BRPI0718328A2

BRPI0718328A2 - composição, curativo hemostático e dispositivo médico para a inserção em um corpo de um ser humano ou de um mamìfero inferior

Info

Publication number: BRPI0718328A2
Application number: BRPI0718328-3A
Authority: BR
Inventors: Orahn Preiss-Bloom; Ishay Attar; Natalie Iram
Original assignee: Lifebond Ltd
Priority date: 2006-12-15
Filing date: 2007-12-17
Publication date: 2011-10-11
Also published as: AU2007334394B2; US20100063459A1; CN101854960B; US8722039B2; US9655988B2; CA2672651A1; WO2008076407A2; JP2010521994A; EP2111239A2; WO2008076407A3; CN102552967A; CN103933606A; EP2111239B1; AU2007334394A1; US20150273103A1; CA2672651C; HK1148488A1; JP5993571B2; CN101854960A; US20150196683A1

Abstract

COMPOSIçãO, CURATIVO HEMOSTáTICO E DISPOSITIVO MéDICO PARA A INSERçãO EM UM CORPO DE UM SER HUMANO OU DE UM MAMìFERO INFERIOR. Trata-se de um material adesivo para o uso médico que compreende gelatina e um material de reticulação atóxico tal como a transglutaminase. Uma realização opcional da invenção inclui curativos nos quais uma camada de uma transglutaminase é prensada entre uma primeira e uma segunda camadas de gelatina. Os produtos hemostáticos são úteis para o tratamento de tecidos feridos.

Description

COMPOSIÇÃO, CURATIVO HEMOSTÁTICO E DISPOSITIVO MÉDICO PARA A INSERÇÃO EM UM CORPO DE UM SER HUMANO OU DE UM MAMÍFERO INFERIOR

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a curativos, dispositivos e agentes hemostáticos que contêm materiais reabsorvíveis ou não reabsorvíveis e/ou proteínas de coagulação. Os dispositivos hemostáticos são úteis para o tratamento de tecido ferido.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O controle da hemorragia (sangramento) é uma etapa crítica nos primeiros socorros e no cuidado dos traumas em campo. Infelizmente, a ocorrência de sangramento excessivo ou hemorragia fatal de um sítio acessível não é incomum (J. M. Rocko et al. (1982). J. Trauma 22:635). Os dados de mortalidade da Guerra do Vietnã indicam que 10% das mortes em combate eram devidas a hemorragia descontrolada da extremidade. Até um terço das mortes por dessangramento durante a Guerra de Vietnã poderia ter sido evitado pela utilização de métodos de controle de hemorragia em campo eficazes. (SAS/STAT Users Guide, 4a. ed. (Cary, N.C.: SAS Institute Inc;1990)).

Embora as estatísticas de mortalidade por trauma de civis não forneçam números exatos para mortes em pré-hospital

por hemorragia de extremidade, os relatórios anedóticos e de casos indicam ocorrências similares (J. M. Rocko et al. (1982). J. Trauma 22:635). Esses dados sugerem que um aumento substancial da sobrevivência pode ser afetado pela utilização no pré-hospital de um método simples e eficaz do controle da hemorragia. Infelizmente, tal método não foi demonstrado com sucesso pela utilização dos dispositivos hemostáticos comercialmente disponíveis.

Separadamente, o fechamento cirúrgico da ferida é obtido atualmente pelas suturas e pelos grampos que facilitam a cura ao juntar os tecidos. No entanto, muito freqüentemente eles falham ao produzir a vedação necessária adequada para impedir o vazamento do fluido. Desse modo, há uma grande necessidade médica, não satisfeita, de dispositivos e métodos para a prevenção de vazamentos depois da cirurgia, incluindo os vazamentos que normalmente ocorrem ao longo do grampo e das linhas de sutura. Tais dispositivos e métodos são necessários como auxiliares das suturas ou dos grampos para obter a hemostasia ou outra estase de fluido em reconstruções vasculares periféricas, em reconstruções dura-mãter, torácicas, cardiovasculares, de pulmão, neurológicas e cirurgias gastrointestinais.

A maioria dos dispositivos hemostáticos de pressão elevada atualmente no mercado consiste nominalmente, se não completamente, em adesivos. Bons exemplos de tais dispositivos são o QuikClot® ACS™ (Z-Medica, Wallington, CT) e a bandagemm HemCon™ (HemCon, Portland, OU) , os dois dispositivos hemostáticos fornecidos atualmente aos membros das forças armadas dos Estados Unidos. Os cristais de zeõlito mineral na esponja QuikClot causam a adsorção das moléculas de água no sangue, concentrando desse modo os fatores de coagulação e acelerando a coagulação do sangue. A mistura de quitosana que compõe a bandagemm HemCon acima tem uma carga positiva e atrai as hemácias do sangue, que têm uma carga negativa. As hemácias do sangue são atraídas para dentro do curativo, formando uma vedação sobre a ferida e estabilizando a superfície da ferida.

O produto bandagem HemCon mencionado acima foi desenvolvido em uma tentativa de obter o controle da hemorragia no pré-hospital e já tem demonstrado um sucesso limitado no campo. No entanto, a rede de quitosana que compõe a bandagem HemCon pode ficar saturada com o sangue e falhar rapidamente quando se defronta com um fluxo de sangue intenso ou após uma a duas horas quando confrontada com o fluxo moderado de sangue de uma ferida (B.S Kheirabadi et do al. (2005). J. Trauma.59:25-35; A.E.Pusateri et al. (2006). J.

Trauma.60:674-682). Além disso, o curativo de bandagem HemCon está disponível somente como um curativo rígido que não pode se ajustar facilmente às feridas irregulares, limitando desse modo a sua utilidade.

Outros dispositivos hemostáticos baseados em polissacarídeos que foram sugeridos para a utilização no controle de hemorragia são RDH™ (acetilglicosamina), TraumaDEX™ (MPH) e Chitoskin™ (Quitosana e gelatina). No entanto, nenhum desses tipos de bandagens demonstrou consistentemente a prevenção de falhas diante de um fluxo sangüíneo significativo. Outros dispositivos hemostáticos recentemente apresentados incluem Celox™ (cristais de quitosana) e WoundStat™ (TraumaCure Inc., MD) (mistura granular do mineral smectita e de um polímero super absorvente). No entanto, ambos os produtos ficam intumescidos rapidamente ao cobrir os sítios de ferida, o que faz com que eles sejam apropriados somente para a aceleração da coagulação sangüínea em tipos específicos de feridas e apresentam um perigo de reduzir ou mesmo eliminar o fluxo sangüíneo em vasos sangüíneos circundantes.

O QuikClot ACS™, também mencionado acima, também demonstrou eficácia ao estancar níveis de hemorragia moderados. No entanto, o mecanismo de adsorção de água do mineral zeólito não pode ocorrer sem a liberação de uma grande quantidade de calor. Dessa maneira, a aplicação do

QuikClot ACS™ resulta em elevadas temperaturas e queimaduras graves no sítio de ferimento, o que danifica as áreas de tecido circundantes e torna o cuidado médico posterior muito mais complicado (A. E. Pusateri et al. (2006). J. Trauma.60:674-682) . Claramente, uma solução hemostática sem esse efeito colateral significativo é ideal. Embora o QuikClot tenha desenvolvido uma mistura mineral que libera menos calor na aplicação, a eficácia da mistura mais fria é insuficiente para o cuidado de traumas graves. Além disso, nem as misturas minerais originais nem as mais frias podem deter um sangramento arterial intenso.

Todos os produtos mencionados acima contam com a cascata de coagulação natural para controlar o vazamento de fluido de um sítio de ferida. Dessa maneira, eles só são úteis para deter o fluxo sangüíneo e cada um deles somente sob condições apropriadas para esse dispositivo em particular. A vedação geral do sítio de ferida, particularmente dos sítios feridos dos quais vazam fluidos não sangüíneos, estão além do âmbito desses produtos.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

Há necessidade de, e seria útil que se tivesse um material adesivo atóxico que pudesse ser utilizado para uma ampla variedade de aplicações, incluindo, mas sem ficar a eles limitado, aplicações cirúrgicas, controle de hemorragias e controle de sangramento de uma ferida. Há também a necessidade de, e seria útil que se tivesse um material adesivo atóxico que pudesse ser utilizado como parte de uma bandagem hemostática. Há também a necessidade de, e seria útil que se tivesse, um material adesivo atóxico que poudesse ser utilizado como um vedante cirúrgico.

A presente invenção supera os inconvenientes dos antecedentes da invenção ao apresentar um material adesivo que compreende uma proteína de reticulação e um material atóxico que induz a reticulação da proteína de reticulação.

Preferivelmente, a proteína de reticulação inclui a gelatina e qualquer variante da gelatina ou proteína variante tal como aqui descrito. Opcionalmente, e preferivelmente, o material atóxico compreende a transglutaminase (TG) , que pode opcionalmente compreender uma transglutaminase microbiana (mTG) . De acordo com algumas realizações da presente invenção, o material adesivo é provido em uma bandagem, que é preferivelmente adaptada para utilização como uma bandagem hemostática. De acordo com outras realizações, ele é provido como um vedante, o qual é preferivelmente adaptado para utilização como vedante cirúrgico.

Ao agir sobre uma transglutaminase, a gelatina, que é uma forma desnaturada de colágeno-proteína, passa por uma rápida reticulação para formar um gel vibrante. 0 processo de gelificação que ocorre é extremamente similar à cascata de coagulação de estágio final natural pela qual passa a fibrina quando entra em contato com o Fator XIII e o cálcio. Além disso, o gel resultante demonstra capacidade adesiva muito similar à da cola de fibrina, quando não maior do que a mesma. (M.K. McDermott, Biomacromolecules.2 004 Jul- Aug;5(4) :12 70-9) .

A presente invenção utiliza as similaridades da reticulação gelatina-TG com a cascata de coagulação da fibrina para imitar o desempenho hemostático superior de um curativo de fibrina avançado. Ao substituir a disposição em camadas de fibrina-trombina de uma bandagem de fibrina por disposição em camadas de gelatina-TG resulta na criação de um curativo novo, barato e estável que pode controlar a hemorragia sem efeitos colaterais significativos. Esta nova bandagem maximiza as propriedades adesivas da mistura de gelatina-TG permitindo a aplicação controlada de uma grande quantidade da mistura a um sítio de ferida de uma maneira que impede a propagação da TG às áreas que não ficam em contato com a bandagem. Dessa maneira, esta tecnologia sinergística representa um avanço tanto no campo de curativos de fibrina avançados quanto no campo da aderência gelatina-TG. Ao contrário de uma rede de fibrina coagulada, a rede de gelatina-TG tem um benefício adicional, uma vez que ela pode ser especificamente dissolvida utilizando uma protease especificada que não seja de outra maneira fisiologicamente reativa (T. Chen, Biomacromolecules. 2003 Nov-Dec; 4(6):1558-63). Desse modo, enquanto um curativo hemostático com a disposição em camadas de gelatina-mTG pode imitar o desempenho de um curativo hemostático com a disposição em camadas de fibrina-trombina, ele também pode ser removido conforme desejado sem complicação.

Além de sua aplicação como curativo de campo hemostático para cuidados de traumas, a presente invenção de um dispositivo hemostático com base em gelatina-TG tem o grande potencial de controlar um sangramento arterial intenso durante uma cirurgia, um sangramento após a cauterização endovascular ou um vazamento de outros fluidos corpóreos após ferimentos ou durante uma cirurgia.

Até a presente data, embora as propriedades gelificantes da gelatina-TG reticulada e a capacidade adesiva da reticulação gelatina-TG tenham sido exploradas separadamente, nenhum esforço foi feito para utilizar ambas as características para formar uma composição para vedação de tecido ou hemostática.

A utilização do composto de gelatina-TG como um adesivo foi demonstrada in vivo em um modelo de retina de rato, onde uma gota da mistura de gelatina-TG foi utilizada para fixação retinal (T. Chen, J Biomed Mater Res B Appl Biomater. Maio 2006; 77 (2) :416-22) .

A utilização do gel de gelatina-TG como uma sustentação para a terapia celular também foi testado (Patente US 5.834.232. Também Ito A, J Biosci & Bioeng. 2003;95 (2) : 196-99. E também Broderick EP, J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2005 janeiro 15;72(1):37-42). Embora esses estudos tenham enfatizado a segurança da utilização fisiológica da mistura de gelatina-TG, cada um deles utilizou somente uma das características da reticulação de gelatina-TG, e falharam em mostrar ou sugerir o avanço da vedação de tecido e da hemostasia apresentado na presente invenção.

A utilização da mistura de gelatina-TG para a hemostasia ou estase de fluido também marca um avanço significativo de diversas tentativas bem documentadas da utilização de transglutaminases, particularmente TG de tecido, independentemente como adesivos cirúrgicos (USP 5736132, USP 61908196, entre muitos). O emprego da gelatina como um substrato para a TG adiciona uma sustentação mecânica à atividade da TG que confere diversas vantagens em relação à utilização da TG sozinha. A TG em conjunto com a gelatina pode ser aplicada com mais precisão do que a TG sozinha, pode se ajustar com precisão a um sitio de ferida e permite uma capacidade de bioabsorção controlada.

A presente invenção supera os inconvenientes dos antecedentes da invenção. As soluções experimentadas anteriormente utilizaram muitas formas de redes de gelatina modificadas e não modificadas para hemostasia suave a moderada. No entanto, não existe um método de formação, in situ, de uma rede de gelatina fortemente reticulada que possa controlar a hemorragia arterial de sangramento intenso ou outros vazamentos de fluidos corpóreos significativos. Um método, tal como a reticulação de gelatina-TG que pode formar uma rede de gelatina intensa in vivo aumenta a resistência mecânica de uma matriz de gelatina e faz com que ela seja apropriada para controlar um sangramento arterial de pressão elevada e outros vazamentos de fluidos corpóreos. Além do método de reticulação aperfeiçoado, a presente invenção envolve muitas outras inovações que conferem à mesma vantagen sobre os materiais hemostáticos com base em gelatina existentes. Uma lista não limitadora ilustrativa parcial é fornecida abaixo:

1) A reticulação in si tu entre as cadeias de gelatina e o colágeno endógeno de tecido ECM (matriz extracelular) cria uma barreira forte, hemostática, para fluidos.

2) A gelatina e a TG afetam mais eficazmente a hemostasia ou a estase de fluido ao serem aplicadas na forma liofilizada e reconstituídas pelo sangue ou por outro fluido corpóreo.

3) Uma mistura de gelatina-TG na forma liofilizada aumentou a vida útil.

4) A gelatina e a TG na forma de camadas, liofilizadas, proporcionaram uma reconstituição mais rápida, o que é útil para um ambiente de fluxo de fluido de pressão elevada.

5) A adição de um suporte mecânico à mistura de gelatina-TG básica aumenta a capacidade hemostática ou de controle de fluido da mistura, retardando o fluido e propiciando à gelatina-TG mais tempo para reticular e obstruir o vazamento de fluido.

De acordo com algumas realizações preferidas da presente invenção, a mistura de gelatina-mTG é parcialmente reticulada antes da aplicação a um sítio de ferida ou antes da liofilização. Em uma outra realização, a gelatina ou mTG não reticuladas estão presentes em conjunto com gelatina-mTG parcialmente reticuladas.

s bandagens hemostáticas de natureza adesiva são conhecidas no estado da técnica, porém apresentam muitas complicações e inconvenientes em sua utilização. Por exemplo, a utilização hemostática difundida do fibrinogênio e da trombina era comum até o último ano da Segunda Guerra Mundial, mas eles foram abandonados por causa da transmissão da hepatite (D. B. Kendrick, Blood Program in WW II (Washington, DC: Office of the Surgeon General, Department of Armyl98 9), 363-368).

Os curativos de fibrinogênio foram utilizados

primeiramente por cirurgiões de traumas durante a Primeira Guerra Mundial quando Grey e seus colegas produziram folhas e pós de fibrina pré-polimerizada. Durante a Segunda Guerra Mundial, a cola de fibrina foi criada com folhas de fibrina pré-polimerizadas similares a isopor e películas de fibrina pelo exército dos Estados Unidos e a Cruz Vermelha Americana. Os curativos baseados em fibrina mostram uma diferença significativa no tempo de controle do sangramento e na redução da perda de sangue quando comparados a um controle.

(Jackson, M., et al. (1996). J. of Surg. Res. 60:15-22; e Jackson, M., et al. (1997). Surg. Fórum. XL, VIII:770-772)

Apesar da eficácia dos curativos de fibrinogênio no controle da hemorragia, a utilização de curativos de fibrinogênio foi interrompida, uma vez que as doenças transportadas pelo sangue e pelo soro, tais como hepatite e

HIV, eram transmitidas freqüentemente, uma vez que os curativos continham fibrinogênio humano ou animal purificado ou outros produtos de sangue purificados. (Holcomb, J. B., et al. (1997). Surgical Clinics of North América.77:943-952)

Nos últimos anos, no entanto, houve um interesse renovado nos produtos baseados de fibrina para tratamento de feridas uma vez que as técnicas de purificação de plasma reduziram muito o risco das doenças transportadas pelo sangue e pelo soro.

Um curativo hemostático em camadas foi descrito pela Cruz Vermelha dos Estados Unidos, o qual contém uma camada de trombina imprensada entre camadas de fibrinogênio (vide, por exemplo, PCT/US99/10952, patente norte-americana n° . 6054122, 6762336). Esse curativo hemostático demonstrou muito sucesso no tratamento de ferimentos de trauma potencialmente fatais (E.M. Acheson. (2005). J. Trauma.59 (4) :865-74 ; discussion 874-5; B.S.

Kheirabadi.(2005). J. Trauma.59(1):25-34; discussion 34-5; A.E. Pusateri. (2004) . J. Biomed. Mater. Res.B Appl. Biomater. 15; 70(1) :114-21) . De fato, nesses estudos com suínos, o curativo em camadas de fibrina teve um desempenho muito melhor que os produtos HemCon e QuikClot no tratamento de ferimentos de trauma potencialmente fatais, demonstrando uma taxa de sobrevivência > 75% após duas horas, contra a sobrevivência de 0% quando a bandagem de campo padrão do exército, a bandagem HemCon, ou o pó QuikClot, eram utilizados.

Embora tais curativos possam ser utilizados nos métodos para tratamento de tecido ferido, tais curativos em camada convencional podem se desprender, uma vez que as bordas das camadas do curativo não aderem mais umas às outras. Tal desprendimento pode resultar na interação reduzida das camadas componentes do curativo, com eficácia diminuída do curativo para impedir a hemorragia.

Foi descrito um curativo hemostático em camadas com base em fibrina aperfeiçoado, o qual compreende uma pluralidade de camadas que contêm materiais reabsorvíveis e/ou proteínas de coagulação. Especificamente, o curativo (vide PCT/US03/2 8100, Pedido de Patente Norte-americano n°. 0060155234) inclui uma camada de trombina imprensada entre uma primeira e uma segunda camada de fibrinogênio, sendo que a camada de trombina não é coextensiva com a primeira e/ou segunda camada de fibrinogênio.

Apesar dos avanços nos curativos de ferida de fibrina, essas bandagens apresentam muitos inconvenientes. 0 fibrinogênio liofilizado utilizado para fazer a bandagem deve ser purificado do plasma sangüíneo humano. Uma vez que este é um procedimento caro e delicado, a bandagem de fibrinogênio resultante é extremamente cara de produzir e tem uma vida útil muito curta à temperatura ambiente. Quanto mais fibrinogênio é adicionado ao revestimento protetor, melhor o desempenho da bandagem para deter o sangramento. No entanto, quanto mais fibrinogênio é adicionado ao revestimento protetor, mais cara a bandagem. Além disso, quantidades elevadas de fibrinogênio no revestimento protetor da bandagem podem contribuir para a fragilidade da bandagem, tornando a mesma friável e difícil de trabalhar. Em conseqüência dessas limitações, nenhuma bandagem de fibrina eficaz é disponível comercialmente.

Desse modo, embora um curativo de fibrina avançado possa controlar a hemorragia sem efeitos colaterais significativos e cobrir a deficiência previamente mencionada nas hemostasias de cuidado de trauma ativo, as limitações de preço e de estabilidade apresentam grandes desvantagens para a utilização desse tipo de curativo.

Os vedantes ou colas de fibrina líquida têm sido utilizados por muitos anos como auxiliares nas salas de cirurgia para controlar a hemorragia (J. L. Garza et al. (1990). J. Trauma. 30:512-513; H. B. Kram et al. (1990). J. Trauma.30:97-101; M.G. Ochsner et al. (1990). J. Trauma.30:884-887; T.L. Matthew et al. (1990). Ann. Thorac. Surg. 50:40-44; H. Jakob et al. (1984). J. Vasc. Surg. 1:171- 180). Além disso, os vedantes de fibrina de doador único também têm sido extensamente utilizados clinicamente em várias situações cirúrgicas. (W. D. Spotnitz. (1995). Thromb. Haemost. 74.-482-485; R. Lerner et al. (1990). J. Surg. Res.48:165-181).

Embora uma série de hemostatos cirúrgicos absorvíveis seja utilizada atualmente na área cirúrgica, nenhum produto existente é suficientemente competente para conferir o suporte mecânico e biológico necessário para controlar hemorragia grave ou o fluxo vigoroso de outros fluidos biológicos.

As bandagens hemostáticas atualmente disponíveis, tais como os curativos de ferida de colágeno (INSTAT™, Ethicon, Somerville, NJ, e AVITENE™, CR Bard, Murray Hill, NJ) , ou os curativos de ferida de fibrina e trombina secas TACHOCOMB™, Hafslund Nycomed Pharma, Linz, Áustria) , são restritas para utilização em aplicações cirúrgicas, e não são suficientemente resistentes para dissolução em um grande fluxo sangüíneo. Elas também não possuem propriedades adesivas suficientes para satisfazer qualquer finalidade prática de estancamento de fluxo sangüíneo grave. Essas bandagens hemostáticas cirúrgicas disponíveis atualmente também são delicadas e desse modo propensas a falhas se forem danificadas ao serem dobradas ou carregadas com pressão. Elas também são suscetíveis à dissolução em sangramento hemorrágico. A dissolução e a decomposição dessas bandagens podem ser catastróficas, porque podem produzir uma perda da aderência à ferida e permitir que o sangramento continue sem diminuir.

O sangramento arterial também não é controlável com a aplicação de celulose oxidada (SURGICEL, Ethicon,

Somerville, NJ) ou hemostatos absorvíveis de esponja de gelatina (SURGIFOAM, Ethicon, Somerville, NJ) . A finalidade desses produtos é de controlar o sangramento de baixa pressão do osso e de escoamento venoso epidural. As esponjas de gelatina não são apropriadas para sangramento arterial de fluxo intenso de pressão elevada, porque não formam uma ligação sem folga com a fonte do sangramento e são desse modo, desalojadas com facilidade. A celulose oxidada também não é apropriada para controle do sangramento arterial porque fica intumescida e precisa ser removida do sítio de aplicação quando a hemostasia é obtida. Quando o fluxo sangüíneo é demasiadamente grande, ocorre um grande intumescimento antes de a hemostasia ser obtida (M. Sabei et al. (2004). Eur.

Spine J. 13 (1):S97-101).

Os adesivos de tecido mais amplamente utilizados são geralmente inadequados para utilização como dispositivos hemostáticos ou de estase de fluido interna devido a razões geralmente relacionadas à toxicidade suave e impossibilidade de serem preparados e aplicados facilmente em campo. Um bom exemplo é a família do cianoacrilato de adesivos de pele tópicos, tais como Dermabond™, Indermil™, Liquiband™ etc. A natureza de ativação rápida do cianoacrilato quando exposto ao ar torna os produtos baseados em cianoacrilato impróprios para utilização em um curativo de campo hemostático ativo, e a sua incapacidade de se ligar a superfícies úmidas torna os mesmos impróprios para utilização em hemostasias internas ou estases de fluido.

Os produtos existentes destinados à utilização em estase de fluido interno também apresentam problemas significativos. 0 BioGlue™ (Cryolife Inc.) é um adesivo e vedante forte, mas contém albumina reticulada por glutaraldeído, uma substância que é tóxica e elevadamente neurotóxica. Esta toxicidade limita extremamente a sua utilização. Um outro vedante é o CoSeal (Baxter), que é composto de polietileno glicol (PEG). Embora seja atóxico, ele tem uma fraca intensidade adesiva, limitando extremamente as suas aplicações.

A gelatina tem sido utilizada em uma variedade de curativos de feridas. Uma vez que os géis de gelatina têm um ponto de fusão relativamente baixo, eles não são muito estáveis à temperatura corporal. Portanto, é imperativo estabilizar esses géis ao estabelecer reticulações entre as cadeias de proteína. Na prática, isto é geralmente obtido ao tratar a gelatina com glutaraldeído ou formaldeído. Desse modo, a gelatina reticulada pode ser fabricada como esponjas secas que são úteis para induzir a hemostasia em feridas com sangramento. Os exemplos comercialmente disponíveis de tais esponjas incluem Spongostan (Ferrosan, Dinamarca), Gelfoam (Upjohn, EUA) e Surgifoam (Ethicon, Somerville, NJ). A desvantagem principal dessas esponjas é que o agente de reticulação utilizado (formaldeído ou glutaraldeído) é tóxico para as células. O efeito negativo da reticulação do glutaraldeído é exemplificado, por exemplo, pelas descobertas feitas por de Vries et al. (Abstract Book of the Second Annual Meeting of the WHS, Richmond, EUA, p51, 1992). Esses autores mostraram que as retículas de colágeno reticulado com glutaraldeído eram tóxicas para a célula, ao passo que a variedade não reticulada não era. Portanto, apesar de suas propriedades hemostáticas benéficas, esses produtos não são ideais como curativos de ferida para o tratamento de feridas problemáticas. Conseqüentemente, um curativo de ferida baseado em gelatina que utilize uma tecnologia diferente, menos tóxica, de reticulação seria muito desejável.

Além da toxicidade potencial, as redes de gelatina sozinhas não conferem as propriedades mecânicas necessárias para controlar um sangramento intenso. Elas são mais apropriadas para as aplicações de controle de ferida que só requerem um pouco de absorção de fluido. Em um estudo, foi concluído que as folhas de gelatina de glutaraldeído reticulado são mais apropriadas como curativo para a cura sustentada da ferida, particularmente de tecido distrófico, que necessita de um tempo mais longo. Alternativamente, elas podem ser úteis como revestimento protetor para a fixação da célula, onde podem estimular um microambiente fracamente reativo através da presença in si tu prolongada (MG Tucci. (2001). J. Bioactive & Comp. Polymers. 16 (2) :145-157).

As redes de gelatina reticuladas com polissacarídeos também foram sugeridas para utilização no controle do sangramento. Esses compostos hemostáticos ficam liberados da toxicidade potencial das esponjas de gelatina de glutaraldeído reticulado. No entanto, nas substâncias de gelatina-polissacarídeo geralmente falta resistência mecânica e elas são destinadas a controlar principalmente quantidades pequenas de escoamento de fluidos durante a cirurgia ou a limitar o escoamento da ferida em um período de cuidado prolongado, pós-médico.

Um exemplo de um composto de gelatina- polissacarídeo é um curativo de ferida de gelatina-alginato que é reticulado in si tu. Tal curativo não tem nenhuma função adesiva e é utilizado principalmente para manter a umidade no sítio de ferida. 0 curativo intumesce até 90% de seu tamanho inicial, o que reduz bastante sua resistência mecânica (B Balakrishnan et al. (2005). Biomaterials. 26 (32) :6335-42) .

Um outro exemplo, mais difundido, é um curativo de ferida de gelatina-quitosana reticuladas (exemplos nas Patentes Norte-americanas 6.509.039, 4.572.906). Embora alguns tenham sugerido a utilização de tais curativos para o cuidado de trauma (Chitoskin™), as propriedades hemostáticas desse material são simplesmente insuficientes para controlar o sangramento de pressão elevada. Além disso, o material fica significativamente intumescido quando confrontado com grandes volumes de fluidos corpóreos. Tais curativos são mais apropriados para o tratamento de feridas e queimaduras crônicas.

Ainda um outro exemplo é mencionado (Patente Norte- americana 6.132.759) onde a gelatina solubilizada é reticulada com dextrana oxidada. Este material é sugerido para cobertura e tratamento de longo prazo de feridas, uma vez que demonstrou uma capacidade de absorção elevada e propriedades de liberação controlada favoráveis para a aplicação de substâncias terapêuticas, particularmente para as feridas.

Atualmente nenhum material que envolve redes de gelatina reticulada ou redes de outros materiais reticulados com gelatina pode oferecer independentemente a hemostasia para o sangramento interno intenso, mesmo com a adição de trombina. Um estudo foi feito comparando a capacidade hemostática da matriz de gelatina FloSeal (BioSurgery, Fremont, CA) e da matriz de gelatina GelFoam embebida em solução ativa de trombina. Nenhum dispositivo hemostático pôde deter o sangramento caracterizado por fluxo em mais de dois terços dos pacientes após cinco minutos. O sangramento arterial pulsátil é muito mais forte do que o sangramento de fluxo e certamente deve apresentar um problema para essas matrizes embebidas em trombina (FA Weaver et al. (2002). Ann. Vasc. Surg. 16 (3) :286-93) .

Em qualquer caso, permanece uma clara deficiência no cuidado de traumas, em que não há nenhum curativo de campo hemostático novo, ativo, disponível que possa controlar a hemorragia sem efeitos colaterais significativos. De modo similar, permanece uma clara deficiência no cuidado cirúrgico, uma vez que não há nenhum vedante atóxico disponível que seja capaz de suportar um sangramento intenso e vedar os sítios de ferida no vazamento de fluidos corpóreos não sangüíneos.

De acordo com algumas realizações da presente invenção, é apresentado um método de tratamento de um tecido ferido, o qual compreende a aplicação ao tecido de uma composição que compreende gelatina e um agente de reticulação atóxico.

Opcionalmente, o agente de reticulação atóxico compreende a transglutaminase. Preferivelmente, a transglutaminase é incluída como parte de uma composição de transglutaminase e a relação de peso entre a gelatina e a composição de transglutaminase fica em uma faixa de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 300:1. Mais preferivelmente, a composição de transglutaminase tem um nível de atividade específico de pelo menos aproximadamente 4 0 U/g. Ainda mais preferivelmente, a composição de transglutaminase tem um nível de atividade específico de pelo menos aproximadamente 800 U/g.

Opcionalmente e preferivelmente, a atividade da transglutaminase na composição de gelatina-transglutaminase é de aproximadamente 25 a aproximadamente 400 U/g de gelatina. Mais preferivelmente, a atividade é de aproximadamente 40 a aproximadamente 200 U/g de gelatina.

Opcionalmente, a transglutaminase compreende uma planta, um animal recombinante ou uma transglutaminase derivada microbiana com exceção do Fator XIII derivado do sangue. Preferivelmente, a composição tem um pH na faixa de aproximadamente 5 a aproximadamente 8.

Opcionalmente, a gelatina é produzida a partir de origem animal, de origem recombinante ou de uma combinação das mesmas. Preferivelmente, a origem animal é selecionada do grupo que consiste em peixes e mamíferos. Mais preferivelmente, o mamífero é selecionado do grupo que consiste em suínos e bovinos.

Opcionalmente, a gelatina é do tipo A (tratada com ácido) ou do tipo B (tratada com álcali) . Mais preferivelmente, a gelatina compreende uma gelatina de elevado peso molecular.

Opcionalmente, o tecido ferido é selecionado do grupo que consiste em tecido cortado cirurgicamente, tecido reparado cirurgicamente e tecido traumatizado. Opcionalmente, o método compreende ainda a redução do sangramento ou o vazamento de outros fluidos corpóreos do tecido. Opcionalmente, um fluido corpóreo é selecionado do grupo que consiste em um fluido espinal cerebral, fluido intestinal, ar, bile e urina. Preferivelmente, o método compreende ainda a indução da hemostasia ou da estase de outros fluidos corpóreos que vazam do tecido.

Opcionalmente, há sangramento da ferida e vazamento de um outro fluido corpóreo e o tratamento do tecido ferido compreende a aplicação da composição ao sítio de ferida para incentivar a reticulação in si tu entre as cadeias de gelatina e o colágeno endógeno da matriz extracelular do tecido para criar uma barreira ao vazamento de fluido ou ao sangramento.

Opcionalmente, o método compreende ainda a formação de um coágulo biomimético.

Opcionalmente, a aplicação da composição compreende: da gelatina e da transglutaminase para formar uma mistura; e a aplicação da mistura ao tecido.

De acordo com outras realizações da presente invenção, é apresentado um método para a indução da hemostasia em uma ferida de um mamífero, sendo que o método compreende a aplicação à ferida de uma composição que compreende gelatina e transglutaminase.

Ainda de acordo com outras realizações da presente invenção, é apresentado um método para induzir a formação de um coágulo biomimético em um sítio de vaso sangüíneo danificado, o qual compreende a aplicação à ferida de uma composição que compreende gelatina e transglutaminase.

Ainda de acordo com outras realizações da presente invenção, é apresentada uma composição que compreende uma combinação de gelatina e transglutaminase, sendo que a relação de uma quantidade de gelatina e de uma quantidade de transglutaminase é selecionada para induzir a formação de um coágulo biomimético em um mamífero.

Ainda de acordo com outras realizações da presente invenção, é apresentada uma composição que compreende uma combinação de gelatina e agente de reticulação atóxico, em que uma relação de uma quantidade de gelatina e de uma quantidade do agente de reticulação atóxico é suficiente para reduzir o sangramento em uma ferida de um mamífero.

Preferivelmente, o agente de reticulação atóxico compreende a transglutaminase. Mais preferivelmente, a transglutaminase é adicionada como parte de uma composição de transglutaminase, e a relação de peso entre a gelatina e a composição de transglutaminase fica compreendida em uma faixa de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 3 00:1. Mais preferivelmente, a relação fica em uma faixa de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 100:1. Mais preferivelmente, a composição de transglutaminase tem um nível de atividade específico de pelo menos aproximadamente 40 U/g. Ainda mais preferivelmente, a composição de transglutaminase tem um nível de atividade específico de pelo menos aproximadamente 8 0 U/g. Também mais preferivelmente, a composição de transglutaminase tem um nível de atividade específico de pelo menos aproximadamente 200, 400 ou 800 U/g.

Opcionalmente, a atividade da transglutaminase na composição de gelatina-transglutaminase é de aproximadamente a aproximadamente 4 00 U/g de gelatina. Preferivelmente, a atividade é de aproximadamente 4 0 a aproximadamente 2 00 U/g de gelatina.

Opcionalmente, a transglutaminase compreende uma planta, recombinante, animal ou transglutaminase derivada microbiana à exceção do Fator XIII derivado do sangue. Preferivelmente, a composição compreende ainda um estabilizante ou uma carga. Também preferivelmente, a composição tem um pH em uma faixa de aproximadamente 5 a aproximadamente 8.

Opcionalmente, a gelatina é produzida a partir de origem animal, de origem recombinante ou de uma combinação das mesmas. Preferivelmente, a origem animal é selecionada de um grupo que consiste em peixes e mamíferos. Mais preferivelmente, o mamífero é selecionado de um grupo que consiste em suínos e bovinos. Mais preferivelmente, a gelatina compreende as peles dos suínos ou os ossos dos suínos, ou uma combinação dos mesmos. Ainda mais preferivelmente, a gelatina é do tipo A (tratada com ácido) ou do tipo B (tratada com álcali) . Ainda mais preferivelmente, a gelatina compreende uma gelatina de elevado peso molecular.

Opcionalmente, a gelatina tem um valor de Bloom de pelo menos aproximadamente 25 0. Preferivelmente, o peixe compreende uma espécie de peixe de água fria.

Opcionalmente, a gelatina recombinante é produzida utilizando sistemas bacterianos, de levedura, de animal, de inseto ou de planta ou qualquer tipo de cultura de célula.

Opcionalmente, a gelatina é purificada para remover os sais.

Opcionalmente, a gelatina tem pelo menos uma característica ajustada, adaptada ou predeterminada. Opcionalmente, a gelatina não é submetida a processo de gelificação termoreversível.

Ainda de acordo com outras realizações da presente invenção, é apresentado um agente hemostático ou de vedação de fluido corpóreo que compreende uma combinação de gelatina e um agente de reticulação atóxico. Opcionalmente, o agente de reticulação atóxico compreende a transglutaminase. Preferivelmente, a combinação compreende a gelatina e a transglutaminase agregadas.

Tal como aqui descrito, um método ou uma composição em que a transglutaminase pode, opcionalmente, ser extraída de um ou mais dentre Streptoverticillium Baldaccii, uma cepa de Streptomyces Hygroscopicus ou Eseheriehia Coli.

Ainda de acordo com outras realizações da presente invenção, é apresentado um método para a indução da hemostasia dentro em um tecido ferido e/ou para vedação do mesmo, o qual compreende a aplicação no tecido de uma composição que compreende um substrato de proteína de reticulação e de um agente de reticulação atóxico.

Opcionalmente, o agente de reticulação atóxico compreende a transglutaminase. Preferivelmente, o substrato compreende uma ou mais seqüências de polímeros sintetizados que caracterizam um sítio de reticulação de transglutaminase. Mais preferivelmente, o substrato compreende um polipeptídeo modificado que compreende pelo menos um sítio de reticulação de transglutaminase.

Ainda de acordo com outras realizações da presente invenção, é apresentada uma composição para a indução da hemostasia e/ou vedação de uma ferida que compreende uma mistura de gelatina e de transglutaminase, sendo que a mistura é modificada de tal modo que a gelatina forma uma solução com a transglutaminase a uma temperatura mais baixa do que a temperatura de transição de sol-gel natural da gelatina animal padrão.

Opcionalmente, a gelatina foi modificada para apresentar uma temperatura de transição de sol-gel reduzida. Preferivelmente, a composição compreende ainda um aditivo para aumentar a solubilidade de gelatina na mistura. Mais preferivelmente, a composição compreende ainda um aditivo para reduzir a temperatura de transição de sol-gel da gelatina. Mais preferivelmente, a composição compreende ainda um plastif icante. Opcionalmente, e mais pref erivelmente, o plastificante é selecionado do grupo que consiste em álcool poliídrico, glicerina, glicerol, xilitol, sacarose, sorbitol, trietanolamina, resorcinol, tiodiglicol, sal de sódio de toluenosulfoácido, butileno glicol, nitrato de uréia, tiouréia, uréia, ácido glutâmico, ácido aspárgico, valina, glicina, KSCN, KI e LiBr.

Opcionalmente, uma faixa da relação de concentração para o glicerol varia de aproximadamente 0,5:1 a aproximadamente 5:1 de Glicerol: Gelatina, peso por peso. Preferivelmente, a faixa da relação de concentração varia de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 2:1 de Glicerol: Gelatina, peso por peso. Opcionalmente, uma faixa da relação de concentração para o sorbitol varia de aproximadamente 0,5:1 a aproximadamente 5:1 de Sorbitol: Gelatina, peso por peso. Preferivelmente, a faixa da relação de concentração varia de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 3:1 de Sorbitol:Gelatina, peso por peso.

Opcionalmente, uma faixa da relação de concentração para a uréia varia de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:2 de uréia: gelatina, peso por peso.

Opcionalmente, a composição compreende ainda um agente de ajuste selecionado do grupo que consiste em um agente de ajuste do pH e um agente de ajuste da concentração de íons. Preferivelmente, o agente de ajuste do pH provê um pH em uma faixa de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 5,0 ou de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 9,0.

Opcionalmente, a composição compreende ainda um sal.

Opcionalmente, a composição compreende ainda um carboidrato de trehalose, um carboidrato de manitol ou um outro carboidrato para estabilização para a secagem por aspersão, a liofilização ou uma outra secagem de proteína.

Opcionalmente, a composição compreende ainda um desnaturante. Preferivelmente, o desnaturante é selecionado do grupo que consiste em hidrocloreto de guanidina e uréia. Mais preferivelmente, uma faixa da relação de concentração varia de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:2 de GuHCl:gelatina, peso por peso. Ainda mais preferivelmente, uma faixa da relação de concentração varia de aproximadamente 0.5:1 a aproximadamente 1:1 de uréia: gelatina, peso por peso.

Opcionalmente, a composição compreende ainda um agente redutor. Preferivelmente, o agente redutor é selecionado do grupo que consiste em cloreto de magnésio e hidroquinona. Mais preferivelmente, a hidroquinona está presente na solução da mistura a uma concentração de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,5 M. Mais preferivelmente, a concentração varia de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 0,4 M.

Opcionalmente, o cloreto de magnésio está presente na solução da mistura a uma concentração de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 M. Preferivelmente, a concentração varia de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 3,5M.

Opcionalmente, a composição compreende ainda um agente exotérmico. Preferivelmente, o agente exotérmico compreende um ou mais entre o cloreto de cálcio, outros sais de cálcio, cloreto de magnésio, óxidos/zeólitos metálicos, ou uma combinação destes. Mais preferivelmente, o cloreto de cálcio está presente em uma quantidade de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,7 g de cloreto de cálcio por ml da mistura na solução para cada aumento em graus Celsius na temperatura acima da temperatura ambiente.

Opcionalmente, a composição compreende ainda uma protease específica de gelatina.

Opcionalmente, a composição compreende ainda um inibidor de protease.

Opcionalmente, a composição compreende ainda um agente hemostático adicional. Preferivelmente, o agente hemostático adicional compreende ainda um ou mais dentre albumina, colágeno, fibrina, trombina, quitosana, sulfato férrico ou outros sulfatos de metal.

De acordo com outras realizações da presente invenção é apresentado um curativo hemostático ou de vedação que compreende: (i) uma primeira camada de gelatina; (ii) uma camada de transglutaminase adjacente à primeira camada de gelatina; e (iii) uma segunda camada de gelatina adjacente à camada de transglutaminase, sendo que a camada de transglutaminase é coextensiva ou não coextensiva com a primeira camada de gelatina e/ou a segunda camada de gelatina.

De acordo com outras realizações da presente invenção é apresentado um curativo hemostático ou de vedação que compreende: (i) uma camada de material reabsorvível ou não reabsorvível; (ii) uma primeira camada de gelatina adjacente à camada de material; (iii) uma camada de transglutaminase adjacente à primeira camada de gelatina; e (iv) uma segunda camada de gelatina adjacente à camada de transglutaminase, sendo que a camada de transglutaminase é coextensiva ou não coextensiva com a primeira camada de gelatina e/ou a segunda camada de gelatina.

De acordo com outras realizações da presente invenção é apresentado um curativo hemostático ou de vedação que compreende: (i) uma camada de gelatina; (ii) uma camada de transglutaminase adjacente à camada de gelatina; sendo que a camada de transglutaminase é coextensiva ou não coextensiva com a camada de gelatina.

De acordo com outras realizações da presente invenção é apresentado um curativo hemostático ou de vedação que compreende: (i) uma camada de material reabsorsível ou não reabsorsível; (ii) uma camada de gelatina adjacente à camada de material; (iii) uma camada de transglutaminase adjacente à camada de gelatina; sendo que a camada de transglutaminase é coextensiva ou não coextensiva com a camada de gelatina.

De acordo com outras realizações da presente invenção é apresentado um curativo hemostático ou de vedação que compreende: (i) uma camada de gelatina; (ii) uma camada de material reabsorvivel ou não reabsorvível adjacente à primeira camada de gelatina; (iii) uma camada de transglutaminase adjacente à camada de material; sendo que a camada de transglutaminase é coextensiva ou não coextensiva com a camada de gelatina.

Opcionalmente, o curativo compreende ainda um material de revestimento protetor.

De acordo com outras realizações da presente invenção, é apresentado um dispositivo hemostático ou de vedação que compreende: (i) uma matriz reabsorvível ou não reabsorvível; (ii) gelatina; (iii) transglutaminase; sendo que a gelatina e a transglutaminase são incorporadas dentro da matriz.

De acordo com outras realizações da presente invenção é apresentado um dispositivo hemostático ou de vedação que compreende: (i) uma matriz reabsorvível ou não reabsorvível porosa; (ii) gelatina; (iii) transglutaminase; sendo que a gelatina e a transglutaminase são aderidas à matriz.

De acordo com outras realizações da presente invenção, é apresentado um dispositivo médico para ser inserido em um corpo de um ser humano ou de um mamífero inferior, o qual compreende um agente hemostático ou de vedação ou uma composição tal como aqui descrito. Preferivelmente, o dispositivo compreende um cateter vascular. De acordo com outras realizações da presente invenção é apresentado um dispositivo médico para aplicação tópica no corpo de um ser humano ou mamífero inferior, o qual compreende um agente hemostático ou de vedação ou uma composição tal como aqui descrito. Opcionalmente o dispositivo compreende um spray ou uma espuma pressurizada.

Deve ser compreendido que tanto a descrição geral antecedente quanto a descrição detalhada a seguir são apenas exemplificadoras e explanatórias e se prestam a fornecer explanações adicionais da invenção tal como reivindicado.

A menos que esteja definido de alguma outra maneira, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado do modo como é geralmente compreendido por um elemento versado na técnica de produção ao qual pertence a presente invenção. Todas as patentes, pedidos de patente e publicações aqui mencionados são aqui incorporados a título de referência.

Tal como aqui utilizado, uma camada de transglutaminase que é considerada como "não coextensiva" com uma camada de gelatina é aquela na qual os limites espaciais da camada de transglutaminase em duas dimensões são menores do que os limites espaciais de uma ou ambas as camadas de gelatina de tal modo que a camada de transglutaminase é coextensiva com somente aproximadamente 5% a aproximadamente 95% da área de superfície da primeira camada de gelatinada do curativo hemostático e/ou coextensiva com somente aproximadamente 5% a aproximadamente 95% da camada de superfície da segunda camada de gelatinada do curativo hemostático, independentemente. Por exemplo, a camada de transglutaminase pode ser coextensiva com aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80 ou 90% da área de superfície de cada uma das primeiras e segundas camadas de gelatina, independentemente. Uma camada de transglutaminase que é "coextensiva" com uma camada de gelatina propicia um recobrimento completo da camada de gelatina e é coextensiva com 100% da área de superfície da camada de gelatina. Uma camada de transglutaminase pode ser não coextensiva com a primeira camada de gelatina e ainda ser coextensiva com a segunda camada de gelatina, ou vice versa, por exemplo, ao empregar as camadas de gelatina que têm áreas de superfície total ou formas diferentes.

"Paciente", tal como aqui utilizado, refere-se aos indivíduos humanos ou animais que precisam de cuidado médico e/ou tratamento.

"Ferida", tal como aqui utilizado, refere-se a qualquer dano a qualquer tecido de um paciente que resulta na perda de sangue do sistema circulatório ou na perda de qualquer outro fluido corpóreo de sua rota fisiológica. 0 tecido pode ser um tecido interno, tal como um órgão ou vaso sangüíneo, ou um tecido externo, tal como a pele. A perda de sangue ou de fluido corpóreo pode ser interna, tal como de um órgão rompido, ou externo, tal como de uma laceração. Uma ferida pode estar em um tecido mole, tal como um órgão, ou em um tecido duro, tal como um osso. 0 dano pode ter sido causado por qualquer agente ou fonte, incluindo ferimento traumático, infecção ou intervenção cirúrgica. Os danos podem representar risco de vida ou não representar risco de vida.

"Material reabsorvível11 tal como aqui utilizado refere-se a um material que é decomposto espontaneamente e/ou pelo corpo dos mamíferos em componentes que são consumidos ou eliminados de maneira a não interferir significativamente com a cura da ferida e/ou a regeneração do tecido, e sem causar nenhum distúrbio metabólico significativo.

"Estabilidade", tal como aqui utilizado, refere-se à retenção das características de um material que determinam a atividade e/ou a função. "Agente de ligação", tal como aqui utilizado, refere-se a um composto ou mistura de compostos que melhoram a aderência de uma camada do curativo hemostático em relação a uma ou mais camadas diferente e/ou a aderência dos componentes de uma determinada camada em relação a outros componentes dessa camada.

"Agente de solubilização", tal como aqui utilizado, refere-se a um composto ou mistura de compostos que melhoram a dissolução de uma proteína ou proteínas em um solvente aquoso (preferivelmente).

"Carga", tal como aqui utilizado, refere-se a um composto ou mistura de compostos que conferem volume e/ou porosidade a uma ou mais camadas dos curativos hemostáticos.

"Agente desprendedor", tal como aqui utilizado, refere-se a um composto ou mistura de compostos que facilitam a remoção de um curativo hemostático de um molde de fabricação.

"Agente formador de espuma", tal como aqui utilizado, refere-se a um composto ou mistura de compostos que produzem gás quando hidratados sob condições apropriadas.

"TG" refere-se à transglutaminase de qualquer tipo; "mTG" também pode se referir à transglutaminase microbiana e/ou a qualquer tipo de transglutaminase, dependendo do contexto (nos exemplos experimentais específicos abaixo, o termo refere-se à transglutaminase microbiana).

O termo "mamífero", particularmente no que diz respeito ao método de tratamento e/ou de utilização ou aplicação de um dispositivo e/ou composição, refere-se tanto aos seres humanos quanto aos mamíferos inferiores, a menos que especificado de outra maneira.

Tal como aqui utilizado, "aproximadamente" significa mais ou menos aproximadamente dez por cento do valor indicado. Outras características e vantagens da invenção ficarão aparentes a partir da descrição detalhada a seguir e das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A invenção é aqui descrita, somente a titulo de exemplo, com referência aos desenhos anexos. Com referência específica detalhada aos desenhos, deve ser enfatizado que os detalhes mostrados somente servem como exemplo e para finalidades de discussão ilustrativa das realizações preferidas da presente invenção, e são apresentados a fim de prover o que se acredita ser a descrição mais útil e imediatamente compreendida dos princípios e aspectos conceituais da invenção. Sob esse aspecto, nenhuma tentativa é feita de mostrar mais detalhadamente os detalhes estruturais da invenção do que o necessário para uma compreensão básica da invenção, e a descrição apresentada com os desenhos torna claro aos elementos versados na técnica de produção como as diversas formas da invenção podem ser incorporadas na prática.

Nos desenhos:

a Figura 1 é um diagrama de blocos esquemático de uma bandagem exemplificadora de acordo com a presente invenção;

a Figura 2 mostra uma vista frontal de uma bandagem exemplificadora de acordo com a presente invenção, coberta com um revestimento protetor absorvível opcional e um envoltório de plástico opcional;

a Figura 3 é um diagrama de blocos esquemático exemplificadora de um dispositivo hemostático de acordo com a presente invenção, incorporando uma matriz porosa;

a Figura 4 é um gráfico que mostra o efeito de diferentes porcentagens de uma gelatina testada na resistência da ferida; a Figura 5 mostra o efeito da temperatura na atividade da transglutaminase (a faixa de temperatura testada era de 32 a -150°F; a faixa ideal era de 122-131°F (50- 55°C));

a Figura 6 mostra medições da pressão de ruptura representativas dos adesivos de tecido baseados na composição A;

a Figura 7 mostra medições da pressão de ruptura representativas dos adesivos de tecido baseados na composição B;

a Figura 8 é uma fotografia que mostra a formação de gel e também a indução da hemostasia (a Figura 8A mostra a área inteira, ao passo que a Figura 8B mostra uma parte da área, ampliada para mais detalhes);

a Figura 9A mostra a falta de formação de coágulo após a aplicação da solução de controle, ao passo que a Figura 9B mostra o processo de gelificação da solução experimental e a hemostasia;

as Figuras 10A-D mostram fotografias da artéria enquanto ela era cortada (10A); a artéria cortada, sangrando profusamente (10B); aplicação da composição da presente invenção à artéria cortada (10C); e hemostasia, com formação de um coágulo biomimético (10D);

as Figuras IlA e IIB mostram um exemplo do método de seringa dupla de aplicação dos dois vedantes hemostáticos componentes; e

as Figuras 12A e 12B mostram um exemplo de um fechamento do ponto de inserção vascular onde o cateter é coberto pelos componentes aqui descritos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção é de um material adesivo que compreende uma proteína de reticulação e um material atóxico que induz a reticulação da proteína de reticulação. Preferivelmente, a proteína de reticulação inclui gelatina e qualquer variante de gelatina ou proteína variante tal como aqui descrito. Opcionalmente e preferivelmente, o material atóxico compreende a transglutaminase (TG), que pode opcionalmente compreender qualquer tipo de transglutaminase dependente de cálcio ou independente (mTG), que pode opcionalmente, por exemplo, ser uma transglutaminase microbiana. De acordo com algumas realizações da presente invenção, o material adesivo é provido em uma bandagem, a qual é pref erivelmente adaptada para utilização como uma bandagem hemostática. As várias realizações da presente invenção são descritas em mais detalhes abaixo, sob os títulos de seção que são apresentados somente para fins de clareza e sem nenhuma intenção de ser limitadores de qualquer maneira.

GELATINA E TRANSGLUTAMINASE

De acordo com as realizações preferidas da presente invenção, é apresentada uma composição para a hemostasia e vedação de tecido na qual o material de reticulação compreende a transglutaminase e a proteína de reticulação que compreende a gelatina.

De acordo com uma realização preferida, a transglutaminase está presente em uma composição que tem um nível de atividade específico de pelo menos aproximadamente 100 U/g, embora, opcionalmente, níveis de atividade mais baixos também possam ser utilizados, por exemplo, ao ajustar opcionalmente as relações acima descritas. Opcionalmente, tais níveis de atividade mais baixa da composição compreendem pref erivelmente pelo menos aproximadamente 20 U/g, mais pref erivelmente pelo menos aproximadamente 4 0 U/g, ainda mais pref erivelmente pelo menos aproximadamente 60 U/g e mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 8 0 U/gm.

A transglutaminase, sozinha ou como parte de uma composição, é preferivelmente adicionada à gelatina em uma quantidade tal que a atividade de transglutaminase resultante na mistura é preferivelmente de aproximadamente 25 a aproximadamente 100 U/g de gelatina, e mais pref erivelmente de aproximadamente 4 0 a aproximadamente 60 U/g de gelatina.

A gelatina e a transglutaminase apropriadas podem ser obtidas por quaisquer métodos conhecidos e disponíveis aos elementos versados na técnica de produção. A gelatina pode compreender opcionalmente qualquer tipo de gelatina que compreende a proteína que é conhecida no estado da técnica, preferivelmente incluindo, mas sem ficar a eles limitada, a gelatina obtida pela hidrólise parcial de tecido animal e/ou colãgeno obtido de tecido animal, incluindo, mas sem ficar a eles limitados, pele de animal, tecido conjuntivo (incluindo, mas sem ficar a eles limitado, ligamentos, cartilagem e outros), cornos ou chifres e outros, e/ou ossos, e/ou escamas de peixes e/ou ossos ou outros componentes; e/ou uma gelatina recombinante produzida com a utilização de sistemas bacterianos, de leveduras, de animais, de insetos ou de planta ou qualquer tipo de cultura de célula.

De acordo com as realizações preferidas da presente invenção, a gelatina de origem animal compreende preferivelmente a gelatina proveniente de mamíferos, e mais preferivelmente compreende uma ou mais peles de suínos, ossos de suínos ou de gado ou couro de gado aberto ou qualquer outra fonte suína ou bovina. Mais preferivelmente, tal gelatina compreende a gelatina suína uma vez que tenha uma taxa mais baixa de anafilaxia. A gelatina de origem animal pode opcionalmente ser do tipo A (tratada com ácido) ou do tipo B (tratada com álcali) , embora seja pref erivelmente do tipo A.

Preferivelmente, a gelatina de origem animal compreende a gelatina obtida durante a primeira extração, que é executada geralmente a baixas temperaturas (50-60°C, embora esta faixa de temperatura exata não seja necessariamente uma limitação). A gelatina produzida dessa maneira fica compreendida na faixa de valor de Bloom de 250-300 e tem um peso molecular elevado de pelo menos aproximadamente 95-100 kDa. Preferivelmente, é utilizada a gelatina com um valor de Bloom de 300.

Um exemplo não limitador de um produtor de tais gelatinas é a PB Gelatins (Tessenderlo Group, Bélgica).

De acordo com algumas realizações da presente invenção, a gelatina de origem animal compreende opcionalmente a gelatina de peixe. Opcionalmente, qualquer tipo de peixe pode ser utilizado, preferivelmente uma variedade de peixe de água fria tal como a carpa, o bacalhau, o lúcio ou o atum. 0 pH dessa gelatina (medido em uma solução de 10%) varia preferivelmente de 4 a 6.

A gelatina dos peixes de água fria forma uma solução em água a 10°C e desse modo qualquer gelatina de peixes de água fria é considerada como tendo um valor de Bloom igual a 0. Para a presente invenção, a gelatina de peixes de água fria de peso molecular elevado é preferivelmente utilizada, mais preferivelmente incluindo um peso molecular de pelo menos aproximadamente 95-100 kDa. Isto é equivalente a uma gelatina animal de peso molecular de 250- 300 de valor de Bloom. A gelatina de peixe de água fria é submetida ao processo de gelificação termoreversível a temperaturas muito mais baixas do que a gelatina animal em conseqüência de seus níveis mais baixos de prolina e hidroxiprolina. Para 1.000 resíduos de aminoácido, a gelatina de peixe de água fria tem grupos de prolina de 100-130 e de hidroxiprolina de 50-75 em comparação com prolina de 135-145 e hidroxiprolina de 90-100 nas gelatinas animais (Haug IJ, Draget Kl, Smidsrod O. (2004). Food Hydrocolloids.18:203 - 213).

Um exemplo não limitador de um produtor de tal gelatina é a Norland Products (Cranbury, NJ).

Em uma realização preferida da invenção, a gelatina é purificada para a remoção de sais. Isto pode ser realizado de acordo com as técnicas previamente descritas. Uma das técnicas envolve a formação de uma solução de 20% em peso/volume de gelatina em água e seu aquecimento até 60° C sob agitação. A mistura é então deixada em repouso durante toda a noite. O gel obtido é dializado contra mudanças repetidas da água deionizada para eliminar sais, agitado e aquecido a 50° C para desagregar a rede física. A solução final é filtrada e congelada a vácuo. (Crescenzi V, Francescangeli A, Taglienti A. (2002). Biomacromolecules. 3:1384-1391). Alternativamente, a gelatina pode ser dessalinizada por uma coluna de exclusão de tamanho.

De acordo com algumas realizações da presente invenção, é utilizada uma gelatina recombinante. As gelatinas recombinantes são produzidas comercialmente atualmente pela

FibroGen (San Francisco, CA). O método atualmente preferido é a utilização de um sistema de levedura recombinante (Pichia Pastoris) para expressar fragmentos especificados do Tipo I, colágeno de seqüência 1 alfa humano.

Em uma realização opcional, mas preferida da presente invenção, as gelatinas recombinantes são moléculas completamente sintéticas, não contendo nenhum componente contaminando de quaisquer humanos ou animais. P "sintético" deve ser compreendido que a gelatina é preferivelmente produzida de acordo com um método selecionado da síntese química, síntese de proteína livre de célula, cultura de tecido de célula, qualquer tipo de cultura bacteriana, de inseto ou de levedura, ou de planta. A utilização de gelatinas sintéticas elimina muitas das variáveis e dos inconvenientes associados com materiais derivados de tecido, inclusive provocando respostas imunes não desejadas. Por exemplo, as gelatinas de peixe demonstram elevada capacidade de provocar alergia, e as gelatinas animais demonstram baixa- média capacidade de provocar alergia, ao passo que as gelatinas recombinantes podem ter capacidade zero de provocar alergia. Em estudos de segurança com humanos, nenhum evento adverso relacionado à gelatina recombinante foi encontrado.

Os métodos de criação de gelatinas recombinantes e os benefícios de sua utilização estão integralmente descritos nas Patentes US 6.413.742 e 6.992.172, que são aqui incorporadas a título de referência e tal como aqui apresentado integralmente.

As gelatinas recombinantes podem ser produzidas para serem altamente purificadas (99%). A produção de gelatina recombinante permite a produção opcional de gelatinas com pelo menos uma característica definida e predeterminada, incluindo, mas sem ficar a eles limitada, pesos moleculares definidos, pi (ponto isoelétrico) , reproducibilidade lote a lote garantida e a capacidade de adaptar a molécula para corresponder a uma aplicação específica.

Um exemplo de adaptação de uma molécula para corresponder a uma aplicação específica foi descrito previamente, em que uma gelatina foi criada para ser altamente hidrofílica (Werten MWT, et al. (2001) . Protein. 14(6) :447-454) . Opcionalmente e preferivelmente, uma gelatina de acordo com a presente invenção compreende uma gelatina que tem pelo menos uma característica ajustada, adaptada ou predeterminada.

Os exemplos não limitadores de outros tipos de características que podem opcionalmente ser adaptados de acordo com a presente invenção incluem a sujeição ou a não sujeição a um processo de gelificação termoreversível. As gelatinas recombinantes podem ser criadas para serem submetidas a um processo de gelificação termoreversível ou para não serem submetidas a um processo de gelificação termoreversível. Uma gelatina que tem uma ou mais características benéficas da gelatina animal natural, mas não é submetida ao processo de gelificação termoreversível, tem diversas utilidades ao permitir a reticulação da gelatina por outros meios a temperaturas nas quais normalmente seria submetetida ao processo de gelificação termoreversível. Tal gelatina também é incluída em algumas realizações da presente invenção.

A gelatina animal (de bovinos, suínos, e assim por diante), a gelatina de peixe de água morna e a gelatina recombinante (do tipo gelificante) podem ser submetidas ao processo de gelificação termoreversível entre aproximadamente 3 5-40 graus, particularmente a pesos moleculares elevados e/ou em concentrações elevadas (> 20%) e/ou com modificação(ões) e/ou um ou mais materiais adicionais (ver descrição abaixo). À temperatura ambiente, elas estão na forma de gel e não podem se misturar facilmente com a mTG. Várias modificações de uma composição de acordo com algumas realizações da presente invenção são descritas abaixo para manter as soluções de gelatina na forma líquida à temperatura ambiente.

A gelatina de peixe de água fria e a gelatina recombinante (tipo não gelificante) não formam géis termoreversíveis à temperatura ambiente, mesmo sem modificação adicional e/ou a presença de um ou mais materiais adicionais. Elas têm pontos de transição muito abaixo da

temperatura ambiente. À temperatura ambiente, elas permanecem em solução e podem reagir com a mTG sem modificação adicional. De acordo com as realizações preferidas da presente invenção no que diz respeito à gelatina recombinante, um sistema de cultura in vitro apropriado é utilizado para produzir a gelatina recombinante. Além da utilização de sistemas de levedura metilotróficos recombinantes para a produção de gelatina recombinante, outros organismos foram utilizados.

A recombinante, as proteínas do tipo gelatina, foram expressas em Escherichia Coli, embora os níveis de expressão geralmente obtidos com a E. coli sejam um tanto baixos e a purificação da proteína produzida intracelularmente possa ser difícil. 0 bacilo brevis foi utilizado para a expressão das proteínas do tipo gelatina, sendo que trechos de seqüência foram selecionados dos genes de colágeno natural e polimerizados para formar a gelatina semissintética (Werten MWT, et al. Secreted production of a custom-designed, highly hydrophilic gelatin in Pichia pastoris. Protein Engineering, Vol. 14, No. 6.447-454, Jun 2001).

Esforços adicionais bem sucedidos na produção da gelatina recombinante incluíram a produção de gelatina recombinante utilizando células de mamíferos e de insetos. 0 colágeno e a gelatina também foram expressos em plantas de fumo transgênicas, e camundongos transgênicos. Um sistema de bicho-da-seda transgênico foi utilizado para produzir uma proteína de fusão que contém uma seqüência colagenosa. Esses sistemas carecem de atividade endógena de propil hidroxilase suficiente para produzir o colágeno completamente hidroxilado, o que pode ser superado pela super-expressão de propil hidroxilase (Olsen D, et al. Recombinant collagen and gelatin for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 2003 Nov 28;55 (12) :1547-67) . Sistemas baseados em planta também podem opcionalmente ser utilizados; por exemplo, uma colaboração entre a Iowa State University e a Fibrogen está desenvolvendo a expressão de gelatina no milho transgênico.

A gelatina empregada no curativo hemostático pode ser uma gelatina complexa ou qualquer gelatina, ou um derivado ou um metabólito da mesma, ou uma gelatina produzida de acordo com um único processo ou uma pluralidade de processos. Por exemplo, a gelatina pode opcionalmente compreender o tipo A de gelatina ou o tipo B da gelatina, ou uma combinação dos mesmos.

A transglutaminase pode compreender opcionalmente qualquer planta, animal ou transglutaminase derivada microbiana, preferivelmente outro que não o Fator XIII derivado do sangue. Preferivelmente, é utilizada a transglutaminase microbiana derivada de Streptoverticillium mobaraensis.

A transglutaminase pode, opcionalmente, estar em uma composição que compreende pelo menos outra substância, tal como um estabilizante ou uma carga, por exemplo. Os exemplos não limitadores de tais materiais incluem a maltodextrina, a proteína da espuma do leite hidrolisada ou qualquer outra substância de proteína, cloreto do sódio, óleo de cártamo, fosfato trissódico, caseinato de sódio ou lactose, ou uma combinação dos mesmos.

Embora o pH ideal para a atividade de transglutaminase crua seja 6,0, ela também funciona com atividade elevada na faixa de pH 5,0 a pH 8,0. Portanto, uma composição de acordo com a presente invenção para hemostasias tem pref erivelmente um valor de pH em uma faixa de aproximadamente 5 a aproximadamente 8.

A transglutaminase apresenta um coeficiente de temperatura negativo. Na faixa de temperatura da atividade de transglutaminase, ela leva um tempo mais curto para reagir em temperaturas mais elevadas e uma quantidade de tempo muito maior para começar a funcionar em temperaturas mais baixas. A tabela a seguir mostra tempos de reação diferentes em diferentes temperaturas ao comparar o mesmo grau de reação que a reação a 50° C, pH 6,0, que ocorre em dez minutos:

Tabela 1 - temperatura de reação da transglutaminase

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Os exemplos não limitadores de produtos de transglutaminase disponíveis comercialmente incluem aqueles produzidos por Ajinomoto Co. (Kawasaki, Japão). Um exemplo preferido de tal produto dessa empresa é a Activa TG-TI (Europa: Activa WM) - Ingredientes: mTG e maltodextrina; atividade: 81 - 13 5 U/g de Activa. Outros exemplos não limitadores de produtos apropriados dessa empresa incluem Activa TG-FP (Ingredientes: proteína da espuma do leite hidrolisada, mTG; atividade: 34-65 U/g de Activa TG-FP) ; Activa TG-GS (Ingredientes: cloreto do sódio, gelatina, fosfato trisódico, maltodextrina, mTG e óleo de cártamo (auxiliar de processamento); atividade: 47-82 U/g de Activa TG-GS); Activa TG-RM (Europa: Activa EB) - ingredientes: caseinato de sódio, maltodextrina e mTG; atividade: 34-65 U/g de Activa; Activa PM (ingredientes: mTG, lactose e maltodextrina; atividade: 78 - 126 U/g de Activa). Outros exemplos não limitadores de produtos de transglutaminase comercialmente disponíveis incluem aqueles produzidos por Yiming Biological Products Co. (Jiangsu, China). Um exemplo preferido de tal produto dessa empresa é a TG-B (ingredientes: 1% de MTG, 99% de co-proteína; atividade: 80 - 130 U/g de TG-B) . Outros exemplos não limitadores de produtos apropriados dessa empresa incluem TG-A (ingredientes: 0,5% de mTG, 99,5% de co-proteína; atividade: 40 - 65 U/g de TG-A). Para ambos os exemplos, os produtos de transglutaminase preferidos são aqueles com atividade específica mais elevada e co-ingredientes mais simples, uma vez que se acredita que eles (sem desejar estar limitado a uma única hipótese) tenham a melhor reatividade na aplicação e um potencial mais baixo para efeitos colaterais indesej ados.

Em uma outra realização, a transglutaminase pode ser opcionalmente extraída de uma cepa de Streptoverticillium baldaccii ou Streptomyces hygroscopicus para produzir as variantes de enzima que demonstraram funcionar da maneira ideal a temperaturas mais baixas (aproximadamente 37°C e 37°C-45°C, respectivamente) (Negus SS. A Novel Microbial Transglutaminase Derived From Streptoverticillium Baldaccii. Tese de PhD. Griffith University, Queensland, Austrália, e Cui L et al. Purification and characterization of transglutaminase from a newly isolated Streptomyces hygroscopicus. 2007:105(2). p. 612-618.). Uma atividade específica mais elevada a temperaturas mais baixas é desejável para conseguir uma reticulação mais rápida e mais forte da gelatina sob condições ambientes.

De acordo com algumas realizações, a transglutaminase pode ser utilizada na forma de quaisquer das composições acima descritas, incluindo opcionalmente algumas das misturas disponíveis comercialmente que incluem a transglutaminase.

Em uma outra realização, quaisquer das misturas de transglutaminase acima podem opcionalmente ser purificadas por meio de filtração de gel, da cromatografia de troca de cátions, da filtração de fibras ocas ou da filtração de fluxo tangencial para remover as suas proteínas transportadoras e/ou carboidratos. Alguns desses métodos foram descritos previamente (Bertoni F, Barbani N, Giusti P, Ciardelli G. Transglutaminase reactivity with gelatine: perspective applications in tissue engineering Biotechnol Lett (2006) 28:697-702) (Broderick EP, et al. Enzymatic Stabilization os Gelatin-Based Scaffolds. J Biomed Mater Res 7213:37-42, 2005). O tamanho de poro do filtro utilizado para filtração é preferivelmente de aproximadamente 10 kDA.

De qualquer maneira, a atividade da transglutaminase é preferivelmente medida antes da utilização e/ou da fabricação de uma composição de acordo com a presente invenção com um ensaio de reatividade da transglutaminase.

Tal ensaio pode incluir opcionalmente, mas sem ficar a eles limitado, o Método de Hidroxamato, o Ensaio de Nessler, um Ensaio Colorimétrico ou qualquer outro ensaio de atividade de transglutaminase (vide, por exemplo, Folk JE, Cole PW.

Transglutaminase: mechanistic features of the active site as determined by kinetic and inhibitor studies. Biochim BiophysActa.1966; 122:244-64; ou o Ensaio de Nessler como descrito em: Bertoni F, Barbani N, Giusti P, Ciardelli G.

Transglutaminase reactivity with gelatine: perspective applications in tissue engineering Biotechnol Lett (2006) 28:697-702).

Em geral, a pureza e/ou qualidade da gelatina e/ou da transglutaminase para utilização na composição hemostática serão de uma pureza apropriada conhecida de um elemento versado na técnica correspondente para levar à eficácia e à estabilidade da proteína.

PROTEÍNAS PARA. SUBSTRATOS DE RETICULAÇÃO DIFERENTES DA GELATINA.

Conforme observado acima, a proteína de reticulação compreende preferivelmente a gelatina, mas também pode, adicional ou alternativamente, compreender um outro tipo de proteína. De acordo com algumas realizações da presente invenção, a proteína também é um substrato para a transglutaminase e preferivelmente apresenta seqüências de polímero e de polipeptídeo apropriadas específicas da transglutaminase. Essas proteínas podem incluir opcionalmente, mas sem ficar a elas limitadas, as seqüências de polímero sintetizado que têm independentemente as propriedades para formar um bioadesivo ou os polímeros que foram mais preferivelmente modificados com os substratos específicos da transglutaminase que melhoram a capacidade de o material ser reticulado pela transglutaminase. Os exemplos não limitadores de cada um desses tipos de materiais são descritos abaixo.

As seqüências de polímeros e de polipeptídeos sintetizados com uma transglutaminase alvo apropriada para reticulação foram desenvolvidas com pontos de transição preferivelmente de aproximadamente 20 a aproximadamente 40°C. As características físicas preferidas incluem, mas sem ficar a elas limitadas, a capacidade de ligar o tecido e a capacidade de formar fibras. Assim como as gelatinas do tipo gelificantes (descritas acima), esses polipeptídeos podem ser opcionalmente utilizados em composições que também apresentam uma ou mais substâncias que diminuam o seu ponto de transição.

Os exemplos não limitadores de tais peptídeos são descritos nas Patentes Norte-americanas números 5.428.014 e 5.939.385, ambas depositadas por ZymoGenetics Inc, ambas aqui incorporadas a título de referência tal como aqui apresentado integralmente. A Patente Norte-americana n°. 5.428.014 descreve polipeptídeos de transglutaminase reticuláveis, biocompatíveis, bioadesivos, sendo que é sabido que a transglutaminase catalisa uma reação de transferência de acila entre o grupo γ-carboxamida dos resíduos de glutaminil das proteínas ligadas e do grupo ε-amino de resíduos de Lys, tendo por resultado a formação de ligações do isopeptídeo de ε-(γ-glutamil)lisina.

Por exemplo, são descritos os polipeptídeos que têm 13 a 120 resíduos de aminoácido, compreendendo um segmento da fórmula S1-Y-S2, em que: S 1 é Thr-Ile-Gly-Glu-Gly-Gln; Y é um peptídeo espaçador de 1 a 7 aminoácidos ou não presentes; e S2 é Xaa-Lys-Xaa-Ala-Gly-Asp-Val. Opcionalmente, o peptídeo espaçador Y é Gln-His-His-Leu-Gly, Gln-His-His-Leu-Gly-Gly ou His-His-Leu-Gly-Gly. Além disso, opcionalmente, Xaa, o aminoácido 1, de S2 é Ala ou Ser. Opcionalmente, o peptídeo espaçador compreende His-His-Leu-Gly. Opcionalmente e preferivelmente, pelo menos um de Y e S2 é livre de resíduos de Gln. Opcionalmente, o resíduo de aminoácido de terminal carbóxi do polipeptídeo é Pro ou Gly. Os exemplos não limitadores específicos dos polipeptídeos incluem os seguintes: Thr-Ile-Gly-Glu-Gly-Gln-Gln-His-His-Leu-Gly-Gly- Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Vai, Thr-Ile-Gly-Glu-Gly-Gln-Gln-His- His-Leu-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val, Thr-Ile-Gly-Glu-Gly- Gln-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val, ou Leu- Ser-Gln-Ser-Lys-Val-Gly. A patente também descreve copolímeros e homopolímeros de transglutaminase reticuláveis, bioadesivos, biocompatíveis, de elevado peso molecular que envolvem esses peptídeos.

A Patente Norte-americana n° . 5.939.385 descreve polipeptídeos de transglutaminase reticuláveis, bioadesivos, biocompatíveis. Esses polipeptídeos têm preferivelmente aproximadamente 9 a 12 0 resíduos de aminoácidos que compreendem um segmento da fórmula S1-Y-S2, em que: Sl é selecionado do grupo que consiste em Ile-Gly-Glu-Gly-Gln, Gly-Glu-Gly-Gln, Glu-Gly-Gln e Gly-Gln; Y é His-His-Leu-Gly- Gly ou His-His-Leu-Gly; e S2 é selecionado do grupo que consiste em Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp, Ala-Lys-Gln-Ala-Gly, Ala-Lys-Gln-Ala, Ala-Lys-Gln, Ala-Lys-Ala-Gly-Asp-Val, Ala- Lys-Ala e Ala-Lys, em que o dito polipeptídeo tem um término amino e um término carbóxi e é reticulável por uma transglutaminase. Um polipeptídeo preferido é Gly-Gln-His- His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln. Também é preferido um polipeptídeo em que o polipeptídeo é flanqueado em um ou outro ou em ambos os término amino e término carbóxi por um polipeptídeo elastomérico. É apresentado ainda um polipeptídeo elastomérico em que o polipeptídeo elastomérico é um pentapeptídeo ou um tetrapeptídeo, particularmente um polipeptídeo flanqueado em que o polipeptídeo elastomérico de flanqueamento é Val-Pro-Gly-Val-Glyi Ala-Pro-Gly-Val-Gly, Gly-Val-Gly-Val-Pro, Val-Pro-Gly-Gly ou qualquer parte dos mesmos, preferivelmente de tal modo que o término amino do polipeptídeo flanqueado é Val e o término carbóxi do polipeptídeo flanqueado é Gly. A patente também descreve copolímeros e homopolímeros de transglutaminase reticuláveis, bioadesivos, biocompatíveis, de elevado peso molecular que envolve esses peptídeos.

Essas patentes reconhecem a utilidade dos peptídeos e polímeros descritos para utilização como adesivos de tecido, no fechamento de ferida e em várias outras aplicações médicas. No entanto, ambas as patentes mencionam que os pontos de transição desejados desses peptídeos e do polímero são de 20-40°C e reconhecem a necessidade de baixar o ponto de transição de modo que o peptídeo/polímero possa reagir com a transglutaminase em um sítio de ferida. Ambas as patentes declaram: "A temperatura de transição do polímero pode ser ajustada pelo número de monômeros de polipeptídeo dos polipeptídeos que podem ser reticulados por uma transglutaminase. Conforme será apreciado pelo elemento versado na técnica, para aplicações clínicas, a redução da temperatura de transição na hora da aplicação irá facilitar a rápida solidificação da matriz no sítio de ferida".

Naturalmente, a fim de assegurar a intensidade adesiva e coesiva máxima de um polímero reticulado planejado para utilização como bioadesivo, normalmente não é possível remover os monômeros reticuláveis. De fato, para maximizar as intensidades adesiva e coesiva de tais adesivos, geralmente é preferível adicionar mais substratos de monômero reticulável. Desse modo, o potencial bioadesivo dos polímeros descritos nessas patentes é significativamente limitado pela temperatura de transição da solução de polímero.

As realizações preferidas da presente invenção melhoram significativamente a utilidade desses polipeptídeos ou polímeros para utilização nas aplicações de vedante de tecido, de adesivo de tecido hemostáticas. Por exemplo, as realizações opcionais são descritas abaixo para diminuição do ponto de transição dos polímeros que formam gel à temperatura ambiente. Essas estratégias podem ser utilizadas na diminuição do ponto de transição das seqüências de peptídeos e dos polímeros descritos nessas patentes.

Além disso, tal como descrito com mais detalhes abaixo, preferivelmente a quantidade desses polímeros difere para as realizações da presente invenção, ao contrário dos usos originais descritos nas patentes acima (as quais não apresentam nem sugerem nenhum dos usos aqui descritos para a presente invenção). Por exemplo, as faixas de concentração de polímero apresentadas nessas patentes para utilização em um kit de adesivo de tecido variam de 5 a 100 mg/ml, e preferivelmente de 35 a 50 mg/ml. Algumas realizações da presente invenção compreendem concentrações de polímero mais elevadas, por exemplo, na faixa de 150-250 mg/ml. Concentrações de transglutaminase mais elevadas também são preferidas para algumas realizações da presente invenção.

Outros substratos sintéticos também podem opcionalmente ser providos de acordo com algumas realizações da presente invenção. Preferivelmente, os substratos de transglutaminase curtos são sintetizados e então conectados e/ou ligados às moléculas de polímero grandes. Os substratos de transglutaminase são geralmente muito curtos (< 2 0 resíduos de aminoácido). 0 ponto de solubilidade e de transição de tais substratos é dependente do polímero ao qual o substrato é fixado. Por exemplo, se o substrato for fixado à gelatina gelificante, então uma solução desta molécula recentemente sintetizada deve requerer a adição de uma outra substância para permanecer na forma líquida à temperatura ambiente.

Um exemplo não limitador desse tipo de material é descrito na Patente Norte-americana 7.208.171, que é aqui incorporada a título de referência tal como aqui apresentado integralmente, a qual descreve o desenho racional de peptídeos de substrato de transglutaminase. A estratégia do desenho foi baseada na maximização do número de substratos de lisina-peptídeo aceptores de acila disponíveis e de substratos de glutaminil-peptídeo doadores de acila disponíveis para a reticulação da transglutaminase. Além disso, os peptídeos de substrato Lys e Glu foram projetados para possuir características básicas de substratos de peptídeo sintéticos e biomacromoleculares conhecidos de transglutaminase. Por exemplo, os peptídeos do substrato Glu continham dois a cinco resíduos de Glu contíguos, com base na evidência de que os peptídeos se transformam em substratos de transglutaminase melhores com comprimento crescente de repetições de Glu (Gorman, J. J.; Folk, J. E. J. Biol. Chem. 1980, 255, 419-427. & Kahlem, P.; Terre, C.; Green, H.; Djian, P. Proc. Natl. Acad. Sei. EUA. 1996, 93, 14580-14585) e que as proteínas que contêm dois ou mais resíduos de Glu adjacentes são conhecidas por serem bons substratos. (Etoh, Y.; Simon, M.; Green, H. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1986, 136, 51-56. Sc Hohenadl, C.; Mann, K.; Mayer, U.; Timpl, R.; Paulsson, R.; Aeschlimann, D. J. Biol. Chem. 1995, 270, 23415-23420.) Um resíduo Leu foi colocado adjacente a Glu perto de término-C em diversos peptídeos, porque foi demonstrado que isso resulta em um aumento significativo na especificidade de Glu. (Gross, M.; Whetzel, N. K.; J. E. J. Biol. Chem. 1975, 250, 4648-4655.) No que se refere aos peptídeos do substrato Lys, foi demonstrado que a composição e a seqüência dos aminoácidos adjacentes aos resíduos de lisina em substratos de peptídeo e de proteína podem ter um efeito na especificidade do amino. (Groenen, P.; Smulders, R.; Peters, R. F. R.; Grootj ans, J. J.; Vandeni j ssel, P.; Bloemendal, H.; Dejong, W. W. Eur. J. Biochem. 1994, 220.795- 7 99. & Grootjans, J. J.; Groenen, P.; Dejong, W. W. J. Biol. Chem. 1995, 270, 22855-22858.). Finalmente, em todos os peptídeos um resíduo Gly foi adicionado no lado de término-C para agir como espaçador entre o peptídeo e o polímero no conjugado de peptídeo-polímero, de modo que o peptídeo no conjugado possa ser mais acessível à enzima.

Os ensaios de especificidade da transglutaminase dos peptídeos descritos nesta patente demonstraram que foram criados com sucesso substratos aceptores de acila e doadores de acila com elevada especificidade de ligação de transglutaminase. É sugerido na patente que esses substratos sejam conjugados de modo covalente a PEG, dendrímeros, quitosana, gelatina, colágenos solúveis, ácido hialurônico, alginatos e albuminas. A patente continua a sugerir que tais conjugados de peptídeo-polímero na forma de solução ou de líquido poderiam ser utilizados como vedantes cirúrgicos e/ou adesivos médicos.

Embora essa patente descreva substratos de peptídeo de transglutaminase reticulável altamente específicos, ela não apresenta nem sugere os métodos de aplicação avançados ou as modificações materiais descritos como parte da presente invenção, nem apresenta ou sugere as composições da presente invenção. Os substratos apresentados na patente, no entanto, podem opcionalmente ser úteis na intensificação de um bioadesivo criado através de reticulação de transglutaminase ou na criação de tal bioadesivo a partir de um polímero que não seja específico da transglutaminase. Esses substratos teriam que ser combinados com uma ou mais dentre outras proteínas ou sustentações tal como aqui descrito para serem úteis para a presente invenção.

MATERIAIS DE RETICULAÇÃO DIFERENTES DA TRANSGLUTAMINASE

Tal como observado acima, o material de reticulação compreende preferivelmente a transglutaminase, mas também pode, adicional ou alternativamente, compreender um outro tipo de material de reticulação.

Os exemplos não limitadores de tais agentes de reticulação incluem carbodiimidas tais como N,N-(3- (dimetilamino)propil)-N-etil carbodiimida (EDC), N- hidroxisuccinimida (NHS) com EDC, ou as carbodiimidas utilizadas em conjunto com o poli(ácido L-glutâmico) (PLGA) e o ácido poliacrílico. Em uma outra realização, tais agentes de reticulação podem incluir a tirosinase ou a tirosinase com quitosana. Em uma outra realização, a reticulação (polimerização) é foto-iniciada com luz ultravioleta ou raios γ. Em uma outra realização, os agentes de reticulação podem incluir o alquileno, o ácido cítrico (ácido carbônico) ou a nano-hidroxiapatita (n-HA) + o álcool poli(vinílico) (PVA).

Em uma outra realização, um agente de reticulação é um polifenol derivado de planta tal como (isto é, ácidos cinâmicos hidroxilados, tais como o ácido caféico (ácido 3,4- di-hidroxicinâmico), ácido clorogênico (seu éster ácido quínico), ácido caftárico (seu éster do ácido tartárico) e flavonóides (isto é, como a quercetina e a rutina) . Em uma outra realização, o agente de reticulação adicional é um mono ou dissacarídeo oxidado, oxo-lactose ou um dialdeído baseado em uma porção de açúcar (galacto-hexodialdose) (GALA) . Em uma outra realização, a genipina ou outro derivado do glicosídeo iridóide, ou secoiridóides, oleuropeina preferível, compreendem o agente de reticulação. Em uma outra realização, o agente de reticulação é um poli(etileno glicol) tiol- reativo. Em uma outra realização, o agente de reticulação é a dextrana, dextrana oxidada, dialdeído de dextran. Em uma outra realização, o agente de reticulação é uma oxidase multicúprica tal como a lacase ou oxidase de bilirrubina.

COMPOSIÇÕES ILUSTRATIVAS

Os substratos de reticulação e os materiais de reticulação descritos acima podem, opcionalmente, ser combinados com um ou mais materiais adicionais para formar as várias composições de acordo com a presente invenção. De acordo com algumas realizações, o material adesivo compreende, opcional e preferivelmente: (i) gelatina; (ii) uma transglutaminase; sendo que a gelatina e a transglutaminase são formadas em partículas separadas ou juntas. Mais preferivelmente, a gelatina e a transglutaminase são providas em quantidades suficientes para serem úteis como um agente de vedação, hemostático.

As várias quantidades de cada uma e as suas relações foram descritas previamente. 0 teor de transglutaminase pode ser opcionalmente aumentado para aumentar a taxa de reação ou ser diminuído para melhorar a segurança. De acordo com algumas realizações da presente invenção, uma solução de gelatina de 15-30% é preferivelmente aplicada, seguida por uma solução de 15-30% de transglutaminase.

Além disso, um ou mais suplementos também podem ser incluídos no produto hemostático, por exemplo, drogas tais como fatores de crescimento, anticorpos monoclonais e policlonais, è outros compostos. Os exemplos ilustrativos de tais suplementos incluem, mas sem ficar a eles limitados: antibióticos, tais como a tetraciclina e a ciprofloxacina, a amoxicilina e o metronidazol; anticoagulantes, tais como proteína C ativada, heparina, prostraciclina (PGI2) , prostaglandinas, leucotrienos, antitransglutaminase III, ADPase e ativador plasminogênico; esteróides, tal como a dexametasona, inibidores de prostaciclina, prostaglandinas, leucotrienos e/ou quininas para inibir a inflamação; drogas cardiovasculares, tais como bloqueadores dos canais de cálcio, vasodilatores e vasoconstritores; quimioatractantes; anestésicos locais tais como a bupivacaína; e drogas antiproliferativas/antitumor tais como 5-fluorouracil (5-FU), taxol e/ou taxotere; antivirais, tais como ganciclovir, zidovudina, amantidina, vidarabina, ribaravina, trifluridina, aciclovir, dideoxiuridina e os anticorpos para componentes virais ou produtos de gene; citoquinas, tais como alfa- ou beta- ou gama-Interferon, fator de necrose do tumor alfa- ou beta-, e interleuquinas; fatores para estimulação de colônia; eritropoietina; antifúngicos, tais como diflucan, cetaconazol e nistatina; agentes antiparasíticos, tais como pentamidina; agentes anti-inflamatórios, tais como alfa-l-anti-tripsina e alpha-l-antiquimotripsina; anestésicos, tais como

bupivacaína;analgésicos;antissépticos; e hormônios. Outros suplementos ilustrativos incluem, mas sem ficar a eles limitados: vitaminas e outros suplementos nutricionais ; glicoproteínas; fibronectinas; peptídeos e proteínas; carboidratos (simples e/ou complexo); proteoglicanos ; antiogiogênicos; antígenos; lipídeos ou lipossomos; e oligonucleotídeos (DNA e/ou RNA de sentido ou antisentido) .

De acordo com algumas realizações preferidas da presente invenção, é apresentada uma composição que apresenta a gelatina que é submetida à reticulação termoreversível (tal como descrito acima, alguns, mas nem todos os tipos de gelatina são submetidos à reticulação termoreversível sem modificação e/ou utilização de um ou mais materiais adicionais). 0 processo de gelificação termoreversível de gelatina animal ocorre quando uma solução de gelatina é resfriada até aproximadamente a temperatura do corpo (37°C). Em misturas de gelatina-mTG â temperatura ambiente, esse processo de gelificação prende a mTG em um gel termoreversível e impede que ela reaja com a gelatina para formar um gel de vedação irreversível. Uma vez que a temperatura da sala de operação é mantida geralmente a 22° C, o processo de gelificação termoreversível de uma solução de gelatina irá ocorrer um tanto rapidamente em um ambiente clínico se este não for aquecido continuamente. Isto apresenta um problema na aplicação de uma mistura de gelatina-mTG para a hemostasia, uma vez que a solução de gelatina tem que ser aquecida antes de ser misturada com a mTG. O fato de ter que aquecer a gelatina imediatamente antes da aplicação é indesejável tanto do ponto de vista logístico quanto de segurança, uma vez que um elemento de aquecimento precisaria ser adicionado ao ambiente da sala de operações sensível; por exemplo, em situações de emergência e/ou em situações de cuidado médico urgente fora da sala de operações, tal requisito para aquecimento é ainda mais problemático.

Além de seu impedimento à aderência de tecido e hemostasia, a incapacidade da gelatina de formar uma solução à temperatura ambiente e de se misturar com a transglutaminase microbiana também apresenta dificuldades para outras aplicações potenciais da mistura de gelatina-mTG. Por exemplo, quando os géis de gelatina-mTG foram utilizados como sustentação para o encapsulamento de célula na engenharia de tecido, um cuidado extremo teve que ser tomado para garantir que a solução de gelatina esfriasse suficientemente antes do encapsulamento das células. Além disso, o implante das células encapsuladas é muito complicada quando o processo de gelificação termoreversível da gelatina ocorre antes que a mistura de gelatina-mTG possa ser implantada com segurança no corpo. Ocorre um problema similar no que se refere ao local da aplicação da droga, uma vez que a eficácia de determinadas drogas poderia ser prejudicada ao entrar em contato com a gelatina aquecida, e o implante de um gel de gelatina-mTG que incorpora uma determinada droga poderia ser prejudicado pelo processo de gelificação termoreversível da gelatina.

Felizmente, a reticulação da gelatina pela mTG ocorre ao ligar os aminogrupos Lys e Gln (Chen et al. Biomacromolecules, Vol. 4, n° 6, 2003), ao passo que os grupos de aminoácido na gelatina que são responsáveis por seu processo de gelificação termoreversível são Pro e Hyp (Haug et al. Food Hydrocolloids 18(2004) 203-213). Desse modo, existe o potencial para redução da propensão da gelatina para o processo de gelificação termoreversível sem prejudicar sua capacidade de formar géis reticulados através de reticulação da mTG. Em outras palavras, a solubilidade da gelatina utilizada em uma mistura de gelatina-mTG pode ser ampliada e o seu ponto de fusão ser diminuído para permitir que ela forme uma solução à temperatura ambiente com mTG sem afetar negativamente o gel de gelatina-mTG reticulado que é formado.

De acordo com algumas realizações da presente invenção, são apresentadas composições de matéria de uma mistura de gelatina-mTG em que a mistura é modificada por um dos vários métodos para aumentar a solubilidade da gelatina e para permitir que a gelatina forme uma solução com a mTG a temperaturas mais baixas do que o ponto de fusão natural da gelatina animal padrão. Essas composições incluem (i) as misturas de gelatina-mTG obtidas utilizando a gelatina padrão que foi modificada para reduzir o seu ponto de fusão; (ii) as misturas de gelatina-mTG que incluem aditivos que aumentam a solubilidade da gelatina na própria solução gelatina-mTG; (iii) as misturas de gelatina-mTG que foram feitas utilizando os produtos de gelatina comercialmente disponíveis tratados para ter temperaturas de transição mais baixas; e (iv) as misturas de gelatina-mTG que formam uma solução sob condições ambientais específicas, cuidadosamente controladas

(temperatura, pH, concentração iônica, etc.) que diminuem o ponto de fusão da gelatina.

Essas novas composições aumentam muito a utilidade dos géis de gelatina-mTG e permitem uma ampla variedade de aplicações, particularmente no campo médico, que pode utilizar os géis de gelatina-mTG que podem ser formados ao misturar gelatina e mTG à temperatura ambiente. Além disso, em muitos casos, a gelatina e as soluções de gelatina-mTG formadas utilizando soluções de gelatina que contêm uma gelatina com um ponto de fusão mais baixo terão o benefício adicional de diminuir a viscosidade inicial da solução, permitindo à mTG mais liberdade de movimento e aumentando a velocidade em que a reação de gelatina-mTG ocorre.

De acordo com algumas realizações da presente 25 invenção também são providas outras intensificações à mistura de gelatina-mTG que têm o potencial de melhorar as propriedades de um produto com base em gelatina-mTG. Por exemplo, a presente invenção também apresenta métodos para estabilizar ainda mais a mTG na mistura de gelatina-mTG para aumentar a sua vida útil.

Em uma outra realização da invenção, um plastif icante é incorporado à solução de gelatina-mTG. Foi demonstrado que os plastificantes diminuem o ponto de fusão da gelatina, permitindo que ela forme uma solução a temperaturas mais baixas sem ser submetida ao processo de gelificação termoreversível. Um ou mais plastificantes são adicionados preferencialmente aos grânulos de gelatina ou a uma solução de gelatina para diminuir o seu ponto de fusão antes da mistura da solução de gelatina com a mTG ou a solução de mTG. Em uma situação onde as soluções de gelatina e de mTG são liof ilizadas, um ou mais plastif icantes são adicionados à solução de gelatina antes de sua Iiofilização.

Em uma realização alternativa, tal como descrito acima, um ou mais plastificantes são adicionados à solução de gelatina, permitindo a adição de mTG a uma temperatura mais baixa, em que a mTG não é altamente reativa. A solução de gelatina-mTG- plastificante pode então ser liofilizada ou então secada em uma forma já misturada.

Em uma realização preferida, um álcool poliídrico, ou poliol, é utilizado como plastificante. Tais polióis incluem a glicerina, o glicerol, o xilitol, a sacarose e o sorbitol. O sorbitol torna os géis de gelatina-mTG mais elásticos e viscosos. 0 glicerol torna os géis de gelatina- mTG mais duros e acelera a reticulação de mTG da gelatina. Uma faixa de relação de concentração preferida para o glicerol varia preferivelmente de aproximadamente 0,5:1 a aproximadamente 5:1 de Glicerol: Gelatina, e mais preferivelmente de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 2:1 de GlicerolrGelatina, peso por peso. Uma faixa de relação de concentração preferida para o sorbitol é pref erivelmente de aproximadamente 0,5:1 a aproximadamente 5:1 de Sorbitol: Gelatina, e mais pref erivelmente de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 3:1 de Sorbitol: Gelatina, peso por peso.

Os álcoois poliídricos têm pontos de ebulição mais elevados quando comparados aos álcoois monohxdricos de tamanho similar. As solubilidades em água dos álcoois poliidricos são mais elevadas quando comparadas aos álcoois monohídricos de tamanho similar, uma vez que há mais grupos hidroxila para os quais as moléculas de água são atraídas. Na indústria alimentícia, os álcoois poliidricos tais como a glicerina são utilizados para aumentar a solubilidade da água da gelatina como descrito na Patente Norte-americana 2.558.065, aqui incorporada a título de referência tal como aqui apresentado integralmente, onde um álcool poliídrico tal como a glicerina é despejado sobre grânulos de gelatina, e na Patente Norte-americana 3.93 9.001, aqui incorporada a título de referência tal como aqui apresentado integralmente, onde é permitido que a gelatina absorva o álcool poliídrico por um período de tempo suficiente para que os grânulos de gelatina se tornem intumescidos, mas antes da dissolução. Essas técnicas e as variações dessas técnicas descritas nas patentes devem ser consideradas como realizações preferenciais da utilização do poliol tal como descrito como parte da presente invenção.

Os efeitos das diferentes concentrações dos plastificantes glicerol, xilitol, sorbitol, sacarose e trehalose na diminuição dos pontos de transição da gelatina são bem documentados (D1Cruz NM, Bell, LN. Thermal Unfolding of Gelatin in Solids as Affected by the Glass Transition. J Food Science 2005:70(2), Kozlov PV, Burdygina GI. The structure and properties of solid gelatin and the principies of their modification Polymer, 1983 (24): p.651-666).

Embora o efeito dos álcoois poliidricos no ponto de fusão da gelatina tenha sido bem documentado, eles nunca foram utilizados antes da presente invenção, com gelatina ou solução de gelatina antes de sua mistura com mTG ou com uma solução de gelatina-mTG.

Em uma realização da adição de plastificantes de poliol, uma faixa preferida da relação de peso de plastificante para a gelatina é preferivelmente de aproximadamente 0,5:1 a aproximadamente 1:1 de plastificante:gelatina.

Em uma outra realização da utilização de plastificantes na gelatina para diminuir o ponto de fusão de gelatina em solução, o tipo de plastificante utilizado pode incluir a trietanolamina, o resorcinol, o tiodiglicol, o sal de sódio de toluenosulfoácido, o glicol butileno, o nitrato de uréia, a tiouréia, a uréia, o ácido glutâmico, o ácido aspárgico, a valina, a glicina, KSCN, KI e LiBr.

A adição de uréia à solução de gelatina foi previamente explorada e demonstrou a sua capacidade de impedir que a gelatina de peso molecular elevado (99 kDa) forme um gel termoreversível a 25° C. (Otani Y, Tabata Y, Ikada Y. Effect of additives on gelation and tissue adhesion of gelatin-poly(L-glutamic acid) mixture. Biomaterials 19 (1998) 2167-2173) .

Em uma realização preferida da utilização da uréia para impedir a gelificação termoreversível na solução de gelatina ou de gelatina-mTG a temperaturas abaixo de seus pontos de fusão naturais, a uréia é adicionada às soluções a uma relação de uréia: gelatina entre 0,25 - 2,0, peso por peso. Ainda mais preferivelmente, a uréia é adicionada às soluções a uma relação de uréia: gelatina de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:2, peso por peso.

Em uma outra realização da presente invenção, o nível de pH e a concentração de íon de um solvente aquoso são modificados para aumentar a solubilidade da gelatina dissolvida em solvente. Quanto mais distante o pH do produto do pH isoiônico, melhor será a solubilidade da gelatina. Um solvente aquoso preferido utilizado nesta técnica é a solução salina tamponada com fosfato (PBS). Outros tamponadores apropriados incluem o borato, o fosfato, HEPES (ácido N-[2- Hidroxietil]piperazina-N'- [2-etano sulfônico]) e similares.

Geralmente, nas composições que serão utilizadas dentro de organismos vivos, é preferível dissolver a gelatina em um solvente aquoso tamponado a um pH 5,5-9,0 e de resistência iônica baixa a moderada (equivalente a aproximadamente 1 a 1.000 mM de NaCl, preferivelmente de 100 a 150 mM de NaCl). Mais preferivelmente, o pH da solução é de aproximadamente 6,0-8,0, e mais preferencialmente aproximadamente 7,4. Embora a gelatina seja solúvel nesse pH e concentrações de íon, a sua solubilidade pode ser aumentada ao ampliar a disparidade entre o pH da solução e o pH isoiônico da gelatina.

Um ou mais sais também podem ser opcionalmente adicionados para diminuir a temperatura de transição da gelatina. Preferivelmente, os sais são adicionados em uma faixa de concentração apropriada para a redução da temperatura de transição, e mais preferivelmente abaixo da temperatura ambiente. Por exemplo, foram descobertos os seguintes sais nas faixas de concentração indicadas para reduzir o ponto de transição da gelatina abaixo da temperatura ambiente: Brometo do sódio (1-2 Μ), Nitrato de sódio (1-2 Μ), Tiocianato de sódio (0,5-1,5 Μ), lodeto de sódio (0,5-1,5 Μ), Benzenossulfonato de sódio (0,5-1,5 Μ), Salicilato de sódio (0,25-1 Μ), Dicloroacetato de sódio (1-2 Μ), Tricloroacetato de sódio (0,5-1,5 Μ), Dibromoacetato de sódio (0,5-1,5 Μ), Tribromoacetato de sódio (0,25-1 Μ), Diiodoacetato de Sódio (0,5-1,5 Μ), Acetiltriptofano de sódio (0,5-1,5 Μ), Acetilenodicarboxilato de sódio (1-2 Μ), 30 Salicilato de lítio (1-2 Μ), Diidodosalicilato de litio (0,2- 1M) (vide, por exemplo, Bello J, Riese HCA, Vinograd JR. Mechanism of Gelation of Gelatin. Influence of Certain Electrolytes on the Melting Points of Gels of Gelatin and Chemically Modified Gelatins. Am Chem Soc. Sept 1956 (60). Ρ.1299-1306) .

Opcional e preferivelmente, uma ou mais substâncias ácidas são adicionadas à composição para diminuir o pH. A diminuição do pH da solução de gelatina reduz o seu ponto de transição. Em geral, a redução do ponto de transição da gelatina é útil para reconstituir a gelatina em um corpo a 37 graus. Para alguns tipos preferidos de gelatina aqui utilizados, tal como, por exemplo, de fontes de mamíferos, a diminuição do pH fornece resultados melhores para o ponto de transição da gelatina. No entanto, para alguns tipos de gelatina, o aumento do pH pode opcionalmente fornecer resultados melhores.

Em uma outra realização de aumento da disparidade do pH entre a solução de gelatina e o ponto isoiônico da gelatina, a própria gelatina é modificada. Isto pode ser realizado ao tratar a mesma antes que ela seja dissolvida em solução para criar uma gelatina carregada eletrostaticamente, tal como na Patente Norte-americana 6.863.783, aqui incorporada a título de referência tal como aqui apresentado integralmente, ou ao controlar o ponto isoelétrico da gelatina, tal como na Patente Norte-americana 2.398.004, aqui incorporada a título de referência tal como aqui apresentado integralmente.

Se o pH da solução de gelatina for aumentado, em vez de diminuído, então o pH da solução estará mais perto do ponto isoiônico da gelatina e o ponto de transição será aumentado. Esta modificação poderia, opcionalmente, ser utilizada para manter a gelatina não reticulada tal como um gel termoreversível após o implante no corpo.

Em uma outra realização da presente invenção, a gelatina, a mTG ou ambas as substâncias foram submetidas à secagem depois de serem misturadas com um carboidrato de trehalose ou outro carboidrato para estabilizar a proteína ou a enzima em sua forma ativa, permitindo que ela seja reconstituída com facilidade. Várias realizações da secagem são a Iiof ilização, a secagem por aspersão, a secagem em tambor rotativo, a secagem a ar, a secagem por aquecimento, a secagem a vácuo ou qualquer outro método para secar uma solução de gelatina-trehalose ou gelatina-mTG-trehalose.

A capacidade de estabilização superior da trehalose na secagem a ar e na secagem por congelamento foi bem documentada. Foi mostrado que os materiais secados passam por uma reconstituição mais rápida quando a secagem é feita depois que a trehalose foi adicionada a um material ou solução particular (Crowe LM, Reid DS, Crowe JH. Is Trehalose Special for Preserving Dry Biomaterials? Biophysical Journal 1996 (71) :2087-2093).

A secagem das soluções de proteína que incorporam a trehalose à temperatura ambiente e à pressão atmosférica foi descrita completamente na Patente Norte-americana 4.891.319. Nos exemplos aqui descritos, a função das proteínas secadas foi preservada.

No caso específico da gelatina, a incorporação da trehalose na solução de gelatina tem o benefício adicional de aumentar a resistência dos géis de gelatina. (Norie N, Kazuhiro M, Masami N, Yusuke O, Takashi O, Keiko N. Factors Affecting the Gelation of a Gelatin Solution in the Presence of Sugar. Journal of Home Economics of Japan. 55(2): p.159- 166 (2004))

Além disso, a reação de reticulação da gelatina-mTG tem muitas similaridades com a reação de reticulação dos fatores sangüíneos naturais. A secagem de trehalose para estabilizar fatores sangüíneos foi recentemente demonstrada (Patentes Norte-americanas 6.649.386 e 7.220.836) e está em processo de ser utilizada comercialmente para a preparação de produtos com proteínas do sangue que podem ser facilmente reconstituídas (ProFibrix™, Leiderdorp).

Em uma outra realização da presente invenção, a gelatina é secada na presença de um açúcar. Isto pode incluir a aspersão-atomização das gelatinas em diferentes suportes tais como açúcares, maltodextrinas ou amidos.

Em uma realização opcional da presente invenção, é utilizado um produto de gelatina comercial chamado Cryogel™ produzido por PB Gelatins (Tessenderlo Group, Bélgica). O Cryogel é solúvel a temperaturas 5-60C menores do que a gelatina não tratada equivalente. O processo exato do tratamento utilizado na produção do Cryogel é patenteado.

Ainda em uma outra realização da presente invenção, a composição pode opcionalmente apresentar uma ou mais substâncias adicionais. Por exemplo, a composição pode compreender opcionalmente um desnaturante, incluindo, mas sem ficar a eles limitado, um ou mais dentre hidrocloreto de guanidina ou uréia. A composição também pode compreender opcionalmente, alternativa ou adicionalmente, um agente redutor, incluindo, mas sem ficar a eles limitado, um ou mais cloreto de magnésio ou hidroquinona. A composição também pode compreender opcionalmente, alternativa ou adicionalmente, uma substância tal como o isopropanol para aumentar a formação de ligação do hidrogênio. A composição também pode compreender opcionalmente, alternativa ou adicionalmente, um solvente polar prótico, que pode preferivelmente interagir estruturalmente com as proteínas e impedir a formação da hélice na gelatina, tal como o DMSO (sulfóxido de dimetila) .

A composição também pode compreender opcionalmente, alternativa ou adicionalmente, um dessecativo que seja exotérmico na solução de entrada, tal como o cloreto de cálcio, por exemplo.

De acordo com algumas realizações, a presente invenção também apresenta uma protease específica de gelatina que compreende uma enzima ou mistura de enzimas que pode rapidamente decompor os filamentos da molécula de gelatina, mas sem afetar desfavoravelmente as redes de coagulação baseadas em fibrina naturais.

Uma protease específica de gelatina poderia opcionalmente ser utilizada para remover a bandagem/curativo/ hemostato absorvível/vedante de um sítio de ferida sem danificar o coágulo de fibrina endõgeno natural e causar novo sangramento. Esta característica é um benefício adicional da presente invenção em comparação com os produtos existentes, e resolve o problema técnico de que os curativos hemostáticos que são suficientemente adesivos para aderir bem a um sítio de ferida e parar o sangramento não podem ser removidos sem remover ou destruir o coágulo de fibrina. Embora pelo menos algumas realizações de uma bandagem de acordo com a presente invenção sejam reabsorvíveis, pode haver a necessidade de remover a mesma de uma ferida se o médico quiser operar um sítio de ferida ou colocar a bandagem em um lugar diferente.

Uma protease exemplificadora não limitadora é a proteinase K (Chen, et al.Biomacromolecules 2003, 4, 1558- 1563). No entanto, outras proteases, particularmente as enzimas de ação mais rápidas, podem ser utilizadas alternativamente.

De acordo com outras realizações, um ou mais inibidores de protease opcionalmente são adicionados, incluindo, mas sem ficar a eles limitados, a aprotinina, o ácido tranexâmico, o inibidor da alfa 2-plasmina, a alfa-1 de antitripsina ou a alfa-1 de antitripsina do mutante de Pittsburgh (Arg-358 alfa-l-antitrypsin; vide Owen et al. N.Engl.I Med. 309:694-698, 1983 e a Patente Norte-americana n°. 4.711.848, que é aqui incorporada a título de referência tal como aqui apresentado integralmente) . Dentro de uma realização preferida, a aprotinina é incluída em quantidade suficiente para fornecer uma concentração operável final de 1.500-20.000 KlU/ml.

De acordo com outras realizações, o material hemostático da presente invenção pode ainda compreender uma substância hemostática adicional, além da gelatina e da TG. Tal substância pode ser de natureza biológica ou sintética e pode incluir, mas sem ficar a eles limitada, um ou mais agentes hemostáticos conhecidos, tais como a albumina, o colágeno, a fibrina, a trombina, a quitosana, o sulfato férrico ou outros sulfatos de metal.

Ainda de acordo com outras realizações, o material hemostático da presente invenção pode ainda compreender um acelerador para acelerar a taxa de reticulação na combinação do material de reticulação, tal como a transglutaminase, por exemplo, e a gelatina. Tal acelerador pode, opcionalmente, compreender o cálcio, por exemplo.

O cálcio é um componente preferido da reação de reticulação da transglutaminase/gelatina. Vários estudos demonstraram que as concentrações de cálcio variadas e/ou a adição de drogas para mobilização do cálcio (que incluem, mas sem ficar a ela limitadas, a maitotoxina (MTX)) podem acelerar a reação de coagulação da transglutaminase. Portanto, de acordo com as realizações da presente invenção, o cálcio e/ou as drogas para mobilização do cálcio são incluídos, embora alternativamente nenhum cálcio e/ou drogas para mobilização do cálcio sejam utilizados. Essas modificações para a utilização do cálcio são úteis com as transglutaminases dependentes de cálcio, mas não com as transglutaminases independentes de cálcio. Ainda de acordo com outras realizações, o material hemostático da presente invenção pode ainda compreender um material para indução de uma reação exotérmica, preferivelmente na combinação do material de reticulação, tal como a transglutaminase, por exemplo, e a gelatina. A indução de uma reação exotérmica pode, opcional e preferivelmente, suportar a reticulação mesmo sob condição ambiente, em que "ambiente" pode, opcionalmente, ser definido como qualquer ambiente que tem uma temperatura menor do que aproximadamente 30°C. Tal agente exotérmico pode opcionalmente compreender um ou mais dentre o cálcio, moléculas que contêm cloro (tais como o cloreto de cálcio ou o cloreto de magnésio) ou os zeólitos/óxidos metálicos, por exemplo, ou uma combinação dos mesmos.

PREPARAÇÃO DA COMPOSIÇÃO

As composições tal como aqui descritas podem ser opcionalmente preparadas de acordo com um ou mais métodos diferentes das várias realizações da presente invenção. Em uma realização da invenção, a gelatina na mistura de gelatina-mTG é submetida a métodos de secagem muito específicos que envolvem a utilização de calor antes de ser misturada com a mTG. Esses métodos de secagem aumentam a solubilidade da gelatina ao diminuir o seu ponto de fusão preferivelmente abaixo das temperaturas das salas de operação. Os métodos de secagem podem aumentar a solubilidade da gelatina sem nenhum aditivo e sem alterar as condições ambientais sob as quais a gelatina ou as soluções de gelatina-mTG são formadas. Entretanto, a adição de determinados aditivos, tais como plastificantes ou estabilizantes, ou a manipulação de determinados fatores ambientais, tais como a temperatura, a concentração de íons e a pressão osmótica da gelatina ou das soluções de gelatina- mTG podem ser utilizadas para realçar ainda mais as propriedades de uma mistura de gelatina-mTG que já incorpore a gelatina seca utilizando uma técnica que reduza o seu ponto de fusão. Em uma realização preferida da secagem da gelatina dependente de calor para preparar uma gelatina que possa formar uma solução com a mTG em temperaturas reduzidas, uma solução pura de gelatina que temum teor de água de pelo menos 3 5% é aspergida em uma temperatura superior à temperatura do processo de gelificação e de solidificação em um excesso das partículas de gelatina sólidas finamente divididas que contêm menos de 8% de água. As partículas são secadas então em um leito fluido até um teor de água de 8 a 13%. Esse processo, assim como as variações desse processo que também são incluídas dentro do âmbito da presente invenção, é descrito em detalhes na Patente Norte-americana 4.889.920, aqui incorporada a título de referência tal como aqui apresentado integralmente.

Em uma outra realização preferida da secagem de gelatina dependente de calor para preparar uma gelatina que possa formar uma solução com a mTG em temperaturas reduzidas, uma gelatina que tenha um teor de água maior do que 8% por peso com base no peso total de gelatina e da água é submetida a aquecimento com microondas para remover pelo menos 35% do dito teor de água para obter uma gelatina tratada que tenha um teor de água de não mais do que 16% do peso com base no peso total da gelatina e da água. Este processo, assim como as variações desse processo que devem também ser consideradas como parte da presente invenção, é descrito em detalhes na Patente Norte-americana 4.224.348, aqui incorporada a título de referência tal como aqui apresentado integralmente.

Em uma outra realização preferida da secagem de gelatina dependente de calor para preparar uma gelatina que possa formar uma solução com a mTG em temperaturas reduzidas, a gelatina é secada a IOO0C sob pressão reduzida tal como descrito na Patente Norte-americana 2.803.548, aqui incorporada a título de referência tal como aqui apresentado integralmente. Este processo altera os próprios filamentos da gelatina, impedindo que oe mesmos passem pelo processo de gelificação termoreversível. Embora a reticulação da gelatina com a mTG não seja dependente da capacidade da gelatina de formar um gel termoreversível, esse processo de secagem resulta em um enfraquecimento dos filamentos da gelatina, e desse modo de qualquer gel criado utilizando tal gelatina na reticulação de gelatina-mTG.

Em uma outra realização da invenção, a gelatina na mistura de gelatina-mTG é submetida a métodos de secagem muito específicos que envolvem a utilização da liofilização antes de sua mistura com a mTG. Esses métodos de secagem aumentam a solubilidade da gelatina ao diminuir seu ponto de fusão preferivelmente abaixo das temperaturas das salas de operação. Os métodos de secagem podem aumentar a solubilidade da gelatina sem quaisquer aditivos e sem alterar as condições ambientais sob as quais a gelatina ou as soluções de gelatina-mTG são formadas. Entretanto, a adição de determinados aditivos, tais como plastificantes ou estabilizantes, ou a manipulação de determinados fatores ambientais, tais como a temperatura, a concentração de íons e a pressão osmótica da gelatina ou das soluções de gelatina- mTG podem ser utilizadas para realçar ainda mais as propriedades de uma mistura de gelatina-mTG que já incorpore a gelatina seca utilizando uma técnica de liofilização que reduza o seu ponto de fusão.

Em uma realização preferida da secagem de gelatina com liofilização para preparar uma gelatina que possa formar uma solução com a mTG a temperaturas reduzidas, uma gelatina dissolvida em água em uma concentração de 0,1-2% em peso é secada por congelamento sob pressão reduzida. Esse processo, assim como as variações desse processo que também devem ser consideradas como parte da presente invenção, é descrito em detalhes na Patente Norte-americana 2.166.074, aqui incorporada a título de referência tal como aqui apresentado integralmente.

Em uma outra realização da invenção, a mistura de gelatina-mTG fica sujeita a liofilização uma vez que a gelatina e a mTG já tenham sido misturadas em solução. Isto diminui o ponto de fusão de gelatina enquanto resulta em uma mistura de gelatina-mTG liofilizada, uniformente misturada, onde a gelatina na forma seca fica em contato com a mTG na forma seca. Nesta realização, a gelatina e a mTG são reconstituídas simultaneamente do estado liofilizado e formam imediatamente uma solução no sítio de reconstituição. Esta técnica pode preferivelmente ser utilizada com gelatina ou uma mistura de gelatina que já tenha um ponto de fusão mais baixo do que a gelatina padrão, uma vez que a atividade da mTG diminui exponencialmente a temperaturas mais baixas (abaixo de aproximadamente 37°C).

Desse modo, uma solução que consiste em um ponto de fusão reduzido da gelatina e da mTG pode ser formada a baixa temperatura sem a ocorrência rápida da reticulação e do processo de gelificação. Esta solução pode então ser liofilizada, resultando em uma mistura seca de gelatina e mTG homogeneamente distribuídas. Tal mistura pode ser reconstituída rapidamente para formar um gel quando colocada em contato com um solvente mais quente. Tal técnica poderia preferivelmente ser utilizada em um curativo de ferida, onde os fluidos corpóreos em sua temperatura natural de 37°C pudessem reconstituir a gelatina e a mTG.

Preferivelmente, de acordo com algumas realizações da presente invenção, é apresentada uma mistura de partículas de gelatina-mTG para fins de vedação de tecido ou hemostático em que a gelatina e a mTG são aspergidas conjuntaamente para criar um pó bem dispersado que contém gelatina e mTG na concentração apropriada para as aplicações como vedação de tecido ou hemostático.

Em uma outra realização da presente invenção, a gelatina utilizada como parte da mistura de gelatina-mTG foi hidrolisada, parcialmente hidrolisada, ou alguma porcentagem da mistura de gelatina foi hidrolisada ou parcialmente hidrolisada a fim de aumentar a sua solubilidade. Um exemplo de tal técnica foi demonstrado com sucesso em um processo que envolve o revestimento dos grânulos de gelatina padrão com uma película de gelatina hidrolisada (Patente Norte-americana 4.729.897, aqui incorporada a título de referência tal como aqui apresentado integralmente). Esta realização pode incluir a utilização da gelatina que foi hidrolisada ou parcialmente hidrolisada na presença de um plastificante, que pode incluir um álcool poliídrico, um carboidrato ou um outro plastificante tal como descrito acima.

Em uma outra realização da presente invenção, uma solução que contém mTG e gelatina pré-misturadas ou outros hidrolisatos de proteína é secada por cobgelamento para aumentar a estabilidade do composto. Esta técnica, tal como utilizada na preparação de uma composição utilizada para processamento de alimentos, é descrita na Patente Norte- americana 6.030.821, aqui incorporada a título de referência tal como aqui apresentado integralmente.

Em uma outra realização da presente invenção, a gelatina utilizada como parte da mistura de gelatina-mTG é secada por aspersão depois de ser misturada com ácido para formar uma solução de gelatina diluentemente ácida em que o ácido é mantido a 5-20% do nível da gelatina, permitindo que se formem gotícuias finas para uma secagem intensificada.

Este processo é descrito na Patente Canadense 896.965, aqui incorporada a título de referência tal como aqui apresentado integralmente. Em uma outra realização da presente invenção, uma ou mais das técnicas descritas acima para realçar um produto que contém gelatina e mTG são utilizadas em iníssono ou em séries. Isto pode preferivelmente incluir a utilização de dois ou mais plastificantes conjuntamente em uma gelatina ou solução de gelatina-mTG ao utilizar um ou mais plastificantes em uma gelatina ou solução de gelatina-mTG antes de sua secagem utilizando um dos métodos de secagem descritos. Também pode incluir a secagem da gelatina ou da gelatina-mTG utilizando uma técnica de secagem, ao dissolver a gelatina ou gelatina-mTG seca em solução, e então secando novamente a gelatina ou a gelatina-mTG.

Esses métodos também poderiam ser opcionalmente utilizados para a composição que é submetida ao processo de gelificação termoreversível, preferivelmente incluindo as composições que compreendem várias combinações de proteínas que não de gelatina e também opcionalmente outros reticulantes (com exceção da transglutaminase) , por exemplo.

BANDAGENS

Uma realização exemplificadora da presente invenção refere-se a um curativo hemostático, por exemplo, para tratamento de um tecido ferido em um paciente, o qual compreende gelatina e transglutaminase, preferivelmente separadas até que sua interação seja necessária ou desejada para a atividade da bandagem. A bandagem pode apresentar opcionalmente um revestimento protetor não absorvente, tal como um revestimento protetor de plástico. A bandagem também pode apresentar opcionalmente uma camada de material reabsorvível.

Uma outra realização da presente invenção refere-se a um curativo hemostático para tratamento de um tecido ferido em um paciente, o qual compreende opcional e preferivelmente: (i) uma camada de gelatina; (ii) uma camada de transglutaminase adjacente à dita camada da gelatina; sendo que a camada de transglutaminase é coextensiva ou não coextensiva com a camada de gelatina.

Uma outra realização da presente invenção refere-se a um curativo hemostático para tratamento de um tecido ferido em um paciente, o qual compreende opcional e preferivelmente:

(i) uma camada de material reabsorvível ou não reabsorvível;

(ii) uma camada de gelatina adjacente à dita camada de material; (iii) uma camada de transglutaminase adjacente à dita camada de gelatina; sendo que a camada de transglutaminase é coextensiva ou não coextensiva com a camada de gelatina.

Uma outra realização da presente invenção refere-se a um curativo hemostático para tratamento de um tecido ferido em um paciente, o qual compreende: (i) uma primeira camada de gelatina; (ii) uma camada de material reabsorvível adjacente à primeira camada de gelatina; (iii) uma camada de transglutaminase adjacente à camada de material reabsorvível; e (iv) uma segunda camada de gelatina adjacente à camada de transglutaminase, sendo que a camada de transglutaminase não é coextensiva com a primeira e/ou a segunda camada de gelatina.

De acordo com algumas realizações, a presente invenção apresenta um curativo hemostático (por exemplo, uma bandagem) que inclui uma camada de transglutaminase imprensada entre uma primeira e uma segunda camada de gelatina, sendo que a camada de transglutaminase pode ser coextensiva ou não coextensiva com a primeira e/ou a segunda camada de gelatina. Tal curativo hemostático é útil para tratamento de feridas. O modelo não coextensivo oferece a vantagem de inibir a separação em lâminas das camadas, em comparação com os curativos em que a camada de transglutaminase é coextensiva com a primeira e a segunda camada completa da gelatina. No entanto, o desempenho hemostático do modelo coextensivo pode ser superior àquele do modelo não coextensivo.

De acordo com outras realizações da presente invenção, é apresentado um curativo da invenção, o qual compreende opcional e preferivelmente: (i) uma matriz reabsorvível ou não reabsorvível; (ii) gelatina; (iii) uma transglutaminase; sendo que a gelatina e a transglutaminase são incorporadas dentro da dita matriz.

Em uma outra realização, o dispositivo hemostático compreende: (i) uma matriz reabsorvível ou não reabsorvível porosa; (ii) gelatina; (iii) uma transglutaminase; sendo que a gelatina e a transglutaminase são aderidas à dita matriz.

Em várias realizações, a camada de transglutaminase pode ser configurada em qualquer uma dentre uma variedade de formas e padrões. Por exemplo, e sem limitação, a camada de transglutaminase pode ser configurada como uma disposição de pontos que compreendem a transglutaminase, ou como um único ponto que compreende a transglutaminase. Alternativamente, a camada de transglutaminase pode ser configurada como uma pluralidade de linhas que compreendem a transglutaminase.

Cada camada de curativos hemostáticos também pode conter opcionalmente uma ou mais cargas apropriadas, agentes de ligação e/ou agentes de solubilização. Além disso, cada um dos curativos hemostáticos também pode compreender opcionalmente ainda uma camada desprendedora que contém um agente desprendedor e/ou um material de suporte.

De acordo com as realizações preferidas, cada camada de curativos hemostáticos pode, opcionalmente, conter uma ou mais cargas apropriadas, tal como a sacarose. Cada

camada de curativos hemostáticos também pode conter opcionalmente um ou mais agentes de ligação apropriados, tal como a sacarose. Cada um dos curativos hemostáticos também pode compreender opcionalmente ainda uma camada desprendedora que contém um agente desprendedor. Um agente desprendedor exemplificador é a sacarose. Cada camada de curativos hemostáticos também pode conter opcionalmente um ou mais agentes de solubilização apropriados, tal como a sacarose.

Sem desejar ficar limitado a uma única hipótese, as propriedades da sacarose como parte da presente invenção podem opcionalmente ser ao menos parcialmente determinadas por uma quantidade adicionada. Em concentrações relativamente elevadas (solução de sacarose a 20-30%) ela pode ser aspergida na superfície (tal como uma bandagem) para preparar tal superfície para a aplicação de uma outra solução (tal como a gelatina ou solução de mTG) a ser aderida. As concentrações mais baixas (cerca de 2%, por exemplo) , a sacarose pode ser adicionada à gelatina ou solução de mTG para ajudar tal solução a aderir a uma superfície (tal como a bandagem).

Cada camada de curativos hemostáticos também pode conter opcionalmente um ou mais agentes de formação de espuma apropriados, tal como uma mistura de ácido cítricô e bicarbonato de sódio.

Cada um dos curativos hemostáticos também pode compreender ainda um material de revestimento protetor no lado oposto do curativo ao lado da ferida quando o curativo está sendo utilizado. O material de revestimento protetor pode ser afixado com um adesivo fisiologicamente aceitável ou pode ser autoaderente (por exemplo, contendo uma carga estática de superfície). O material de revestimento protetor pode ser um material reabsorvível ou um material não reabsorvível, tal como um curativo de silicone ou um curativo de plástico e/ou um dispositivo tal como um cateter vascular e/ou outro tipo de dispositivo médico que pode, opcionalmente, ser introduzido no corpo. A camada de transglutaminase pode ser aplicada à primeira camada de gelatina de tal modo que seja não coextensiva com a primeira camada de gelatina e/ou não coextensiva com a segunda camada de gelatina na aplicação da segunda camada de gelatina. Por exemplo, a camada de transglutaminase pode ocupar aproximadamente 5% a aproximadamente 95% da área de superfície da primeira camada de gelatina e/ou aproximadamente 5% a aproximadamente 95% da área de superfície da segunda camada de gelatina. A transglutaminase pode ser aplicada à camada de gelatina em um único ponto ou como uma série de pontos na camada de gelatina de tal modo que a área de superfície total dos pontos de transglutaminase ocupe aproximadamente 5% a aproximadamente 95% da área de superfície da primeira camada de gelatina e/ou aproximadamente 5% a aproximadamente 95% da área de superfície da segunda camada de gelatina.

Tal ponto ou pontos de transglutaminase podem ter qualquer forma geométrica, por exemplo, círculos, retângulos, triângulos, linhas, formas amorfas preenchidos ou não preenchidos, ou combinações dos mesmos. Tais pontos podem ser aplicados à primeira camada de gelatina em um padrão aleatório ou regular. Uma pluralidade de pontos pode formar qualquer variedade de formas e padrões, tais como uma disposição, uma grade, uma série de pontos concêntricos (por exemplo, círculos ou quadrados concêntricos), uma série de pontos sobrepostos (por exemplo, círculos sobrepostos) , raios que emanam de um eixo ou qualquer outra configuração, contanto que a área de superfície total de transglutaminase seja de aproximadamente 5% a aproximadamente 95% da área de superfície da primeira camada de gelatina e/ou aproximadamente 5% a aproximadamente 95% da área de superfície da segunda camada de gelatina. Em geral, é preferível um grande número de pontos pequenos em vez de um número pequeno de pontos grandes. Por exemplo, uma disposição de pontos de 2 0 vezes 2 0 geralmente é preferível a uma disposição de pontos de 10 vezes 10 para ocupar a mesma área de superfície total. No entanto, os pontos podem ser de qualquer tamanho, contanto que a área de superfície total de transglutaminase seja de aproximadamente 5% a aproximadamente 95% da área de superfície da primeira camada de gelatina e/ou aproximadamente 5% a aproximadamente 95% da área de superfície da segunda camada de gelatina. Por exemplo, dependendo do tamanho geral do curativo, os pontos podem ter, sem limitação, pelo menos aproximadamente 0,01, 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10 mm de diâmetro ou mais, na largura ou no comprimento. Em uma realização, por exemplo, quatro pontos circulares que têm um diâmetro de 2-3 mm cada podem ocupar um centímetro quadrado de um curativo. Uma variedade de outras configurações está dentro do âmbito da invenção e pode prontamente ser utilizada pelos elementos versados na técnica.

O curativo pode, opcionalmente, ser preparado de qualquer uma dentre uma variedade de tamanhos e formas. Tipicamente, os curativos são de um tamanho e de uma forma que podem prontamente ser manipulados pelos elementos versados na técnica, tipicamente menos de 12" de comprimento ao longo de um lado, por exemplo, 1" χ 1", 1" χ 2", 4" χ 4", etc. O nível de umidade do curativo é tipicamente menos que 8% (por exemplo, menos de 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1%) .

Qualquer um dentre uma variedade de materiais reabsorvíveis conhecidos dos elementos versados na técnica pode ser opcionalmente empregado na presente invenção. Por exemplo, o material reabsorvível pode ser uma substância proteinácea, tal como a fibrina, a queratina, o colágeno e/ou a gelatina, ou as substâncias de um carboidrato, tais como os alginatos, a quitina, a celulose, os proteoglicanos (por exemplo, poli-N-acetil glucosamina), polímeros de ácido glicólico, polímeros de ácido lático ou co-polímeros de ácido glicólico/ácido lático. Por exemplo, o material reabsorvível pode ser uma substância de carboidrato. Os exemplos ilustrativos de materiais reabsorvíveis são comercializados sob as marcas registradas VICRYL.TM. e DEXON.TM.

Geralmente, as várias camadas do curativo hemostático podem ser afixadas umas às outras por quaisquer meios conhecidos e disponíveis aos elementos versados na técnica. Por exemplo, opcional e preferivelmente a(s) camada(s) de gelatina e/ou a(s) camada(s) de transglutaminase é (são) aplicadas como uma série de camadas com solução aquosa de congelamento rápido e subseqüentemente liofilizadas ou secadas por congelamento, por exemplo, após a aplicação de cada camada, e na montagem de todo o curativo. As camadas podem ser aplicadas por qualquer uma dentre uma variedade de técnicas, incluindo aspersão, pipetagem (por exemplo, com uma pipeta de múltiplos canais), pulverização, utilizando uma máscara, deposição eletrostática, utilizando um sistema de disposição por microsseringas ou dosagem utilizando um misturador distribuidor que contém portas para produzir uma disposição com densidade elevada.

Em determinadas realizações da presente invenção, quando os curativos são preparados utilizando um molde, um agente desprendedor, tal como a sacarose, é aplicado ao molde antes que a primeira camada do curativo seja aplicada. Em tais realizações, o curativo hemostático compreende ainda uma camada desprendedora que contém o dito agente desprendedor.

Alternativamente, um adesivo fisiologicamente aceitável pode ser aplicado ao material reabsorvível e/ou ao material de revestimento protetor (quando presente) e à(s) camada(s) de gelatina e/ou à(s) camada(s) de transglutaminase fixadas subseqüentemente. Em uma realização do curativo, o adesivo aceitável fisiologicamente tem uma resistência ao cisalhamento e/ou estrutura tal que o material reabsorvível e/ou o material de revestimento protetor possam ser separados da camada de gelatina após a aplicação do curativo ao tecido ferido. Em uma outra realização, o adesivo fisiologicamente aceitável tem uma resistência ao cisalhamento tal que o material reabsorvível e/ou o material de revestimento protetor não podem ser separados da camada de gelatina após a aplicação do curativo no tecido ferido.

A concentração de gelatina por área da ferida depende de vários fatores, incluindo, mas sem ficar a eles limitados, a construção final da bandagem, os materiais empregados, e assim por diante.

De acordo com outras realizações da presente invenção, são apresentados métodos para a preparação de um curativo hemostático mediante a provisão, opcional e preferivelmente, de uma primeira camada de gelatina, a aplicação de uma camada de transglutaminase à primeira camada de gelatina e a aplicação de uma segunda camada de gelatina à camada de transglutaminase, sendo que a camada de transglutaminase não é coextensiva com a primeira camada de gelatina e/ou não é coextensiva com a segunda camada de gelatina.

De modo similar, outras realizações da invenção incluem um método para a preparação de um curativo hemostático mediante a provisão de uma camada reabsorvível ou não reabsorvível de revestimento protetor que tem uma primeira camada de gelatina fixada; a aplicação de uma camada de transglutaminase à dita primeira camada de gelatina em um lado da camada de gelatina que seja oposto do lado ao qual a camada reabsorvível ou não reabsorvível do revestimento protetor é fixada; e a aplicação de uma segunda camada de gelatina à camada de transglutaminase, sendo que a camada de transglutaminase não é coextensiva com a primeira camada de gelatina e/ou não é coextensiva com a segunda camada de gelatina.

DISPOSITIVO HEMOSTÁTICO

Uma outra realização exemplificadora da presente invenção refere-se a um dispositivo hemostãtico, por exemplo, para a hemostasia em um ambiente cirúrgico de paciente com sangramento intenso, o qual compreende: (i) uma matriz reabsorvível ou não reabsorvível porosa; (ii) gelatina em pó, em partículas ou em outra forma sólida, e (iii) transglutaminase em pó, em partículas ou em outra forma sólida; sendo que a gelatina e a transglutaminase são incorporadas dentro da dita matriz.

Uma outra realização da presente invenção refere-se a um dispositivo hemostático, por exemplo, para a hemostasia em um ambiente cirúrgico de paciente com sangramento intenso, o qual compreende: (i) uma matriz reabsorvível ou não reabsorvível porosa; (ii) gelatina; (iii) transglutaminase; sendo que a gelatina e a transglutaminase são aderidas à dita matriz.

Outras realizações da presente invenção incluem a aplicação da mistura hemostática/vedante através dos métodos aceitos da aplicação de vedação. Tais métodos podem incluir opcionalmente a aplicação da mistura como parte de um gel, espuma ou spray. A aplicação da mistura hemostática/vedante que utiliza esses métodos pode ser opcionalmente executada, por exemplo, ao armazenar os componentes da mistura separadamente e ao misturar os mesmos imediatamente antes da aplicação; e/ou, por exemplo, opcionalmente ao armazenar os componentes juntos na forma inativa e ao ativar os mesmos imediatamente antes da aplicação. As formas inativas dos componentes do vedante podem ser providas opcionalmente como um ou mais dentre uma solução congelada, um pó liofilizado que precise de reconstituição, um pó secado por aspersão que precise de reconstituição e/ou qualquer outra forma apropriada de mistura vedante inativa.

PREPARAÇÃO DO DISPOSITIVO HEMOSTÁTICO

De acordo com algumas realizações da presente invenção, a técnica de secagem por congelamento e/ou a liofilização podem, opcionalmente, ser aplicadas para aderir ou fixar a composição vedante de acordo com a presente invenção na superfície de quaisquer cateteres, trocartes ou implantes, ou de qualquer outro dispositivo médico. Isto pode, opcionalmente, facilitar a hemostasia na ferida de penetração e seu fechamento, o que pode opcionalmente ser útil para cateteres/dispositivos arteriais, por exemplo. A hemostasia depois do procedimento arterial é crítica para os pacientes que foram tratados com medicação anticoagulação e que são mais propensos às complicações do sangramento. A composição hemostática da presente invenção é independente da coagulação sangüínea e dessie modo propicia um auxílio adicional para impedir o excesso de sangramento.

UTILIZAÇÃO DO DISPOSITIVO, DA COMPOSIÇÃO OU DA BANDAGEM

Durante a utilização do curativo, dispositivo ou agente hemostático, a gelatina e a transglutaminase podem ser ativadas no momento em que o curativo, o dispositivo ou a mistura da partícula são aplicados ao tecido ferido por fluidos endógenos (por exemplo, sangue, ar, bile, fluido intestinal) do paciente que estão escapando da ferida com hemorragia ou vazamento. Alternativamente, nas situações onde a perda de fluido do tecido ferido é insuficiente para obter uma hidratação adequada das camadas da proteína, a gelatina e ou a transglutaminase podem ser ativadas pela aplicação de um líquido fisiologicamente aceitável (por exemplo, água, tampão, solução salina) que contém opcionalmente quaisquer co-fatores e/ou enzimas necessários, antes ou durante a aplicação do curativo, dispositivo ou agente hemostático ao tecido ferido.

Os princípios e a operação da presente invenção podem ser mais bem compreendidos com referência aos desenhos e à descrição anexos.

Agora com referência aos desenhos, a Figura 1 é um diagrama de blocos esquemático de uma bandagem exemplificadora de acordo com a presente invenção. Conforme mostrado, uma bandagem 100 apresenta preferivelmente pelo menos uma, e preferivelmente uma pluralidade de camadas de gelatina 102, sendo mostradas duas de tais camadas somente para fins de descrição e sem nenhuma intenção limitadora. Pelo menos uma camada de transglutaminase 104 também é preferivelmente fornecida; neste exemplo, a camada de transglutaminase 104 é mostrada como estando imprensada entre a pluralidade de camadas de gelatina 102 somente para a finalidade da ilustração e sem nenhuma intenção limitadora. Um revestimento protetor apropriado 106 também é mostrado, o qual confere preferivelmente resistência mecânica à bandagem 100. 0 revestimento protetor 106 pode, opcionalmente, ser implementado como uma malha ou curativo de ácido poliglicólico, tal como, por exemplo, provido como Dexon™ ou Vicryl™.

A Figura 2 mostra uma vista frontal de uma bandagem exemplificadora de acordo com a presente invenção, coberta com um revestimento protetor absorvível opcional e um envoltório de plástico opcional.

A Figura 3 é um diagrama de blocos esquemático exemplificador de um dispositivo hemostático de acordo com a presente invenção, incorporando uma matriz porosa. Conforme mostrado, um dispositivo hemostático 300 apresenta preferivelmente pelo menos uma, e preferivelmente uma pluralidade de camadas de gelatina 302, sendo mostradas duas de tais camadas somente para fins de descrição e sem nenhuma intenção limitadora. Pelo menos uma camada de transglutaminase 304 também é preferivelmente fornecida; neste exemplo, a camada de transglutaminase 304 é mostrada como estando imprensada entre a pluralidade de camadas de gelatina 302 somente para fins de ilustração e sem nenhuma intenção limitadora. Um revestimento protetor apropriado 306 também é mostrado, o qual preferivelmente confere resistência mecânica à bandagem 300. O revestimento protetor 306 pode, opcionalmente, ser implementado como qualquer tipo de material biodegradável.

Com referência agora aos exemplos abaixo, as várias composições de acordo com a presente invenção foram construídas e testadas para demonstrar a sua capacidade de reduzir o sangramento e induzir a hemostasia. As composições testadas se mostraram muito competentes e com capacidade de deter o sangramento, até mesmo o sangramento arterial, em um animal experimental.

EXEMPLO 1

PREPARAÇÃO DO ADESIVO ILUSTRATIVO

Este exemplo refere-se à preparação de um adesivo ilustrativo, não limitador, de acordo com a presente invenção. Para este exemplo, a transglutaminase microbiana independente de cálcio (lote n° L-04207, Ajinomoto USA, Chicago, IL) foi utilizada com um nível de atividade específico de 100 U/g. Além disso, a gelatina testada era gelatina do tipo A, valor de Bloom de 300 de pele suína (sigma-Aldrich-Aldrich, St. Louis, MO).

O método a seguir foi utilizado para preparar o adesivo ilustrativo: 20% em peso/peso de gelatina em PBS (solução salina tamponada com fosfato; 20 g de gelatina em 80 g de PBS) foram preparados. Em seguida 20% em peso/volume de solução de mTG foi preparada em PBS (1 g de mTG em 5 ml de PBS) . Em seguida, 5 g da solução de gelatina foram misturados com 0,5 ml de solução de mTG (em outras palavras 10:1) .

A Figura 4 mostra o efeito de porcentagens diferentes de gelatina na intensidade de aderência do adesivo. As intensidades de aderência foram medidas ao fixar uma amostra de pele suína a uma segunda amostra, ao colocar um peso de 4 7,5 g na junção, e então ao submergir a mesma imediatamente em água por 120 minutos. Após o período de submersão, a tensão foi aplicada a 5 mm/min para determinar a intensidade de aderência final (Mcdermott et al.

Biomacromolecules 2004, 5, 1270-1279) .

Tal como demonstrado na Figura 5, o nível de reatividade ideal da transglutaminase microbiana está na faixa de 50-55°C. No nível fisiológico de 37°C, o nível de reatividade só é aproximadamente 60% do nível ideal. Dessa maneira, o aumento da temperatura da reação utilizando um agente exotérmico deve aumentar o nível de reatividade e desse modo acelerar a reticulação da gelatina. Desse modo, opcional e preferivelmente, um agente exotérmico faz parte da presente invenção.

O cálcio pode ser opcionalmente utilizado como parte de tal agente, uma vez que o cloreto de cálcio libera calor quando dissolvido, mas não suficiente calor para danificar o tecido. Além disso, conforme observado acima, é possível que o cálcio ajude a acelerar a reação de outras maneiras, independentemente de sua dissolução exotérmica.

Opcionalmente, uma substância exotérmica atóxica pode ser incluída na bandagem com um ou mais fatores de reticulação. Alternativa ou adicionalmente, um ou mais agentes exotérmicos não reabsorvíveis podem ser opcionalmente adicionados atrás do revestimento protetor da bandagem, tal como descrito anteriormente. EXEMPLO 2

TESTE DE PRESSÃO DE RUPTURA IN VITRO Este exemplo demonstra a capacidade de uma composição de acordo com a presente invenção de resistir à ruptura como uma representação de sua capacidade de resistir ao fluxo sangüíneo de pressão arterial elevada. Um sistema da pressão de ruptura foi desenvolvido, tal como descrito abaixo, para imitar o fluxo sangüíneo de pressão elevada, com PBS morno utilizado no lugar do sangue para aplicar uma pressão sobre uma ferida em uma amostra de pele suína. A resistência a 200 mmHg de pressão por dois minutos foi considerada um critério de sucesso, uma vez que a pressão sangüínea fisiológica é quase sempre mais baixa do que 200 mmHg. Esses resultados do teste de ruptura demonstraram que a composição de acordo com a presente invenção é apropriada para o tratamento do fluxo sangüíneo, incluindo o fluxo de pressão arterial elevada.

A maior parte das amostras (8/10) resistiu a uma pressurização de 200 mmHg por dois minutos. Aquelas que não passaram foram relacionadas provavelmente a erro humano ou de sistema. A pressão de ruptura média era de 320 ± 50 mmHg, mas este número é conservador, uma vez que às amostras que não se romperam foi atribuído um valor numérico de 354 mmHg, pois esta era a pressão máxima mensurável pelo aparelho experimental. Esses resultados demonstram a capacidade de a composição adesiva de acordo com algumas realizações da presente invenção ser utilizada para finalidades hemostáticas, até mesmo sob rigorosas condições de teste.

MATERIAIS

A gelatina (do tipo A, de suínos, valor Bloom 300) foi obtida junto à Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). A mistura de transglutaminase microbiana (mTG) independente de cálcio TG-TI foi obtida junto à Ajinomoto e utilizada sem purificação adicional. O fabricante relata que esta enzima tem uma atividade específica de 100 U/g. 0 tecido de pele suína foi adquirido em uma loja local.

PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

A pele suína foi tratada com NaOH diluído por uma hora antes de ser cortada em forma de disco, com um diâmetro de aproximadamente 6-6,5 cm. A gordura da pele foi removida com um bisturi. Um furo de 2 mm foi feito no centro da seção da pele para simular uma ferida. A pele foi lavada com grande quantidade de água e de tampão PBS e armazenada em uma placa de Petri com cerca de 1 ml de tampão PBS para manter a pele úmida até a utilização. Para todas as experiências aqui descritas, foi utilizada uma solução salina tamponada com fosfato da Dulbecco com um pH de 7,4 para o tampão PBS.

A solução de gelatina (25% em peso/peso) no tampão PBS era fresca e preparada a cada dia e armazenada a 650C antes da utilização. A solução de partida de mTG (20% em peso/peso) no tampão PBS foi preparada e dividida em frascos de 2 ml, e armazenada a -18 °C. A solução de enzima foi descongelada até a temperatura ambiente antes da utilização.

A superfície da pele foi secada ao toque com um lenço de tecido em laboratório antes de o adesivo ser aplicado. 0 adesivo foi preparado em um frasco de 2 ml ao misturar 1 ml de gelatina e 0,5 ml de mTG. Duas composições diferentes foram preparadas. A composição "A" utilizou a transglutaminase da Ajinomoto, enquanto que a composição "B" utilizou a transglutaminase da (Yiming Biological Productos Co. (Jiangsu, China); o produto preferido tal como descrito acima). 0,6 ml da mistura resultante (uma composição adesiva de tecido exemplificadora de acordo com a presente invenção) foi aplicado na pele suína sobre o furo. Após a aplicação do adesivo, o tecido da pele foi incubado a 37°C por trinta minutos. Os testes de ruptura foram realizados imediatamente depois da incubação.

TESTE DE RUPTURA

O dispositivo feito em casa foi equilibrado em tampão morno (~44°C) antes da montagem. Depois de montar rapidamente a pele incubada no dispositivo, aproximadamente 50 ml de tampão PBS a 42°C foram despejados no dispositivo sobre o tecido da pele. Um fluxo de nitrogênio foi controlado manualmente para aumentar a pressão. O procedimento total para o teste de ruptura foi o seguinte:

Etapa 1 - Aumentar a pressão para 200 mmHg e manter por dois minutos;

Etapa 2 - Aumentar a pressão para 3 00 mmHg e manter por dois minutos;

Etapa 3 - Aumentar a pressão para > 3 54 mmHg (pressão máxima measurável).

Como controles, a solução de gelatina pura foi aplicada na pele e então transformada em gel (isto é, sedimentada) à temperatura ambiente por trinta minutos mediante a formação de um gel físico. Gelatina-Morno refere- se à utilização da solução tampão a 420C que pode derreter o gel físico de gelatina.

RESULTADOS

A Figura 6 mostra medições da pressão de ruptura dos adesivos de tecido baseados na composição A. Os dados mostrados são das amostras #4 e #5 da Figura 6. Um resumo dos resultados do teste de ruptura para a composição A é fornecido na Tabela 2, enquanto que a lista completa das amostras é mostrada na Tabela 3.

Tabela 2. Resumo dos resultados do teste de ruptura para a composição A

Número total de amostras testadas <table>table see original document page 85</column></row><table>

* Um valor numérico de mensurável) foi adotado para amostras "Sem falha".

Tabela 3. Resultados do teste de ruptura das amostras da composição A.

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a A ~200 mmHg o dispositivo começou a vazar. A compressão do dispositivo aumentou a pressão, mas também pode ter distorcido a pele, tendo por resultado a falha do adesivo a 232 mmHg.

A Figura 7 mostra medições da pressão de ruptura representativas dos adesivos de tecido da composição B. Os dados mostrados são das amostras #4 e #5 da Figura 7. Os resultados para a lista completa de amostras são mostrados na Tabela 4.

Tabela 4. Resultados do teste de ruptura das amostras da composição B.

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* As pressões dessas amostras foram ajustadas inadvertidamente acima de 200 mmHg, ao passo que a pressão foi controlada manualmente e não há nenhuma válvula de liberação de pressão.

EXEMPLO 3

HEMOSTASIA EM UM MODELO DE RATO

Este exemplo apresenta uma demonstração inicial in vivo de uma composição de gelatina-mTG de acordo com a presente invenção para a obtenção de hemostasia em um animal vivo. O rato era um rato sírio fêmea adulto.

MATERIAIS

Foi utilizada uma solução de gelatina que apresentava a gelatina a 25% em peso/peso (suína, tipo A, valor de Bloom de 300, Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)) em PBS. A solução foi misturada ao misturar PBS aquecido (50°C) no pó de gelatina e foi agitada manualmente ao utilizar uma espátula. Antes da aplicação, a solução de gelatina foi armazenada em seringas de 5 ml tampadas submersas em um banho da água a 50°C para manter a sua fase líquida.

A solução de transglutaminase (mTG) apresentava a transglutaminase microbiana a 20% em peso/peso (Activa WM, Ajinomoto™) em PBS. A solução de mTG foi mantida à temperatura ambiente.

Antes da aplicação, 1 ml da solução de gelatina foi adicionado a 0,5 ml da solução de mTG em um tubo de eppendorf de 2 ml. O tubo foi virado duas a três vezes para misturar as soluções e então a solução foi aplicada ao sítio de ferida ao utilizar uma ponta de pipeta de 1 ml. Esta era a solução experimental.

Para a solução de controle, o protocolo foi repetido, mas sem a adição da solução de mTG, de tal modo que somente a gelatina foi administrada.

Para ambas as aplicações experimental e de controle, as pontas da pipeta foram cortadas a aproximadamente 1/2 cm da extremidade a fim de expandir a abertura e permitir a passagem da solução viscosa de gelatina-mTG.

FERIDA DO FÍGADO

Para ambas as aplicações experimental e de controle, o lóbulo esquerdo do fígado foi cortado utilizando um bisturi na direção rostral-caudal, criando um corte sagital de 1 cm de comprimento, 1/2 cm de profundidade. Depois de aproximadamente dez segundos de sangramento, uma gaze de algodão foi utilizada para remover o sangue acumulado imediatamente antes da aplicação das soluções de gelatina (controle) ou de gelatina-mTG (experimental).

Primeiramente, a solução experimental foi aplicada a um corte no lado esquerdo do lóbulo. Um gel foi formado aproximadamente dois minutos depois da aplicação e o sangramento foi completamente estancado em menos de aproximadamente dois minutos e meio após a aplicação. Após cinco minutos, o tecido foi agitado vigorosamente e a tensão foi aplicada no sítio de ferida utilizando um fórceps, contudo o gel permaneceu intacto e a ferida fechou. A Figura 8 é uma fotografia que mostra a formação do gel e também a indução da hemostasia (a Figura 8A mostra a área inteira, enquanto que a Figura 8B mostra uma parte da área, ampliada para detalhes adicionais).

Posterioirmente, a solução de controle foi aplicada a um corte no lado direito do lõbulo. Nenhum gel se formou e a maior parte da solução escorreu para fora do sitio de ferida devido ao fluxo sangüíneo. Mesmo após seis a sete minutos, nenhum coágulo foi formado e o fígado continuou sangrando (Figura 9A).

A solução de controle foi removida e a solução experimental foi então aplicada ao sítio de ferida sem remover o sangue acumulado. Embora o sangue acumulado tenha prejudicado visivelmente a aderência da solução experimental ao fígado, um gel ainda se formou e reduziu muito o fluxo sangüíneo após aproximadamente um minuto, detendo-o completamente após quatro minutos e meio (Figura 9B). Isto demonstrou que a composição da presente invenção pode diminuir o fluxo sangüíneo e induzir a hemostasia mesmo na presença de sangue acumulado.

CORTE DA ARTÉRIA FEMORAL

A artéria femoral esquerda do rato foi rompida ao utilizar um bisturi. Após aproximadamente dez segundos de sangramento intenso, uma gaze de algodão foi utilizada para remover o sangue acumulado imediatamente antes da aplicação da solução de gelatina-mTG (experimental). Assim que a solução foi aplicada, o sangue se misturou com o gel experimental como se estivesse se submetendo ao processo de gelificação. Sob essas condições rigorosas, o gel ainda deteve completamente o sangramento em menos de três minutos. Após cinco minutos, o gel foi testado manualmente ao utilizar o fórceps. O gel era visivelmente menos duro e menos aderente quando foi misturado em grande quantidade com o sangue, mas ainda formou um coágulo resistente sobre o sítio da artéria rompida. As Figuras 10A-D mostram fotografias da artéria enquanto estava sendo cortada (10A); a artéria cortada, sangrando profusamente (10B); a aplicação da composição da presente invenção sobre a artéria cortada (10C); e a hemostasia, com formação de um coágulo biomimético (10D).

A artéria femoral direita do rato foi então rompida ao utilizar um bisturi. Após aproximadamente dez segundos de sangramento, uma gaze do algodão foi utilizada para remover o sangue acumulado imediatamente antes da aplicação da solução de gelatina-mTG (experimental). Um sangramento intenso foi observado, mas quase imediatamente estancado pelo gel e o sangramento parou completamente em menos de um minuto. O gel aderiu muito fortemente e o sangue que ficou preso pelo gel era prontamente observável. Após cinco minutos, o gel foi testado manualmente utilizando o fórceps. Ele aderiu muito fortemente ao tecido na área da artéria, apesar da presença do sangue que ficou preso no gel formado.

Desse modo, as composições de acordo com a presente invenção claramente podem diminuir a taxa de sangramento e induzir a hemostasia em um modelo in vivo, mesmo na presença de sangue acumulado e/ou de sangramento intenso (como por exemplo, de uma artéria e/ou de um órgão vascularizado, o que inclui, mas sem ficar a eles limitado, o fígado, o estômago, os rins, o coração, o pulmão e/ou a pele, por exemplo).

EXEMPLO 4

HEMOSTASIA EM UM MODELO SUÍNO

Este exemplo fornece uma demonstração inicial in vivo de uma composição de gelatina-mTG de acordo com a presente invenção para obter a hemostasia em um modelo animal grande. O potencial para a utilidade da hemostasia em um modelo animal grande foi demonstrado claramente.

MATERIAIS

A solução de gelatina apresentava gelatina a 25% em peso/peso (suína, do tipo A, valor de Bloom de 300 de Sigma- Aldrich (St. Louis, MO)) em PBS (pH 7,4) e foi preparada tal como aqui descrito. 0 PBS foi agitado continuamente a 60cC utilizando um agitador magnético com chapa de aquecimento elétrico enquanto o pó de gelatina era gradualmente adicionado. Foi feita uma agitação manual utilizando ocasionalmente um bastão de vidro para aumentar a taxa de dissolução do pó e para obter uma solução homogênea. Durante toda a experiência, a solução de gelatina foi armazenada em um banho térmico ajustado a ~50°C para manter a sua fase líquida e para impedir a formação de um gel termoreversível.

A solução de mTG apresentava transglutaminase microbiana a 20% em peso/peso (Activa WM, Ajinomoto™) dissolvida em PBS (pH 7,4). Ela foi preparada tal como segue. A solução de PBS â temperatura ambiente (RT) foi agitada ao utilizar um agitador magnético e o pó de mTG foi gradualmente adicionado. Durante toda a experiência a solução de mTG foi mantida em um banho térmico ajustado a ~30°C, exceto quando da utilização real.

Um suíno adulto, fêmea, pesando 45 kg, recebeu anestesia geral antes do início da experiência. Durante toda a experiência o suíno foi ventilado e seus sinais vitais foram monitorados.

Antes da aplicação ao sítio de ferida tal como descrito abaixo, a solução de gelatina-mTG de acordo com a presente invenção foi preparada e um aplicador foi utilizado para colocar o vedante no sítio de ferida. Diversos aplicadores diferentes foram examinados como material de suporte da bandagem. A menos que esteja indicado de alguma outra maneira, antes de sua aplicação imediata no sítio de ferida, 6 ml da nova solução vedante cirúrgica foram espalhados sobre o aplicador e colocados para esfriar por um minuto à RT. Esse chumaço contendo vedante é considerado o "protótipo de bandagem". Para a "bandagem de controle" um protocolo similar foi seguido, mas com a solução de controle sendo espalhada sobre o aplicador.

Nova solução vedante cirúrgica - Foi preparada uma mistura 2:1 de gelatina e mTG. A menos que esteja indicado de outra maneira, a mistura foi preparada ao adicionar a solução de 2 ml de mTG à solução de 4 ml de gelatina em um tubo de 15 m, e o tubo foi virado cinco vezes para misturar as soluções.

Solução de controle - para a solução de controle o procedimento descrito para a preparação do novo vedante cirúrgico foi repetido, exceto pelo fato que somente o PBS foi utilizado em vez da solução de mTG. Portanto, a gelatina foi diluída a uma relação de 2:1 com a solução de PBS (pH 7,4), submersa em um banho térmico a ~30°C. A menos que esteja indicado de alguma outra maneira, a mistura foi preparada ao adicionar 2 ml da solução de PBS a 4 ml da solução de gelatina em um tubo de 15 ml, e o tubo foi virado cinco vezes para misturar as soluções.

Os aplicadores foram utilizados tal como segue:

1. Um chumaço de gaze de algodão de 4 cm χ 4 cm.

2. Um chumaço absorvente coberto com plástico descartável de 4 cm χ 4 cm. A solução foi espalhada no lado de plástico, não absorvente, do chumaço.

3. Um molde de silicone.

4. Um chumaço absorvente coberto com plástico descartável de 4 cm χ 4 cm colocada dentro de um molde de silicone. A solução foi espalhada no lado de plástico, não absorvente, do chumaço.

5 . Um molde de plástico flexível transparente com margens elevadas.

6. Aplicação direta do vedante no sítio de ferida ao utilizar uma seringa ou respingamento de um tubo de 15 ml.

A aplicação do novo vedante cirúrgico neste estudo foi realizada pelo cirurgião, que colocou manualmente o vedante sobre o sítio de ferida utilizando diferentes aplicadores. Quando necessário, a gaze de algodão foi utilizada para remover o sangue acumulado imediatamente antes da aplicação. Uma pressão hemostática foi aplicada no lado inverso da bandagem por três minutos. Após três minutos, o cirurgião aliviou a pressão e o sítio de ferida foi observado quanto à hemostasia. Mesmo não tendo ocorrido uma hemostasia completa, o sítio de ferida foi fechado pelas técnicas hemostáticas cirúrgicas aceitas. A aplicação da solução de controle seguiu a mesma técnica, com as técnicas hemostáticas aceitas sendo imediatamente aplicadas caso a hemostasia não fosse observada depois que a bandagem de controle tivesse sido removida.

FERIDA DO MÚSCULO GLÚTEO

0 animal foi colocado em uma posição debruçada e a pele acima dos músculos glúteos foi removida. Em geral, sete experiências foram realizadas em que a hemostasia e a aderência do tecido foram examinadas. A menos que esteja indicado de alguma outra maneira, em cada teste foram cortados quadrados de 3 cm χ 3 cm de músculo com 2 cm de profundidade no músculo, utilizando um bisturi #15. 0 excesso de sangue foi removido da área da ferida conforme necessário e a nova solução vedante cirúrgica ou a solução de controle foram aplicadas tal como descrito previamente.

As Tabelas 5 e 6 resumem e descrevem o procedimento experimental e os resultados de cada uma das experiências. A Tabela 5 refere-se à hemostasia, enquanto que a Tabela 6 refere-se às propriedades adesivas do tecido.

Examinando primeiramente a hemostasia, a solução de controle foi aplicada a um sítio de ferida utilizando um chumaço de gaze de algodão (Tabela 5, Controle # 1). A solução de controle foi aplicada na gaze de algodão e colocada para esfriar por um minuto e vinte segundos antes da sua aplicação imediata. 0 sítio de ferida só sangrou levemente e a hemostasia completa foi observada dois minutos após a aplicação da bandagem de controle. Embora nenhum coágulo biomimético tenha sido observado no sítio de ferida, a pressão hemostática aplicada ao sítio de ferida era suficiente para incentivar a hemostasia.

A experiência foi repetida em um sítio de ferida diferente, com a diferença de que o aplicador utilizado era um chumaço absorvente coberto com plástico descartável e a solução de controle foi deixada em repouso por trinta segundos antes de sua aplicação (Tabela 5, Controle # 2). O sítio de ferida apresentou um sangramento muito pequeno e dois minutos após a aplicação da bandagem de controle a hemostasia completa foi observada. Tal como no caso anterior, isso provavelmente foi devido à pressão hemostática aplicada sobre o sítio ao aplicar a bandagem. Nenhum coágulo biomimético foi observado no sítio de ferida.

Devido à pequena quantidade de sangramento observado durante a primeira das duas experiências de controle, a experiência foi repetida, com a exceção do fato que foi feito um corte mais' profundo, de 4 cm (Tabela 5, Controle # 3). Conseqüentemente, um sangramento intenso foi observado. A solução de controle foi aplicada sobre um chumaço absorvente e deixada em repouso por cinqüenta segundos. O cirurgião removeu o excesso de sangue da área da ferida e aplicou a bandagem de controle. Após três minutos o sangramento diminuiu, mas a hemostasia completa não foi observada.

A solução de controle foi removida do sítio de ferida criado na experiência anterior utilizando um chumaço de gaze de algodão. O sangramento ainda foi observado. 0 novo vedante cirúrgico foi aplicado à área da ferida para obter a hemostasia (Tabela 5, Vedante # 1). A solução vedante foi colocada sobre um chumaço absorvente, deixada em repouso por um minuto e aplicada sobre o sítio de ferida. Após três minutos, a hemostasia completa foi observada. O vedante formou um coágulo biomimético sobre o sítio de ferida. 0 gel foi agitado ao utilizar fórceps, e uma forte aderência ao tecido foi observada. 0 gel foi removido após a aplicação de alguma força e se apresentou como uma película. Desse modo, esses resultados demonstraram as propriedades hemostáticas da composição de acordo com a presente invenção.

Tabela 5 - Músculo Glúteo

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Após ter demonstrado a capacidade de hemostasia do vedante em um modelo de músculo glúteo, a aderência do tecido foi examinada (Tabela 6). As incisões cirúrgicas foram feitas para levantar um segmento de tecido do leito do músculo, ao abrir um sítio de ferida.

Na primeira experiência de aderência (Tabela 6, Vedante # 2) , o vedante foi aplicado diretamente sobre o sítio de ferida e o cirurgião aplicou uma pressão imediata forte na parte superior do tecido por três minutos, deslocando todo o vedante do sítio de ferida e resultando em nenhuma aderência.

A experiência foi repetida, com exceção do fato que em seguida à aplicação do vedante o cirurgião aplicou somente uma pressão moderada (Tabela 6, Vedante # 3). Após três minutos, apareceram os tecidos aderidos. Quando a parte superior do tecido foi agitada, uma quantidade moderada de resistência foi experimentada até a sua remoção completa.

A experiência foi repetida ao tomar o cuidado especial de não deslocar o vedante do sítio de ferida na aplicação da pressão (Tabela 6, Vedante # 4) . Em um sítio de ferida diferente, o vedante foi aplicado em ambas as partes do tecido e deixado por dez segundos. Em seguida, o lado superior do tecido foi substituído e uma pressão moderada foi aplicada. Após três minutos, a aderência forte do tecido foi observada. Uma quantidade significativa de força foi necessária para separar os tecidos aderidos.

Tabela 6 - Aderência do Tecido

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HEMQSTASIA NO FÍGADO

0 suíno foi colocado de costas e seu fígado foi exposto através de uma laparotomia mediana. Foram feitos cortes em série para remover progressivamente biópsias mais profundas do fígado, expondo conseqüentemente vasos sangüíneos maiores. No total, foram realizadas cinco biópsias. Quando necessário, uma gaze de algodão foi utilizada para remover o sangue acumulado imediatamente antes da aplicação da composição de acordo com a presente invenção.

Para a primeira série de biópsias, a bandagem de controle foi aplicada com pressão hemostática no lado inverso da bandagem por três minutos. Após três minutos, o cirurgião aliviou a pressão e o sítio de ferida foi observado quanto à hemostasia. Quando a hemostasia completa não ocorreu, uma biópsia mais profunda foi realizada, seguida pela aplicação do novo vedante cirúrgico. Outra vez, o vedante foi aplicado com pressão hemostática no lado inverso da bandagem por três minutos e a hemostasia foi examinada. Quando a hemostasia completa foi observada, uma biópsia mais profunda do fígado foi removida e a experiência foi repetida com o vedante. Isto demonstrou a potencialidade de hemostasia do vedante para pressões sangüíneas mais elevadas. A Tabela 7 resume o procedimento e os resultados experimentais de cada experiência.

Uma biópsia profunda de 4 cm foi removida do lóbulo esquerdo do fígado (Tabela 7, Controle # 1). A solução de controle foi aplicada sobre um chumaço absorvente colocado em um molde de silicone e deixado em repouso por um minuto. A bandagem de controle foi aplicada sobre o sítio de ferida com pressão hemostática. Após três minutos, a pressão foi removida e nenhuma hemostasia foi observada.

Depois que nenhuma hemostasia foi obtida com a aplicação da bandagem de controle, uma biópsia 1 cm mais profunda foi removida, deixando sangrar por trinta segundos. A experiência então foi repetida com o novo vedante (Tabela 7, Vedante # 1). O novo vedante foi colocado no chumaço em um molde de silicone e após um minuto foi aplicado ao sítio de ferida com pressão hemostática. Após três minutos, a pressão foi aliviada, a bandagem protótipo foi arrancada, e a hemostasia foi examinada. O vedante criou uma película biomimética visível. A hemostasia foi obtida, mas não estava completa, uma vez que o vedante não cobriu a ferida inteira.

Era visível que as áreas cobertas com o vedante pararam de sangrar. Quando a película biomimética foi removida após alguns minutos, o sangramento recomeçou.

Em seguida, uma biópsia 1 cm mais profunda foi removida, resultando em um sangramento intenso. A experiência foi repetida, com exceção do fato que um molde de silicone foi utilizado como aplicador e o excesso de sangue foi removido antes da aplicação (Tabela 7, Vedante # 2). 0 cirurgião então aplicou pressão ao sítio de ferida por três minutos. Quando o cirurgião removeu a sua mão, um coágulo biomimético era visível sobre o sítio de ferida. A pressão do sangue empurrando o coágulo biomimético era aparente e após mais alguns minutos o sangue irrompeu da borda do vedante biomimético. A ruptura ocorreu em uma parte lateral do sítio de ferida que não foi coberta pelo vedante. Isto indicou que, neste estágio, a capacidade hemostática do vedante depende da cobertura completa do sitio de ferida.

Para evitar rompimento, a experiência anterior foi repetida; com a exceção do fato que uma quantidade maior de vedante foi aplicada sobre o sítio de ferida (Tabela 7, Vedante # 3) . Uma biópsia 0,5 cm mais profunda foi removida do lóbulo do fígado. 9 ml de vedante foram aplicados sobre o sítio de ferida com pressão. Infelizmente, durante a aplicação, quase todo o vedante escorreu para fora das laterais do sítio de ferida, não sobrando nenhum vedante perceptível no sítio de ferida depois que a pressão foi aplicada pelo cirurgião.

A experiência foi repetida (Tabela 7, Vedante # 4). Uma outra biópsia de 1 cm foi removida e um sangramento intenso foi observado. Desta vez, 15 ml do vedante foram aplicados sobre o sítio de ferida ao utilizar um molde de plástico transparente com margens elevadas para manter o . vedante no lugar. 0 vedante foi colocado no aplicador e deixado para esfriar por um minuto e vinte segundos. 0 vedante foi aplicado sobre o sítio de ferida e quatro minutos mais tarde uma grossa camada de coágulo biomimético foi observada e a hemostasia completa foi obtida. Cinqüenta minutos depois, o tecido foi reexaminado e a hemostasia ainda era observada. Isto indicou a forte capacidade hemostática do vedante quando vedante suficiente é aplicado a um sítio de ferida e mantido no lugar. A película biomimética formada era difícil de remover porque foi aderiu fortemente à superfície do tecido e a remoção da película resultou em um pouco de sangramento.

Tabela 7 - Hemostasia no lóbulo esquerdo do fígado Tempo

RT Batimento Técnica de Experiencia (°C) cardiaco Aplicao Descrição de Resultados Hemosta <table>table see original document page 100</column></row><table> <table>table see original document page 101</column></row><table>

HEMOSTASIA NA ARTÉRIA FEMORAL

Em seguida, foi examinada a capacidade da composição da presente invenção de induzir a hemostasia nas feridas ou trauma em uma artéria, especificamente a artéria femoral. A artéria femoral direita animal foi exposta. Em seguida, um corte longitudinal circular de 2 mm foi feito utilizando uma lâmina cirúrgica. Um sangramento intenso foi observado e, portanto, um hemostato foi utilizado. 0 excesso de sangue foi removido utilizando um chumaço de gaze de algodão imediatamente antes da aplicação do vedante. Aproximadamente 9 ml do novo vedante cirúrgico foram preparados e aplicados utilizando uma seringa sobre a área da ferida. Após quatro minutos, o hemostato foi removido delicadamente e a hemostasia através do vedante foi examinada. Um coágulo biomimético foi observado e a hemostasia completa foi obtida. A Tabela 9 resume o procedimento experimental e os resultados dessa experiência.

Tabela 9 - Hemostasia na artéria femoral

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EXEMPLO 5

EFEITO DQ PROTOCOLO DE HIDROCLORETO DE GUANIDINA NO PROCESSO DE GELIFICAÇÃO E DE RETICULAÇÃO

Este exemplo refere-se ao efeito de um desnaturante exemplificador, o hidrocloreto de guanidina (aqui descrito como "GuCl"), em composições de acordo com algumas realizações da presente invenção. Uma faixa preferida da relação de concentração é fornecida a seguir: de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:2 de GuHCl: gelatina, peso por peso.

PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO

1) 10 g de GuCl (Fluka, St. Louis, MO) foram dissolvidos em 3 0 ml de PBS da Dulbecco (Biological Industries, Israel) à temperatura ambiente (RT). 10 g de pó de gelatina suína do tipo A, valor de Bloom de 300 (Sigma, St. Louis, MO) foram pesados separadamente. A gelatina e a solução de GuCl foram então misturadas sob agitação moderada para formar uma solução homogênea. A solução resultante tinha uma relação 1:1 de gelatina:GuCl (pesorpeso).

O peso molecular (MW) do GuCl é 95,53. Nesta solução, a concentração final de GuCl era desse modo 3,489 M.

A solução final era de 20% em peso/peso de gelatina, mas de acordo com o volume, equivalente à solução de 25% em peso/peso de gelatina em PBS.

2) 2 g de GuCl foram dissolvidos em 30 ml de PBS à RT. 10 g de pó de gelatina suína do tipo A, valor de Bloom de 300, foram pesados separadamente. A gelatina e a solução de GuCl foram então misturadas sob agitação moderada para formar uma solução homogênea. A solução resultante tinha a relação 5:1 de gelatina:GuCl (peso:peso). A concentração final de GuCl era 698 mM. A solução final era de 23,8% de gelatina em peso/peso, mas de acordo com o volume, equivalente à solução de 25% em peso/peso de gelatina em PBS.

3) 6 g de GuCl foram dissolvidos em 30 ml de PBS à RT. 10 g de pó de gelatina suína do tipo A, valor de Bloom de 300, foram pesados separadamente. A gelatina e a solução de GuCl foram então misturadas sob agitação moderada para formar uma solução homogênea. A solução resultante tinha a relação 5:3 de gelatina:GuCl (peso:peso). A concentração final de GuCl era 2,09 Μ. A solução final era de 21,7% em peso/peso de gelatina, mas de acordo com o volume, equivalente à solução de 25% em peso/peso de gelatina em PBS.

4) 4 g de GuCl foram dissolvidos em 30 ml de PBS à RT. 10 g de pó de gelatina suína do tipo A, valor de Bloom de 300, foram pesados separadamente. A gelatina e a solução de GuCl foram então misturadas sob agitação moderada para formar uma solução homogênea. A solução resultante tinha a relação de 5:2 de gelatina:GuCl (peso:peso). A concentração final de GuCl era 1,40 Μ. A solução final era de 22,7% de gelatina em peso/peso, mas de acordo com o volume, equivalente à solução de 25% em peso/peso de gelatina em PBS.

5) 8 g de GuCl foram dissolvidos em 30 ml de PBS à RT! 10 g de pó de gelatina suína do tipo A, valor de Bloom de 300, foram pesados separadamente. A gelatina e a solução de GuCl foram então misturadas sob agitação moderada para formar uma solução homogênea. A solução resultante tinha a relação de 5:1 de gelatina:GuCl (peso:peso). A concentração final de GuCl era 2,79 Μ. A solução final era de 20,8% de gelatina em peso/peso, mas de acordo com o volume, equivalente à solução de 25% em peso/peso de gelatina em PBS. ADIÇÃO DA MTG

Uma solução de 20% em peso/peso de 1% de pó de transglutaminase microbiana (mTG) (Ajinomoto Activa TI-WM, Japão) em PBS foi preparada.

A) 2 ml de cada solução de gelatina-GuCl foram misturados com 1 ml da solução de mTG em tubos de plástico transparente de 4 mL. A solução de mTG foi injetada na solução de gelatina-GuCl. Cada tubo foi virado diversas vezes e então deixado em repouso. B) 2 ml de cada solução de gelatina-GuCl foram misturados com 1 ml da solução de mTG em pratos de pesagem de plástico. As misturas foram misturadas manualmente com uma ponta da pipeta.

C) As soluções de gelatina-GuCl foram aquecidas até 43 0C e então alíquotas de 2 ml das soluções de gelatina- GuCl foram misturadas com 1 ml da solução de mTG em pratos de pesagem de plástico. As misturas foram misturadas manualmente com uma ponta da pipeta.

D) As soluções 1 de gelatina-GuCl (10 g de GuCl) e 5 (8 g de GuCl) foram aquecidas até 43°C e então alíquotas de 2 ml das soluções de gelatina-GuCl foram misturadas com 2 ml da solução de mTG em pratos de pesagem de plástico. As misturas foram misturadas manualmente com uma ponta da pipeta. RESULTADOS

1) A solução 1:1 de gelatina:GuCl formou uma solução homogênea à RT em dois minutos. Imediatamente depois da formação, a solução continha muitas bolhas. Após duas horas de repouso à RT, quase todas as bolhas de ar tinham saído da solução. A solução permaneceu na forma líquida e apresentou um aspecto claro com um matiz amarelo, como soluções de gelatina padrão. Após 24 horas, as propriedades da solução permaneciam inalteradas e nenhuma bolha era visível.

2) 5:1 de gelatina: GuCl não formou uma solução homogênea à RT. Os grânulos de gelatina ficaram intumescidos, mas não se dissolveram, como ocorreria normalmente com gelatina em PBS à RT. A solução foi aquecida até 420C até formar uma solução. Ao esfriar até a RT, formou um gel a aproximadamente 32°C.

3) 5:3 de gelatina:GuCl formou uma solução homogênea à RT depois de cinco a seis minutos de agitação vigorosa. Imediatamente depois da formação, a solução continha muitas bolhas. Após duas horas à RT, quase todas as bolhas de ar tinham saído da solução. A solução permaneceu na forma líquida e apresentou um aspecto claro com um matiz amarelo, como as soluções de gelatina padrão. A solução estava na forma líquida, mas mais viscosa do que a solução de 1:1 de gelatina: GuCl. No entanto, poderia ainda ser pipetada sem dificuldade. Após 24 horas, as propriedades da solução permaneciam inalteradas e nenhuma bolha era visível.

4) 5:2 de gelatina: GuCl formou uma solução ligeiramente granulosa à RT após dez minutos de agitação vigorosa. Imediatamente depois da formação, a solução continha muitas, muitas bolhas. Imediatamente depois da formação, a solução parecia ser muito viscosa, mas ainda na forma líquida. No entanto, após duas horas à RT, muitas bolhas de ar ainda eram visíveis na solução e a solução era gelatinosa. A solução não podia facilmente ser pipetada e era muito viscosa para se misturar com outras soluções. Após 24 horas, muitas bolhas de ar permaneciam na solução e a solução tinha formado um gel termoreversível.

5) 5:4 de gelatina: GuCl formou uma solução homogênea à RT após dois a três minutos de agitação. Imediatamente depois da formação, a solução continha muitas bolhas. Após duas horas à RT, quase todas as bolhas de ar tinham saído da solução. A solução permaneceu na forma líquida e apresentou um aspecto claro com um matiz amarelo, como as soluções de gelatina padrão. A solução estava na forma líquida, mais viscosa do que a solução de 1:1 de gelatina: GuCl, mas menos do que a solução de 5:3 de gelatina:GuCl, e podia ser pipetada sem dificuldade. Após 24 horas, as propriedades da solução permaneciam inalteradas e nenhuma bolha era visível.

RESULTADOS DA MTG

A) 2 ml da solução de gelatina-GuCl, 1 ml da solução de mTG à RT em um tubo de 4 ml.

1) Para a solução de 1:1 de gelatina: GuCl, um aglomerado pequeno gelatinoso foi formado perto da parte superior do tubo após quatro minutos. 0 aglomerado foi removido e mais 1 ml da solução de mTG foi adicionado. Após 35 minutos, um gel meio mole foi formado. 0 aglomerado não era termoreversível, tal como confirmado pelo aquecimento com microondas. No entanto, ele também não era fortemente coesivo como deveria ser um gel reticulado. 0 gel meio mole foi confirmou ser termicamente irreversível ao utilizar o aquecimento com microondas.

2) A solução de 5:1 de gelatina: GuCl era demasiadamente viscosa para se misturar com a mTG.

3) Para a solução 5:3 de gelatina: GuCl, um aglomerado pequeno gelatinoso foi formado perto da parte superior do tubo após quatro minutos. Ele não foi removido. Após vinte minutos, um gel médio foi formado por toda a solução. O aglomerado era de uma consistência um pouco diferente do restante do gel. Tal como acima, embora não fosse termoreversível, tal como confirmado pelo aquecimento com microondas, ele também não era muito coesivo e quebrava facilmente quando apalpado. 0 gel médio formado tornou-se ligeiramente mais mole no aquecimento com microondas, mas era termicamente irreversível.

4) Os resultados para a solução 5:2 de gelatina: GuCl eram muito irregulares, uma vez que a solução tornou-se muito viscosa durante os primeiros poucos minutos após a adição da mTG em conseqüência do processo de gelificação termoreversível (indicado pela solução de controle, onde a mTG não tinha sido adicionada) . Após quinze minutos, um gel moderadamente firme foi formado, mas era parcialmente termoreversível e tornou-se muito mole no aquecimento.

5) Para a solução 5:4 de gelatina: GuCl, um aglomerado pequeno gelatinoso foi formado perto da parte superior do tubo após quatro minutos. Ele não foi removido. Após trinta minutos, um gel médio foi formado por toda a solução. O aglomerado tinha uma consistência distintamente diferente do restante do gel. Tal como acima, embora não fosse termoreversível, tal como confirmado pelo aquecimento de microondas, ele também não era muito coesivo e quebrava facilmente quando apalpado. O gel médio formado tornou-se ligeiramente mais mole no aquecimento com microondas, mas era termicamente irreversível.

B) 2 ml da solução de gelatina-GuCl, 1 ml da solução de mTG à RT em um prato de plástico.

Os resultados do tempo do processo de gelificação para as soluções misturadas em um prato de plástico eram quase idênticos àqueles encontrados nas soluções misturadas em um tubo plástico de 4 ml: 1:1 de gelatina: GuCl formou um gel meio mole após 35 minutos, 5:3 de gelatina: GuCl formou um gel médio após vinte minutos, 5:4 de gelatina:GuCl formou um gel médio após trinta minutos.

No entanto, os aglomerados gelatinosos observados quando a mTG foi injetada nas soluções de gelatina-GuCl não foram observados nestas experiências.

C) 2 ml da solução de gelatina-GuCl a 43°C, 1 ml da solução de mTG em um prato de plástico - os resultados foram os seguintes: para a solução 1:1 de gelatina: GuCl, nenhum gel foi formado após 35 minutos; para a solução 5:3 de gelatina:GuCl, um gel médio foi formado após dezessete minutos; para a solução 5:4 de gelatina:GuCl, um gel médio foi formado após 25 minutos.

D) 2 ml da solução de gelatina-GuCl a 43°C, 2 ml da solução de mTG em um prato de plástico - os resultados foram os seguintes: para a solução 1:1 de gelatina: GuCl, nenhum gel foi formado após 25 minutos; para a solução 5:4 de gelatina:GuCl, um gel médio foi formado após nove minutos.

Dos resultados acima, foi verificado que o GuCl melhora significativamente a solubilidade de gelatina em PBS. Para concentrações de 25% em peso/peso de gelatina em PBSr a adição de GuCl a relações de 5:4 e 1:1 de gelatina: GuCl permite que a gelatina se dissolva em PBS à RT quase imediatamente. Este efeito é diminuído significativamente a uma relação de 5:3 de gelatina: GuCl. Para concentrações de 25% em peso/peso de gelatina em PBS, a adição de GuCL em relações de 5:3, 5:4 e 1:1 de gelatina:GuCl pode manter a solução de gelatina-GuCl na forma líquida indefinidamente. A uma relação de 5:2 de gelatina: GuCl, a solução é submetida a um processo de gelificação termoreversível retardada e forma um gel completo após duas horas. A uma relação de 2:1, a solução de gelatina-GuCl: solução de mTG, nenhum gel foi formado se a relação da solução de gelatina:GuCl fosse de 1:1. A concentrações mais baixas de GuCl, foram formados géis reticulados. O tempo do processo de gelificação parece ser dependente da concentração de GuCl.

O aquecimento da solução de gelatina-GuCl até 43°C antes da mistura com mTG acelera o processo de reticulação quando a relação de gelatina:GuCl é de 5:4 e 5:3. Isto era esperado, uma vez que a atividade da mTG aumenta com aumentos na temperatura de reação até 55°C. É provável que se a atividade da mTG for aumentada, as soluções de gelatina:GuCl serão reticuladas mais rapidamente pela mTG.

A uma relação de 1:1, a solução de gelatina-GuCl- solução:mTG, géis reticulados foram formados até mesmo guando a relação da solução de gelatina:GuCl era de 1:1. O aumento da quantidade de mTG diminuiu muito o tempo do processo de gelificação dos géis que não formaram géis a uma relação da solução de gelatina:GuCl:solução:mTG de 2:1. Foi observado que o tempo do processo de gelificação era dependente da concentração de GuCl. Isto era esperado, uma vez que o GuCl provavelmente desnatura em uma determinada quantidade de mTG. A mTG que é adicionada acima dessa quantidade é livre para reticular com a gelatina.

Sem desejar ficar limitado por uma única hipótese, é possível que, se mais enzima de mTG for adicionada, as soluções de gelatina:GuCl serão reticuladas muito mais rapidamente pela mTG. Isto pode ser realizado, por exemplo, ao remover opcionalmente o transportador do pó de mTG e formar uma solução concentrada da própria enzima.

EXEMPLO 6

PROTOCOLO: ADIÇÃO DE MGCL2 À GELATINA - EFEITO NO PROCESSO DE GELEIFICAÇÃO E NA RETICULAÇÃO

Este Exemplo refere-se ao efeito de um agente de redução exemplificador, o cloreto de magnésio, em composições de acordo com algumas realizações da presente invenção. Uma faixa de concentração preferida para a dissolução de gelatina na solução de Cloreto de magnésio-PBS é preferivelmente de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 M, e mais preferivelmente de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 3, 5M.

MATERIAIS E MÉTODOS

MATERIAIS Gelatina suína do Tipo A com valor de Bloom de 3 00 e MgC12 em pó, malha -325 foi obtida junto à Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO). A transglutaminase microbiana Activata TI-WM (mTG) foi fornecida pela Ajinomoto (Japão) .

PBS da Dulbecco (pH 7,4) foi obtido junto à Biological Industries (Kibbutz Beit HaEmek, Israel).

PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO DE MTG:

A mistura de transglutaminase microbiana Fresh Activa TI-WM (Ajinomoto, Japão) (mTG) foi preparada pela dissolução em PBS da Dulbeceo para formar uma solução a 20% em peso/peso. A solução foi mantida à temperatura ambiente (RT) durante o curso da experiência.

Preparação da solução de gelatina-MgCl2:

A gelatina foi dissolvida em concentrações diferentes de soluções de MgCl2 tal como segue.

Solução A - 5 g de MgCl2 foram dissolvidos em 15 ml de PBS da Dulbecco até uma concentração final de 3,5 Μ. A reação de dissolução de MgCl2 é exotérmica, atingindo 90°C. A solução foi colocada para esfriaraté a RT. Uma alíquota de gelatina de 25% (peso/peso) foi preparada pela dissolução de 5 g de gelatina em 15 g da solução de MgCl2 3,5 M e sob agitação à RT.

Solução B - 2,5 g de MgCl2 foram dissolvidos em 15 ml de PBS da Dulbecco até uma concentração final de 1,75 Μ. A reação de dissolução de MgCl2 é exotérmica, atingindo 63°C. A solução foi colocada para esfriaraté a RT. Uma alíquota de gelatina de 25% (peso/peso) foi preparada pela dissolução de 5g de gelatina em 15 g da solução de MgCl2 a 63 °C, 1,75 M, e sob agitação.

EFEITO DO MGCL2 NO PROCESSO DE GELEIFICAÇÃO DA GELATINA:

A gelatina dissolvida em soluções de MgCl2 em concentrações diferentes foi colocada para esfriar até a RT. Um termômetro foi utilizado para acompanhar a temperatura de cada solução. A aparência e a viscosidade das soluções de gelatina-MgCl2 foram avaliadas à medida que a temperatura diminuiu pela observação e palpação da solução com um bastonete de vidro.

EFEITO DO MGCL2 NA RETICULAÇÃO QUÍMICA DAS SOLUÇÕES DE GELATINA UTILIZANDO A MTG:

A "Solução A" de gelatina-MgCl2 foi testada quanto à reticulação química utilizando a mTG. 1 ou 2 ml da solução de mTG a 20% em peso/peso foram misturados com 2 ml da solução de gelatina-MgCl2 em um tubo technicon de 4 ml. A solução de gelatina-MgCl2 foi adicionada à RT ou pré-aquecida a 50°C utilizando um banho de água. As soluções foram misturadas delicadamente ao agitar com a ponta da pipeta e ao inverter o tubo quatro vezes, e o tempo do processo de geleificação foi medido. A aparência e a viscosidade das soluções de gelatina-MgCl2 após a mistura com mTG foi avaliada pela observação e palpação da solução com um bastonete de vidro. Quando o gel foi formado, ele foi testado quanto à termorreversibilidade ao aquecer o gel a 50°C utilizando um banho de água.

RESULTADOS

EFEITO DO MGCL2 NO PROCESSO DE GELEIFICAÇÃO DA GELATINA:

Solução A - uma solução 3,5 M de MgCl2 reduziu o ponto de transição da gelatina. A solução de gelatina-MgCl2 era viscosa à RT. A solução pareceu opaca e consistia em pequenas partículas pretas. Estas partículas são provavelmente partículas de magnésio que oxidaram. Solução B - uma solução 1,75 M de gelatina-MgCl2 foi geleificada à RT. O ponto de transição era de 29°C. O gel era opaco e consistia em poucas partículas pretas que se formaram provavelmente pela oxidação do magnésio. EFEITO DO MGCL2 NA RETICULAÇÃO QUÍMICA DAS SOLUÇÕES DE GELATINA UTILIZANDO A MTG:

O efeito de MgCl2 na reticulação foi testado com a solução A, tal como segue. 2 ml da solução A à RT misturada com 1 ml da solução de mTG-gel irreversível foram produzidos após noventa minutos. O gel era muito viscoso e um pouco mole. 2 ml da solução A aquecida a 50°C misturada com 1 ml da solução de mTG-gel irreversível foram produzidos após setenta minutos. 2 ml da solução A aquecida a 50°C misturada com 2 ml da solução de mTG-gel irreversível foram produzidos após 25 minutos. O gel era um pouco fraco. A viscosidade do gel aumentou após o aquecimento em um banho de água a 50°C.

A partir do que foi visto acima, parece que a adição de cloreto de magnésio às soluções de gelatina diminui significativamente o ponto de transição da gelatina. Parece que o ponto de transição é inversamente proporcional à concentração do cloreto de magnésio. O ponto de transição é reduzido abaixo da RT pela adição de 3,5 M de cloreto de magnésio. A 1,75 M de cloreto de magnésio, o ponto de transição das soluções de gelatina fica ligeiramente acima da RT. A adição de cloreto de magnésio à gelatina deve ser otimizada para encontrar a concentração mínima que reduz o ponto de transição da gelatina abaixo da RT.

Também foi mostrado que a reticulação da gelatina utilizando a mTG na presença do cloreto de magnésio é possível. O cloreto de magnésio tem um efeito prejudicial na relação de reticulação da gelatina. A adição de quantidades adicionais de mTG pode, opcionalmente, ser executada para superar este efeito.

A atividade da mTG a 500C é bem maior do que a atividade da mTG à RT. Isto confirma os dados teóricos e indica a utilidade da adição de um elemento exotérmico na mistura de gelatina mTG para assegurar uma temperatura de reação que seja mais elevada do que a RT.

A dissolução exotérmica do cloreto de magnésio pode, opcionalmente, ser utilizada para a liquefação da gelatina e o aumento da atividade de mTG, a partir dos dados acima.

EXEMPLO 7

PROTOCOLO: ADIÇÃO DE HIDROQUINONA Á ELATINA - EFEITO NO PROCESSO DE GELEIFICAÇÃO E NA RETICULAÇÃO

Este Exemplo refere-se ao efeito de um agente redutor exemplificador, a hidroquinona, em composições de acordo com algumas realizações da presente invenção. A hidroquinona é um agente redutor natural e solúvel em água. Os agentes redutores podem aumentar a solubilidade da gelatina, permitindo que ela permaneça líquida à temperatura ambiente (RT) . Uma faixa de concentração preferida é preferivelmente determinada para a dissolução de gelatina na solução de hidroquinona-PBS à concentração de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,5 M e mais pref erivelmente de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 0,4 M.

MATERIAIS E MÉTODOS

MATERIAIS

Gelatina suína do Tipo A com valor de Bloom de 300 e hidroquinona (ReagentPlusTM, ≥99%) foi obtida junto à Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO). A transglutaminase microbiana Activata TI-WM (mTG) foi fornecida pela Ajinomoto (Japão). PBS da Dulbecco (pH 7,4) foi obtido junto à Biological Industries (Kibbutz Beit HaEmek, Israel).

PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO DE MTG:

A mistura de transglutaminase microbiana Fresh Activa TI-WM (Ajinomoto, Japão) (mTG) foi preparada pela dissolução em PBS da Dulbecco para formar uma solução a 20% em peso/peso. A solução foi mantida à temperatura ambiente (RT) durante o curso da experiência. PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO DE GELATINA-HIDROQUINONA:

A gelatina foi dissolvida em concentrações diferentes de soluções de hidroquinona tal como segue. Solução A - 2,7 5 g da solução de hidroquinona foram dissolvidos em PBS da Dulbecco até uma concentração final de 0,5 M. Durante toda a experiência, a solução foi mantida em um béquer vedado, envolvido em folha de alumínio, para evitar a sua exposição ao ar e à luz. Uma alíquota de gelatina de 25% (peso/peso) em 0,5 M da solução de hidroquinona foi preparada ao misturar 5 g de gelatina com 15 g de 0,5 M da solução de hidroquinona e agitada.

Solução B - 1,32 g de hidroquinona foram dissolvidos em PBS da Dulbecco até uma concentração final de 0,4 M. Durante toda a experiência, a solução foi mantida em um béquer vedado, envolvido na folha de alumínio, para evitar a sua exposição ao ar e à luz. Uma alíquota de gelatina de 25% (peso/peso) em 0,4 M da solução de hidroquinona foi preparada ao misturar 5 g de gelatina com 15 g de 0,4 M da solução de hidroquinona. A mistura foi então agitada e aquecida em um banho de água a 50°C.

EFEITO DA HIDROQUINONA NO PROCESSO DE GELEIFICAÇÃO DA GELATINA:

As soluções de gelatina dissolvidas em concentrações diferentes de hidroquinona foram mantidas à RT ou aquecidas em um banho de água a 50°C e então esfriadas até a RT. Um termômetro foi utilizado para acompanhar a temperatura de cada solução. A aparência e a viscosidade das soluções de gelatina-hidroquinona foram avaliadas à medida que a temperatura diminuía, pela observação e palpação da solução com um bastonete de vidro.

EFEITO DA HIDROQUINONA NA RETICULAÇÃO QUÍMICA DAS SOLUÇÕES DE GELATINA UTILIZANDO A MTG:

A "Solução B" de gelatina-hidroquinona foi testada quanto à reticulação química utilizando a mTG. 1 ml da solução de mTG a 2 0% em peso/peso foi misturado com 2 ml da solução de gelatina-hidroquinona, aquecidos até 50°C, em um tubo technicon de 4 ml. As soluções foram misturadas delicadamente ao agitar com a ponta da pipeta e ao inverter o tubo quatro vezes, e o tempo do processo de geleificação foi medido. A aparência e a viscosidade da solução de gelatina- hidroquinona após a mistura com mTG foi avaliada pela observação e palpação da solução com um bastonete de vidro. Quando o gel foi formado, ele foi testado quanto à termorreversibilidade ao aquecer o gel a 500C utilizando um banho de água.

RESULTADOS

EFEITO DA HIDROQUINONA NO PROCESSO DE GELEIFICAÇÃO DA GELATINA

Solução A- 0,5 M da solução de hidroquinona à RT não dissolveu a gelatina.

A gelatina em pó foi encharcada na solução de hidroquinona, criando uma solução colorida, heterogênea granulosa, marrom. Solução B - 0,4 M da solução de hidroquinona conseguiu reduzir o ponto de transição da gelatina. A solução de hidroquinona não dissolveu a gelatina à RT. Após ter aquecido a mistura no banho de água a 50°C, a gelatina foi dissolvida e uma solução homogênea foi obtida. A solução foi esfriada até a RT. A 28°C, a gelatina permaneceu solúvel, mas era muito viscosa. 0 gel foi formado quando do esfriamento até a RT. 0 gel era marrom colorido.

O efeito na reticulação foi testado com a solução B. 2 ml da solução B aquecidos a 50cC foram misturados com 1 ml da solução de mTG. Após quatro minutos, um gel irreversível foi formado. O gel era forte, assemelhando-se ao gel reticulado que é formado por uma mistura de 25% (peso/peso) de gelatina sozinha a 20% (peso/peso) de mTG.

A partir do que foi visto acima, parece que a adição de hidroquinona às soluções de gelatina diminui o ponto de transição da gelatina. Em 0,4 M de hidroquinona, o ponto de transição das soluções de gelatina fica ligeiramente acima da RT (28°C).

Em contraste com outras substâncias que foram testadas como métodos para reduzir o ponto de transição da gelatina, a hidroquinona não teve um efeito inibidor significativo na reticulação da gelatina com mTG.

A hidroquinona pode, opcionalmente, ser utilizada para reduzir a temperatura de transição da solução coloidal- gel de gelatina sem impactar negativamente a reticulação da mTG da gelatina, tal como demonstrado pelos dados acima. Isto é muito desejável para muitas realizações da presente invenção, tal como descrito previamente.

EXEMPLO 8

PROTOCOLO: ADIÇÃO DE CACL2 Á GELATINA- EFEITO NO PROCESSO DE GELEIFICAÇÃO E NA RETICULAÇÃO

Este Exemplo refere-se ao efeito de um dessecativo exemplificador, o cloreto de cálcio, em composições de acordo com algumas realizações da presente invenção. Uma faixa de concentração preferida no que diz respeito à dissolução de gelatina na solução de Cloreto de cálcio-PBS fica preferive lmente em uma faixa de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 M, para diminuir o ponto de transição da gelatina. Para criar uma reação exotérmica que poderia ajudar a dissolver a gelatina ou a aumentar a atividade da mTG, aproximadamente 0,2 - 0,7 g de cloreto de cálcio por ml de solução são, opcional e preferivelmente, adicionados para cada aumento em graus Celsius à temperatura acima da temperatura ambiente, embora a quantidade exata dependa de diversos fatores.

Uma solução de cloreto de cálcio-gelatina em DPBS foi preparada tal como segue: a solução de partida de CaCl2 4M foi preparada ao dissolver 44,396 g de CaCl2 (97%, MW = 110,99, Alfa Aesar, Lancaster) em 100 ml de PBS da Dulbecco (Biological Industries, Israel) sob agitação. Após a dissolução, a solução atingiu uma temperatura de pico de 80°C em conseqüência da reação exotérmica da dissolução de CaCl2.

A solução 1 foi preparada tal como segue. 5 g de pó de gelatina suína do tipo A com valor de Bloom de 300 (Sigma, St. Louis, MO) foram pesados. 25% em peso/peso das soluções de gelatina em PBS-CaCl2 foram formados pela adição de 15 g de soluções com diferentes concentrações de PBS-CaCl2 aos 5 g de gelatina. A gelatina-CaCl2 foi misturada utilizando uma barra de agitação bem como agitação manual ocasional para dispersar pelotas. As concentrações de CaCl2 testadas eram:

a. 2 M da solução de CaCl2 em PBS.

b. 2 M da solução de CaCl2 em PBS.

c. 1 M da solução de CaCl2 em PBS.

Para a e b, 2 ml da solução de gelatina-CaCl2 foram misturados com 1 ml da solução em pó de 20% em peso/peso de transglutaminase microbiana (mTG) , cada uma em um tubo de plástico de 4 ml. 0 produto da mTG utilizado (Activa TI-WM, Ajinomoto, Japão) tinha uma atividade específica de aproximadamente 100 U/g do pó do produto da mTG.

A solução 2 foi preparada tal como segue. Uma solução base de 2 0% em peso/peso da mTG foi formada ao dissolver 10 g de pó de mTG em 40 ml de PBS.

a. Uma solução de gelatina a 25% em peso/peso foi preparada ao dissolver 5 g de gelatina em 15 ml de PBS ao aquecer a mistura de gelatina-PBS em microondas por cinco segundos e em seguida por quinze segundos. A solução foi agitada imediatamente após cada período de aquecimento com microondas. A temperatura após o segundo aquecimento era de 72°C. 3,325 g de CaCl2 foram então adicionados para formar 2 M da solução de CaCl2. A temperatura após a adição de CaCl2 era de 74°C. Imediatamente depois que o CaCl2 foi dissolvido e a temperatura foi medida, 2 ml da solução de gelatina-CaCl2 foram misturados com 1 ml da solução em pó de 20% em peso/peso de transglutaminase microbiana (mTG) em um tubo de plástico de 4 ml.

b. 5 g de pó de gelatina foram misturados com 3,33 g de pó de CaCl2. 30 ml de PBS foram então agitados nesta mistura para formar uma solução. A temperatura da solução quando da dissolução atingiu 42°C. Depois que a solução homogênea foi formada, 2 ml da solução de gelatina- CaCl2 foram misturados com 1 ml da solução em pó de 20% em peso/peso de transglutaminase microbiana (mTG) em um tubo de plástico de 4 ml.

A solução 3 foi preparada tal como segue. Uma solução de gelatina a 25% em 2M de CaCl2-PBS (la, acima) foi colocada em repouso por duas horas. Em seguida, 2 ml da solução de gelatina-CaCl2 foram misturados com 2 ml da solução de mTG a 20% em peso/peso em um tubo de plástico de 4 ml.

A solução 4 foi preparada tal como segue. Após um repouso por duas horas, uma solução de gelatina a 25% em 2M de CaCl2-PBS (lb, acima) foi aquecida até 43°C. Em seguida, 2 ml da solução de gelatina-CaCl2 foram misturados com: a. 1 ml da solução de mTG a 20% em peso/peso; ou b. 2 ml da solução de mTG a 2 0% em peso/peso; cada um em um tubo de plástico de 4 ml.

RESULTADOS

As soluções foram formadas em todas as concentrações de CaCl2. Utilizando uma solução de 2 M de CaCl2 (la), uma solução homogênea foi formada e permaneceu na forma líquida. A solução era moderadamente viscosa e continha muitas bolhas de ar. Antes da mistura com a solução de mTG, a solução de CaCl2-gelatina foi colocada em repouso por trinta minutos para permitir que as bolhas se dispersassem.

A segunda solução 2M (Ib) era idêntica à primeira, exceto pelo fato que ela requeria mais agitação manual para dispersar uma pelota de gelatina que tinha sido formada.

Utilizando uma solução de 1 M de CaCl2 (Ic) , uma solução homogênea foi formada, mas começou a geleificar após alguns minutos. Após duas horas, um gel termorreversível completo tinha sido formado. No entanto, este gel era muito mais mole do que o gel termorreversível formado normalmente pela gelatina à temperatura ambiente. A solução era muito viscosa para ser misturada com a solução de mTG após meia hora.

Após a adição da solução de mTG às soluções de 2 M de gelatina-CaCl2, as soluções tornaram-se progressivamente mais viscosas durante um período de vinte minutos, mas não formaram um gel coesivo.

O aquecimento das soluções de gelatina-CaCl2 aumentou o efeito geleificante da mTG.

A solução aquecida com microondas tornou-se progressivamente mais viscosa. Após vinte minutos, (tal como confirmado pelo aquecimento a 50°C) um gel muito mole e irreversível tinha sido formado. A solução aquecida de CaCl2 tornou-se progressivamente mais viscosa. Após vinte minutos, (como confirmado pelo aquecimento a 50°C) um gel muito mole e irreversível tinha sido formado.

Para a solução de gelatina-CaCl2 (2M) misturada com 2 ml da solução de mTG a 20% em peso/peso, um gel mole foi formado após dez minutos. Após vinte minutos, um gel com resistência média foi formado. Após 3 5 minutos, um gel com resistência firme-média foi formado. Para a solução de gelatina-CaCl2 (2M) aquecida até 43 °C, após ser misturada com 1 ml da solução de mTG a 20% em peso/peso, um gel mole foi formado após dez minutos e um gel com resistência macia-média foi formado após vinte minutos.

No entanto, após ser misturado com 2 ml da solução de mTG a 20% em peso/peso, um gel com resistência média foi formado após dez minutos e um gel com resistência firme-média foi formado após vinte minutos.

EXEMPLO 9

PROTOCOLO: SECAGEM DA GELATINA EM MICROONDAS - EFEITO NO PROCESSO DE GELEIFICAÇÃO E NA RETICULAÇÃO

Este Exemplo examina o efeito da secagem da gelatina com microondas na solubilidade. Uma solubilidade aumentada foi observada. Uma faixa opcional mas preferida de energia de radiação de microondas apresenta, preferivelmente, uma taxa de absorção específica total (SAR) de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mW/centímetro cúbico, e mais preferivelmente de aproximadamente 3 0 a aproximadamente 6 0 mW/centímetro cúbico. 0 método foi executado tal como segue.

PREPARAÇÃO E SECAGEM DA GELATINA

Porções de 10 g de pó de gelatina suína do tipo A com valor de Bloom de 300 (Sigma, St. Louis, MO) foram colocadas em béqueres de 50 ml ou de 250 ml. A gelatina foi então aquecida com microondas a 700 Wea 2.450 MHz (modelo Kennedy KN-949, China) para as seguintes quantidades de tempo:

Amostra A: 3 0 segundos, béquer de 50 ml

Amostra B: 60 segundos, béquer de 250 ml

Amostra C: 120 segundos, béquer de 250 ml

Amostra D: 180 segundos, béquer de 250 ml

Controle: A gelatina que não foi submetida ao aquecimento com microondas Após o aquecimento, 3 0 ml de PBS da Dulbecco (Biological Industries, Israel) a 37°C foram adicionados à gelatina e a mistura foi agitada a 37°C. Para a amostra A, o PBS foi adicionado imediatamente depois que a gelatina foi removida das microondas. Para o restante das amostras, a gelatina foi colocada para esfriar até a temperatura ambiente (RT) antes da adição de PBS.

Para a amostra C, depois que a gelatina foi misturada com o PBS, parte da mistura foi separada, aquecida até 50 °C e misturada então com uma transglutaminase microbiana (mTG) a 20% em peso/peso (Activa TI-WM da Ajinomoto, Japão) da solução de acordo com uma relação de 2:1 entre a solução de gelatina e a solução de mTG.

AQUECIMENTO EM MICROONDAS DA MISTURA DE GELATINA/ PBS

Na amostra F, a gelatina não foi aquecida na forma de pó. Em vez disso, a gelatina foi despejada diretamente em 30 ml de PBS à RT em um béquer de 50 ml e a mistura foi então aquecida com microondas por quinze segundos duas vezes consecutivamente, com uma pausa de cinco segundos entre os períodos de aquecimento. Após o aquecimento, ela foi agitada manualmente. A solução de gelatina foi então misturada com uma solução de mTG a 20% em peso/peso de acordo com uma relação de 2:1 entre a solução de gelatina e a solução de mTG.

AQUECIMENTO DA mTG

A solução de mTG a 20% em peso/peso foi aquecida com microondas por quinze segundos duas vezes consecutivamente, com uma pausa de cinco segundos entre os períodos de aquecimento. A mTG foi então adicionada à solução de gelatina a 25% em peso/peso em uma relação de 1:2 entre a solução de gelatina e a mTG.

RESULTADOS Amostra A: A gelatina foi dissolvida facilmente em PBS, formando uma solução viscosa. Quando do esfriamento até a RT, a solução de gelatina formou um gel termorreversível firme comparável ao gel termorreversível formado pelas soluções de gelatina padrão à RT.

Controle: A gelatina não se dissolveu completamente em PBS. Embora completamente encharcada em PBS, a gelatina permaneceu muito granulosa.

Amostra Β: A gelatina não se dissolveu completamente em PBS. Embora completamente encharcada em PBS, a gelatina permaneceu muito granulosa.

Amostra C: A gelatina não se dissolveu completamente em PBS. Embora completamente encharcada em PBS, a gelatina permaneceu muito granulosa. A mistura granulosa de gelatina-PBS foi então aquecida com microondas por trinta segundos. A temperatura quando da remoção das microondas era de 76°C. A mistura foi então agitada manualmente para formar uma solução homogênea. A solução foi colocada para esfriar até a RT e formou um gel termorreversível comparável ao gel termorreversível formado pelas soluções de gelatina padrão à RT. Quando a solução foi aquecida a 500C e misturada com a mTG, um gel firme e pegajoso foi formado após três minutos. Este gel foi aquecido por dez segundos em microondas para confirmar a sua irreversibilidade. Quando da saída do microondas, o gel era mais pegajoso, mas mais forte. Ele parecia estar ligeiramente seco.

Amostra D: Durante o aquecimento, a gelatina formou uma bolha carbonizada. A bolha foi formada dentro do pó de gelatina pela gelatina queimada. Um forte cheiro de queimado acompanhou esta ocorrência.

Mistura Aquecida de Gelatina/PBS: Uma solução líquida foi formada pelo aquecimento da mistura de gelatina/PBS com microondas. A adição de mTG à solução resultou em um gel irreversível firme.

MTG aquecida: A mTG que tinha sido aquecido com microondas não reticulou a gelatina.

A partir do que foi visto acima, parece que o aquecimento do pó de gelatina em microondas reduz o teor de umidade da gelatina, tal como indicado por reduções significativas no peso da gelatina (dados não mostrados). O aquecimento pó de gelatina com microondas, seguido pela adição imediata de PBS a 37°C reduz o tempo de dissolução da gelatina. No entanto, se o pó de gelatina for esfriado até a RT, então não ocorre nenhuma melhoria no tempo de dissolução da gelatina.

Se a gelatina aquecida com microondas for aquecida com microondas depois de ter sido misturada com o PBS, então a solução formada pode ser reticulada pela mTG. É possível dissolver a gelatina em PBS à RT e então aquecer a mesma com microondas mediante aquecimento por quinze segundos e então outra vez por quinze segundos. A dissolução dessa maneira não afeta negativamente a reticulação da mTG.

A gelatina seca irá queimar se for aquecida com microondas por mais de dois minutos. O aquecimento da mTG com microondas reduz drasticamente a sua atividade.

EXEMPLO 10

EFEITO DA URÉIA NO PROCESSO DE GELE IFI CAÇÃO E NA RETICULAÇÃO DA GELATINA

Este Exemplo refere-se ao efeito da uréia como parte de uma composição exemplificadora de acordo com a presente invenção. Foi verificado que a uréia abaixa o ponto de transição das soluções de gelatina. Os dados abaixo confirmam que ela abaixa suficientemente o ponto de transição até mesmo de uma solução de gelatina com concentração elevada abaixo da temperatura ambiente de modo que a solução ainda esteja na forma líquida à temperatura ambiente. Foi verificado que a transglutaminase é capaz de reticular a gelatina até mesmo na presença da uréia.

PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO DE GELATINA:

A gelatina suína do tipo A com valor de Bloom de 300 (Sigma, St. Louis, MO) foi utilizada. As soluções de gelatina de 25% e de 15% em peso/peso foram preparadas ao dissolver 50 g e 30 g de gelatina em 150 ml e em 170 ml de PBS da Dulbecco (Biological Industries, Israel) , respectivamente, sob agitação em uma placa quente a 50°C. A gelatina foi adicionada ao PBS gradualmente e agitada manualmente utilizando um bastonete de vidro. As soluções de gelatina foram mantidas em um banho de água a 500C durante o curso da experiência.

PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO DE TRANSGLUTAMINASE:

A mistura de transglutaminase microbiana (mTG) Activa TI-MW (Ajinomoto, Japão) foi dissolvida em PBS da Dulbecco para formar uma solução a 20% em peso/peso. A solução foi mantida à temperatura ambiente (RT) durante o curso da experiência.

PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO DE GELATINA-URÉIA:

Alíquotas de 40 g das soluções de gelatina de 25% ou de 15% em peso/peso foram transferidas a béqueres de 100 ml e agitadas em uréia a 50°C. A uréia (98%, Alfa Lancaster, Reino Unido) foi adicionada a estes béqueres em relações diferentes, tal como detalhado abaixo na tabela:

<table>table see original document page 124</column></row><table>

Após a adição da uréia, a solução de gelatina-uréia foi agitada a 50°C por cinco minutos para assegurar a homogeneidade, e foi então transferida a um banho de água a 37 °C.

EFEITO DA URÉIA NO PROCESSO DE GELEIFICAÇÃO TERMORREVERSÍVEL DA GELATINA:

Cada solução de gelatina-uréia foi removida, por sua vez, do banho de água a 370C e colocada para esfriar até a RT. Um termômetro foi utilizado para acompanhar a diminuição da temperatura de cada solução. A aparência e a viscosidade da solução de gelatina-uréia foram avaliadas à medida que a temperatura diminuía, pela observação e palpação da solução com um bastonete de vidro. Os resultados desta experiência são descritos na seguinte tabela:

% de gelatina Relação (peso/peso) gelatina:ur Resultados éia

Solução 1 1:0 A 25°C, a gelatina formou um gel termorreversivel firme. A 25°C, a solução permaneceu na forma líquida. Embora ligeiramente Solução 2 1:1 viscosa, ela podia ser facilmente pipetada.

A 25°C, a gelatina formou um gel Solução 3 1:0 termorreversivel firme. A temperaturas >26°C, a solução permaneceu significativamente mais Solução 4 1:0,5 líquida do que a gelatina sozinha. No entanto, à RT (23-25°C), a solução formou um gel. A 25°C, a solução permaneceu na forma líquida. Após refrigeração a Solução 5 1:1 4ºC e retorno a 25°C, a solução retornou à forma líquida. A 25°C, a solução permaneceu na Solução 6 1:1,5 forma líquida. Após a refrigeração a 40C e retorno a 25°C, a solução retornou à forma líquida.

RETICULAÇÃO DA SOLUÇÃO DE GELATINA-URÉIA UTILIZANDO A MTG :

As soluções de gelatina-uréia foram reticuladas utilizando a mTG. 1 ou 2 ml da solução de mTG a 20% em peso/peso foram misturados manualmente com 2 ml da solução de gelatina-uréia em um prato plástico. A solução de gelatina- uréia foi tanto adicionada à RT ou pré-aquecida até 0°C. Em alguns testes, ela foi aquecida até 500C para facilitar a comparação com a gelatina sozinha, que precisa ser aquecida para ser misturada com a mTG. As soluções foram misturadas delicadamente ao agitar com a ponta da pipeta e foi colocada para reticular por vários minutos. Tal como no exame da formação do gel termorreversível, a aparência e a viscosidade da solução de gelatina-uréia após a mistura com mTG foram avaliadas pela observação e palpação da solução com um bastonete de vidro. Os resultados são resumidos na seguinte tabela:

<table>table see original document page 126</column></row><table> Os estudos acima mostram que a adição de uréia às soluções de gelatina diminui o ponto de transição da gelatina significativamente. Para soluções de gelatina a 15% e a 25% em peso/peso, o ponto de transição é reduzido abaixo da RT pela adição de uréia em relações entre uréia e gelatina de 1:1 e mais. Nas relações entre uréia e gelatina 0,5:1,0, o ponto de transição das soluções de gelatina estão ligeiramente acima da RT. É provável que uma relação entre a uréia:gelatina entre 0,5:1 e 1:1 seja suficiente para abaixar o ponto de transição da gelatina abaixo da RT.

Também foi mostrado que a reticulação da gelatina utilizando a mTG na presença de uréia é possível. No entanto, a uréia tem um efeito prejudicial na atividade da mTG. Parece que este efeito é relativo à concentração da uréia, de uma maneira tal que a atividade da mTG na presença da uréia seja inversamente proporcional à concentração de uréia.

A atividade da transglutaminase a 50°C era bem maior do que a atividade da mTG à RTi conforme esperado. A adição da uréia à gelatina pode ser otimizada para encontrar a concentração mínima que reduz o ponto de transição da gelatina abaixo da RT. Se uma quantidade suficiente de mTG for adicionada, deve ser capaz de superar o efeito prejudicial da uréia.

EXEMPLO 11

EFEITO DO PH NO PONTO DE TRANSIÇÃO DA GELATINA

Este Exemplo demonstra o efeito da alteração do pH das soluções de gelatina no ponto de transição dessas soluções de gelatina.

PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO

58,82 g de citrato de sódio diidratado a 99% (Alfa Aesar, Lancaster, Reino Unido) foram dissolvidos em 100 ml de água destilada duas vezes para criar uma solução de partida de citrato de sódio 2 M. Uma solução base da solução de gelatina a 25% em peso/peso em PBS da Dulbecco (Biological Industries7 Israel) foi preparada utilizando a gelatina suína do tipo A com valor de Bloom de 300 (Sigma, St. Louis, MO). A solução de gelatina foi continuamente agitada e mantida a 50°C. 19,21 g de ácido cítrico anidro (Frutarom, Israel) foram dissolvidos em 50 ml de água destilada duas vezes para criar uma solução de partida de ácido cítrico 2 M.

MEDIÇÕES DO PH

O pH da solução foi medido utilizando um medidor de pH (Eutech pH510, Cingapura) com um eletrodo de vidro. O medidor de pH foi calibrado antes da experiência utilizando soluções de calibração com valores de pH de 4,01, 7 e 10,01. A exatidão da medição do pH foi determinada periodicamente durante o curso da experiência. O pH da solução de citrato de sódio 2 M era de 8,54. O pH da solução de ácido cítrico 2 M era de 1,4.

ADIÇÃO DE CITRATO DE SÓDIO

Uma alíquota de 20 ml da solução de gelatina a 25% em peso/peso foi separada em um béquer de 100 ml, o qual foi mantido a 5 00C com agitação moderada. O pH inicial da solução de gelatina foi medido com sendo igual a 4,89. Quantidades diferentes da solução de citrato de sódio 2 M foram adicionadas às soluções de gelatina de 20 ml para a formação das seguintes soluções:

Solução 1: pH de 5,87 - 2 ml da solução de citrato de sódio

Solução 2: pH de 6,55 - 4 ml da solução de citrato de sódio

Solução 3: pH de 6,7 - 6 ml da solução de citrato de sódio Cada solução foi então colocada para esfriar até a RT. ADIÇÃO DE ÁCIDO CÍTRICO

Uma alíquota de 100 ml da solução de gelatina a 25% em peso/peso foi separada em um béquer de 250 ml, o qual foi mantido a 500C com agitação moderada. 0 pH inicial da solução de gelatina foi medido como sendo igual a 5,19.

Quantidades diferentes da solução de ácido cítrico 2 M foram adicionadas às soluções de gelatina para a formação das seguintes soluções:

Solução 1: pH de 3,99

Solução 2: pH de 3,54

Solução 3: pH de 2,72

Solução 4: pH de 2,3 5

Solução 5: pH de 2,17

Solução 6: pH de 2,04

Solução 7: pH de 1,7

Cada solução foi então colocada para esfriar até a RT.

RESULTADOS DQ CITRATO DE SÓDIO

Enquanto o citrato de sódio era adicionado, a adição formou uma pelota turva branca na solução de gelatina. A agitação vigorosa dispersou a pelota, primeiramente em pelotas menores e em seguida em uma solução homogênea. A solução homogênea que foi formada era turva e opaca.

A um valor de pH de 5,87, uma alíquota da solução de gelatina que foi colocada para esfriar formou um gel termorreversível aproximadamente na mesma quantidade de tempo que a gelatina sozinha formou um gel termorreversível.

A um valor de pH de 6,55, uma alíquota da solução de gelatina que foi colocada para esfriar formou um gel termorreversível muito rapidamente, dentro de um minuto. Isto era muito mais rápido do que a gelatina sozinha.

A um valor de pH de 6,70, uma alíquota formou um gel termorreversível quase instantaneamente. Depois que a solução de citrato de gelatina-sódio foi deixada a 500C por diversos minutos, a solução inteira formou um gel. O ponto de transição tinha aumentado até um ponto acima de 50°C.

Em todos os valores de pH, foi demonstrado que os géis são termorreversiveis à medida que todos voltaram à forma líquida após a imersão em água a 60°C.

RESULTADOS DO ÁCIDO CÍTRICO

Uma clara diferença no ponto de transição não foi observada em valores de pH acima de 3,54. No valor de pH de 3,54, a solução de gelatina permaneceu líquida de 500C até aproximadamente 32°C, em cujo ponto foi formado um gel muito pegaj oso.

A um valor de pH de 2,72, o ponto de transição era de aproximadamente 310C e o gel formado era poroso, granuloso, com muitas bolhas de ar.

A um valor de pH de 2,04, o ponto de transição caiu a 29°C. 0 gel formado era mais poroso do que o gel formado a um valor de pH de 2,72.

A um valor de pH de 1,7, o ponto de transição caiu a 27-28°C. O gel formado era completamente poroso.

Em todos os valores de pH, foi demonstrado que os géis são termorreversiveis à medida que todos voltaram à forma líquida após a imersão em água a 50°C.

No entanto, depois que os géis foram deixados na água a 500°C por trinta minutos, foi formado um gel que não retornou à forma líquida. Isto pode ter indicado que o ácido cítrico resultou na reticulação da gelatina após trinta minutos a 50°C.

O que foi visto acima mostra que a diminuição do pH de uma solução de gelatina através da adição de ácido cítrico pode diminuir significativamente o ponto de transição do gel. A adição de ácido cítrico, que diminui o pH da solução de gelatina a valores abaixo de 2, não resulta na reticulação da gelatina. Outras adições de ácido cítricô para abaixar o pH abaixo de 2 podem resultar na reticulação da gelatina após trinta minutos a 50°C.

EXEMPLO 12

EFEITO DOS ALCOÓIS POLIÍDRICOS NO PROCESSO DE GELEIFICAÇÃO E NA RETICULAÇÃO DA GELATINA

Este Exemplo refere-se ao efeito dos alcoóis poliídricos tais como o sorbitol na reticulação da gelatina.

MATERIAIS E MÉTODOS

MATERIAIS

A gelatina suína do Tipo A com valor de Bloom de 300 e D-sorbitol a 97% foram obtidos junto à Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO). O glicerol a 99% foi adquirido junto à Frutarom (Israel). A transglutaminase microbiana Activa TI-WM (mTG) foi fornecida pela Ajinomoto (Japão). 0 PBS da Dulbecco (pH 7,4) foi obtido junto à Biological Industries (Kibbutz Beit HaEmek, Israel).

PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO DE MTG:

A mistura de transglutaminase microbiana Fresh Activa TI-WM (Ajinomoto, Japão) (mTG) foi preparada pela dissolução em PBS da Dulbecco para formar uma solução a 2 0% em peso/peso. A solução foi mantida à temperatura ambiente (RT) durante o curso da experiência.

PREPARAÇÃO DAS SOLUÇÕES DE GELATINA-ÁLCOOL POLIÍDRICO:

Solução A - 10 g de glicerol foram dissolvidos em 30 ml de PBS. 10 g de gelatina foram então encharcados na solução de glicerol por uma hora e meia à RT. Após uma hora e meia de encharcamento, 10 ml de PBS foram adicionados e a mistura foi aquecida até 50°C. A mistura foi agitada manualmente até ser formada uma solução homogênea, líquida (relação entre o glicerol e a gelatina de 1:1) .

Solução B - 27,5 ml da solução de gelatina a 20% em peso/peso foram aquecidos até 500C com agitação. 11 g de glicerol foram adicionados à solução de gelatina (relação entre o glicerol e a gelatina de 2:1) . A solução de glicerol- gelatina foi então colocada para esfriar. A solução 2:1 de glicerol e gelatina foi colocada para encharcar por uma hora e meia a 50°C. A solução foi então removida e colocada para esfriar até a RT.

Solução C - uma solução de gelatina a 2 0% contendo glicerol em uma relação entre o glicerol e a gelatina de 2:1 foi aquecida até 500C com agitação. 11 g de sorbitol foram adicionados para formar uma solução homogênea (relação entre glicerol:sorbitol:gelatina de 2:2:1).

Solução D - 12 g de sorbitol foram adicionados a 20 ml da solução de gelatina a 20% em peso/peso até 500C para a formação de uma solução homogênea com uma relação entre sorbitol:gelatina de 3:1. A solução foi então colocada para esfriar.

Solução E - Uma solução de glicerol: gelatina de 5:1 foi preparada pela adição de 25 g de glicerol ã RT a 20 ml da solução de gelatina a 20% em peso/peso a 50°C. A mistura foi misturada sob agitação a 50°C.

Solução F - 2 0 g de sorbitol foram adicionados a 20 ml da solução de gelatina a 20%, resultando em uma relação entre sorbitol:gelatina de 5:1. A mistura foi misturada a 50 °C. A mistura foi então resfriada à RT.

EFEITO DO ÁLCOOL POLIÍDRICO NO PROCESSO DE GELEIFICAÇÃQ DA GELATINA:

Conforme preparado com respeito à descrição acima, 2 ml das soluções de gelatina com alcoóis poliídricos (vide as soluções A-F acima) foram removidos e colocados para esfriar até a RT. Um termômetro foi utilizado para determinar a temperatura de cada solução. A aparência e a viscosidade das soluções de gelatina-álcool poliídrico foram avaliadas à medida que a temperatura diminuía, pela observação e palpação da solução com um bastonete de vidro.

EFEITO DOS ALCOÕIS POLIÍDRICOS NA RETICULAÇÃO DAS SOLUÇÕES DE GELATINA UTILIZANDO A MTG:

As soluções de gelatina-álcool poliídrico foram testadas quanto à reticulação química utilizando a mTG. 1 ml da solução de mTG a 20% em peso/peso foi misturado com 2 ml das soluções de gelatina-álcool poliídrico em um prato de plástico pequeno. As soluções de gelatina-álcool poliídrico foram adicionadas à RT ou pré-aquecidas até 50°C utilizando um banho de água. As soluções foram misturadas manualmente delicadamente ao agitar com a ponta da pipeta, e o tempo para o processo de geleificação foi medido. A aparência e a viscosidade das soluções de gelatina-álcool poliídrico após a mistura com mTG foram avaliadas pela observação e palpação da solução com um bastonete de vidro. Quando o gel foi formado, ele foi testado quanto à termorreversibilidade ao aquecer o gel até 50°C utilizando um banho de água.

RESULTADOS

EFEITO DO ÁLCOOL POLIÍDRICO NO PROCESSO DE GELEIFICAÇÃO DA GELATINA:

Solução A - Após o encharcamento em glicerol, as partículas de gelatina se empelotaram para formar um material muito frágil, sólido e granuloso. A presença de glicerol não pareceu retardar absolutamente o processo de geleificação termorreversível da gelatina. Um gel termorreversível foi formado em dois a três minutos, tal como ocorre com soluções de gelatina a 20% em peso/peso sem glicerol. A 35°C, a solução de gelatina-glicerol era muito viscosa, a ponto de se geleificar. Tal como com o esfriamento até a temperatura ambiente, a transição da fase de gelatina-glicerol era quase idêntica àquela da gelatina sozinha.

Solução B - Tal como com a solução de glicerol:gelatina de 1:1, o glicerol, a uma relação entre o glicerol e a gelatina de 2:1, não abaixou a temperatura de transição da gelatina. A solução era elevadamente viscosa a 350C e formava um gel coesivo a 33-34°C. 0 encharcamento da solução de glicerol: gelatina de 2:1 por uma hora e meia não teve nenhum efeito no ponto de transição da gelatina. Um gel termorreversível começou a se formar a 34°C.

Solução C-A 50°C, a solução de gelatina-glicerol- sorbitol era mais viscosa do que a solução de gelatina- glicerol sozinha e era bem mais opaca. Quando esta mistura foi esfriada, um gel foi formado a 35°C. 0 ponto de transição não foi absolutamente abaixado em conseqüência do sorbitol e do glicerol.

Solução D-A solução de gelatina-sorbitol começou a geleificar a 40°C, indicando que concentrações elevadas de sorbitol realmente aumentam o ponto de transição da gelatina. À RT, o gel termorreversível formado era bem mais elástico do que o gel de gelatina sozinho.

Solução E - Até mesmo em concentrações muito elevadas de relação entre glicerol:gelatina de 5:1, a temperatura de transição da gelatina não foi reduzida. Um gel termorreversível foi formado tal como seria formado com a gelatina sozinha.

Solução F - Um gel termorreversível foi formado a 40°C. Muito pouca diferença foi observada entre as propriedades do sorbitol e das soluções de gelatina de 3:1 e 5:1. Ambas as soluções aumentaram ligeiramente o ponto de transição da gelatina, mas resultaram em géis termorreversíveis extremamente pegajosos e elásticos.

EFEITO DOS ALCOÓIS POLIÍDRICOS NA RETICULAÇÃO DAS SOLUÇÕES DE GELATINA UTILIZANDO A MTG:

Solução A-A solução de gelatina-glicerol se transformou em um gel duro pela mTG em três minutos. 0 gel formado após três minutos era mais coesivo do que os géis formados pela gelatina e pela mTG sem o glicerol no mesmo período de tempo. 0 gel foi reaquecido até 50°C utilizando um banho de água e permaneceu sólido, confirmando que a reticulação da mTG era o mecanismo do processo de geleificação.

Solução B - Após três minutos, um gel irreversível foi formado. O gel foi reaquecido até 50 °C utilizando um banho de água e permaneceu sólido, confirmando que a reticulação da mTG era o mecanismo do processo de geleificação. Conforme observado na relação entre o glicerol:solução de gelatina de 1:1, a presença do glicerol resultou em um gel mais firme após três minutos. Na relação entre o glicerol: solução de gelatina de 2:1, também foi observado que o gel formado era significativamente mais frágil do que os géis formados com a gelatina sozinha e também visivelmente mais frágil do que os géis formados a partir do glicerol:solução de gelatina com uma relação de 1:1.

Solução C - Após três minutos, um gel sólido pegajoso e muito elástico foi formado. Este gel não era, de modo nenhum, frágil, e não foi facilmente separado. Isto foi considerado um resultado muito significativo uma vez que o gel de gelatina reticulado somente com glicerol era muito frágil. O sorbitol aumentou extremamente a elasticidade de um material que era antes frágil. O gel foi reaquecido até 50°C utilizando um banho de água e permaneceu sólido, confirmando que a reticulação da mTG era o mecanismo do processo de geleificação.

Solução E-Os resultados foram muito similares aos resultados com o glicerol a uma relação entre glicerol:gelatina de 2:1 - a presença do glicerol resultou na formação de um gel muito mais frágil do que os géis que são formados pela gelatina sozinha. No entanto, após três minutos na presença da mTG, o gel que foi formado era mais sólido do que o gel que é formado pela gelatina sozinha com mTG após três minutos.

Solução F - Após três minutos, um gel sólido, ainda que extremamente elástico e pegajoso, foi formado pela reticulação da mTG da solução de gelatina-sorbitol. O sorbitol pareceu não ter nenhum efeito na reticulação da mTG de gelatina exceto por aumentar extremamente a elasticidade e a viscosidade dos géis de gelatina reticulados pela mTG.

A partir do que foi visto acima, foi verificado que a adição de glicerol à gelatina parece não reduzir o ponto de transição da gelatina. 0 encharcamento da gelatina em glicerol parece não alterar significativamente sua propensão a formar géis termorreversiveis. A presença de glicerol parece resultar em géis mais duros depois que a solução de gelatina foi misturada com a mTG por três minutos. Isto pode indicar uma aceleração da reticulação da mTG de gelatina quando a gelatina está na presença de glicerol.

A presença de concentrações elevadas de glicerol durante a reticulação da mTG de gelatina parece tornar os géis reticulados resultantes mais frágeis do que os géis formados pela reticulação da gelatina sozinha. 0 glicerol parece acelerar a reticulação da mTG da gelatina.

A adição de sorbitol conjuntamente com o glicerol não reduz o ponto de transição da gelatina. No entanto, o sorbitol aumenta extremamente a elasticidade e a viscosidade dos géis de gelatina. O sorbitol pode ser utilizado para aumentar a elasticidade dos géis de gelatina que se tornam mais frágeis pela adição de outras substâncias. O sorbitol parece não inibir a reticulação da mTG da gelatina. Embora o sorbitol pareça aumentar ligeiramente o ponto de transição da gelatina, ele aumenta extremamente a elasticidade e a viscosidade dos géis de gelatina.

O aumento da relação entre o glicerol:gelatina de 5:1 torna os géis de gelatina reticulados mais frágeis do que aqueles produzidos utilizando uma solução de glicerol:gelatina de 2:1, mas não tem nenhum efeito adicional no ponto de transição da gelatina. O ligeiro efeito de aceleração da reticulação ainda ocorre nesta relação entre glicerol: gelatina mais elevada, mas não é mais pronunciada do que este efeito nas relações entre glicerol:gelatina de 1:1 e de 2:1.

A solução com uma relação entre sorbitol:gelatina de 5:1 aumenta o ponto de transição da gelatina, mas não mais do que é aumentado pela solução com uma relação entre sorbitol:gelatina de 3:1.

No entanto, o gel de gelatina reticulado formado com a solução de 5:1 era ainda mais elástico e pegajoso. Isto sugere adicionalmente que a quantidade de sorbitol pode ser alterada para variar a elasticidade de um gel de gelatina reticulado.

EXEMPLO 13

efeito da secagem por aspersão no processo de geleificação e na reticulação da gelatina

Este Exemplo refere-se ao efeito da secagem por aspersão na reticulação da gelatina. Uma faixa preferida para o tamanho da partícula formado utilizando a secagem por aspersão é preferivelmente tal como segue: de aproximadamente 20 a aproximadamente 140 μm, e mais pref erivelmente de aproximadamente 60 a aproximadamente 100 μm (diâmetro).

Várias estratégias para a formação da partícula podem ser opcionalmente consideradas. Uma estratégia potencial é a formação de uma partícula de gelatina e de mTG facilmente reconstituível separadamente, utilizando técnicas de secagem especializadas para esta finalidade ou ao incluir aditivos e então ao secar a gelatina e a mTG com os aditivos às partículas. Outra estratégia potencial é a formação de partículas facilmente reconstituíveis que incorporem a gelatina e a mTG juntas.

Estas partículas podem ser formadas apenas utilizando técnicas de secagem especializadas ou incluindo aditivos que melhorem a capacidade de reconstituição destas partículas. Além disso, estas partículas podem ser criadas quando a gelatina e a mTG não são submetidas a nenhuma reticulação ou depois que são submetidas à reticulação parcial.

MATERIAIS E MÉTODOS

MATERIAIS

A gelatina suína do tipo A com valor de Bloom de 300 foi obtida junto à Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO) . A transglutaminase microbiana Activa TI-WM (mTG) foi fornecida pela Ajinomoto (Japão). 0 PBS da Dulbecco (pH 7,4) foi obtido junto à Biological Industries (Kibbutz Beit HaEmek, Israel) . A uréia, a 98%, foi obtida junto à Alfa Aesar (Lancaster, Reino Unido).

PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO DE MTG:

A solução de transglutaminase microbiana a 20% (peso/peso) (mTG) foi preparada pela dissolução de 4 g de mTG com 16 g de PBS da Dulbecco. A solução foi mantida à temperatura ambiente (RT) durante o curso da experiência.

A solução de transglutaminase microbiana a 4% (peso/peso) (mTG) foi preparada pela dissolução de 2,04 g de mTG com 50 g de PBS da Dulbecco. A solução foi mantida à temperatura ambiente (RT) durante o curso da experiência.

PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO DE GELATINA: A solução de gelatina a 5% (peso/peso) foi preparada pela dissolução de 10,52 g de pó de gelatina em 200 g de PBS da Dulbecco. A mistura foi aquecida até 50°C e agitada até que uma solução homogênea foi formada. A solução 1 apresentou 50 ml de uma solução de gelatina a 5%.

Solução 2 - uma solução de gelatina-manitol 1:1 (peso/peso) foi preparada pela adição de 2,63 g de manitol a 50 ml de uma solução de gelatina a 5%. A solução foi agitada e mantida no banho de água a 50 °C. Durante toda a experiência, a solução foi mantida no prato de água a ~50°C para impedir o processo de geleificação termorreversível.

Solução 3 - uma solução de gelatina-trealose de 1:1 (peso/peso) - foi preparada pela dissolução de 2,63 g de trealose em 50 ml de uma solução de gelatina a 5%, por meio de agitação e aquecimento a 50°C. Durante toda a experiência, a solução foi mantida a 50°C.

Solução 4 - uma solução de gelatina-uréia de 1:1 (peso/peso) foi preparada pela dissolução de 2,63 g de uréia em 50 ml de uma solução de gelatina a 5%, por meio de agitação e aquecimento a 50°C. Durante toda a experiência, a solução foi mantida a 50°C.

Solução 5 - 40 g de uma solução de gelatina a 5% foram misturados com 20 g da solução de mTG a 4%. Durante toda a experiência, a solução foi mantida a 50°C.

SECAGEM POR ASPERSÃO DAS SOLUÇÕES DE GELATINA

Para a preparação de partículas de gelatina secadas por aspersão, soluções diferentes de gelatina a 5% em PBS da Dulbecco foram preparadas (soluções 1-5) . As soluções de gelatina foram secadas por aspersão utilizando um secador por microaspersão BÜCHI. 0 tipo de fluxo é concorrente com a mistura de ar e líquido na cabeça do bocal. A taxa do aspirador e a temperatura de entrada foram mantidas constantes a 100% e a 100°C, respectivamente. A taxa de alimentação líquida foi variada de acordo com as condições do processo, afetando a temperatura de saída tal como indicado abaixo. Solução 1 - 50 ml de uma solução de gelatina a 5% (peso/peso) foram mantidos aquecidos e foram secados por aspersão a uma taxa de alimentação de 15%, com uma temperatura de saída de 57°C.

Solução 2 - 50 ml de uma solução de gelatina- manitol de 1:1 (peso/peso) foram mantidos solúveis em um banho de água a 50°C. A taxa de alimentação de líquido era de 15%, com uma temperatura de saída de 62°C.

Solução 3 - 50 ml de uma solução de gelatina- trealose de 1:1 (peso/peso) foram mantidos solúveis em um banho de água a 50°C. A taxa de alimentação de líquido era de 15%, com uma temperatura de saída de 54°C.

Solução 4-50 ml de uma solução de gelatina-uréia de 1:1 (peso/peso) foram mantidos solúveis em um banho de

água a 50°C. A taxa de alimentação de líquido foi ajustada a 15%, com uma temperatura de saída de 57°C. Durante toda a experiência, a taxa de alimentação líquida foi alterada para 20%, com uma temperatura de saída de 54°C, para permitir a formação de pó.

Solução 5 - 40 ml da solução de gelatina a 5% misturada com a solução de mTG a 4% foram secados por aspersão a uma taxa de alimentação de líquido de 20% e a uma temperatura de saída de 56°C. Durante toda a experiência, a solução foi mantida em um prato de água a 37°C.

EFEITO DA SECAGEM POR ASPERSÃO NO PROCESSO DE GELEIFICAÇÃO DAS SOLUÇÕES DE GELATINA:

Os pós de gelatina secados por aspersão foram dissolvidos em frascos de 4 ml utilizando PBS da Dulbecco, e foram misturados ao inverter o tubo quatro vezes. As soluções precipitantes foram aquecidas no banho de água a 50°C e foram misturadas manualmente, até a dissolução. As soluções foram então colocadas para esfriar até a RT e a aparência e a viscosidade de cada solução foram avaliadas à medida que a temperatura diminuía, pela observação e palpação da solução com um bastonete de vidro.

Solução 1 - 0,33 g de uma solução de gelatina secada por aspersão a 5% foi dissolvido em 1 ml de PBS da Dulbecco à RT, a um final de 25% (peso/peso) de gelatina. A seguir, mais 1 ml de PBS da Dulbecco foi adicionado, reduzindo o teor de gelatina para 12,5% (peso/peso).

Solução 2 - 0,33 g de uma solução de gelatina- manitol secada por aspersão de 1:1 foi dissolvido em 1 ml de PBS da Dulbecco à RT.

Solução 3 - 0,33 g de uma solução de gelatina- trealose secada por aspersão de 1:1 foi dissolvido em 1 ml de PBS da Dulbecco à RT.

Solução 4 - a secagem por aspersão da gelatina- uréia não produziu pó.

Solução 5 - 0,25 g de uma solução de gelatina-mTG secada por aspersão foi dissolvido em 0,75 ml de PBS da Dulbecco a 37°C.

EFEITO DA SECAGEM POR ASPERSÃO NA RETICULAÇÃO QUÍMICA DAS SOLUÇÕES DE GELATINA UTILIZANDO A MTG:

Pós de gelatina secados por aspersão foram dissolvidos tal como descrito na seção precedente e mantidos no banho de água a 50°C. 20% da solução de mTG à RT foram adicionados em uma relação entre a gelatina e a mTG de 2:1 e misturados delicadamente utilizando uma ponta da pipeta e ao inverter o tubo quatro vezes. 0 tempo para o processo de geleificação foi medido e a aparência e a viscosidade das soluções após a mistura com a mTG foram avaliadas pela observação e palpação da solução com um bastonete de vidro. Quando o gel foi formado, ele foi testado quanto à termorreversibilidade ao aquecer o gel a 500C utilizando um banho de água.

RESULTADOS SECAGEM POR ASPERSÃO DAS SOLUÇÕES DE GELATINA A secagem por aspersão das soluções de gelatina resultou em um pó branco fino em quantidades diferentes. Solução 1 - -50 ml de uma solução de gelatina a 5% forneceram 0,78 g. Solução 2 - -40 ml de uma solução de gelatina a 5% misturados com manitol na relação de 1:1 (peso/peso) resultaram em 0,73 g. Solução 3 - -50 ml de uma solução de gelatina a 5% misturados com trealose a uma relação de 1:1 (peso/peso) resultaram em 1,135 g. Solução 4 - nenhum pó foi produzido. A experiência foi terminada, uma vez que a gelatina misturada com a uréia forneceu uma pasta elevadamente viscosa que não pôde ser coletada. Solução 5 - -40 ml de uma solução de gelatina a 5% misturados com a solução de mTG a 4% resultaram em 1,27 g.

Solução 1 - a gelatina em pó foi dissolvida parcialmente em PBS à RT a -25% finais (peso/peso) de gelatina, formando um precipitante não-solúvel branco. Após o aquecimento em um banho de água a 50°C, o pó foi dissolvido, criando uma solução homogênea. Quando do esfriamento até a RT, a solução foi geleificada, mais 1 ml de PBS foi adicionado, para diminuir a gelatina a 12,5% (peso/peso). A solução de gelatina a 12,5% foi geleificada a 26-27°C.

Solução 2 - gelatina-manitol em pó foram dissolvidos parcialmente em PBS ã RT a -12,5% finais (peso/peso) de gelatina (espera-se que a gelatina seja metade da quantidade do pó produzido, apesar de a porcentagem exata de gelatina ser desconhecida). Um precipitante não-solúvel branco foi formado. Após o aquecimento em banho de água a 50 °C, o pó foi dissolvido, criando uma solução homogênea. Quando do esfriamento até a RT, a solução foi geleificada a 28 - 2 9 ° C. Solução 3 - gelatina-trealose em pó foram dissolvidos parcialmente em PBS à RT a -12,5% finais (peso/peso) de gelatina (espera-se que a gelatina seja metade da quantidade do pó produzido, apesar de a porcentagem exata de gelatina ser desconhecida). Um precipitante não-solúvel branco foi formado. Após o aquecimento em um banho de água até 50°C, o pó foi dissolvido, criando uma solução homogênea. Quando do esfriamento até a RT, a solução foi geleificada a 25-26 °C.

Solução 4 - a solução continha um agente de reticulação e, portanto, foi examinada quanto à reticulação em vez do processo de geleificação.

Solução 1 - 500 ul de uma solução de mTG a 20% foram adicionados a 2 ml da solução de gelatina a 12,5%. Após quatro minutos, um gel branco forte foi formado. O gel era irreversível.

Solução 2 - 250 ul de uma solução de mTG a 20% foram adicionados a 1 ml da solução de gelatina a 12,5% com manitol. Após dois minutos e meio, um gel branco forte foi formado. O gel era irreversível.

Solução 3 - 250 ul de uma solução de mTG a 2 0% foram adicionados a 1 ml da solução de gelatina a 12,5% com trealose. Após três minutos, um gel colorido branco forte foi formado. O gel era irreversível.

Solução 4 - a solução de mTG-gelatina foi dissolvida em 1 ml de PBS da Dulbecco aquecido a 37°C. Um gel branco e fraco foi imediatamente formado, impedindo a dissolução completa em PBS. O gel formado era irreversível.

A partir do que foi visto acima, parece que a secagem por aspersão das soluções de gelatina é possível. Por exemplo, as soluções de gelatina a 5% podem ser secadas por aspersão, produzindo pós brancos finos. A gelatina pode ser secada por aspersão com manitol e trealose a uma relação entre a gelatina e o manitol ou a trealose de 1:1 (peso/peso). As soluções de gelatina-manitol secadas por aspersão têm um ponto de transição mais elevado comparado à gelatina secada por aspersão sozinha. A gelatina-trealose secada por aspersão tem um ponto de transição mais baixo comparado à gelatina secada por aspersão sozinha.

A reticulação das soluções de gelatina secadas por aspersão é possível. A secagem por aspersão das soluções de gelatina-manitol de 1:1 (peso/peso) melhorou a reticulação. A secagem por aspersão das soluções de gelatina-trealose de 1:1 (peso/peso) não afetou a reticulação.

A secagem por aspersão das soluções de gelatina misturadas com a mTG é possível. As partículas formadas podem formar imediatamente um gel quando da reconstituição.

EXEMPLO 14

APLICADOR PARA A APLICAÇÃO DE VEDANTE

Este Exemplo refere-se a um aplicador exemplificador e ilustrativo para aplicar um vedante hemostático de acordo com algumas realizações da presente invenção. A Figura IlA mostra um exemplo de um aplicador de seringa duplo 1700, que apresenta duas seringas 1702 e 1704, para conter cada componente dos dois componentes do vedante hemostático. A seringa 1702 pode, opcionalmente, incluir gelatina ou um substituto tal como descrito na presente invenção, sendo que a seringa 1704 pode, opcionalmente, incluir transglutaminase ou um substituto tal como descrito na presente invenção. A diferença no volume dos frascos irá se refletir na relação de mistura relacionada entre os dois componentes. Os dois componentes podem se misturar no bocal 1705. Para uma mistura aprimorada, o bocal 1705 pode conter um elemento de criação de sorvedouro 1706 (mostrado mais detalhadamente na Figura 1113). O aplicador de seringa 1700 pode, opcionalmente, ser conectado a um sistema de ar pressurizado 1708 no bocal 1705, para criar um efeito de aspersão. O ar pressurizado pode, opcionalmente, entrar na extremidade proximal ou distai do bocal 1705 de acordo com a aplicação desejada.

EXEMPLO 15

CATETER E MÉTODO DE UTILIZAÇÃO DO MESMO

Este Exemplo refere-se a um cateter e a um método exemplificador e ilustrativo da utilização do mesmo, de acordo com algumas realizações da presente invenção. A figura 12A mostra um exemplo de um fechamento de ponto de inserção vascular em que um cateter 1200 apresenta preferivelmente um revestimento 1202, que compreende os componentes do vedante descritos na presente invenção. 0 revestimento 1202, opcional e preferivelmente, apresenta pelo menos uma camada de gelatina 1204, sendo que duas delas são mostradas com a finalidade de ilustração somente, e sem nenhuma intenção de ser limitadora. A camada de gelatina 1204 pode, opcionalmente, ser substituída por outro tipo de substrato de proteína tal como descrito na presente invenção. 0 revestimento 1202 também apresenta, opcional e preferivelmente, pelo menos uma camada de transglutaminase 1206, que pode novamente ser substituída por outro material de reticulação tal como descrito na presente invenção. O revestimento 1202 é preferivelmente envolvido em torno de uma bainha introdutora vascular 1208, também denominada como um trocarte.

A bainha 1208 pode, opcionalmente, ser coberta por outra bainha externa 1209 que cria uma barreira mecânica entre o componente do vedante seco e os fluidos corpóreos, tal como mostrado na Figura 12B. Uma vez que a bainha externa 1209 é removida, os componentes do vedante são ativados pelos fluidos corpóreos para criar um tampão de fechamento de ponto de entrada perivascular.

Embora a invenção tenha sido descrita com referência à descrição "detalhada antecedente da mesma e às realizações preferidas, a descrição acima se presta a ilustrar e não limitar a invenção, que é definida pelo âmbito das reivindicações em anexo. Outros aspectos, vantagens e modificações estão dentro do âmbito dessas reivindicações.

Claims

1. COMPOSIÇÃO, caracterizada pelo fato de compreender uma combinação de gelatina e transglutaminase, em que uma relação de uma quantidade da dita gelatina e uma quantidade da dita transglutaminase é suficiente para reduzir o sangramento em uma ferida de um mamífero, em que a dita gelatina não é submetida à gelatinização termoreversível ou em que a dita mistura é modificada tal que a dita gelatina forma uma solução com a transglutaminase a uma temperatura menor que a temperatura natural do sol-gel de uma gelatina de animal padrão, e em que a dita gelatina é produzida a partir de origem animal, de origem recombinante, ou de uma combinação das mesmas.

2. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita gelatina foi modificada para que tenha uma temperatura de transição de sol-gel reduzida ou em que a composição compreender adicionalmente um aditivo para reduzir a dita temperatura de transição de sol- gel da dita gelatina.

3. COMPOSIÇÃO, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a dita transglutaminase é adicionada como parte uma composição de transglutaminase e a relação de peso entre a gelatina e a composição de transglutaminase fica compreendida em uma faixa de cerca de 1:1 a cerca de 100:1.

4. COMPOSIÇÃO, de acordo com as reivindicações 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que a dita composição de transglutaminase tem um nível de atividade específico de pelo menos cerca de 200 U/gm de transglutaminase.

5. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 4, caracterizada pelo fato de que a dita transglutaminase compreende uma transglutaminase derivada de uma planta, recombinante, de animal, ou de micróbio que não o fator XIII derivado de sangue.

6. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a dita origem animal é selecionada do grupo que consiste em peixes e mamíferos.

7. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a dita gelatina é do tipo A (tratada com ácido) ou do tipo B (tratada com álcali).

8. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a dita gelatina compreende uma gelatina de elevado peso molecular tendo um vigor de pelo menos cerca de 250.

9. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 8, caracterizada pelo fato de que a dita composição tem um pH em uma faixa de cerca de 5 a cerca de 8.

10. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente um plastificante.

11. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o dito plastif icante é selecionado do grupo que consiste em um álcool polihídrico, glicerina, glicerol, xilitol, sacarose, sorbitol, trietanolamina, resorcinol, tiodiglicol, sal de sódio de toluenosulfoácido, butileno glicol, nitrato de uréia, tiouréia, uréia, ácido glutâmico, ácido aspárgico, valina, glicina, KSCN, KI e LiBr.

12. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que uma faixa da relação de concentração para a uréia varia de cerca de 1:2 a cerca de 2:2 de uréia:gelatina, peso por peso.

13. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente um agente de ajuste selecionado do grupo que consiste em um agente de ajuste do pH e um agente de ajuste da concentração de íons.

14. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que compreender adicionalmente um sal.

15. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente um carboidrato trealose, um carboidrato manitol, ou um outro carboidrato para a estabilização para a secagem por aspersão, a Iiofilização, ou uma outra secagem de proteína.

16. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente um desnaturante.

17. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o dito desnaturante é selecionado do grupo que consiste em hidrocloreto de guanidina e uréia.

18. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 17, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente um agente redutor.

19. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o dito agente redutor é selecionado do grupo que consiste em cloreto de magnésio e hidroquinona.

20. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente um agente exotérmico.

21. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o dito agente exotérmico compreende um ou mais entre o cloreto de cálcio, outros sais de cálcio, cloreto de magnésio, óxidos metálicos/zeólitos, ou uma combinação destes.

22. CURATIVO HEMOSTÁTICO, caracterizado pelo fato de compreender uma composição, tal como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 21.

23. DISPOSITIVO MÉDICO PARA A INSERÇÃO EM UM CORPO DE UM SER HUMANO OU DE UM MAMÍFERO INFERIOR, caracterizado pelo fato de compreender uma composição, tal como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 21.