JP7333640B2 - 粉体、創傷被覆材、癒着防止材、止血材、及び紛体の製造方法 - Google Patents
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Description
GtlnNH-L-CHR1R2 ・・・(1)
[式(1)中、Gltnはゼラチンの残基を表し、Lは単結合、又は2価の連結基を表し、R1は炭素数1~20個の炭化水素基を表し、R2は水素原子又は炭素数1~20個の炭化水素基を表す]
で表される構造を有し、前記粒子の真球度の平均値が、1.45以下であり、前記粒子の真球度の標準偏差が、0.25以下である、粉体。
[2]前記ゼラチン誘導体は、下記式(2):
GltnNH-CHR1R2・・・(2)
[式中、Gltnはゼラチンの残基を表し、R1は炭素数1~17のアルキル基であり、R2は水素原子又は炭素数1~17のアルキル基である]、
で表される構造を有する、[1]に記載の粉体。
[3]水を滴下して5秒後の水接触角が70°未満であるか、或いは
生理食塩水に5分間浸漬する前後でASTM F-2258-05に従って測定したブタ胃内壁組織との接着強度が1/2以下に低下する、[1]又は[2]に記載の粉体。
[4]前記ゼラチンがアルカリ処理済みゼラチンである、[1]~[3]のいずれかに記載の粉体。
[5]前記ゼラチンが低エンドトキシン化処理済みゼラチンである、[1]~[4]のいずれかに記載の粉体。
[6]前記ゼラチンが、冷水魚由来である、[1]~[5]のいずれかに記載の粉体。
[7]以下のゲル層断面積測定試験から得られるゲル層の断面積が0.01mm以上である、[1]~[6]のいずれかに記載の粉体:
ゲル層断面積測定試験:食道粘膜下組織の表面の2.5cm×2.5cmあたりに、測定対象とする粉体を100mg噴霧し、37℃で48時間保持して、前記組織の表面上にゲルを形成し、前記ゲルを中性緩衝ホルマリンにより固定して固定済みゲルを得て、前記固定済みゲルを位相差顕微鏡で観察した位相差顕微鏡像から、前記ゲルの断面積をミリメートル単位で算出する試験を3回実施し、それらの算術平均値をゲル層の断面積とする。
[8]抗凝固剤を添加したブタ血液と混和して2分後に測定した貯蔵年弾性率(G’)が、200以上である、[2]~[7]のいずれかに記載の粉体。
[9][1]~[8]のいずれかに記載の粉体を含む創傷被覆材。
[10][1]~[8]のいずれかに記載の粉体を含む癒着防止材。
[11][8]に記載の粉体を含有する局所止血材。
[12]下記式(1):
GtlnNH-L-CHR1R2 ・・・(1)
[式(1)中、Gltnはゼラチンの残基を表し、Lは単結合又は2価の連結基を表し、R1は炭素数1~20個の炭化水素基を表し、R2は水素原子又は炭素数1~20個の炭化水素基を表す]
で表される構造を有するゼラチン誘導体を良溶媒に溶解させ、前記ゼラチン誘導体と前記良溶媒とを含有するゼラチン溶液を得る工程と、
前記ゼラチン溶液に貧溶媒を加え、前記ゼラチン誘導体を含有する中間体粒子を前記ゼラチン溶液中に析出させる工程と、
前記析出後の前記ゼラチン溶液を凍結乾燥させ、前記中間体粒子を含む中間粉体を得る工程と、
前記中間体粒子の前記ゼラチン誘導体を架橋させて、架橋されたゼラチン誘導体を含有する粒子を含む粉体を得る工程と
を含む粉体の製造方法。
[13]前記ゼラチン誘導体は、下記式(2):
GltnNH-CHR1R2・・・(2)
[式中、Gltnはゼラチンの残基を表し、R1は炭素数1~17のアルキル基であり、R2は水素原子又は炭素数1~17のアルキル基である]
で表される構造を有する、[13]に記載の方法。
[14]前記中間粉体を加熱し、前記ゼラチン誘導体を架橋させる、[12]又は[13]に記載の製造方法。
[15]前記中間粉体を、100~200℃で2.5~5時間加熱し、前記ゼラチン誘導体を架橋させる、[14]に記載の製造方法。
[16]更に、前記架橋されたゼラチン誘導体を含有する粒子を含む粉体に、紫外線を照射し、前記粒子の表面を親水性化する、[12]~[15]のいずれかに記載の製造方法。
[17]前記粉体に、紫外線を3時間~6時間照射する、[16]に記載の製造方法。
以下の説明は、本発明の代表的な実施形態に基づいてなされるが、本発明はそのような実施形態に制限されるものではない。
なお、本明細書において、「~」を用いて表される数値範囲は、「~」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
本発明の一の実施形態に係る粉体は、架橋されたゼラチン誘導体を含有する粒子を含む粉体であって、前記ゼラチン誘導体は、下記式(1):
GltnNH-L-CHR1R2 ・・・(1)
[式(1)中、Gltnはゼラチンの残基を表し、Lは単結合、又は2価の連結基を表し、R1は炭素数1~20個の炭化水素基を表し、R2は水素原子又は炭素数1~20個の炭化水素基を表す]
で表される構造を有し、前記粒子の真球度の平均値が、1.45以下であり、前記粒子の真球度の標準偏差が、0.25以下である、粉体である。
この特性は、後述する実施例で、真球度が高く、真球度の標準偏差が小さい例1の粉体が、これより真球度が低く、真球度の標準偏差が大きい例2の粉体と比較して、生体への接着強度が1.3倍以上に向上していることからも説明される。
GltnNH-L-CHR1R2 ・・・(1)
[式(1)中、Gltnはゼラチンの残基を表し、Lは単結合又は2価の連結基を表し、R1は炭素数1~20個の炭化水素基を表し、R2は水素原子又は炭素数1~20個の炭化水素基を表す]
で表される構造を有し、
水を滴下した5秒後の水滴の接触角が70°未満であるか、或いは
生理食塩水に5分間浸漬する前後で米国試験材料協会の規格(ASTM F-2258-05)に従って測定したブタ胃内壁組織との接着強度が1/2以下に低下する、粉体である。
この実施形態に係る粉体も、疎水基が導入された架橋ゼラチン誘導体を含有する粒子を含むことで、生体組織への優れた接着性が得られるものと推測される。この実施形態に係る粉体はまた、上記の通り、水を滴下した5秒後の水滴の接触角が70°未満であるか、或いは生理食塩水に5分間浸漬する前後でブタ胃内壁組織との接着強度が1/2以下に低下するという特性を有する。これらの特性は、後述する実施例で記載する通り、紫外線照射により粒子表面が親水性化されることでもたらされるものと理解され、この実施形態に係る粉体では、組織への接着強度が依然大きいものの、組織に適用後は露出面の接着強度が迅速に低下し、他の組織への癒着が防止されるという利点を有する。また、必ずしもその作用機序は明らかではないが、後述する実施例で実証するように、この実施形態の好ましい態様では、血液凝固能に優れ、この特性を利用した応用が期待される。
以下、これら本発明の代表的な実施形態に係る粉体(以下では、纏めて本粉体ということがある)の成分等について詳述する。
本粉体は架橋されたゼラチン誘導体を含有する粒子を含む。このゼラチン誘導体は、下記式(1)で表される構造を有する。
式(1)中、Gltnはゼラチンの残基を表し、Lは単結合又は2価の連結基を表し、R1は炭素数1~20個の炭化水素基を表し、R2は水素原子又は炭素数1~20個の炭化水素基を表す。
上記ゼラチン誘導体の誘導化率は特に制限されないが、一般に、20~80モル%が好ましく、30~70モル%がより好ましい。言い換えれば、得られたゼラチン誘導体におけるイミノ基/アミノ基(モル比)は、20/80~80/20が好ましく、30/70~70/30がより好ましい。
なお、本明細書において、誘導化率は、原料ゼラチンのアミノ基数と、ゼラチン誘導体のアミノ基数を、2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸法(TNBS法)によって定量し、得られた値から、以下の式により算出される。
誘導化率(モル%)=[原料ゼラチンのアミノ基数-ゼラチン誘導体のアミノ基数]/[原料ゼラチンのアミノ基数]×100
より具体的には、例えば、ほ乳類、鳥類、及び魚類等の皮、骨、及び腱等から取得された天然由来のゼラチン、及び天然由来のゼラチンを酸又はアルカリで処理した(必要に応じて加熱抽出された)処理済みゼラチン等が挙げられる。
なかでも、より優れた本発明の効果を有する粉体が得られる点で、アルカリ処理済みゼラチンが好ましい。
本願明細書において「架橋された」とは、可逆的な物理架橋構造は含まず、不可逆的な架橋反応により得られる架橋構造を意味する。したがって、「架橋されたゼラチン誘導体」は、ゼラチン誘導体に熱、光、エネルギー線などでエネルギーを付与して、及び/又は架橋剤により生じる、架橋反応により得られる不可逆的な架橋構造を有するゼラチン誘導体である。典型的には、ゼラチンの側鎖の官能基(-NH2、-OH、-SH、-COOH等)間の反応を通じて生じる。後述する実施例で示す通り、架橋されたゼラチン誘導体を含有する粒子は、接着強度が増強するため、より創傷被覆材等に適する。
本願明細書において、「水滴の接触角」若しくは「水接触角」とは、水を粒子表面に滴下した際の水滴と粒子表面の角度を接線法によって算出される角度を意味する。具体的には、各粉体20mgを、1.5cm×1cmの両面テープ上に平坦になるように敷き詰め、イオン交換水1μlを滴下し、滴下後1秒の時点から0.5秒毎に水滴の側面から水滴の形状を写真撮影し、水滴の形状が一定になった時点に撮影された水滴の形状から接線法により接触角を求めた。
ここで、本願明細書における「貯蔵弾性率(G’)」は、37度にあらかじめ温めておいたステージにおいて上記混合溶液をレオメーター(商品名:MCR30、ANTON PAAR GMBH社製)を用いて5分間、1ヘルツ、1%ひずみの条件下において測定した値をいう。
本発明の実施形態において、粒子は、架橋されたゼラチン誘導体を含有していればよく、本発明の効果を奏する範囲内においてその他の成分を含有していてもよい。粒子の架橋されたゼラチン誘導体の含有量としては、特に制限されないが、より優れた本発明の効果を有する粉体が得られ易い点で、粒子の全質量に対して、架橋されたゼラチン誘導体を90質量%以上含有していることが好ましく、99質量%以上含有していることがより好ましい。
粒子が含有してもよいその他の成分としては特に制限されないが、例えば、非架橋のゼラチン誘導体、溶媒、緩衝化剤、着色料、保存料、賦形剤、及び薬剤(抗血栓薬、抗菌剤、及び、成長因子等)等が挙げられる。
測定対象とする粉体を、カーボンテープを貼った走査型電子顕微鏡ステージに振りかけ、その後、エアースプレーの噴霧によりカーボンテープに接着していない粉体を除いて作成した試料を走査型電子顕微鏡で観察し、1視野から無作為に抽出した20個の粒子について「ImageJ(v1.51)」を用いて横軸、及び縦軸の長さを計測する。次に、各粒子について「横軸/縦軸」を計算し、これを算術平均し、得られた値について小数第3位を四捨五入して小数第2位まで求め、これを真球度とする。なお、上記計測、及び計算においては、(縦軸)≦(横軸)と定義する。すなわち、計測された1つの粒子に係る粒子径のうち、最も大きい粒子径を横軸と定義する。また、縦軸は、横軸から90度回転した位置の径とする。
なお、粉体中における粒子の真球度の標準偏差は、上記20個の粒子の真球度から計算され、得られた計算値の小数第3位を四捨五入して、小数第2位まで求め標準偏差とする。
粒子の平均粒径は、通常0.5~50μmであり、好ましくは1~30μmであり、より好ましくは1~10μmである。本願明細書における「平均粒径」は、電子顕微鏡によってランダムに100個の粒子の粒径(長径)を測定して平均することによって求められた値である。
本粉体は、所定のゲル層断面積測定試験によって測定されるゲル層の断面積が0.010mm2以上であることが好ましい。ゲル層の断面積が0.010mm2以上であると、粉体を生体組織に適用した際、より優れた接着強度が得られる。
ゲル層の断面積としては特に制限されないが、0.020mm2以上がより好ましく、0.030mm 2 以上が更に好ましく、0.050mm 2 以上がより更に好ましく、0.100mm 2 以上が特に好ましく、0.120mm 2 以上が最も好ましい。
ゲル層の面積の上限値としては特に制限されないが、一般に、0.500mm2以下が好ましい。
上記粉体の作成方法としては特に制限されないが、以下の各工程を含む方法により作成されることが好ましい。
・工程1:ゼラチン誘導体を良溶媒に溶解させ、ゼラチン誘導体と良溶媒とを含有するゼラチン溶液を得る工程
・工程2:ゼラチン溶液に貧溶媒を加え、ゼラチン誘導体を含有する中間体粒子をゼラチン溶液中に析出させる工程
・工程3:析出後のゼラチン溶液を凍結乾燥させ、中間体粒子を含む中間粉体を得る工程
・工程4:中間体粒子のゼラチン誘導体を架橋させて、架橋されたゼラチン誘導体を含有する粒子を含む粉体を得る工程
・工程5:任意選択で、更に、架橋されたゼラチン誘導体を含有する粒子を含む粉体に、紫外線を照射し、粒子の表面を親水性化する工程
以下では、上記各工程について詳述する。
工程1は、すでに説明したゼラチン誘導体を良溶媒に溶解させ、ゼラチン溶液を得る工程である。本明細書において、良溶媒とは、ゼラチン誘導体を溶解させやすい溶媒を意味し、特に制限されないが、水、グリセリン、酢酸、及びこれらの混合物等が挙げられ、なかでも水を含有することが好ましい。また、上記良溶媒は加温されてもよい。加温の際の温度としては特に制限されないが、50~70℃が好ましい。
ゼラチン溶液中におけるゼラチンの含有量が上記範囲内であると得られる粉体中における粒子の真球度の標準偏差がより小さくなり易い。
工程2はゼラチン溶液に貧溶媒を加え、ゼラチン誘導体を含有する中間体粒子をゼラチン溶液中に析出させる工程である。
本明細書において、貧溶媒とは、工程1で使用した良溶媒と比較した場合に、ゼラチン誘導体をより溶解させ難い溶媒を意味する。すなわち、本明細書において、良溶媒、及び貧溶媒とは、ゼラチン誘導体の溶解度の絶対量により定義されるのではなく、それぞれ貧溶媒及び良溶媒との関係で相対的に定義される。
工程3は、上記コアセルベーションにより析出後の未架橋ゼラチン粒子の分散溶液を凍結乾燥させ、未架橋ゼラチン誘導体を含有する粒子を含む中間粉体を得る工程である。
ゼラチン溶液の凍結の方法としては特に制限されないが、凍結させる際に未架橋ゼラチン誘導体を含有する粒子の凝集をより発生し難くする観点から、より急速に凍結させることが好ましい。この際、凍結させる際の雰囲気温度としては特に制限されないが、-20℃以下が好ましく、-30℃以下がより好ましい。
また、凍結乾燥の方法としては特に制限されず、公知の方法が使用できる。
工程4は、中間体粒子のゼラチン誘導体を架橋させて、架橋されたゼラチン誘導体を含有する粉体を得る工程である。本工程を経て、粒子のゼラチン誘導体が不可逆的に分子間、及び/又は分子内で架橋する。その結果、架橋されたゼラチン誘導体を含有する粒子を含む粉体が得られる。
なかでも、より容易にゼラチン誘導体の架橋物が得られ、架橋剤に由来する不純物の発生が無く安全な点で、熱エネルギーを付与する(言い換えれば加熱する)方法が好ましい(熱架橋)。この方法では、例えば、ゼラチン誘導体中のアミノ基とその他の反応性基(例えば、カルボキシ基、及びメルカプト基等)が反応し、架橋構造が形成される。
熱架橋の際の加熱時間としては特に制限されないが、一般に、0.1~20時間が好ましく、0.5~10時間がより好ましく、1~6時間が更に好ましく、2~5時間がより更に好ましく、2.5~4時間が特に好ましい。
加熱時間が上記数値範囲内であると、得られる粉体は、より優れた接着性が得られやすい。
架橋剤としては、例えば、国際公開第2018/079538号の0021~0024段落に記載された化合物も使用でき、上記内容は本明細書に組み込まれる。
工程5は、架橋されたゼラチン誘導体を含有する粒子に、更に、紫外線を照射し、粒子の表面を親水性化する工程である。この紫外線照射による表面処理により、粒子と水滴との接触角が小さく成り、水分の存在下でより膨潤し易くなる。他方、乾燥状態で組織と接触させれば、紫外線照射後の粒子は、依然優れた接着性を有する。
紫外線照射の条件については、特に制限は無いが、通常、1時間~10時間の間で照射し、より好ましくは2時間~8時間の間で照射し、更に好ましくは3時間~6時間の間で照射する。紫外線強度は0.05~50mW/cm2が好ましく、0.5~10mW/cm2がより好ましい。また、紫外線積算光量は、1~100J/cm2が好ましく、5~100J/cm2がより好ましい。
紫外線照射装置については特に制限はなく、市販の紫外線照射装置を用いてもよい。
なお、照射中は、粒子にむらなく紫外線が照射されるように、一定時間で(例えば、30分毎に)粒子を混ぜることが好ましい。また、紫外線照射後は、粒子表面が親水性になっているので、保存する際は、除湿剤の存在下など、乾燥した雰囲気で保存することが好ましい。
本発明の実施形態に係る粉体は、創傷被覆材として使用可能である。創傷被覆材としては特に制限されないが、呼吸器外科(特に肺がん手術後の創部)、消化器外科、心臓血管外科、口腔外科、及び、消化器内科等の外科手術における切開口、及び、皮膚創傷等に適用することができる。
ESD(Endoscopic Submucosal Dissection)の場合、止血鉗子、ステント、バルーン、及び、内視鏡等によって、ドライの状態で適用することができる。適用量は適用部位、創傷に依存して適宜調整することができる。
また、本発明の実施形態に係る粉体は、創傷被覆効果を発揮した後は創傷治癒に伴い速やかに分解吸収されるという特長を有する。
従来、創傷被覆材と癒着防止材とを別々に適用していたのと比較して、より簡便に両者を達成できる。
ゼラチン誘導体「76.8C6 ApGltn」を以下の手順により調製した。
スケソウダラ由来のアルカリ処理ゼラチン(Mw=31000、「ビーマトリックスフィッシュゼラチンTA(商品名)」、新田ゼラチン(株)製、後述の方法で測定されるアミノ基量:324μmol/g、以下「Org ApGltn」ともいう。)10gを、50℃のオイルバスに浸したナス型フラスコ中の超純水-エタノール混合溶媒50mLに加え、2時間程度撹拌しながら溶解して20質量%水溶液を調製した。
次に、得られた水溶液に、ヘキサナールの1.5倍当量のピコリンボラン(純正化学(株)製)を加えた後、ヘキサナール(東京化成工業(株)製)を、ゼラチンのアミノ基に対する2倍当量(ゼラチンのアミノ基1モルに対するヘキサナールのモル比)添加した。
次に、反応溶液を1Lのエタノールに滴下し再沈殿させた。1時間攪拌後、冷凍庫にて1時間静置した後、ガラスフィルターでろ過した。ろ過残渣を、再びビーカー中の1Lのエタノールに入れ再沈殿させ、1時間攪拌後、冷凍庫にて1時間静置した。再びガラスフィルターでろ過した後、ろ過残渣を減圧乾燥器で一晩以上乾燥させ、ヘキシル基が導入されたゼラチン誘導体を91%の収率で得た。
まず、原料ゼラチン、及びゼラチン誘導体をそれぞれ0.1質量/体積%で水・DMSO(ジメチルスルホキシド)混合溶媒(体積比1:1、以下同様)に溶解し、48ウェルプレートに100μL分注した。
そこへ水・DMSO混合溶媒に溶解した0.1体積/体積%のトリエチルアミン(TEA、ナカライテスク社製)を100μL加え、プレートシェーカーで400rpm、1分間撹拌した。更に、水・DMSO混合溶媒に溶解した0.1質量/体積%トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS、和光純薬(株)製)を100μL加え、プレートシェーカーで400rpm、1分間撹拌した。アルミホイルで遮光し、37℃のインキュベーター内で2時間静置した後、インキュベーターから取り出し6NHClを50μL加えて反応を停止し、プレートシェーカーで400rpm、1分間撹拌した。
次に、遮光して10分間静置後、340nmの吸光度(Abs)を吸光度計(TECAN社製、Spark 10M-NMST)で測定した。測定された吸光度から、ゼラチンを含まない点でのみ異なるブランク試料の吸光度を引き、以下の計算式によって、ゼラチン誘導体のヘキシル基導入率が76.8モル%であることを求めた。
導入率(モル%)=[Abs(原料ゼラチン)-Abs(ゼラチン誘導体)]/[Abs(原料ゼラチン)]×100
上記の方法により得られた各ゼラチン誘導体0.5gを目盛付きバイアル瓶(50mL)に量り取り、MilliQ(登録商標)水7.5mLを添加した。
次に、50℃水浴にて溶解後、MilliQ水にて10mLにメスアップした。
この時、ゼラチン溶液中にけるゼラチン誘導体の含有量(終濃度)は、5質量/体積%とし、ゼラチン種、実験条件によって適宜変更した。
次に、ゼラチン溶液を冷凍庫(-30℃)で2時間以上静置した。次に、冷凍庫から取り出したバイアル瓶の口をキムワイプ(登録商標)で覆い、凍結乾燥して中間体粒子を含有する中間粉体を得た。得られた中間粉体を150℃にて6時間加熱して架橋させ、各粉体を得た。以下、本段落に記載の粉体の調製方法を、単に「方法A-1」という。
上記の方法により得られた各ゼラチン誘導体をゼラチン濃度が5質量/体積%となるよう、50℃の水浴で加熱した水に溶解し、ゼラチン溶液を得た。次に、このゼラチン溶液をテトラフルオロエチレン製容器に流し込み、40℃のヒーター上に載置し溶媒を乾燥させた。次に、得られた乾燥済みゼラチン溶液を粉砕機(Wonder Crusher)で粉砕した。なお、粉砕の条件は、1サイクル(Speed5にて20秒、Speed10にて1分)を3回実施した。
この粉砕済み中間体粉体を上記と同様に加熱架橋し、粉体を得た。以下、本段落に記載の粉体の調製方法を、単に「方法B」という。
上記の方法により得られた各ゼラチン誘導体をゼラチン濃度が6質量%となるよう、50℃の超純水に溶解し、ゼラチン溶液を得た。次に、上記水溶液に同体積のエタノールを加え、ゼラチン濃度が3質量%となるよう希釈して希釈液を得た。次に、上記希釈液の温度を50℃に維持し、スプレードライヤー装置(ミニスプレードライヤー、B-290、ビュッヒ社製)に設置し、180℃で窒素ガスの流速440L/h、希釈液の流速410mL/hとなるように調整し、中間体粒子を含有する中間粉体を得た。得られた中間粉体を上記と同様に加熱架橋し、粉体を得た。以下、本段落に記載の粉体の調製方法を、単に「方法C」という。
また、「Org ApGltn」を用いて、「方法A-1」により調製した粉体を例3とした。なお、いずれも架橋時間は6時間とした。
各例の粉体を、カーボンテープを貼った走査型電子顕微鏡ステージに振りかけ、その後、エアースプレーの噴霧によりカーボンテープに接着していない粉体を除いて作成した試料を走査型電子顕微鏡で観察した。
・真球度
1視野から無作為に抽出した20個の粒子について「ImageJ(v1.51)」を用いて横軸、及び縦軸(但し、縦軸≦横軸であり、横軸は最も大きな粒子径とし、縦軸は、横軸から90度回転した位置の径とした)の長さを計測した。
次に、各粒子について「横軸/縦軸」を計算し、これを算術平均し、得られた値について小数第3位を四捨五入して小数第2位まで求め、これを真球度とした。
粉体中における粒子の真球度の標準偏差は、上記20個の粒子の真球度から計算し、得られた計算値の小数第3位を四捨五入して、小数第2位まで求めた。
粉体とブタ胃内壁組織との接着強度を以下の方法により測定した。試験方法は、米国試験材料協会の規格(ASTM F-2258-05)に従って行った。ブタ胃を開き、粘膜層を取り除いた。この際、生理食塩水を粘膜下組織へ注入し、隆起した部分を取り除くことで粘膜下組織をある程度残した状態で粘膜層のみを切除した。得られた組織を2.5cm四方の組織片へと裁断し、試験装置の上下の治具それぞれに瞬間接着剤を用いて固定した。ホットプレートを用いることで測定中のブタ胃内壁組織の温度を37℃に保った。
次に、例3-1の粉体の接着強度を1.0とし、例1と例2の粉体の接着強度の比を求めた。結果を表2に示した。
・例A:Org ブタゼラチン、方法A-1
・例B:78.7C6 ブタゼラチン、方法A-1
・例C:78.7C6 ブタゼラチン、方法B
オクタナール(東京化成工業(株)製)を、ゼラチンのアミノ基に対して2倍当量に相当する量をゼラチン溶液に混合した以外は、上記[ゼラチン誘導体の調製(1)]と同様にして、ゼラチン誘導体を調製した。また、上記[ゼラチン誘導体の調製(1)]と同様にして、デシル基の導入率を測定し、オクチル基の導入率が57.7であることを確認した。以下では、得られたゼラチン誘導体を、ゼラチン誘導体「57.7C8 ApGltn」と称する。
上記[ゼラチン誘導体の調製(2)]で得られたゼラチン誘導体を用いて、「方法A-1」と同様にして粉体を調製した。この方法で得られた粉体を例5とした。
デカナール(東京化成工業(株)製)を、ゼラチンのアミノ基に対して2倍当量に相当する量をゼラチン溶液に混合した以外は、上記[ゼラチン誘導体の調製(1)]と同様にして、ゼラチン誘導体を調製した。また、上記[ゼラチン誘導体の調製(1)]と同様にして、デシル基の導入率を測定し、デシル基の導入率が46.1であることを確認した。以下では、得られたゼラチン誘導体を、ゼラチン誘導体「46.1C10 ApGltn」と称する。
上記[ゼラチン誘導体の調製(3)]で得られたゼラチン誘導体を用いて、「方法A-1」と同様にして、或いは加熱架橋を1時間又は3時間行った以外は、「方法A-1」と同様にして粉体を調製した。熱架橋時間を変更したこれらの方法を「方法A-2」及び「方法A-4」といい、得られた粉体をそれぞれ例6-1、例6-2及び例6-3とした。
ドデカナール(東京化成工業(株)製)を、ゼラチンのアミノ基に対して2倍当量に相当する量をゼラチン溶液に混合した以外は、上記[ゼラチン誘導体の調製(1)]と同様にして、ゼラチン誘導体を調製した。また、上記[ゼラチン誘導体の調製(1)]と同様にして、ドデシル基の導入率を測定し、ドデシル基の導入率が48.6であることを確認した。以下では、得られたゼラチン誘導体を、ゼラチン誘導体「48.6C12 ApGltn」と称する。
上記[ゼラチン誘導体の調製(4)]で得られたゼラチン誘導体を用いて、「方法A-1」と同様にして粉体を調製した。この方法で得られた粉体を例7とした。
例3-1、例1、及び例5~7の各粉体とブタ胃内壁組織との接着強度を米国試験材料協会の規格(ASTM F-2258-05)に従って測定した。試験方法の詳細は、[ブタ胃内壁組織との接着強度の測定試験(1)]に記載した通りである。
粉体のゲル層の断面積を以下の方法で測定した。食道粘膜下組織の表面の2.5cm×2.5cmあたりに、測定対象とする粉体を100mg噴霧し、37℃で48時間保持して、組織表面にゲルを形成した。ゲルを中性緩衝ホルマリンにより固定して固定済みゲルを得た。固定済みゲルを位相差顕微鏡で観察し、位相差顕微鏡像から固定済みゲルの幅と厚みを計測し、断面積を平方ミリメートル単位で算出した。試験は3回実施し、それらの算術平均値をゲル層の断面積とした。
結果を表3に示した。
なお、位相差顕微鏡像の例を図5に示した。図5におけるスケールバーは、上段が1mm、それぞれの一部拡大図である下段が100μmを示している。
図5の結果からは、架橋条件を制御することにより、ゲル層の面積を制御可能であることがわかった。
なかでも、R2が水素原子であって、R1のアルキル基の炭素数が7以上である例5の粉体は、例1の粉体と比較してより優れた接着強度を有していた。
また、R2が水素原子であって、R1のアルキル基の炭素数が9以上である例6-1の粉体は、例5の粉体と比較してより優れた接着強度を有していた。
また、R2が水素原子であって、R1のアルキル基の炭素数が11以下である、例6-1の粉体は、例7の粉体と比較してより優れた接着強度を有していた。
また、例6-1~例6-3の比較から、架橋時間によってゲル層の面積が制御でき、ゲル層の面積が0.030mm2以上であることが好ましく、0.110mm2以上であることがより好ましく、0.120mm2以上であることが特に好ましいことがわかった。
デカナール(東京化成工業(株)製)を、ゼラチンのアミノ基に対して2倍当量に相当する量をゼラチン溶液に混合した以外は、上記[ゼラチン誘導体の調製(1)]と同様にして、ゼラチン誘導体を調製した。また、上記[ゼラチン誘導体の調製(1)]と同様にして、デシル基の導入率を測定し、デシル基の導入率が36.4であることを確認した。以下では、得られたゼラチン誘導体を、ゼラチン誘導体「36.4C10 ApGltn」と称する。
上記[ゼラチン誘導体の調製(5)]で得られたゼラチン誘導体を用いて、「方法A-4」(加熱架橋を3時間)と同様にして粉体を調製した。この方法で得られた粉体を例8とした。
また、「Org ApGltn」を用いて、「方法A-4」により調製した粉体を例3-2とした。
[粉体の調製(7)]で得られた例8及び3-2の粉体をガラスシャレーに入れて、UV照射ボックス(物質・材料研究機構にて作成)に静置し、30分毎に粒子を混ぜながら、1時間、2時間および4時間の異なる時間、185nmおよび254nmの紫外線(線源:UVランプMIYATA ELEVAM Inc.製)を、常温で照射し、粒子の表面処理を行った。得られた粉体を、それぞれ、例8(U1)、例8(U2)、例8(U4)、例3-2(U1)、例3-2(U2)、及び例3-2(U4)とした。また、対照として、UV照射をしない粉体を、それぞれ例8(U0)及び例3-2(U0)とした。
例8(U1)、例8(U2)、例8(U4)、例3-2(U1)、例3-2(U2)、及び例3-2(U4)の各粉体について、水接触角を水滴法で測定して表面処理による効果を評価した。
各粉体20mgを、1.5cm×1cmの両面テープ上に平坦になるように載せ、イオン交換水1μlを滴下し、滴下後1秒の時点から0.5秒毎に水滴の側面から水滴の形状を10枚の写真を撮影し、水滴の形状が一定になった滴下後5秒の時点で撮影された水滴の形状から接触角を測定し、平均値(n=10)を求めた。
図6は、滴下後5秒時点の水滴の像及び接触角を示すグラフである。図6に示す通り、UV照射による表面処理により、架橋されたゼラチン及び架橋されたゼラチン誘導体の粉体は、いずれも接触角が小さくなった。また、架橋されたゼラチン誘導体の粒子では、UV照射時間が長くなるにつれ、接触角が小さく成り、4時間UV照射された粉体では、疎水基が導入されていない架橋ゼラチンと同レベルの接触角となった。
例8(U1)、例8(U2)、例8(U4)、例3-2(U1)、例3-2(U2)、及び例3-2(U4)の各粉体とブタ胃内壁組織との接着強度を米国試験材料協会の規格(ASTM F-2258-05)に従って測定した。試験方法の詳細は、[ブタ胃内壁組織との接着強度の測定試験(1)]に記載した通りである。図7に試験結果を示す。
例8(U1)、例8(U2)及び例8(U4)の粒子並びに例3-2(U1)、例3-2(U2)、及び例3-2(U4)の粉体の何れも、UV照射による表面処理によって接着強度は影響を受けなかった。例8(U1)、例8(U2)及び例8(U4)の架橋されたゼラチン誘導体の粉体は、例3-2(U1)、3-2(U2)、及び3-2(U4)の架橋されたゼラチンの粉体に対して約4倍の接着強度を示した。
例8(U0)、及び例8(U4)の粉体、並びに例3-2(U0)、及び例3-2(U4)の粉体を走査型電子顕微鏡で観察した。また、比較対象として、「方法A-4」のプロセスにおける熱架橋前の36.4C10 ApGltn及びOrg ApGltnの中間粉体も走査型電子顕微鏡で観察した。顕微鏡で観察するための試料の調製は、<走査型電子顕微鏡による観察(1)>に記載の通りである。
図8に各粉体の顕微鏡像を示す。各像から理解される通り、熱架橋及びUV照射による、粒子の形状及び大きさに対する影響は認められなかった。
例8(U0)、及び例8(U4)の粉体、並びに例3-2(U0)、及び例3-2(U4)の各粉体10mgを2mlチューブに入れ、30℃の生理食塩水を200μl添加した。ボルテックスで攪拌後37℃の恒温槽に各チューブを静置し、攪拌直後、攪拌後30分、1時間および2時間の時間でチューブから生理食塩水中の粉体を取り出し、走査型電子顕微鏡で観察した。図9に、各粉体の各時間での顕微鏡像を示す。各像から理解される通り、36.4C10 ApGltn粒子はUV照射の有無にかかわらず、水環境で粒子が融合して膜を形成した。
参考として、微小孔デンプン球からなる局所止血材(商品名:バード アリスタAH、株式会社メディコン)について、同様の試験を行い、攪拌直後、攪拌後30分、1時間、2時間、4時間及び24時間にチューブから生理食塩水中の粉体を取り出し、走査型電子顕微鏡で観察した。図10に、粉体の各時間での顕微鏡像を示す。各像から理解される通り、アリスタAHは、水環境でも球状を維持して粒子同士が融合せず、膜を形成しなかった。
上記の通り生理食塩水で膨潤処理した各粉体とブタ胃内壁組織との接着強度を、米国試験材料協会の規格(ASTM F-2258-05)に従って測定した。
試験方法は、組織上に100mgの粉体をのせた後、生理食塩水50ml中に5分間浸漬し、その後、接着剤で試験装置の上下の治具に固定し、上部の治具によって50Nで3分間圧着した後、上部へと引っ張り上げることで接着強度を測定した。その他の点は、[ブタ胃内壁組織との接着強度の測定試験(1)]に記載の通りである。試験結果を図11に示した。
図11に示す通り、架橋されたゼラチン誘導体の粉体を更に紫外線照射による表面処理をした例8(U4)の粉体、および架橋されたゼラチン(疎水基の導入なし)の粉体を更に紫外線照射による表面処理をした例3-2(U4)の粉体のいずれも、生理食塩水に浸漬後の接着強度が低下した。特に、例8(U4)の粉体は、生理食塩水に浸漬しない場合に比べ、接着強度が1/4まで低下し、例3-2(U4)の粉体と同レベルになった。このような特性は、生体組織へ粉体を接着した後に粉体の露出面が他の組織へ癒着するのを低減することが期待される。
例8(U0)、及び例8(U4)の粉体、並びに例3-2(U0)、及び例3-2(U4)の各粉体について、水との接触角の経時的変化を測定した。
各粉体をデシケーター内で保存し、UV照射直後、24時間後、及び48時間後の各時点で水との接触角を測定した。試験方法は、前記[水との接触角の測定(1)]に記載の通りである。
図12に、滴下後5秒後の水滴の像及び接触角を示す。図12に示す通り、例8の粉体、及び例3-2の粉体とも、UV照射による表面処理により、接触角が小さくなり、特に例8の粉体では大幅接触角が小さくなった。一方、UV照射後の放置時間は、接触角に影響を及ぼさなかった。
デカナール(東京化成工業(株)製)を、ゼラチンのアミノ基に対して2倍当量に相当する量をゼラチン溶液に混合した以外は、上記[ゼラチン誘導体の調製(1)]と同様にして、ゼラチン誘導体を調製し、90%の収率でゼラチン誘導体を得た。また、上記[ゼラチン誘導体の調製(1)]と同様にして、デシル基の導入率を測定し、デシル基の導入率が44.2モル%であることを確認した。以下では、得られたゼラチン誘導体を、ゼラチン誘導体「44.2C10 ApGltn」と称する。
上記[ゼラチン誘導体の調製(6)]で得られたゼラチン誘導体を用いて、加熱架橋を1時間、2時間、又は3時間行った以外は、「方法A-1」と同様にして粉体を調製した。この方法を「方法A-2」「方法A-3」及び「方法A-4」といい、この方法で得られた粉体を例9、例10及び例11とした。
[粉体の調製(8)]で得られた例9、例10及び例11の各粉体をガラスシャレーに入れて、UV照射ボックス(物質・材料研究機構にて作成)に静置し、30分毎に粒子を混ぜながら、4時間、185nmおよび254nmの紫外線(線源:UVランプ、MIYATA ELEVAM Inc.製)を、常温で照射し、粒子の表面処理を行った。UV照射した各粉体を例9(UV4)、例10(UV4)及び例11(UV4)と称し、UV照射しなかった各粉体を例9(UV0)、例10(UV0)及び例11(UV0)と称する。
例9(UV4)、例10(UV4)及び例11(UV4)並びに例9(UV0)、例10(UV0)及び例11(UV0)の各粉体とブタ胃内壁組織との接着強度を米国試験材料協会の規格(ASTM F-2258-05)に従って測定した。試験方法の詳細は、[ブタ胃内壁組織との接着強度の測定試験(1)]に記載した通りである。図13に試験結果を示す。
UV照射した架橋ゼラチン誘導体の粉体も、UV照射しなかった架橋ゼラチンの粉体も、熱架橋時間が長くなるにつれ、接着強度が大きくなる傾向が認められた。この傾向は、UV照射による表面処理をしていない、架橋ゼラチン誘導体の粉体でより大きかった。
例9(UV4)、例10(UV4)及び例11(UV4)、並びに例9(UV0)、例10(UV0)及び例11(UV0)の各粉体について、水との接触角を水滴法で測定した。試験方法は、[水との接触角の測定(1)]に記載の通りである。図14は、各粉体について、滴下後5秒後の水滴の像及び水接触角を示す。図14に示す通り、UV照射による表面処理を行った例9(UV4)、例10(UV4)及び例11(UV4)の粉体は、同処理を行わなかった例9(UV0)、例10(UV0)及び例11(UV0)の粉体に比べ、水接触角が小さく成り、粒子表面の濡れ性が増加していた。
例9(UV4)、例10(UV4)及び例11(UV4)並びに例9(UV0)、例10(UV0)及び例11(UV0)の各粉体について、血液凝固能を評価した。
クエン酸Naを添加したブタ血液500μlを、37度にあらかじめ温めておいたレオメーター(商品名:MCR30、ANTON PAAR GMBH社製)のステージに滴下し、血液に各粉体50mg(粒子濃度10w/v%)添加し、スパチュラで混和した。2分後にレオメーターの測定を5分間、1ヘルツ、1%ひずみの条件下で開始して貯蔵弾性率(G’)を求めた。
試験結果を図15に示す。UV照射による表面処理がされた又はされていない架橋ゼラチン誘導体の何れでも、熱架橋時間が長くなるにつれ、貯蔵弾性率(G’)が大きくなった。特に、UV照射による表面処理がされた架橋ゼラチン誘導体では、熱架橋時間が3時間の場合に貯蔵弾性率(G’)が著しく増大した。
Claims (17)
- 架橋されたゼラチン誘導体を含有する粒子を含む粉体であって、
前記ゼラチン誘導体は、下記式(1):
GltnNH-L-CHR1R2 ・・・(1)
[式(1)中、Gltnはゼラチンの残基を表し、Lは単結合、又は2価の連結基を表し、R1は炭素数1~20個の炭化水素基を表し、R2は水素原子又は炭素数1~20個の炭化水素基を表す]、または
下記式(2):
GltnNH-CHR1R2 ・・・(2)
[式中、Gltnはゼラチンの残基を表し、R1は炭素数1~17のアルキル基であり、R2は水素原子又は炭素数1~17のアルキル基である]
で表される構造を有し、
前記粒子の真球度の平均値が、1.20~1.08であり、前記粒子の真球度の標準偏差が、0.20~0.06である、粉体。 - 水を滴下して5秒後の水接触角が70°未満であるか、或いは
37℃の生理食塩水に5分間浸漬後にASTM F-2258-05に従って測定したブタ胃内壁組織との接着強度が、浸漬前に比べ、1/2以下に低下する、請求項1に記載の粉体。 - 前記ゼラチンがアルカリ処理済みゼラチンである、請求項1又は2に記載の粉体。
- 前記ゼラチンが、エンドトキシン含有量をタンパク質1.0%当たり1EU/mL未満に低下させた低エンドトキシン化処理済みゼラチンである、請求項1~3のいずれか1項に記載の粉体。
- 前記ゼラチンが、冷水魚由来である、請求項1~4のいずれか1項に記載の粉体。
- 以下のゲル層断面積測定試験から得られるゲル層の面積が0.110mm2以上である、請求項1~5のいずれか1項に記載の粉体:
ゲル層断面積測定試験:食道粘膜下組織の表面の2.5cm×2.5cmに、測定対象とする粉体を100mg噴霧し、37℃で48時間保持して、前記組織の表面上にゲルを形成し、前記ゲルを中性緩衝ホルマリンにより固定して固定済みゲルを得て、前記固定済みゲルを位相差顕微鏡で観察した位相差顕微鏡像からゲル層の断面積を平方ミリメートル単位で算出し、この試験を3回実施し、それらの算術平均値をゲル層の面積とする。 - 抗凝固剤を添加したブタ血液と37℃で混和して2分後に測定した貯蔵弾性率(G’)が、200Pa以上である、請求項1~6のいずれか1項に記載の粉体。
- 式(1)または式(2)中、R1は炭素数7~12のアルキル基であり、R2は水素原子又は炭素数7~12のアルキル基である、請求項1~7のいずれか1項に記載の粉体。
- 請求項1~8のいずれか1項に記載の粉体を含有する創傷被覆材。
- 請求項1~8のいずれか1項に記載の粉体を含有する癒着防止材。
- 請求項8に記載の粉体を含有する局所止血材。
- 下記式(1):
GltnNH-L-CHR1R2 ・・・(1)
[式(1)中、Gltnはゼラチンの残基を表し、Lは単結合又は2価の連結基を表し、R1は炭素数1~20個の炭化水素基を表し、R2は水素原子又は炭素数1~20個の炭化水素基を表す]、または
下記式(2):
GltnNH-CHR1R2 ・・・(2)
[式中、Gltnはゼラチンの残基を表し、R1は炭素数1~17のアルキル基であり、R2は水素原子又は炭素数1~17のアルキル基である]
で表される構造を有するゼラチン誘導体を良溶媒に溶解させ、前記ゼラチン誘導体と前記良溶媒とを含有するゼラチン溶液を得る工程と、
前記ゼラチン溶液に貧溶媒を加え、前記ゼラチン誘導体を含有する中間体粒子を前記ゼラチン溶液中に析出させる工程と、
前記析出後の前記ゼラチン溶液を凍結乾燥させ、前記中間体粒子を含む中間粉体を得る工程と、
前記中間体粒子の前記ゼラチン誘導体を架橋させて、架橋された前記ゼラチン誘導体を含有する粒子を含む粉体を得る工程とを含む、請求項1~8のいずれか1項に記載の粉体の製造方法。 - 前記中間粉体を加熱し、前記ゼラチン誘導体を架橋させる、請求項12に記載の製造方法。
- 前記中間粉体を、100~200℃で2.5~5時間加熱し、前記中間体粒子中の前記ゼラチン誘導体を架橋させる、請求項13に記載の製造方法。
- 更に、前記架橋されたゼラチン誘導体を含有する粒子を含む粉体に、紫外線を照射し、前記粒子の表面を親水性化する、請求項13または14に記載の製造方法。
- 前記粉体に、紫外線を3時間~6時間照射する、請求項15に記載の製造方法。
- 式(1)または式(2)中、R1は炭素数7~12のアルキル基であり、R2は水素原子又は炭素数7~12のアルキル基である、請求項12~16のいずれか1項に記載の製造方法。
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