏでの組織接着・非接着試験における、水和時間と接着強度との関係を示すグラフである。実施例におけるＩｎ　ｖｉｔｒｏでの組織接着・非接着試験後の、上下治具に固定された組織及びコロイドゲルのヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色画像である。実施例における水中安定性試験後の組織及びコロイドゲルのヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色画像である。実施例における水中安定性試験後の組織上のコロイドゲル残存面積を示すグラフである。実施例における、ＳＤラット盲腸－腹壁癒着モデルへの癒着防止材（粒子）適用実験を説明する写真である。（ａ）正常な盲腸（Ｃｅｃｕｍ）と腹膜（Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）の写真、（ｂ）盲腸擦過傷、及び腹壁欠損（図中では、「Ｄｅｆｅｃｔ」と表示される）を形成した写真、（ｃ）実施例で作製した粒子（ＭＰｓ）を欠損部全体に付与した写真、（ｄ）実施例で作製した粒子を生理食塩水で水和させて欠損上にコロイドゲルを形成した状態の写真。実施例における、ＳＤラット盲腸－腹壁癒着モデルへの癒着防止材（粒子）適用実験結果を示す写真である。実施例における、ＳＤラット盲腸－腹壁癒着モデルへの癒着防止材（粒子）適用実験結果（適用から１週間後（Ｗ１，１ｗｅｅｋ）の癒着スコア）を示すグラフである。実施例における、ＳＤラット盲腸－腹壁癒着モデルへの癒着防止材（粒子）適用実験結果（適用から２週間後（Ｗ２，２ｗｅｅｋｓ）の癒着スコア）を示すグラフである。

　以下、本発明について詳細に説明する。
　以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施形態に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に限定されるものではない。
　なお、本明細書において、「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。

　本明細書における基（原子群）の表記において、置換及び無置換を記していない表記は、本発明の効果を奏する範囲で、置換基を有さないものと共に置換基を有するものをも包含する。例えば、「アルキル基」とは、置換基を有さないアルキル基（無置換アルキル基）のみならず、置換基を有するアルキル基（置換アルキル基）をも包含する。このことは、各化合物についても同義である。

　本実施形態の癒着防止材は粒子を含み、該粒子は架橋されたゼラチン混合物を含む。ゼラチン混合物は、原料ゼラチン（「第１ゼラチン」の一例）と、原料ゼラチンに炭化水素基が導入されている疎水化ゼラチン（「第２ゼラチン」の一例）とを含む。

＜原料ゼラチン（第１ゼラチン）＞
　原料ゼラチンは、天然由来であってもよいし、合成されたもの（発酵、及び遺伝子組換え等を含む）であってもよい。又は天然由来の若しくは合成されたゼラチンに何らかの処理をしたものでもよい。より具体的には、ほ乳類、鳥類、及び魚類等の皮、骨、及び腱等から取得された天然由来のゼラチン；天然由来のゼラチンを酸又はアルカリで処理した（必要に応じて加熱抽出された）処理済みゼラチン；等が挙げられる。なかでも、より優れた本発明の効果を有する粒子が得られる点で、アルカリ処理済みゼラチンが好ましい。

　原料ゼラチンとしては、エンドトキシンの含有量が低減された低エンドトキシン化処理済みゼラチンが好ましい。低エンドトキシン化処理済みゼラチンとしては特に限定されず、公知のものが使用できる。例えば、特開２００７－２３１２２５号公報に記載のものが挙げられる。この内容は参照により本明細書に組み込まれる。

　ほ乳類由来のゼラチンとしては、ブタ、及びウシ由来のゼラチンが挙げられる。魚類由来のゼラチンとしては、特に限定されないが、なかでも、サケ、マス、タラ、スケトウダラ、タイ、ティラピア、及びマグロ等の冷水魚（冷水性魚類）由来のゼラチン（以下「冷水魚由来ゼラチン」ともいう。）が好ましい。

　冷水魚由来ゼラチンは、２個以上のアミノ酸が直鎖状に連結された高分子である。冷水魚由来ゼラチンは、構成アミノ酸１０００個当たり、１９０個以下のイミノ酸を有している。より具体的には、８０個以下のヒドロキシプロリン（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ）と、１１０個以下のプロリンを有している。冷水魚由来ゼラチンの常温流動性は、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ）の数が８０個以下であること、又はプロリンの数が１１０個以下であることに起因すると考えられる。いずれかの条件を満たせば、変性温度がほぼ室温以下となり、常温流動性が生じると考えられる。

　タイゼラチンのヒドロキシプロリン数は７３、プロリン数は１０８で変性温度（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）は３０２．５Ｋである。ティラピアゼラチンのヒドロキシプロリン数は８２、プロリン数は１１０で変性温度は３０９Ｋである。これらに対して、ブタゼラチンのヒドロキシプロリン数は９５、プロリン数は１２１で変性温度は３１６Ｋである。

　尚、冷水魚由来ゼラチンのアミノ酸配列は、動物由来のゼラチンのものと類似しており、酵素により容易に分解され得る。また生体親和性も高い。

　原料ゼラチンの分子量としては特に限定されないが、重量平均分子量（Ｍｗ）として、５，０００～１００，０００が好ましく、１０，０００～５０，０００がより好ましく、２０，０００～４０，０００が更に好ましい。なお、本明細書において重量平均分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により求めた重量平均分子量を意味する。

　原料ゼラチンは、１種類のゼラチンのみから構成されてもよいし、２種類以上のゼラチンの混合物であってもよい。

＜疎水化ゼラチン（第２ゼラチン）＞
　本願明細書において、「疎水化ゼラチン」とは、原料ゼラチンに炭化水素基が導入されたゼラチン誘導体を意味する。疎水化ゼラチンは、下記式（１）で表される構造を有する。

　式（１）において、Ｇｌｔｎはゼラチンの残基を表し、Ｌは単結合、又は２価の連結基を表し、Ｒ^１は炭素数１～２０のアルキル基であり、Ｒ^２は水素原子又は炭素数１～２０のアルキル基である。

　式（１）において、ＧｌｔｎＮＨ－は、上述した原料ゼラチン由来の構造である。したがって、原料ゼラチンは、ＧｌｔｎＮＨ_２で表される。－ＣＨＲ^１Ｒ^２は、原料ゼラチンに導入された炭化水素基であり、Ｌ（単結合、又は２価の連結基）を介して原料ゼラチンに導入されている。

　Ｌの２価の連結基としては特に限定されないが、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ）－（Ｒは水素原子、又は１価の有機基（好ましくは炭素数１～２０個の炭化水素基）を表す）、アルキレン基（好ましくは炭素数２～１０のアルキレン基）、アルケニレン基（好ましくは炭素数２～１０のアルケニレン基）、及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。なかでも－Ｃ（Ｏ）－が好ましい。Ｌは、単結合、又は－Ｃ（Ｏ）－が好ましい。

　式（１）において、－ＣＨＲ^１Ｒ^２（炭化水素基）は、原料ゼラチンが有するε－アミノ基に結合したものであることが好ましく、原料ゼラチン中のリジン（Ｌｙｓ）のε－アミノ基に結合したものであることがより好ましい。アミノ基、好ましくはリジンのアミノ基に連結基を介して、又は介さずに（言い換えれば直接）、＊－ＣＨＲ^１Ｒ^２を結合させる方法としては、例えば、いわゆる還元（的）アミノ化反応（アルデヒド、又はケトンを用いる方法）、及びショッテン・バウマン（Ｓｃｈｏｔｔｅｎ－Ｂａｕｍａｎｎ）反応（酸クロライドを用いる方法）等を利用する方法が挙げられる。

　尚、式（１）の－ＮＨ－構造（２級アミノ基）は、例えばＦＴ－ＩＲ（フーリエ変換赤外吸収）スペクトルにおいて３３００ｃｍ^－１付近のバンドにより検出することができる。

　式（１）において、Ｒ^１及びＲ^２の炭素数１個～２０個の炭化水素基としては特に限定されず、例えば、炭素数１個～２０個の鎖状炭化水素基、炭素数３個～２０個の脂環式炭化水素基、炭素数６個～１４個の芳香族炭化水素基、及びこれらを組み合わせた基が挙げられる。

　Ｒ^２が１個～２０個の炭化水素基である場合、Ｒ^２は、Ｒ^１と同一でも異なってもよい。また、Ｒ^１、及びＲ^２のアルキル基は直鎖状であっても、分岐鎖状であってもよい。

　炭素数１～２０個の鎖状炭化水素基としては、特に限定されないが、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ヘキシル基、オクチル基（又はカプリル基）、ノニル基（又はペラルゴルニル基）、デシル基、ドデジシル基（又はラウリル基）、及びテトラデシル基（又はミリスチル基）等が挙げられる。なかでもより優れた接着性を有する粒子が得られ易い点で、Ｒ^１が炭素数１個～１３個のアルキル基であることが好ましく、炭素数７個～１２個のアルキル基であることがより好ましく、炭素数８個～１１個のアルキル基であることが更に好ましく、炭素数９個～１１個のアルキル基であることが特に好ましい。Ｒ^２としては特に限定されないが、水素原子であることが好ましい。

　炭素数３個～２０個の脂環式炭化水素基としては、例えば、シクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、アダマンチル基、及び、ノルボルニル基等が挙げられる。

　炭素数６個～１４個の芳香族炭化水素基としては、特に限定されないが、フェニル基、トリル基、及びナフチル基等が挙げられる。

　上記を組み合わせた基としては、特に限定されないが、例えば、ベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基、及び、ナフチルエチル基等の炭素数６～１２個のアラルキル基等が挙げられる。

　また、炭化水素基（－ＣＨＲ^１Ｒ^２）の炭素数の合計は、９個～２０個、９個～１８個、又は、９個～１４個が好ましい。また、炭化水素基（－ＣＨＲ^１Ｒ^２）において、Ｒ^１が直鎖のアルキル基であり、且つＲ^２が水素原子又は直鎖のアルキル基であることが好ましく、Ｒ^１は直鎖のアルキル基であり、且つＲ^２は水素原子であることがより好ましい。

　式（１）で表される疎水化ゼラチンとしては、以下の式（２）及び式（３）からなる群より選択される少なくとも１つが好ましく、式（２）で表されるゼラチン誘導体がより好ましい。

　式（２）は、式（１）においてＬが単結合の場合である。式（２）では、炭化水素基（－ＣＨＲ^１Ｒ^２）が、イミノ結合（－ＮＨ－）を介して原料ゼラチンのゼラチン残基Ｇｌｔｎに導入されている。
　式（３）は、式（１）においてＬが－Ｃ（Ｏ）－の場合である。式（３）では、炭化水素基（－ＣＨＲ^１Ｒ^２）が、アミド結合（－ＮＨＣＯ－）を介して原料ゼラチンのゼラチン残基Ｇｌｔｎに導入されている。
　式（２）及び式（３）中、各記号の意味はすでに説明した式（１）と同様であり、好適形態も同様である。

　疎水化ゼラチンは、１種類のゼラチン誘導体のみから構成されてもよいし、２種類以上のゼラチン誘導体の混合物であってもよい。

　ここで、疎水化前のゼラチン（原料ゼラチン）中のアミノ基（－ＮＨ_２）の含有量に対する、疎水化ゼラチン中におけるアルキル基が結合されたイミノ基（＊－ＮＨ－ＣＨＲ^１Ｒ^２）の含有量のモル比を「炭化水素基導入率」と定義する。

　疎水化ゼラチンの炭化水素基導入率は、後述するゼラチン混合物の炭化水素基導入率より高い値であれば特に限定されない。疎水化ゼラチンの炭化水素基導入率は、例えば、３５ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％～７０ｍｏｌ％、又は４５ｍｏｌ％～６０ｍｏｌ％であってよい。換言すれば、疎水化ゼラチンにおける、イミノ基／アミノ基（モル比）は、３５／６５～８０／２０、４０／６０～７０／３０、又は４５／５５～６０／４０であってよい。疎水化ゼラチンの炭化水素基導入率が上記範囲内であれば、後述するゼラチン混合物の炭化水素基導入率を特定の範囲に調整し易くなる。その結果として、本実施形態の癒着防止材（粒子）に適度な疎水性が付与される。

　なお、実施形態において、炭化水素基導入率は、原料ゼラチンのアミノ基数と、疎水化ゼラチンのアミノ基数を、２，４，６-トリニトロベンゼンスルホン酸法（ＴＮＢＳ法）によって定量し、得られた値から、以下の式により算出される。

疎水化ゼラチンの炭化水素基導入率（モル％）
＝［原料ゼラチンのアミノ基数－疎水化ゼラチンのアミノ基数］
／［原料ゼラチンのアミノ基数］×１００

　疎水化ゼラチン1分子中に導入される炭化水素基（－ＣＨＲ^１Ｒ^２）の数は特に限定されない。炭化水素基の数は、原料ゼラチンの分子量に基づいて、炭化水素基導入率が所定の値となるように適宜調整され得る。例えば、疎水化ゼラチン1分子中の炭化水素基の数は、５個～１０個、６個～９個、又は６個～８個としてよい。

　疎水化ゼラチンの分子量は特に限定されない。疎水化ゼラチンの分子量は、原料ゼラチンの分子量と導入された炭化水素基の種類と量（数）によって決定される。したがって、疎水化ゼラチンの重量平均分子量（Ｍｗ）の取り得る範囲は、上述の原料ゼラチンの重量平均分子量の取り得る範囲とほぼ同じである。

　以上説明した疎水化ゼラチンは、市販品であってもよいし、自家合成品であってもよい。疎水化ゼラチンは、例えば、特許文献１に開示される合成方法により、原料ゼラチンに疎水基（炭化水素基）を導入して合成してもよい。特許文献１に開示される疎水化ゼラチン（ゼラチン誘導体）の合成方法に関する内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

＜粒子＞
　本実施形態の粒子は、ゼラチン混合物の架橋物を含む。ゼラチン混合物は、上述の原料ゼラチン（第１ゼラチン）と、疎水化ゼラチン（第２ゼラチン）との混合物である（図１参照）。上述のように、原料ゼラチンと疎水化ゼラチンは、基本骨格が同一である。このため、これらの混合物では架橋反応が均一に進み、得られる粒子（架橋物）の組成も均一であり、後述する本実施形態の効果を奏し易い。

　ゼラチン混合物の炭化水素基導入率は、以下の式（Ｉ）によって算出できる。

Ｘｍ：ゼラチン混合物の炭化水素基導入率（ｍｏｌ％）
Ｘｃ：疎水化ゼラチンの炭化水素基導入率（ｍｏｌ％）
Ａ：原料ゼラチンと疎水化ゼラチンとの合計質量に対する、第２ゼラチンの質量の割合（質量％）

　ゼラチン混合物の炭化水素基導入率は、３０ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％であり、又は、３５ｍｏｌ％～４５ｍｏｌ％であってよい。ゼラチン混合物の炭化水素基導入率がこの範囲であれば、癒着防止材（粒子）に適度な疎水性を付与でき、後述する本実施形態の効果を奏し易くなる。

　原料ゼラチンと、疎水化ゼラチンとの混合比率は特に限定されない。混合比率は、疎水化ゼラチンの炭化水素基導入率に基づいて調整され得る。一形態として、ゼラチン混合物の炭化水素基導入率が特定の値となるように、適宜調整され得る。例えば、原料ゼラチンと疎水化ゼラチンとの合計質量に対する、第２ゼラチンの質量の割合（Ｘｃ）は、３５質量％～９０質量％、３５質量％～７０質量％、又は３５質量％～５０質量％とすることができる。

　本実施形態の粒子は、架橋されたゼラチン混合物（ゼラチン混合物の架橋物）を含む。本願明細書において「架橋された」とは、可逆的な物理架橋構造は含まず、不可逆的な架橋反応により得られる架橋構造を意味する。したがって、「架橋されたゼラチン混合物（ゼラチン混合物の架橋物）」は、架橋反応により得られる不可逆的な架橋構造を有する。架橋反応は、ゼラチン混合物に熱、光、エネルギー線などでエネルギーを付与することで起こる。また、架橋反応は、架橋剤によっても起こる。架橋されたゼラチン混合物における架橋反応は、上記の一方、又は、両方によって起こされ得る。

　粒子は、架橋剤（原料ゼラチン及び疎水化ゼラチンとは異なる化合物）によってゼラチン混合物を架橋したものであってもよい。架橋剤を用いない場合、架橋剤に由来する不純物の発生が無く安全である点で、好ましい。この場合、架橋は、例えば、ゼラチンの側鎖の官能基（－ＮＨ_２、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＣＯＯＨ等）間の反応を通じて生じる。架橋されたゼラチン混合物を含有する粒子は、接着強度が増強するため、より癒着防止材等に適する。

　本発明の実施形態において、粒子は、ゼラチン混合物の架橋物のみから構成されていてもよい。また、本発明の効果を奏する範囲内においてその他の成分を含有していてもよい。
　粒子中における、ゼラチン混合物の架橋物の割合（含有量）は特に限定されない。より優れた本発明の効果を有する粒子が得られ易い点で、架橋物の割合は、１００質量％、９８質量％以上、又は９０質量％以上であってよい。
　粒子が含有してもよいその他の成分としては特に限定されないが、例えば、溶媒、緩衝化剤、着色料、保存料、賦形剤、及び薬剤（抗血栓薬、抗菌剤、及び、成長因子等）等が挙げられる。

　本実施形態の粒子の平均粒子径は特に限定されないが、例えば、０．５μｍ～５０μｍであり、好ましくは１μｍ～３０μｍであり、より好ましくは１μｍ～１０μｍである。本願明細書における「平均粒径」は、電子顕微鏡によってランダムに１００個の粒子の粒径（長径）を測定して平均することによって求められた値である。

＜癒着防止材＞
　以上説明した粒子は、癒着防止材として使用可能である。癒着防止材は、手術後の癒着の軽減を目的に、手術時に適用部位に直接使用する生体吸収性の合成材料として定義され（「特定医療材料及びその材料価格（材料価格基準）」平成２８年厚生労働省告示第４０２号）る。癒着防止材は、一般的には「癒着防止吸収性バリア」と呼ばれる。

　本実施形態の癒着防止材は、以下の利点を有する。
　まず、本実施形態の癒着防止材は粒子であるため、シートタイプの癒着防止材と比較して取り扱いが容易である。更に、本実施形態の癒着防止材（粉体）は１液型であり、架橋剤等が不要である。このため、２液型と比較して低コストで、且つ取り扱いも容易である。本実施形態の癒着防止材は、汎用の噴射システムを用いて患部（欠損部）に付与可能である。これにより、腹腔鏡手術のみならず、内視鏡手術においても容易に使用できる。

　図４は、本実施形態の癒着防止材（粒子）のスプレーシステムを用いた付与について説明する模式図である。生体内の組織４１には、欠損部３７が存在する。これに対し、癒着防止材である粒子１０（例えば「Ｃ１０－ＭＰｓ」）が、スプレーデバイス（図中「Ｓｐｒａｙ」）により付与（噴霧）される。
　すなわち、本実施形態の癒着防止材（粒子）は、欠損部３７に「スプレー可能」という特徴を有する。

　本実施形態の癒着防止材（粒子）は、ゼラチン混合物の架橋物を含む。ゼラチン混合物は、上述のように特定範囲の炭化水素基導入率を有する。その結果、本実施形態の粒子は、適度な疎水性を有する。
　この適度な疎水性により、例えば、外科手術において患部の組織上に付与された粒子は、水和し、粒子間の疎水性相互作用により融合してコロイドゲル層を形成する。このコロイドゲルの層が、物理バリアとなり、癒着防止能を発現する。

　図２は、癒着防止材（粒子）の機能を説明する模式図である。
　まず、癒着防止材である粒子１０が組織に付着する（Ａ）。組織は、漿膜層２２、筋層２３、粘膜下層２４、及び粘膜層２５の積層構造とされ、その表面には、水層２６が存在する。
　粒子１０が組織に付着すると、水層２６によって徐々に水和される（Ｂ）。組織表面に付着した粒子１０は、漿膜層２２上に、コロイドゲル３８の層（コロイドゲル層）を形成する（Ｃ）。コロイドゲル（ｃｏｌｌｏｉｄａｌ　ｇｅｌ）３８の層は、疎水性相互作用２１により、漿膜層２２に強く接着する。一方で、コロイドゲル３８は、他の組織との間では、非接着性２０を示す。

　図３は、生体（ラット）内における、本実施形態の癒着防止材（粒子）の機能を説明する模式図である。ラット３０の腹部３１の内部（腹腔３６）、及び盲腸３９にそれぞれ欠損部３７（３７ａ、３７ｂ）が存在する。画像３２は、癒着防止材（粒子１０）の処置前の状態を表す。
　次に、癒着防止材（粒子１０）が欠損部３７に付与される（矢印４４）。画像３３は、癒着防止材（粒子１０）が付与された状態を表す。欠損部３７ａ、３７ｂに、それぞれ粒子１０が付与されて水和する。これにより、欠損部３７ａ、３７ｂ上にコロイドゲル３８ａ、３８ｂの層が形成される。

　画像３４は、Ａ－Ｂ部分の組織断面の模式図である。組織４１上には、水和された粒子１０によるコロイドゲル３８ｂの層が形成される。コロイドゲル３８ｂの層は、他の組織に対しては（矢印４２）物理的バリアとしての非接着性を発揮する。一方、組織４１側（矢印４３）については粒子１０と組織４１間での疎水性相互作用による組織接着性を発揮する。これにより、組織４１と、他の組織との癒着が抑制される。

　癒着防止材（粒子１０）を用いない場合（矢印４５）について説明する。画像３５は、癒着防止材（粒子１０）を用いない状態を表す。この場合、欠損部３７ａ、３７ｂは互いに癒着４０する。

　適度な疎水性を有する本実施形態の粒子のコロイドゲル層は、患部組織表面の水分を吸収するとともに、粒子－患部組織間で疎水性相互作用を形成し、患部表面に強く接着する。一方で、完全に水和した後は、コロイドゲル層表面の水分、及び組織表面（コロイドゲル層が形成されている組織とは異なる、他の組織の表面）の水分の存在により、コロイドゲル層は別の組織に対して接着性を示さなくなる。このように、本実施形態の癒着防止材（粒子）は、患部組織に対する接着性と、他の組織に対する非接着性（癒着防止能）との両機能を有する（図２及び図３参照）。従来の一般的な癒着防止材は、物理バリアとして機能するが、湿潤状態では軟組織に対する接着性が低く、組織欠損部（患部）から容易に剥離してしまうという課題を有していた。本実施形態の癒着防止材は、上述のようにこの課題を解決することができる。

　癒着防止材は、一定期間の間、湿潤状態で患部に安定に存在することが求められる。癒着防止材が生理的環境（湿潤状態）下において患部に安定に接着されていない場合、フィブリン沈着や線維芽細胞の遊走により、術後癒着が誘発される虞がある。適度な疎水性を有する本実施形態の癒着防止材は、コロイドゲル層－患部組織間で疎水性相互作用を形成し、これにより湿潤状態においても高い安定性を示す。

　胃、十二指腸、大腸などの消化器は、蠕動運動により頻繁に収縮する。従って、形状が変化する組織上での癒着防止材の追従性は重要な性質である。本実施形態の癒着防止材は、コロイドゲル層が患部組織に強固に接着し、組織の変形に対して優れた追従性を示す。また、本実施形態の癒着防止材は、コロイドゲル層が癒着防止効果を発揮した後、そのコロイドゲル層は速やかに分解吸収されるという特長を有する。

　また、癒着防止材（粒子）を一種類の疎水化ゼラチンのみから作製する場合、炭化水素基導入率を特定の値に調整する手順は煩雑である。収率等を考慮して、炭化水素基の導入率を調整するとともに、確認のための測定が必要だからである。
　本実施形態の癒着防止材（粒子）は、原料ゼラチン（第１ゼラチン）と、疎水化ゼラチン（第２ゼラチン）との混合物を用いるため、この点にも優位性がある。
　本実施形態の癒着防止材（粒子）は、疎水化ゼラチンの炭化水素基導入率（Ｘｃ）に基づいて、原料ゼラチンと疎水化ゼラチンとの混合比率（Ａ）を調整するだけでよい。これにより、ゼラチン混合物の炭化水素基導入率（Ｘｍ）、即ち、癒着防止材（粒子）の疎水性を容易に調整できる（上述の式（Ｉ）参照）。

　また、混合比率（Ａ）を変えることで、１種類の疎水化ゼラチンから、疎水性の程度の異なる複数種類の癒着防止材を作製することも可能である。また、癒着防止材を一種類の疎水化ゼラチンのみから作製する場合と比較して、疎水化ゼラチンの使用量が少なくて済む。本実施形態の癒着防止材は、疎水化ゼラチンに原料ゼラチンを混合して使用するからである。
　疎水化ゼラチンは、原料ゼラチンから合成されるため、合成の手間がかかり、また製造コストも原料ゼラチンより高い。所定の疎水性を有する粒子を製造するために必要な疎水化ゼラチンの量が相対的に少なくなりやすい点でも、本実施形態の癒着防止材は優れている。合成の手間、製造コストは、原料ゼラチンへの疎水性基の導入量ではなく、合成すべき疎水化ゼラチンの量、及び、その回数により大きく依存するからである。結果として、合成の手間が省け、製造コストを抑制できる。
　以上説明した利点を有する本実施形態の癒着防止材は、工業的大量生産に適しており、大量生産することで、更に製造コストを下げることが可能となる。

　本実施形態の粒子は癒着防止材として用いられるが、同時に、創傷被覆材としても使用可能である。即ち、創傷被覆、及び癒着防止の２つの機能を有する部材として使用できる。例えば、術後の損傷部に適用すれば、創傷被覆効果と癒着防止効果とを有する膜が形成される。従来、創傷被覆材と癒着防止材とを別々に適用していたのと比較して、より簡便に両者を達成できる。更に、本発明の実施形態に係る粒子は、血液凝固能に優れ、止血材としても使用可能である。創傷被覆、及び癒着防止という機能に加え、血液凝固能を有する部材の形成用としても使用できる。

＜粒子の製造方法＞
　本実施形態の粒子の製造方法は特に限定されない。例えば、特許文献１に開示されるコアセルベーション法を利用して製造してもよい。特許文献１に開示される粒子の製造方法に関する内容は、参照により本明細書に組み込まれる。以下に、本実施形態の粒子の製造方法の一例を説明する。

　本実施形態の製造方法は、例えば、以下の各工程を含む。
　工程１：原料ゼラチンと疎水化ゼラチンとのゼラチン混合物を良溶媒に溶解させて、ゼラチン混合物溶液を調製する工程、
　工程２：ゼラチン混合物溶液に貧溶媒を加え、ゼラチン混合物を含有する第１中間体粒子をゼラチン混合物溶液中に析出させる工程、
　工程３：第１中間体粒子を含むゼラチン混合物溶液を凍結乾燥し、第２中間体粒子を得る工程、
　工程４：第２中間体粒子のゼラチン混合物を架橋させて、架橋されたゼラチン混合物の粒子を得る工程。

工程１：
　工程１は、すでに説明したゼラチン混合物を良溶媒に溶解させ、ゼラチン混合物溶液を得る工程である。本明細書において、良溶媒とは、ゼラチン混合物を溶解させやすい溶媒を意味する。その種類は特に限定されないが、水、グリセリン、酢酸、及びこれらの混合物等が挙げられ、なかでも水を含有することが好ましい。また、上記良溶媒は加温されてもよい。加温の際の温度としては特に限定されないが、５０℃～７０℃が好ましい。

　ゼラチン混合物を良溶媒に溶解させる方法としては、特に限定されず、公知の方法が使用できる。例えば、ゼラチン混合物に低温（例えば室温）の良溶媒を加えてゼラチン混合物を膨潤させ、得られた膨潤体を加熱して、ゼラチン混合物溶液を得る方法（膨潤溶解法）、及び予め加熱した上記良溶媒にゼラチン混合物を投入し、ゼラチン混合物溶液を得る方法（直接溶解法）を使用できる。

　ゼラチン混合物溶液中のゼラチン混合物の含有量としては特に限定されないが、ゼラチン混合物溶液の全体積に対して、ゼラチン混合物の含有量（終濃度）が０．０１質量／体積％～３０質量／体積％が好ましく、１質量／体積％～２５質量／体積％がより好ましく、５質量／体積％～２０質量／体積％が更に好ましく、５質量／体積％～１５質量／体積％が特に好ましい。

工程２：
　工程２はゼラチン混合物溶液に貧溶媒を加え、ゼラチン混合物を含有する第１中間体粒子をゼラチン混合物溶液中に析出させる工程である（コアセルベーション）。本明細書において、貧溶媒とは、工程１で使用した良溶媒と比較した場合に、ゼラチン混合物をより溶解させ難い溶媒を意味する。すなわち、本明細書において、良溶媒、及び貧溶媒とは、ゼラチン混合物の溶解度の絶対量により定義されるのではなく、それぞれ貧溶媒及び良溶媒との関係で相対的に定義される。

　貧溶媒としては、特に限定されないが、例えば、有機溶媒が挙げられ、中でも、水溶性の有機溶媒が好ましく、アルコール類、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、及びｔ－ブチルアルコール等がより好ましい。

　ゼラチン混合物溶液に貧溶媒を加えると、ゼラチン混合物溶液中に第１中間体粒子が析出する。この第１中間体粒子は、上記ゼラチン混合物を含有する粒子状物である。本工程において析出する第１中間体粒子の粒子径としては特に限定されないが、０．１μｍ～１００μｍが好ましく、１μｍ～５０μｍがより好ましく、１μｍ～１０μｍが更に好ましい。粒子径が上記範囲内であると、ゼラチン混合物溶液中で析出した中間体粒子がより沈降しにくくなる。その結果、後述する工程３の凍結乾燥のプロセスにおいて、中間体粒子同士が凝集するのがより抑制されやすい。

　貧溶媒を加える際の温度としては特に限定されないが、一般に１０℃～３０℃が好ましく、１５℃～２５℃がより好ましい。工程１において、溶媒を加熱してゼラチン混合物を溶解させた場合には、工程１及び工程２の間に、ゼラチン混合物溶液を冷却する工程を更に有することが好ましい。

　貧溶媒を滴下する際、ゼラチン混合物溶液を撹拌することが好ましい。撹拌の方法としては特に限定されず、公知の方法が使用できる。ゼラチン混合物溶液を撹拌しながら貧溶媒を加えることにより、析出する粒子がより凝集しにくく、かつ、より沈降しにくい。

工程３：
　工程３は、上記コアセルベーションにより析出した未架橋ゼラチン粒子（第１中間体粒子）の分散溶液を凍結乾燥させ、第２中間体粒子を得る工程である。ゼラチン混合物溶液の凍結の方法としては特に限定されないが、より急速に凍結させることが好ましい。これにより、凍結させる際に未架橋ゼラチン混合物を含有する粒子がより凝集しにくくなる。
　凍結させる際の雰囲気温度としては特に限定されないが、－２０℃以下が好ましく、－３０℃以下がより好ましい。また、凍結乾燥の方法としては特に限定されず、公知の方法が使用できる。第２中間体粒子は、第１中間体粒子を含む粒子である。第２中間体粒子は第１中間体粒子以外の成分を含んでもよい。このような成分としては、例えば、上記良溶媒、及び貧溶媒等が挙げられる。

工程４：
　工程４は、第２中間体粒子のゼラチン混合物を架橋させて、架橋されたゼラチン混合物（架橋物）を含有する粒子を得る工程である。本工程を経て、粒子のゼラチン混合物が不可逆的に分子間、及び／又は分子内で架橋する。その結果、ゼラチン混合物の架橋物を含有する粒子が得られる。

　架橋の方法としては特に限定されないが、例えば、ゼラチン混合物に、熱エネルギーを付与し、又は活性光線若しくは放射線（例えば、電子線等）等を照射する方法が挙げられる。なかでも、より容易にゼラチン混合物の架橋物が得られ、架橋剤に由来する不純物の発生が無く安全な点で、熱エネルギーを付与する（言い換えれば加熱する）方法が好ましい（熱架橋）。この方法では、例えば、ゼラチン混合物中のアミノ基とその他の反応性基（例えば、カルボキシ基、及びメルカプト基等）が反応し、架橋構造が形成される。

　熱架橋の方法としては特に限定されず公知の方法が使用できる。熱架橋の方法としては、例えば、第２中間体粒子が収容された容器を、容器ごと加熱雰囲気（例えば、オーブン内）に配置し、所定の時間維持する方法が挙げられる。

　熱架橋の際の加熱温度としては特に限定されないが、一般に、８０℃～２００℃が好ましく、１００℃～２００℃がより好ましい。熱架橋の際の加熱時間としては特に限定されないが、一般に、０．１時間～２０時間が好ましく、０．５時間～１０時間がより好ましく、１時間～６時間が更に好ましく、２時間～５時間がより更に好ましく、２．５時間～４時間が特に好ましい。加熱時間が上記数値範囲内であると、得られる粒子は、より優れた接着性が得られやすい。

　また、ゼラチン混合物の架橋物は、ゼラチン混合物と、架橋剤とを反応させて得られたものであってもよい。架橋剤としては特に限定されないが、ゲニピン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ－スルホキシスクシンイミドで活性化された多塩基酸、アルデヒド化合物、酸無水物、ジチオカーボネート、及びジイソチオシアネート等が挙げられる。架橋剤としては、例えば、国際公開第２０１８／０７９５３８号の００２１段落～００２４段落に記載された化合物も使用でき、上記内容は本明細書に組み込まれる。

　以下に実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す実施例により限定的に解釈されるべきものではない。

１.粒子の作製
［疎水化ゼラチンの合成］
　原料ゼラチンとして、スケトウダラ由来ゼラチン（以下、適宜、「Ｏｒｇ－ＡｐＧｌｔｎ」又は単に「Ｏｒｇ」と記載する）を用いた。疎水化ゼラチンとして、Ｏｒｇ－ＡｐＧｌｔｎにデシル基が導入されたゼラチン誘導体（以下、適宜、「Ｃ１０－ＡｐＧｌｔｎ」と記載する）を用いた。疎水化ゼラチンは、デカナールを原料ゼラチンのアミノ基と反応させ、シッフ塩基を形成させた後に、得られたシッフ塩基を還元剤によって安定な第２級アミンに還元して得た。以下に、疎水化ゼラチンの合成の詳細を記載する。

　１００gのスケトウダラ由来ゼラチン（Ｏｒｇ－ＡｐＧｌｔｎ）（新田ゼラチン株式会社製、重量平均分子量（Ｍｗ）：３８，５５２Ｄａ、アミノ基含有量：３３９μｍｏｌ／ｇ）を１０５ｍＬの超純水に溶解しさせた。この溶液を５０℃に加熱して攪拌しながら、Ｏｒｇ－ＡｐＧｌｔｎのアミノ基量（３３９μｍｏｌ／ｇ）の２倍等量のデカナール（東京化成工業株式会社製、６７．８ｍｍｏｌ）をエタノール（純生化学株式会社製）と共に添加した。これにより、デカナールとＯｒｇ－ＡｐＧｌｔｎのアミノ基間にイミン結合を形成させた。

　上記の溶液を同温度（５０℃）で１時間撹拌した後、２－ピコリンボラン（純生化学株式会社製、５０．８５ｍｍｏｌ）をエタノールとともに加え、イミンを還元した。得られた混合溶液（Ｏｒｇ－ＡｐＧｌｔｎ濃度：２０質量／体積％、水：エタノール＝１０５：４５ｍＬ）を５０℃で１７時間攪拌し反応を進行させた。
　反応後の混合溶液（１５０ｍＬ）を１５００ｍＬの冷エタノール（－７～４℃）に滴下し、Ｃ１０－ＡｐＧｌｔｎを精製した。得られた再沈殿物を１５００ｍＬのエタノールで洗浄（１時間×３回）することで未反応のデカナール、及び２-ピコリンボランを除去した。その後、３日間真空乾燥し、Ｃ１０－ＡｐＧｌｔｎを収率９２．９質量％で得た。

　得られたＣ１０－ＡｐＧｌｔｎにデシル基が導入されていることは、フーリエ変換赤外分光法、及び^１Ｈ－ＮＭＲによって確認できた。また、Ｃ１０－ＡｐＧｌｔｎの炭化水素基導入率（以下、適宜、「デシル基導入率ＤＳ」又は単に「ＤＳ」と記載する）を算出した。ＤＳは、２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸法（ＴＮＢＳ法）によって定量された原料ゼラチンのアミノ基数と、疎水化ゼラチンのアミノ基数とから算出された。

　算出されたＣ１０－ＡｐＧｌｔｎのＤＳは、４９ｍｏｌ％であった。これは、１分子のＣ１０－ＡｐＧｌｔｎ中のアミノ基に６．４個のデシル基が導入されていることを意味する。以下、ＤＳが４９ｍｏｌ％の疎水化ゼラチンを４９Ｃ１０－ＡｐＧｌｔｎ（又は、単に「４９Ｃ１０」）と記載する場合がある。得られた４９Ｃ１０－ＡｐＧｌｔｎのＤＳ値等を表１にまとめて記載する。

［粒子の作製］
　疎水化ゼラチンの貧溶媒であるエタノールを用いたコアセルベーション法により、原料ゼラチン及び／又は疎水化ゼラチンを表２に示す比率で用いて、疎水性の異なる８種類の粒子を作製した（図１参照）。以下に、粒子作製の詳細を記載する。

＜試料１（４９Ｃ１０－ＭＰｓ）＞
　まず、合成した４９Ｃ１０－ＡｐＧｌｔｎを５０℃の超純水に溶解し、５質量／体積％Ｃ１０－ＡｐＧｌｔｎ水溶液を得た。次に、室温（２５℃）で撹拌（４００ｒｐｍ）しながら、溶液に等量のエタノールを少量ずつ滴下した。得られた溶液を－３０℃で２４時間仮凍結し、その後凍結乾燥した。得られた乾燥粒子を、真空条件下（３ｍｂａｒ未満）で、１５０℃、３時間加熱し、４９Ｃ１０－ＡｐＧｌｔｎのカルボキシ基とアミノ基間にアミド結合を形成させることで熱架橋した。これにより、４９Ｃ１０－ＡｐＧｌｔｎのみの架橋物である粒子（４９Ｃ１０－ＭＰｓ）を得た。

＜試料２（Ｏｒｇ－ＭＰｓ）＞
　疎水化ゼラチン（４９Ｃ１０－ＡｐＧｌｔｎ）に代えて、原料ゼラチン（Ｏｒｇ－ＡｐＧｌｔｎ）を用いた以外は、試料１と同様の方法により試料２を作製した。

＜試料３～８＞
　試料１では疎水化ゼラチン（４９Ｃ１０－ＡｐＧｌｔｎ）のみを用いたが、試料３～８では、それに代えて、原料ゼラチンと疎水化ゼラチンとの表２に示す混合比の混合物を用いた。それ以外は、試料１と同様の方法により試料３～８（１０Ｃ１０－ＭＰｓ～４５Ｃ１０－ＭＰｓ）を作製した。

　各試料１～８（粒子）の収率、粒子の原料（原料ゼラチン、疎水化ゼラチン、又はゼラチン混合物）のＤＳも併せて表２に示す。ＤＳは、上述した式（Ｉ）により算出した。

２.評価
［粒子のＳＥＭ観察、粒度分布］
　作製した試料１～８のＳＥＭ観察を行い、粒度分布を「Ｉｍａｇｅ　Ｊ」で解析した。図５Ａに示すように、全ての試料１～８は、マイクロスケールの粒子径の球体（マイクロ粒子）であった。また、図５Ｂに示すように、試料１～８の平均粒子径は、２～３μｍであり、各試料の粒度分布はＤＳによって変化しなかった。
　なお、図５Ａ、図５Ｂにおいて、「Ｏｒｇ」とあるのは、試料２の「Ｏｒｇ－ＭＰｓ」を表す。また、「１０Ｃ１０」とあるのは、試料３の「１０Ｃ１０－ＭＰｓ」を表す。その他、「２０Ｃ１０」「３０Ｃ１０」、「３５Ｃ１０」、「４０Ｃ１０」、「４５Ｃ１０」、「４９Ｃ１０」とあるのは、それぞれ、試料４、５、６、７、８、１をそれぞれ表す。

［噴霧テスト］
　作製した試料１～８について、内視鏡用スプレーデバイス（噴霧システム）を用いて噴霧テストを行った。図６に示すように、試料１～８は内視鏡用スプレーデバイスで噴霧可能であり、例えば、手術中に内蔵組織の表面に直接噴霧可能であることが確認できた。

［コロイドゲルの作製と評価］
＜コロイドゲルの含水率＞
　試料８（４５Ｃ１０－ＭＰｓ）５０ｍｇを厚さ１ｍｍ、直径１０ｍｍのシリコン製の鋳型に詰めてスパチュラを用いて平らにならした。３００μＬの生理食塩水（大塚製薬株式会社製）を滴下して所定時間（水和時間：１～３０分）水和させることで、コロイドゲルを作製した。その後、コロイドゲル表面の余分な水分を除去し、得られたコロイドゲルの重量（Ｗｗ）を測定した後、凍結乾燥させた。最後に、乾燥後のゲルの重量（Ｗｄ）を測定し、下記式により、各コロイドゲルの含水率を算出した。

　図７Ａに、試料８（４５Ｃ１０－ＭＰｓ）のコロイドゲル含水率の時間依存性（水和時間と含水率との関係）を示す。試料２（Ｏｒｇ－ＭＰｓ）についても、同様にコロイドゲル含水率の時間依存性を評価した。結果を合わせて図７Ａに示す。

　図７Ａから理解できるように、試料２（Ｏｒｇ－ＭＰｓ）及び試料８（４５Ｃ１０－ＭＰｓ）は徐々に水を吸収してコロイドゲルを形成し、３０分後には平衡膨潤に達した。また、５分以降の含水率においては、ＤＳの高い試料８（４５Ｃ１０－ＭＰ）の含水率（５３～６９％）の方が、試料２（Ｏｒｇ－ＭＰｓ）の含水率（６４～８２％）より低く、疎水性が高いことが確認できた。
　なお、試験はｎ＝３で行われ、図７Ａ中、「＊＊」は、Ｐ＜０．０１、「＊＊＊」はＰ＜０．００１を意味する。

＜粒子の融合観察＞
　湿潤環境下での粒子の凝集挙動を観察した。試料２（Ｏｒｇ－ＭＰｓ）及び試料８（４５Ｃ１０－ＭＰｓ）、それぞれ１０ｍｇを２００μＬの生理食塩水に添加して懸濁液を調製した。この懸濁液を最大で２時間培養した後、明視野顕微鏡（キーエンス株式会社製、ＢＺ－Ｘ７１０）を用いて、粒子の凝集挙動を観察した。明視野顕微鏡写真を図７Ｂに示す。

　Ｏｒｇ－ＭＰｓは、いずれの水和時間においても互いに孤立しており、粒子の融合は確認できなかった。一方、４５Ｃ１０－ＭＰｓは水和時間の経過とともに凝集し、疎水性相互作用によりコロイドゲルを形成していた。４５Ｃ１０－ＭＰｓは３０分の水和後では密にパッキングされた構造を示した。その後、６０分間水和させるとほぼ全ての４５Ｃ１０－ＭＰが互いに融合し大きな会合体を形成した。この結果は、４５Ｃ１０－ＭＰｓ間の疎水性相互作用が湿潤条件下でのコロイドゲル形成のドライビングフォースであることも示唆する。

［Ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの組織接着・非接着試験］
　コロイドゲルの組織への接着強度に及ぼす、水和時間の影響を評価した。試験方法は、米国試験材料協会の規格（ＡＳＴＭＦ－２２５８－０５）に従って行った（図８Ａ参照）。
　まず、新鮮なブタ胃（東京芝浦臓器から購入）を開き、粘膜層を取り除き、粘膜下組織である漿膜組織（８１）を露出させた。得られた漿膜組織（８１）を２．５ｃｍ四方の組織片へと裁断し、試験装置（Ｓｔａｂｌｅ　Ｍｉｃｒｏ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社の製、テクスチャーアナライザーＴＡ－ＸＴ２ｉ）の上下の治具（８０）のステージそれぞれにシアノアクリレート系（ヘンケルジャパン株式会社製）を用いて固定した。ホットプレート（８３）を用いることで測定中のブタ胃内壁組織の温度を３７℃に保った。

　上記組織表面の余分な水分を取り除くため、工業用紙ウエス（８２）（商品名「キムワイプ」）を８０ｋＰａで３分間押し付けて水分を取り除いた。その後、試料８（４５Ｃ１０－ＭＰｓ）１００ｍｇを、下治具のステージ上の組織を覆うように散布し、湿潤環境下で所定時間（水和時間：１～３０分間）水和させた。これにより、コロイドゲル（３８）の層を形成させた。具体的には、組織表面と試料８（４５Ｃ１０－ＭＰｓ）周辺の湿度を腸内環境に近づけるため、組織周辺に生理食塩水（８４）（７ｍＬ）を満たし、プラスチックカバー（８５）で組織を覆った。
　所定時間水和させた後、下治具の試料８（コロイドゲル３８）上に上治具を乗せて８０ｋＰａの圧力下で３分間圧着した。その後、上治具を１０ｍｍ／ｍｉｎで上昇させ、試料８（４５Ｃ１０－ＭＰｓ）の接着強度を測定した。図８Ｂに、水和時間と接着強度との関係を示す。試料２（Ｏｒｇ－ＭＰｓ）についても、同様の評価を行い、結果を図８Ｂに示す。また、コントロールとして、粒子を散布していない２つの組織間の接着強度も併せて図８Ｂに示す。

　更に、接着強度の測定後、組織切片を１０％ホルマリン緩衝液（和光純薬工業株式会社製）で固定し、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）で染色した後、コロイドゲルと組織の界面を観察した。光学顕微鏡写真を図８Ｃに示す。

　図８Ｂに示すように、試料２（Ｏｒｇ－ＭＰｓ）のコロイドゲルの接着強度は、水和時間の増大によって大きく変化しなかった（最大強度：２．７３ｋＰａ、最小強度：１．４８ｋＰａ）。一方、試料８（４５Ｃ１０－ＭＰｓ）のコロイドゲルの接着強度は、水和時間と共に５．２４ｋＰａから２．４１ｋＰａに減少し、３０分間の水和によって試料２（Ｏｒｇ－ＭＰｓ）のコロイドゲルの接着強度付近まで低下した。

　図８Ｃに示すＨＥ染色の観察から理解できるように、試料８（４５Ｃ１０－ＭＰｓ）のコロイドゲルは、１分間と３分間の水和では、上部と下部の双方の組織表面に接着していたが、３０分間の水和では、上部組織表面に接着したコロイドゲル量が減少した。この結果は、試料８（４５Ｃ１０－ＭＰｓ）が水和時間３０分で十分に水和してコロイドゲルを形成すると同時に、他の組織に対して非接着性となることを示している。粒子が水和する過程では、試料８（４５Ｃ１０－ＭＰｓ）は組織表面の水分を吸収するとともに粒子－組織間で疎水性相互作用を形成し強く接着することができる。そして、完全に水和した後は、コロイドゲル表面および組織表面の水分の存在によりコロイドゲル層は接着性を示さなくなる（癒着防止効果を示す）と考えられる（図２参照）。

［水中安定性試験］
　粒子のコロイドゲルの水中安定性は、コロイドゲルを胃組織（粘膜下層）に接着させた後に、生理食塩水に浸漬することにより評価した。まず、ブタの胃組織を２．５×２．５ｃｍに切り分けた。試料８（４５Ｃ１０－ＭＰｓ）５０ｍｇを組織上に直径１０ｍｍの円形に散布し、３００μＬの生理食塩水で３０分間水和させてコロイドゲルを形成させた。胃組織に接着したコロイドゲルを０．０５質量／体積％アジ化ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）を含む生理食塩水に浸漬し、３７℃で２日間培養した。その後、胃組織に接着したコロイドゲルを１０％ホルマリン緩衝液で固定し、ＨＥ染色後にコロイドゲルと組織との界面を観察した。光学顕微鏡写真を図９Ａに示す。試料１～７についても同様の評価を行い、結果を図９Ａに示す。

　更に、ＨＥ染色画像の画像解析により、胃組織上のコロイドゲル残存面積を定量化した。試料１～８の結果を図９Ｂに示す。尚、図９Ａ及び図９Ｂにおいて、各試料は、粒子名の前半部分（－ＭＰｓより前の部分）を記載している。例えば、粒子４５Ｃ１０－ＭＰｓ（試料８）は、「４５Ｃ１０」と表記した。

　図９Ａ及び図９Ｂに示すように、ＤＳ３０ｍｏｌ％未満の試料は、水中安定性試験後、組織表面にコロイドゲルはほぼ確認できなかった。一方で、ＤＳ３０ｍｏｌ％以上の試料のコロイドゲル、より好ましくはＤＳ３５ｍｏｌ％以上の試料のコロイドゲルは、生理食塩水に２日間浸漬しても高い水中安定性を示した。組織（４１）表面に残存するコロイドゲル（３８）面積は、ＤＳの増加とともに増加傾向にあり、粒子の疎水性の増大によって組織上のコロイドゲルの安定性が改善された。発明者らの先行研究（例えば、Ａｃｔａ　Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ　９９　（２０１９）　３８７－３９６）では、ゼラチンに導入された疎水基は、疎水性相互作用によりフィブロネクチンなどの細胞外タンパク質や細胞と相互作用することを明らかにしている。更に、胃組織は主にコラーゲンで構成されることが知られており、デシル基はコラーゲンの疎水性アミノ酸残基と相互作用したとも推測される。以上の結果と知見より、実施例で作製した粒子は胃組織上において細胞外タンパク質や細胞と相互作用し、これにより高い水中安定性を示したと推測される。

［Ｉｎ　ｖｉｖｏ癒着防止試験］
　まず、ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ）ラット（ジャクソン・ラボラトリー・ジャパン株式会社から購入、雄、７週齢）の腹壁－盲腸欠損モデルは以下の方法で作製した。２．５％イソフルランの導入によりラットを麻酔下とし、腹部の毛を剃り、エタノールで感染症を予防した。腹部を５ｃｍ程度開腹し、腹壁と盲腸を露出させた（図１０Ａの（ａ））。滅菌ガーゼを用いて盲腸を擦ることで、盲腸の擦過傷（盲腸欠損部）を作成した。盲腸欠損部と接する位置にある腹壁組織（１ｃｍ×２ｃｍ、中皮層を含む）を、外科用ナイフを用いて切除することで腹壁欠損を作製した（図１０Ａの（ｂ））。

　次に、１５０℃で３時間熱殺菌した試料８（４５Ｃ１０－ＭＰｓ）１００ｍｇを各欠損部に散布して創傷部を覆い（図１０Ａの（ｃ））、生理食塩水で１５分間水和することでコロイドゲルを形成させた（図１０Ａの（ｄ））。感染症を防ぐためにアミカマイシン（１．０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に注射した後、腹部を縫合し閉腹した。

　所定時間（１～２週間）経過後に再開腹し、表３に示す腹膜壁癒着スコア（５段階）で術後癒着を評価した。結果を図１０Ｃ及び図１０Ｄに示す。スコアが低い程、癒着が少ないことを示す。また、図１０Ｂに、閉腹直前（Ｗ０）、閉腹から１週間後（Ｗ１）及び２週間後（Ｗ２）における、盲腸及び腹膜付近の写真を示す。写真中の黒矢印は腹壁と盲腸間の癒着部位を示す。尚、試料８（４５Ｃ１０－ＭＰｓ）は、図１０Ｂにおいて「Ｃ１０」と表記し、図１０Ｃ及び図１０Ｄにおいて「Ｃ１０－ＭＰｓ」と表記した。なお、試験はｎ＝５で行われ、＊＊＊はＰ＜０．００１を表す。

　試料８（４５Ｃ１０－ＭＰｓ）に代えて、試料２（Ｏｒｇ－ＭＰｓ）、及びヒアルロン酸／カルボキシメチルセルロースシート（ＨＡ／ＣＭＣ）（市販の癒着防止材、科研製薬株式会社製、セプラフィルム（登録商標））それぞれを用いて同様の評価を行った。また、癒着防止材を付与しなかった未処置ラット（Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ）についても、同様の評価を行った。これらの評価結果を合わせて、図１０Ｂ～図１０Ｄに示す。尚、試料２（Ｏｒｇ－ＭＰｓ）は、図１０Ｂにおいて「Ｏｒｇ」と表記した。

　１週間後、未処置ラット群（Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ）では重度の癒着（平均スコア：２．８０）が見られ（図１０Ｃ）、盲腸と腹壁の間には癒着層が形成されていた（図１０Ｂ）。これは組織間の物理的バリアがないことから、過剰なフィブリン沈着とマクロファージや線維芽細胞の遊走を引き起こし、盲腸と腹膜間に線維組織（ＦＴ）が形成され、術後癒着を形成したと考えられる。一方、試料８（４５Ｃ１０－ＭＰｓ）及び試料２（Ｏｒｇ－ＭＰｓ）、および市販のＨＡ／ＣＭＣシートを投与した群では、癒着は認められなかった（図１０Ｂ、平均スコア：全群０）。この結果は、コロイドゲルや市販シートが、フィブリンや炎症細胞の移動を効果的に防いだためと考えられる。

　２週間後、未処置ラット群（Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ）においては１週間後よりも高いスコアで重度の癒着が確認された（図１０Ｃ、図１０Ｄ）。他の群では１週間後と比較して若干の癒着スコアの上昇を認めた。ＨＡ／ＣＭＣ投与群では癒着スコアの上昇（スコア：２および３）が認められ、これまでの知見と同様であった。また試料２（Ｏｒｇ－ＭＰｓ）投与群では５匹に１匹の割合で癒着（スコア：２）が見られたが、試料８（４５Ｃ１０－ＭＰｓ）投与群では1匹に軽い癒着が見られたのみであった。

　以上説明した癒着防止試験の結果より、試料８（４５Ｃ１０－ＭＰｓ）は水和することにより盲腸擦過傷および腹膜欠損部に接着してコロイドゲル層を形成し、該コロイドゲル層は、水和後に癒着防止にための物理的バリアとして機能して術後癒着を防止することが確認できた。

　本発明は、組織上での接着性、及び水環境下での接着安定性に優れ、簡便な操作性を有し、更に工業的大量生産が容易な新しい癒着防止材を提供する。

１０　粒子、２２　漿膜層、２３　筋層、２４　粘膜下層、２５　粘膜層、２６　水層、３０　ラット、３１　腹部、３６　腹腔、３７、３７ａ、３７ｂ　欠損部、３８、３８ａ、３８ｂ　コロイドゲル、３９　盲腸、４０　癒着、４１　組織、８０　治具、８１　漿膜組織、８２　工業用紙ウエス、８３　ホットプレート、８４　生理食塩水、８５　プラスチックカバー

Claims

　粒子を含む癒着防止材であって、
　前記粒子は、第１ゼラチンと、第１ゼラチンに炭化水素基が導入されている第２ゼラチンとのゼラチン混合物の架橋物を含み、
　前記ゼラチン混合物の炭化水素基導入率が、３０ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％であり、
　第２ゼラチンが、下記式（１）で表される構造を有する、癒着防止材。

　式（１）において、Ｇｌｔｎはゼラチンの残基を表し、Ｌは単結合、又は２価の連結基を表し、Ｒ^１は炭素数１～２０のアルキル基であり、Ｒ^２は水素原子又は炭素数１～２０のアルキル基である。
　式（１）において、Ｌは単結合、又は－Ｃ（Ｏ）－である、請求項１に記載の癒着防止材。
　式（１）において、Ｌは単結合である、請求項２に記載の癒着防止材。
　式（１）において、Ｒ^１は直鎖のアルキル基であり、Ｒ^２は水素原子である、請求項１～３のいずれか一項に記載の癒着防止材。
　第２ゼラチンの炭化水素基導入率が、前記ゼラチン混合物の炭化水素基導入率より高い、請求項１～４のいずれか一項に記載の癒着防止材。
　第２ゼラチンの炭化水素基導入率が、３５ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％である、請求項１～５のいずれか一項に記載の癒着防止材。
　前記ゼラチン混合物の炭化水素基導入率が、３５ｍｏｌ％～４５ｍｏｌ％である、請求項１～６のいずれか一項に記載の癒着防止材。
　第１ゼラチンと第２ゼラチンとの合計質量に対する、第２ゼラチンの質量の割合が３５質量％～９０質量％である、請求項１～７のいずれか一項に記載の癒着防止材。
　第１ゼラチンがアルカリ処理済みゼラチンである、請求項１～８のいずれか一項に記載の癒着防止材。
　第１ゼラチンが低エンドトキシン化処理済みゼラチンである、請求項１～９のいずれか一項に記載の癒着防止材。
　第１ゼラチンが冷水魚由来である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の癒着防止材。
　生体の患部に噴霧システムを用いて付与可能である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の癒着防止材。
　請求項１～１２のいずれか一項に記載の癒着防止材の製造方法であって、
　第１ゼラチンと第２ゼラチンとの前記ゼラチン混合物を良溶媒に溶解させて、ゼラチン混合物溶液を調製することと、
　前記ゼラチン混合物溶液に貧溶媒を加え、前記ゼラチン混合物を含有する第１中間体粒子を前記ゼラチン混合物溶液中に析出させることと、
　第１中間体粒子を含む前記ゼラチン混合物溶液を凍結乾燥し、第２中間体粒子を得ることと、
　前記第２中間体粒子の前記ゼラチン混合物を架橋して、架橋された前記ゼラチン混合物の粒子を得ることを含む、癒着防止材の製造方法。
　前記第２中間体粒子を加熱し、前記ゼラチン混合物を架橋させる、請求項１３に記載の癒着防止材の製造方法。