WO2014112208A1 - 組織接着剤及びその製造方法 - Google Patents

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WO2014112208A1
WO2014112208A1 PCT/JP2013/081559 JP2013081559W WO2014112208A1 WO 2014112208 A1 WO2014112208 A1 WO 2014112208A1 JP 2013081559 W JP2013081559 W JP 2013081559W WO 2014112208 A1 WO2014112208 A1 WO 2014112208A1
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fish
carbon number
adhesive
tissue
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PCT/JP2013/081559
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English (en)
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Inventor
田口　哲志
Original Assignee
独立行政法人物質・材料研究機構
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L24/00—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices
    • A61L24/04—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices containing macromolecular materials
    • A61L24/10—Polypeptides; Proteins
    • A61L24/104—Gelatin

Definitions

  • the present invention relates to a tissue adhesive and a method for producing the same.
  • the tissue adhesive refers to a tissue adhesive that performs biological tissues such as blood vessels and skin (hereinafter referred to as tissues) during operations such as cardiovascular surgery. By using this, blood leakage and the like can be prevented, and the safety of surgery can be improved.
  • the first tissue adhesive is a cyanoacrylate-based tissue adhesive, and the product is DERMABOND.
  • This tissue adhesive has a problem of high adhesive strength but low biocompatibility.
  • the second tissue adhesive is a biopolymer and aldehyde-based tissue adhesive, and the product is GRF blue. This tissue adhesive also has a problem that it has high adhesive strength but low biocompatibility.
  • the third tissue adhesive is a fibrin-based tissue adhesive, and a product is Bolheal. In contrast, this tissue adhesive has high biocompatibility, but has a problem of low adhesive strength.
  • Non-patent Document 1 a tissue adhesive composed of human serum albumin (hereinafter referred to as HSA) and a crosslinking agent is high.
  • HSA is a serum protein made from a blood product, and is a globular protein having a molecular weight of 69000 and a diameter of about 10 nm. It is an acidic protein with a negative charge. Moreover, tartaric acid (Disuccinimidyl Tartrate: DST) is used as a crosslinking agent.
  • DST disuccinimidyl Tartrate
  • Patent Document 1 discloses a medical material prepared by crosslinking gelatin with succinimidated poly-L-glutamic acid.
  • Patent Document 2 relates to a tissue adhesive film, and discloses a tissue adhesive film made from gelatin or collagen (Collagen). However, these have the subject that adhesive force is not enough.
  • Patent Document 3 relates to a tissue adhesive composition, and discloses a tissue adhesive composition in which a particulate form synthetic and / or crosslinkable material and a particulate material are mixed.
  • this tissue adhesive composition also has a problem that the adhesive force is not sufficient.
  • Non-Patent Documents 2 and 3 There are also papers on gelatin with an alkyl group introduced in the side chain (Non-Patent Documents 2 and 3). Furthermore, there is a paper consisting of gelatin with a cholesteryl group introduced in the side chain and a tartaric acid crosslinking agent (Non-patent Document 4).
  • hydrophobic gelatin in which a hydrophobic functional group is introduced into gelatin having a molecular weight of 10,000 or more and less than 50000 instead of HSA, it is possible to provide a tissue adhesive having high adhesive strength and high biocompatibility. There is sex.
  • the adhesiveness can be improved.
  • the tissue adhesive becomes liquid even if the molecular weight is about 20000. In other words, it hardens into a gel and cannot be uniformly applied to the bonded part when used as a tissue adhesive, which makes it difficult to handle in terms of applicability. Also, when left at room temperature, it sometimes became a jelly.
  • Tissue adhesives in which these molecules are not uniformly dispersed caused variations in adhesion properties such as adhesion strength and adhesion stability.
  • tissue adhesive consisting of the water-soluble crosslinking agent Polyethyleneglycol di-succinimidyl succinate (PEG- (SS) 2) and HSA is approved in the United States under the product name ProGEL. There is a high possibility that it can be used as a constituent of
  • An object of the present invention is to provide a tissue adhesive having high adhesive strength, stable adhesive properties, and excellent coating properties, and a method for producing the same.
  • the adhesive component and the hardening component are mixed and applied to the tissue.
  • hydrophobized fish-derived gelatin prepared with fish-derived gelatin and water-soluble cross-linking molecules when the adhesive component and hardening component are mixed, they are uniformly dispersed in an aqueous solution, It has been found that an adhesive can be prepared, thereby producing a tissue adhesive having stable adhesive properties.
  • This tissue adhesive has a high adhesive strength and is a gel rather than a gel before hardening, so it can be applied uniformly to the tissue without heating, and is a tissue adhesive with excellent applicability And completed the present invention.
  • the tissue adhesive of the present invention is characterized by the following.
  • a tissue adhesive in which an adhesive component containing a fish-derived gelatin aqueous solution and a hardening component hardening component containing a water-soluble cross-linking molecule aqueous solution are mixed and applied to the tissue, and the molecular backbone of the water-soluble cross-linking molecule is an amide It has a bond or ethylene glycol unit or sugar chain, and has two or more active ester groups or acid anhydride or aldehyde groups.
  • the fish-derived gelatin of the adhesive component is a hydrophobized fish-derived gelatin having a hydrophobic functional group in the side chain.
  • the fish-derived gelatin has a main chain of fish-derived gelatin having 90 or less hydroxyprolines per 1000 amino acids.
  • the hydrophobized fish-derived gelatin contains Lys, and a part of the amino group of Lys is substituted with a hydrophobic functional group.
  • the hydrophobic functional group is a saturated fatty acid ethyl group (carbon number 2), propyl (carbon number 3), butyl group (carbon number 4), pentyl group (carbon number 5), hexanoyl group (carbon number 6), heptanoyl Group (carbon number 7), octanoyl group (carbon number 8), nonanoyl group (carbon number 9), decanoyl group (carbon number 10), undecanoyl group (carbon number 11), dodecanoyl group (carbon number 12), tridecanoyl group ( 13 carbon atoms, tetradecanoyl group (14 carbon atoms), pentadecanoyl group (15 carbon atoms), hexadecanoyl group (16 carbon atoms), heptadecanoyl group (17 carbon atoms), stearoyl group (18 carbon atoms) Branched saturated fatty acid isopropyl (carbon number 3), isobutyl group (carbon number 4), is
  • the fish-derived gelatin is fish-derived gelatin derived from tilapia, Thailand, or cod.
  • the molecular weight of the hydrophobized fish-derived gelatin is 50,000 or more and less than 100,000.
  • the water-soluble cross-linking molecule is selected from the group consisting of polyethyleneglycol di-succinimidyl succinate, pentaerythritol poly (ethyleneglycol) ether tetrasuccinimidyl glutarate, succinimidated polydeoxyaldehyde, succinimidyl group, introduced succinimidated polydeoxy-aldehyde group. It is a combination of more than species.
  • the aqueous solvent used for the fish-derived gelatin aqueous solution and the aqueous solvent used for the water-soluble molecular aqueous solution for crosslinking are phosphate buffer solutions (PBS) having a pH of 6.0 or more and pH 8.0 or less.
  • PBS phosphate buffer solutions
  • the adhesive component it further contains fish-derived gelatin that has not been hydrophobized.
  • the hydrophobized fish-derived gelatin aqueous solution is liquid at room temperature.
  • the method for producing a tissue adhesive of the present invention is characterized by the following.
  • An organic molecule having a hydrophobic functional group in the presence of an amine is added to a solution in which fish-derived gelatin having a hydroxyproline number of 90 or less per 1000 amino acids is dissolved, and the amino group in the side chain of the fish-derived gelatin is added.
  • a water-soluble cross-linking molecule having an amide bond, an ethylene glycol unit, or a sugar chain and having two or more active ester groups, acid anhydrides, or aldehyde groups is dispersed in a phosphate buffer.
  • a step of preparing a curing component containing a water-soluble molecular aqueous solution for crosslinking including.
  • the step of preparing the adhesive component includes a step of mixing the hydrophobized fish-derived gelatin aqueous solution with a fish-derived gelatin aqueous solution prepared by dispersing fish-derived gelatin in a phosphate buffer.
  • the weight ratio of the hydrophobized fish-derived gelatin aqueous solution and the fish-derived gelatin aqueous solution is 1: 9 or more and less than 5: 5.
  • An adhesive component containing a fish-derived gelatin aqueous solution A step of mixing a curing component containing a water-soluble molecular aqueous solution for crosslinking, in which the molecular main chain has an amide bond, an ethylene glycol unit, or a sugar chain, and has two or more active ester groups, acid anhydrides, or aldehyde groups including.
  • the tissue adhesive of the present invention can prepare a tissue adhesive by uniformly dispersing hydrophobized fish-derived gelatin and water-soluble crosslinking molecules in an aqueous solution, whereby a tissue adhesive having stable adhesive properties can be prepared.
  • the tissue adhesive can be manufactured, can be made into a liquid rather than a gel, and can be uniformly applied to the tissue, and can be applied to the tissue.
  • the molecular weight can be increased, and the amino groups of the hydrophobized gelatins can be cross-linked with the active ester group, acid anhydride or aldehyde group of the cross-linking molecule to form a chemically strong bond. it can.
  • the hydrophobic functional group can penetrate into tissue (anchoring) to form a physically strong bond to increase the adhesive strength, and the hydrophobic gelatin can be used as an enzyme in the wound healing process.
  • Collagenase can be easily decomposed, and the biocompatibility can be increased.
  • an organic molecule having a hydrophobic functional group is added in the presence of an amine to a solution in which fish-derived gelatin having 90 or less hydroxyprolines per 1000 constituent amino acids is dissolved.
  • Synthesizing a hydrophobic fish-derived gelatin by substituting a part of the amino group of the side chain of the fish-derived gelatin with the hydrophobic functional group, and dispersing the hydrophobic fish-derived gelatin in a phosphate buffer.
  • a step of preparing an adhesive component comprising an aqueous solution containing hydrophobized fish-derived gelatin, a molecular main chain of a water-soluble crosslinking molecule having an amide bond, an ethylene glycol unit or a sugar chain, and two or more active ester groups
  • a water-soluble cross-linking molecule having an acid anhydride or an aldehyde group is dispersed in a phosphate buffer solution to prepare a curing component comprising an aqueous solution containing the water-soluble cross-linking molecule.
  • a tissue adhesive excellent in applicability can be easily produced.
  • the method for producing a tissue adhesive of the present invention preferably includes a step of mixing the hydrophobized fish-derived gelatin aqueous solution with a fish-derived gelatin aqueous solution prepared by dispersing fish-derived gelatin in a phosphate buffer solution.
  • a tissue adhesive by uniformly dispersing hydrophobized fish-derived gelatin and water-soluble cross-linking molecules in an aqueous solution, having high adhesive strength, stable adhesive properties, and excellent coating properties.
  • Tissue adhesive can be easily manufactured.
  • aggregation of hydrophobic groups can be inhibited, and the adhesive strength of the tissue adhesive can be improved.
  • 3 is a cross-sectional image obtained by staining a tissue after an adhesion test using the adhesive of Test Example 2-1 with hematoxylin and eosin.
  • the conditions for preparing the adhesive of Test Example 2-1 were Gltn 40 wt% soln. It is 4S-PEG 4.5 mM (0.1 M PBS pH 6.0).
  • 3 is a cross-sectional image of a tissue after an adhesion test using the adhesive of Test Example 2-2 stained with hematoxylin and eosin.
  • the conditions for preparing the adhesive of Test Example 2-2 were Gltn 40 wt% soln. 4S-PEG 4.5 mM (0.1 M PBS pH 6.5).
  • FIG. 4 is a cross-sectional image of a tissue after an adhesion test using the adhesive of Test Example 2-3 stained with hematoxylin and eosin.
  • the conditions for preparing the adhesive of Test Example 2-3 were Gltn 40 wt% soln. It is 4S-PEG 4.5 mM (0.1 M PBS pH 7.0).
  • 6 is a cross-sectional image of a tissue after an adhesion test using the adhesive of Test Example 2-4 stained with hematoxylin and eosin.
  • the conditions for preparing the adhesive of Test Example 2-4 were Gltn 40 wt% soln. It is 4S-PEG 4.5 mM (0.1 M PBS pH 7.5).
  • FIG. 3 is a cross-sectional image obtained by staining a tissue after an adhesion test using the adhesive of Example 3-2 with hematoxylin and eosin.
  • 3 is a cross-sectional image obtained by staining a tissue after an adhesion test using the adhesive of Example 3-3 with hematoxylin and eosin.
  • FIG. 3 is a cross-sectional image obtained by staining a tissue after an adhesion test using the adhesive of Example 3-4 with hematoxylin and eosin.
  • FIG. 3 is a cross-sectional image obtained by staining a tissue after an adhesion test using the adhesive of Example 3-4 with hematoxylin and eosin.
  • Example 3 is a cross-sectional image obtained by staining a tissue after an adhesion test using the adhesive of Example 3-5 with hematoxylin and eosin.
  • 6 is a cross-sectional image obtained by staining the tissue after the adhesion test using the adhesive of Example 3-6 with hematoxylin and eosin.
  • FIG. 5 is a photomicrograph showing the fracture surface of the porcine aortic media when hydrophobized cod gelatin having a hydrophobic group introduction rate by cholesterylation of 4.9 mol%, 7.5 mol%, and 12.2 mol% is used as an adhesive component.
  • the tissue adhesive according to an embodiment of the present invention is a tissue adhesive that is applied to a tissue by mixing an adhesive component containing a fish-derived gelatin aqueous solution and a hardening component containing a water-soluble molecular aqueous solution for crosslinking.
  • a tissue adhesive that is applied to a tissue by mixing an adhesive component containing a fish-derived gelatin aqueous solution and a hardening component containing a water-soluble molecular aqueous solution for crosslinking.
  • the hydrophobized fish origin gelatin which provided the hydrophobic functional group in the side chain as a fish origin gelatin.
  • FIG. 1 illustrates a form having a hydrophobized fish-derived gelatin and a water-soluble crosslinking molecule.
  • the hydrophobized fish-derived gelatin is a polymer in which two or more amino acids are linearly linked. A part of the amino group of Lys contained as the amino acid is substituted with the hydrophobic functional group. Lys is one of the ⁇ -amino acids constituting the protein and is an essential amino acid. An amino acid having an ⁇ -amino group in the side chain.
  • a part of the amino group of Lys can be easily substituted with a hydrophobic functional group, and a part of the amino group of Lys of the hydrophobized fish-derived gelatin is substituted with a hydrophobic functional group.
  • the hydrophobized fish-derived gelatin has, as a main chain, a fish-derived gelatin having 90 or less hydroxyproline (Hydroxyproline) represented by the following formula (1) per 1000 constituent amino acids, and an amino group and a hydrophobic group in its side chain. It is preferable to have a functional functional group.
  • Hydroxyproline hydroxyproline
  • a fish-derived gelatin skeleton By using a fish-derived gelatin skeleton, it can be easily decomposed by an enzyme, and the biocompatibility can be increased. Moreover, the dispersibility to a water solvent can be improved.
  • the fish-derived gelatin is preferably a fish-derived gelatin of tilapia, Thai or cod.
  • the tissue adhesive can be prepared by uniformly dispersing in an aqueous solution, and it can be made into a liquid rather than a gel, and has excellent coating properties that can be uniformly applied to the tissue. It can be a tissue adhesive.
  • the molecular weight of the hydrophobized fish-derived gelatin is preferably 50,000 or more and less than 100,000. By setting the molecular weight to 50000 or more, the adhesive strength can be improved. Further, since the hydrophobized fish-derived gelatin has fish gelatin as a main skeleton, it is highly dispersible in an aqueous solvent and can be maintained in a liquid state without gelation even when the molecular weight is 50,000 or more.
  • the hydrophobic functional group introduced into the fish-derived gelatin can be anchored to the tissue and the fish-derived gelatin can be firmly fixed to the tissue. Thereby, the hydrophobized fish-derived gelatin can be physically and firmly adhered to the tissue, and the adhesive strength can be improved.
  • hydrophobic functional group examples include a cholesteryl group represented by the following formula (2).
  • hydrophobic functional groups include saturated fatty acid ethyl group (2 carbon atoms), propyl (3 carbon atoms), butyl group (4 carbon atoms), pentyl group (5 carbon atoms), hexanoyl group (6 carbon atoms), Heptanoyl group (7 carbon atoms), octanoyl group (8 carbon atoms), nonanoyl group (9 carbon atoms), decanoyl group (10 carbon atoms), undecanoyl group (11 carbon atoms), dodecanoyl group (12 carbon atoms), tridecanoyl group (Carbon number 13), tetradecanoyl group (carbon number 14), pentadecanoyl group (carbon number 15), hexadecanoyl group (carbon number 16), heptadecanoyl group (carbon number 17), stearoyl group (carbon number 18) ), Branched saturated fatty acid isopropyl (3 carbon atoms), isobutyl group (4 carbon
  • the molecular main chain of the water-soluble crosslinking molecule has an amide bond, an ethylene glycol unit, or a sugar chain, and two or more active ester groups, acid anhydrides, or aldehyde groups.
  • the molecular main chain of the water-soluble crosslinking molecule Since the molecular main chain of the water-soluble crosslinking molecule has an amide bond, an ethylene glycol unit, or a sugar chain, it exhibits high water solubility and can be highly dispersible in an aqueous solvent.
  • these water-soluble cross-linking molecules react with and bind to two amino groups of hydrophobized fish-derived gelatin. And two or more hydrophobized fish-derived gelatins can be cross-linked to form a strong bonded structure.
  • the active ester group is preferably one or a combination of two or more of N-hydroxysuccinimidyl and N-hydroxysulfosuccinimidyl groups.
  • succinimide is a derivative of succinic acid existing in the metabolic pathway in the living body and has a track record of being used in tissue adhesives (sealants) approved by the US Food and Drug Administration.
  • water-soluble crosslinking molecule examples include one or a combination of two or more selected from the group consisting of 4S-PEG, PEG- (SS) 2, succinimidated poly-L-glutamic acid, aldehyde group-introduced starch, and aldehyde group-introduced dextran. be able to.
  • a pentaerythritol poly (ethyleneglycol) ether tetracuccinimidyl glutarate (abbreviation: 4S-PEG) represented by the following formula (3) can be given.
  • n is preferably 60 or less.
  • the molecular weight is preferably about 10,000.
  • a phosphate buffer can be used as the aqueous solvent.
  • the pH value is preferably 5 to 9, and more preferably 6 to 8.
  • tissue adhesion using the tissue adhesive of this embodiment will be described.
  • tissue two sheets of a substantially rectangular shape in plan view (for example, 1 cm in length ⁇ 1 cm in width and 0.5 cm in height) are prepared.
  • tissue a collagen casing made of components such as collagen, cellulose, and glycerin can be used as pseudo skin.
  • a liquid adhesive component, a liquid curing component, and a double syringe syringe are applied to one surface of one tissue, and then mixed on the one surface.
  • the standing time is a time required for the tissue adhesive to solidify, and is appropriately set depending on the ratio of the constituent materials in the tissue adhesive.
  • the maximum is preferably about 10 minutes. In this case, for example, it is preferable to incubate by heating at a temperature of 37 ° C. or lower. Thereby, a cure rate can be raised. In addition, you may leave at room temperature until it solidifies after adhesion
  • the tissue adhesive is preferably pre-incubated to a temperature of 37 ° C. or less before use and then applied.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing an example of tissue adhesion using a tissue adhesive according to an embodiment of the present invention.
  • the amino group of the hydrophobized fish-derived gelatin reacts with one active ester group of the crosslinking molecule to form an amide bond. At that time, N-hydroxysuccinimide in the active ester group is liberated.
  • —COOR represents an active ester of a water-soluble crosslinking molecule
  • —NH 2 represents an amino group in the hydrophobized fish-derived gelatin.
  • This cross-linking reaction is carried out in a chain, thereby forming a structure in which a plurality of hydrophobized fish-derived gelatins are chemically and firmly bound by water-soluble cross-linking molecules.
  • the active ester group of this water-soluble cross-linking molecule also reacts with the hydrophobized fish-derived gelatin and the amino group of proteins such as collagen present in living tissue to form an amide bond. As a result, a structure that is more chemically bonded is formed.
  • hydrophobic functional groups having a certain molecular weight and size penetrate into the tissue by hydrophobic interaction, and the hydrophobized fish-derived gelatin is firmly fixed to the tissue. Thereby, the said structure is adhere
  • the adhesive component more preferably contains hydrophobized fish-derived gelatin and non-hydrophobized fish-derived gelatin. Thereby, aggregation of hydrophobic groups can be inhibited, and the adhesive strength of the tissue adhesive can be increased.
  • a method for producing a tissue adhesive includes an adhesive component containing a fish-derived gelatin aqueous solution, a molecular main chain having an amide bond, an ethylene glycol unit or a sugar chain, and two or more active esters. And a step of mixing with a curing component containing an aqueous solution of a water-soluble crosslinking molecule having a group, an acid anhydride or an aldehyde group.
  • the method for producing a tissue adhesive of the present invention more preferably includes a hydrophobized fish-derived gelatin synthesis step S1, an adhesive component preparation step S2, and a hardening component preparation step S3.
  • Hydrophobized fish-derived gelatin synthesis step S1 First, an organic molecule having a hydrophobic functional group in the presence of an amine is added to a solution in which fish-derived gelatin having 90 or fewer hydroxyprolines per 1000 constituent amino acids is dissolved. Hydrophobized fish-derived gelatin is synthesized by replacing a part of the amino group of the chain with the hydrophobic functional group.
  • acid chloride having a hydrophobic functional group having reactivity with an amino group is mixed with fish-derived gelatin dissolved in an organic solvent in the presence of triethylamine to prepare a mixed solution in a container.
  • organic solvent for example, dimethyl sulfoxide (DMSO) is used.
  • organic molecules examples include cholesteryl chloroformate represented by the following formula (5).
  • the mixed solution is heated and stirred in an inert gas atmosphere.
  • the heating temperature is 80 ° C.
  • the stirring time is day and night.
  • this mixed solution is dropped into an ice-cooled ethanol solvent.
  • this solution is filtered with a glass filter or the like.
  • the filtrate is washed with an organic solvent.
  • an organic solvent for washing, for example, ethanol or ethyl acetate is used.
  • hydrophobic fish-derived gelatin in which a part of the amino group of the side chain of the fish-derived gelatin is substituted with a hydrophobic functional group can be produced.
  • Adhesive component preparation step S2 The hydrophobic fish-derived gelatin is dispersed in a phosphate buffer to prepare an adhesive component comprising an aqueous solution containing the hydrophobic fish-derived gelatin.
  • the time until solidification can be set as appropriate.
  • a buffer solution having a pH of 6 to 8 By using a buffer solution having a pH of 6 to 8, the cross-linking reaction upon mixing can be advanced rapidly.
  • a water-soluble cross-linking molecule having an amide bond, an ethylene glycol unit or a sugar chain in the molecular main chain of the water-soluble cross-linking molecule and having two or more active ester groups, acid anhydrides or aldehyde groups is used as a phosphate buffer. Disperse to prepare a curing component comprising an aqueous solution containing water-soluble crosslinking molecules.
  • the time until solidification can be appropriately set by appropriately setting the pH of the phosphate buffer.
  • a buffer solution having a pH of 6 to 8 By using a buffer solution having a pH of 6 to 8, the cross-linking reaction upon mixing can be advanced rapidly.
  • the tissue adhesive which is an embodiment of the present invention can be easily produced.
  • the two tissues can be easily bonded by mixing the adhesive component and the hardening component, applying the mixture to the tissue, and then bonding the other tissues together.
  • Method for producing tissue adhesive (another example)> Next, another example of the method for producing a tissue adhesive which is an embodiment of the present invention will be described.
  • Another example of the method for producing a tissue adhesive which is an embodiment of the present invention includes a hydrophobized fish-derived gelatin synthesis step S11, an aqueous solution preparation step S12 containing hydrophobized fish-derived gelatin, and an aqueous solution preparation step containing fish-derived gelatin. S13, adhesive component preparation step S14, and curing component preparation step S15.
  • the hydrophobized fish-derived gelatin synthesis step S11 is the same step as the previously described hydrophobized fish-derived gelatin synthesis step S1.
  • the aqueous solution preparation step S12 containing the hydrophobized fish-derived gelatin is the same step as the adhesive component preparation step S2 described above.
  • Aqueous solution preparation step S13 containing fish-derived gelatin Fish-derived gelatin is dispersed in a phosphate buffer to prepare an aqueous solution containing fish-derived gelatin.
  • the time until solidification can be set as appropriate.
  • a buffer solution having a pH of 6 to 8 By using a buffer solution having a pH of 6 to 8, the cross-linking reaction upon mixing can be advanced rapidly.
  • Adhesive component preparation step and S14 An aqueous solution containing the hydrophobized fish-derived gelatin and an aqueous solution containing the fish-derived gelatin are mixed to prepare an adhesive component comprising a mixed solution.
  • the weight ratio is preferably 1: 9 to 5: 5, more preferably 1: 9. Thereby, dispersibility can be improved and aggregation can be suppressed.
  • Curing component preparation step S15 is the same step as the curing component preparation step S3 described above.
  • the tissue adhesive which is an embodiment of the present invention can be easily produced.
  • the two components can be easily bonded by mixing the adhesive component and the curing component, applying the mixture to the tissue, and then bonding the other components together.
  • the volume ratio between the adhesive component and the curing component is preferably about 1: 1. Dispersibility can be increased.
  • the tissue adhesive according to the embodiment of the present invention can be prepared by uniformly dispersing hydrophobized fish-derived gelatin and water-soluble cross-linking molecules in an aqueous solution, thereby stabilizing adhesive properties.
  • a tissue adhesive can be produced, and can be made into a liquid rather than a gel, and can be made into a tissue adhesive excellent in applicability that can be uniformly applied to a tissue. Further, it is possible to form a chemically strong bond by increasing the molecular weight and crosslinking the amino groups of the hydrophobic gelatins with the active ester group or acid anhydride of the crosslinking molecule.
  • the hydrophobic functional group can penetrate into tissue (anchoring) to form a physically strong bond to increase the adhesive strength, and the hydrophobic gelatin can be used as an enzyme in the wound healing process.
  • Collagenase can be easily decomposed, and the biocompatibility can be increased.
  • the hydrophobized fish-derived gelatin is a polymer in which two or more amino acids are linearly linked, and one of the amino groups of Lys contained as the amino acid. Since the part is substituted with the hydrophobic functional group, amino groups present in the hydrophobic gelatin can be cross-linked with the active ester group of the cross-linking molecule to form a chemically strong bond. In addition, the adhesive strength can be increased, and the hydrophobized gelatin can be easily decomposed by an enzyme (collagenase) in the wound healing process, so that the biocompatibility can be increased.
  • an enzyme collagenase
  • the hydrophobic functional group is a saturated fatty acid ethyl group (carbon number 2), propyl (carbon number 3), butyl group (carbon number 4), pentyl group (carbon number). 5), hexanoyl group (carbon number 6), heptanoyl group (carbon number 7), octanoyl group (carbon number 8), nonanoyl group (carbon number 9), decanoyl group (carbon number 10), undecanoyl group (carbon number 11) , Dodecanoyl group (carbon number 12), tridecanoyl group (carbon number 13), tetradecanoyl group (carbon number 14), pentadecanoyl group (carbon number 15), hexadecanoyl group (carbon number 16), heptadecanoyl group ( 17 carbon atoms, stearoyl group (18 carbon atoms), branched saturated fatty acid isopropyl (3 carbon atoms), is
  • the fish-derived gelatin is a fish-derived gelatin of tilapia, tie or cod, so that the tissue adhesive is prepared by uniformly dispersing in an aqueous solution.
  • This makes it possible to produce a tissue adhesive with stable adhesive properties, and it can be made into a liquid rather than a gel and can be uniformly applied to the tissue. It can be used as an agent.
  • the tissue adhesive according to the embodiment of the present invention has a structure in which the molecular weight of the hydrophobized fish-derived gelatin is 50,000 or more and less than 100,000, the tissue adhesive can be chemically bonded.
  • the water-soluble cross-linking molecule is a polyethyleneglycol di-succinimidyl succinate, a pentaerythritol poly (ethylene glycol) ether-tetracylimidyl aldehyde-modified succinimidyl aldehyde, Since it is the structure which is 1 type, or 2 or more types of combinations chosen from the group of group introduction
  • the amino groups of hydrophobic gelatins and the amino groups of proteins such as collagen present in living tissues are cross-linked with an active ester group or acid anhydride of a cross-linking molecule to chemically bond tissue adhesives. A strong bond.
  • the aqueous solvent used in the aqueous solution is a phosphate buffer solution (PBS) having a pH of 6.0 or more and 8.0 or less, so that the time until solidification is appropriately set. Can do.
  • PBS phosphate buffer solution
  • the tissue adhesive which is an embodiment of the present invention has a fish-derived gelatin having a number of hydroxyproline of 90 or less per 1000 amino acids, so that it can inhibit aggregation of hydrophobic groups and improve the adhesive strength of the tissue adhesive Can be made.
  • the method for producing a tissue adhesive according to an embodiment of the present invention includes an organic molecule having a hydrophobic functional group in the presence of an amine in a solution in which fish-derived gelatin having 90 or fewer hydroxyprolines per 1000 constituent amino acids is dissolved. And a step of synthesizing the hydrophobic fish-derived gelatin by substituting a part of the amino group of the side chain of the fish-derived gelatin with the hydrophobic functional group, and phosphate-buffering the hydrophobic fish-derived gelatin.
  • a step of preparing an adhesive component comprising an aqueous solution containing hydrophobized fish-derived gelatin dispersed in a liquid, and the molecular main chain of the water-soluble crosslinking molecule has an amide bond, an ethylene glycol unit or a sugar chain, and two or more A water-soluble cross-linking molecule having an active ester group, an acid anhydride, or an aldehyde group is dispersed in a phosphate buffer, and the aqueous solution contains a water-soluble cross-linking molecule.
  • the step of preparing the chemical component so that the tissue adhesive can be prepared by uniformly dispersing the hydrophobized fish-derived gelatin and the water-soluble crosslinking molecule in the aqueous solution, A tissue adhesive having stable adhesive properties and excellent coating properties can be easily produced.
  • a hydrophobic functional group is added in the presence of an amine in a solution in which fish-derived gelatin having 90 or fewer hydroxyprolines per 1000 constituent amino acids is dissolved.
  • a step of synthesizing hydrophobized fish-derived gelatin by adding a part of the amino group of the side chain of the fish-derived gelatin with the hydrophobic functional group, and adding the hydrophobic fish-derived gelatin; Dispersing in a phosphate buffer to prepare an aqueous solution containing hydrophobized fish-derived gelatin; dispersing the fish-derived gelatin in a phosphate buffer to prepare an aqueous solution containing fish-derived gelatin; and Mixing an aqueous solution containing hydrophobized fish-derived gelatin with an aqueous solution containing the fish-derived gelatin to prepare an adhesive component comprising a mixed solution;
  • a water-soluble cross-linking molecule having an amide bond, an ethylene glycol unit, or a sugar
  • the method for producing a tissue adhesive comprises the mixed solution, wherein a weight ratio of the solution containing the hydrophobized fish-derived gelatin and the aqueous solution containing the fish-derived gelatin is 1: 9 or more and less than 5: 5. Since the adhesive component is prepared, aggregation of hydrophobic groups can be inhibited, and the adhesive strength of the tissue adhesive can be improved.
  • tissue adhesive that is an embodiment of the present invention and the manufacturing method thereof are not limited to the above-described embodiment, and can be implemented with various modifications within the scope of the technical idea of the present invention. Specific examples of this embodiment are shown in the following examples. However, the present invention is not limited to these examples.
  • phosphate buffered saline Phosphate buffered saline, abbreviated as PBS
  • PBS phosphate buffered saline
  • Gltn was dissolved in 0.1 M PBS (pH 7.0) so that the Gltn concentration was 40 wt% to prepare a gelatin solution (Gltn solution).
  • tissue adhesives of Test Examples 1-1 to 1-5 were prepared by mixing the Gltn solution and the 5 types of 4S-PEG solutions in a volume ratio of 1: 1, respectively.
  • 4 to 6 are schematic diagrams of the adhesion test.
  • porcine vascular membranes 50 were prepared.
  • the porcine vascular membrane 50 has a medial side 51 on one side and an external membrane 52 on the other side.
  • a mask made of a silicon sheet having a square shape in plan view with one side of about 12 mm and a thickness of 0.5 mm on the media film 51 on one end side of one pig vascular membrane 50. 53 was placed.
  • the mask 53 is provided with a circular hole 54 having a diameter of 10 mm in plan view.
  • a slit connected to the hole 54 is provided on one side of the mask 53.
  • tissue adhesive 60 was dropped on the middle film 51 exposed from the hole 54.
  • one end side of the other porcine vascular membrane 50 was placed so that the media layers 51 overlap each other with the tissue adhesive 60 interposed therebetween.
  • a weight 55 having a weight of 50 g was placed on the superposed porcine vascular membrane 50.
  • a 4.5 mM 4S-PEG solution was prepared using 0.1 M PBS and a solvent having a pH of 6.0, 6.5, 7.0, or 7.5.
  • tissue adhesives were preincubated at 37 ° C. in advance, and then an adhesion test was performed to measure the adhesive strength.
  • tissue adhesive gelatin resorcinol formaldehyde: GRF
  • formaldehyde a commercially available tissue adhesive (gelatin resorcinol formaldehyde: GRF) made of gelatin and formaldehyde was also measured.
  • PBS adhesive strength solvent
  • the crosslinking reaction of the tissue adhesive is a nucleophilic substitution reaction in which the amino group of gelatin is an active ester of 4S-PEG, and the reaction rate depends on the protonation of the amino group, that is, the pH value of the solvent. Therefore, the dependence of adhesive strength on the solvent (PBS) pH value was measured.
  • 9 to 12 are cross-sectional images obtained by staining the tissues after the adhesion test using the adhesives of Test Examples 2-1 and 2-4 with hematoxylin and eosin, respectively.
  • the conditions for creating each adhesive were Gltn 40 wt% soln. 4S-PEG 4.5 mM (0.1 M PBS pH 6.0 (Test Example 2-1), 6.5 (Test Example 2-2), 7.0 (Test Example 2-3), 7.5 (Test Example) 2-4)).
  • FIG. 13 shows a cross-sectional image of the tissue after the adhesion test using GRF stained with hematoxylin and eosin.
  • hydrophobized tilapia scale-derived fish gelatin (4Chol-Gltn) 40 wt% solution was prepared using 0.1 M PBS and a solvent having a pH of 7.0.
  • tilapia scale-derived fish gelatin (Gltn) 40 wt% solution was prepared using 0.1 M PBS and a pH 7.0 solvent.
  • this tissue adhesive was preincubated in advance at 37 ° C., and then an adhesion test was performed to measure the adhesion strength at adhesion times of 1, 3, 5, 10, 15, 30, and 45 (min).
  • Example 2 ⁇ Preparation of 0, 4, 7, 23, 70Chol-Gltn / 4S-PEG tissue adhesive>
  • fish gelatin (Chol-Gltn) derived from tilapia scales having a hydrophobic group (Chol group) introduction rate of 4, 7, 23, and 70 mol% with respect to all amino groups in Gltn was prepared.
  • tilapia scale-derived fish gelatin which has not been hydrophobized was also evaluated, which is expressed as 0Chol-Gltn.
  • this tissue adhesive was preincubated at 37 ° C. in advance, and then an adhesion test was performed to measure the adhesive strength.
  • the adhesive strength of a tissue adhesive prepared by mixing a 40 wt% solution of 0, 4, 7, 23, 70 Chol-Gltn and a 4S-PEG solution at a volume ratio of 1: 1 was evaluated, and a hydrophobic group (Chol group of adhesive strength) was evaluated. ) The introduction rate dependency was evaluated.
  • tilapia scale-derived fish gelatin (Gltn) 40 wt% solution was prepared using 0.1 M PBS and a solvent having a pH of 7.4.
  • tissue adhesives of Examples 3-1 to 3-6 were prepared.
  • the tissue adhesive was preincubated at 37 ° C. in advance, and then an adhesion test was performed to measure the adhesive strength.
  • FIGS. 17 to 22 are cross-sectional images obtained by staining the tissues after the adhesion test using the adhesives of Examples 3-1 to 3-5 with hematoxylin and eosin, respectively.
  • Example 4 Preparation of 7Chol-Gltn / Gltn (0: 10-9: 1) / 4S-PEG Tissue Adhesive> First, a 40 wt% solution of 7Chol-Gltn and Gltn was prepared using a 0.1M PBS, pH 7.4 solvent.
  • tilapia scale-derived fish gelatin (Gltn) 40 wt% solution was prepared using 0.1 M PBS and a solvent having a pH of 7.4.
  • the tissue adhesive was preincubated at 37 ° C. in advance, and then an adhesion test was performed to measure the adhesive strength.
  • hydrophobized tilapia scale-derived fish gelatin (4Chol-Gltn) 40 wt% solution was prepared using 0.1 M PBS and a solvent having a pH of 7.0.
  • tilapia scale-derived fish gelatin (Gltn) 40 wt% solution was prepared using 0.1 M PBS and a pH 7.0 solvent.
  • the tissue adhesive was preincubated at 37 ° C. in advance, and then an adhesion test was performed to measure the adhesive strength.
  • hydrophobized tilapia scale-derived fish gelatin (7Chol-Gltn) 40 wt% solution was prepared using 0.1 M PBS and a pH 7.0 solvent.
  • tilapia scale-derived fish gelatin (Gltn) 40 wt% solution was prepared using 0.1 M PBS and a pH 7.0 solvent.
  • tissue adhesives of Examples 6-1 to 6-3 were prepared by mixing the three kinds of mixed solutions and the 4S-PEG solution at a volume ratio of 1: 1, respectively.
  • the tissue adhesive was preincubated at 37 ° C. in advance, and then an adhesion test was performed to measure the adhesive strength.
  • hydrophobized tilapia scale-derived fish gelatin (23Chol-Gltn) 40 wt% solution was prepared using 0.1 M PBS and a pH 7.0 solvent.
  • tilapia scale-derived fish gelatin (Gltn) 40 wt% solution was prepared using 0.1 M PBS and a pH 7.0 solvent.
  • tissue adhesives of Examples 7-1 to 7-3 were prepared by mixing the three mixed solutions and the 4S-PEG solution at a volume ratio of 1: 1, respectively.
  • the tissue adhesive was preincubated at 37 ° C. in advance, and then an adhesion test was performed to measure the adhesive strength.
  • hydrophobized tilapia scale-derived fish gelatin (70Chol-Gltn) 40 wt% solution was prepared using 0.1 M PBS and a solvent having a pH of 7.0.
  • tilapia scale-derived fish gelatin (Gltn) 40 wt% solution was prepared using 0.1 M PBS and a pH 7.0 solvent.
  • tissue adhesives of Examples 8-1 to 8-3 were prepared by mixing the three kinds of mixed solutions and the 4S-PEG solution at a volume ratio of 1: 1, respectively.
  • the tissue adhesive was preincubated at 37 ° C. in advance, and then an adhesion test was performed to measure the adhesive strength.
  • FIG. 28 is a graph showing the hydrophobic group introduction rate dependency of the adhesive strength of the tissue adhesive having a weight ratio of 1: 9.
  • tissue adhesives prepared in the examples can be used in a liquid state, not in a gel state, and are very easy to handle compared to a tissue adhesive using porcine gelatin having a molecular weight of about 20000. there were.
  • tissue adhesive prepared by using showed the highest adhesive strength, but the tissue adhesives prepared in other examples also showed higher adhesive strength than the commercially available GRF.
  • Tables 1 to 5 summarize the preparation conditions and test conditions of each test example and example.
  • Example 9 Evaluation of sealing effect of tissue adhesive comprising hydrophobic cod gelatin and 4S-PEG (1) Measurement of pressure strength against porcine aorta (1-1) Experimental method One amino group of cod gelatin (cGltn) The adhesive strength of porcine aorta with tissue adhesive consisting of partly hexanoylated Hx-cGltn and 4S-PEG was examined.
  • tara gelatin having a molecular weight of 153,000 and a hydroxyproline content of 50 per 1000 amino acids was used.
  • cGltn that is not hydrophobized is prepared as an adhesive component (described as Org-cGltn solution or Org), and an aqueous solution containing a water-soluble crosslinking agent 4S-PEG is prepared as a curing component (4S-PEG solution).
  • an adhesive component described as Org-cGltn solution or Org
  • an aqueous solution containing a water-soluble crosslinking agent 4S-PEG is prepared as a curing component (4S-PEG solution).
  • a hydrophobicized cGltn having a hexanoyl group introduction rate of 2.1 mol%, 8.5 mol%, and 18.3 mol% was prepared as an adhesive component (described as 2.1Hx, 8.5Hx, and 18.3Hx). 200 ⁇ l of each was mixed to prepare a 1.0 mm thick sealant (tissue adhesive).
  • the concentration of 4S-PEG was set so that the amino group in cGltn or hydrophobized cGltn and the succinimide group in 4S-PEG were 1: 1.
  • hydrophobic cGltn having a hydrophobic group introduction rate of 2.1 mol% was prepared as an adhesive component (2.1Hx), and this adhesive component and a curing component were mixed to prepare a sealant (tissue adhesive). 50 ⁇ l of this sealant (tissue adhesive) was dropped on the surface of the rat organ. It was allowed to stand in 37 ° C. physiological saline for 3 days and qualitatively evaluated by the amount of remaining adhesive.
  • hydrophobized cGltn with a hydrophobic group introduction rate of 4.9 mol%, 7.5 mol%, and 12.2 mol% by cholesterylation is prepared as an adhesive component, and this adhesive component and a curing component are mixed to form a sealant (tissue adhesive). ) was prepared.
  • the tissue adhesive of the present invention and the method for producing the same relate to a tissue adhesive that can be used in a liquid state, not in a gel form, and has improved ease of handling, while increasing the adhesive strength. It may be used in industries that require a sealant, a hemostatic agent, and the like.
  • Hydrophobized fish-derived gelatin Hydrophobic group (cholesteryl group) 13 Amino group 14 Hydroxychlorine 21 Water-soluble cross-linking molecule 22 Cross-linking part 31, 32 Tissue 41 Tissue adhesive 50 Pig vascular membrane 51 Intima 52 Outer membrane 53 Mask 54 Hole 55 Weight 60 Tissue adhesive 62, 63 Support

Abstract

魚由来ゼラチン水溶液を含む接着成分と、水溶性架橋用分子水溶液を含む硬化成分とを混合して組織に塗布する組織接着剤であって、前記水溶性架橋用分子の分子主鎖がアミド結合またはエチレングリコールユニットまたは糖鎖を有するとともに、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有する組織接着剤とする。

Description

組織接着剤及びその製造方法
　本発明は、組織接着剤及びその製造方法に関する。
　組織接着剤とは、心臓血管外科等の手術の際、血管、皮膚等の生体組織（以下、組織）を行う組織接着剤のことである。これを用いることにより、血液の漏出等を防止でき、手術の安全性を高めることができる。
　組織接着剤として、以下の３種類がある。第１の組織接着剤は、シアノアクリレート系組織接着剤であり、製品としてはＤＥＲＭＡＢＯＮＤがある。この組織接着剤は、接着強度は高いが、生体親和性が低いという課題がある。第２の組織接着剤は、バイオポリマーとアルデヒド系の組織接着剤であり、製品としてはＧＲＦ　ｇｌｕｅがある。この組織接着剤も、接着強度は高いが、生体親和性が低いという課題がある。第３の組織接着剤は、フィブリン系組織接着剤であり、製品としてはボルヒール（Ｂｏｌｈｅａｌ）がある。この組織接着剤は、逆に、生体親和性は高いが、接着強度が低いという課題がある。
　近年、ヒト血清アルブミン（Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ：以下、ＨＳＡ）と架橋剤とからなる組織接着剤の接着強度が高いことが分かってきた（非特許文献１）。
　ＨＳＡは、血液製剤から作られる血清タンパク質であり、分子量６９０００、直径約１０ｎｍの球状タンパク質である。また、マイナスチャージを持った酸性タンパク質である。また、架橋剤としては、酒石酸（Ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　Ｔａｒｔａｒａｔｅ：以下、ＤＳＴ）が用いられている。
　しかし、血液製剤を使うと医薬品の分類となるため、承認認可の面で多大な労力を必要とする。また、医薬品となる場合には、認可後も、使用履歴を２０年間継続して残さねばならず、多大な労力を必要とするという課題がある。
　そのため、ＨＳＡに代わり、非血液製剤であるゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）を用いることが考えられる。例えば、特許文献１は、ゼラチンをスクシンイミド化ポリ－Ｌ－グルタミン酸により架橋して調製する医用材料が開示されている。また、特許文献２は、組織接着フィルムに関するものであり、ゼラチンまたはコラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ）から作成される組織接着フィルムが開示されている。しかし、これらは、接着力が十分でないという課題がある。
　また、特許文献３は、組織接着構成物に関するものであり、粒子形態の合成および／または架橋性の材料と、粒子状材料とが混合された組織接着構成物が開示されている。しかし、この組織接着構成物も、接着力が十分でないという課題がある。
　また、側鎖にアルキル基を導入したゼラチンに関する論文がある（非特許文献２、３）。さらに、側鎖にコレステリル基を導入したゼラチンと酒石酸架橋剤から成る論文がある（非特許文献４）
　ＨＳＡに代わり、分子量が１００００以上５００００未満のゼラチンに疎水性官能基を導入した疎水化ゼラチンを用いることで、接着強度が高く、かつ、生体親和性の高い組織接着剤を提供することができる可能性がある。
　しかし、ゼラチンの分子量を高めれば、接着性を向上させることができるにもかかわらず、ブタ由来のゼラチンを用いた場合には、その分子量を２００００程度にしても、組織接着剤が液体状とならず、ゲル状に固まり、組織接着剤として使用する際に接着部に均一に塗ることができず、塗布性の点で取り扱いが困難となる場合があった。また、常温で放置しておくと、ゼリー状となる場合があった。
　また、酒石酸等の水に不溶性の分子を水溶媒に混合すると、これらの分子を水溶媒中で均一に分散させることができなかった。これらの分子が均一に分散されていない組織接着剤は、接着強度及び接着安定性等の接着特性にバラツキを発生させた。
　一方、水溶性架橋剤Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ　ｄｉ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｓｕｃｃｉｎａｔｅ　（ＰＥＧ－（ＳＳ）２）とＨＳＡからなる組織接着剤は、製品名ＰｒｏＧＥＬとしてアメリカで認可されているので、ＰＥＧ系のポリマーについては、組織接着剤の構成成分として問題なく使用できる可能性が高い。
特開平９―１０３４７９号公報 特開２００８－２８４２５６号公報 特表２００６－５２３１１３号公報
Ｊ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｃｏｍｐａｃｔ．Ｐｏｌｙｍ．，２４，５４６－５５９（２００９） Ｃｏｌｌｏｉｄｓ　Ｓｕｒｆ．Ａ，２７２，２００６，８－１４ Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，１０５，２００７，３３７１－３３７７ Ｃｏｌｌｏｉｄｓ　Ｓｕｒｆ．Ｂ，９１，４８－５６（２０１２）．
　本発明は、接着強度が高く、安定した接着特性を有し、塗布性に優れた組織接着剤及びその製造方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、疎水化魚由来ゼラチン水溶液からなる接着成分と、水溶性架橋用分子水溶液からなる硬化成分とからなり、前記接着成分と硬化成分を混合して組織に塗布する組織接着剤において、魚由来のゼラチンを用いて調製した疎水化魚由来ゼラチンと水溶性架橋用分子と用いることにより、前記接着成分と硬化成分を混合したときに、水溶液中でこれらを均一に分散させて、組織接着剤を調製することができ、これにより安定した接着特性を有する組織接着剤を製造できることを見出した。この組織接着剤は、接着強度が高く、硬化前はゲル状ではなく液体状であるため、加温することなく均一に組織に塗布することができ、塗布性に優れた組織接着剤であることを発見し、本発明を完成した。
　本発明の組織接着剤は、以下のことを特徴としている。
　魚由来ゼラチン水溶液を含む接着成分と、水溶性架橋用分子水溶液を含む硬化成分硬化成分とを混合して組織に塗布する組織接着剤であって、前記水溶性架橋用分子の分子主鎖がアミド結合またはエチレングリコールユニットまたは糖鎖を有するとともに、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有する。
　前記接着成分の前記魚由来ゼラチンが、側鎖に疎水性官能基を備えた疎水化魚由来ゼラチンである。
　前記魚由来ゼラチンは、その構成アミノ酸１０００個当たりヒドロキシプロリンの数が９０個以下の魚由来ゼラチンを主鎖としている。
　前記疎水化魚由来ゼラチンはＬｙｓを含み、かつ、Ｌｙｓのアミノ基の一部が疎水性官能基で置換されている。
　前記疎水性官能基が飽和脂肪酸であるエチル基（炭素数２）、プロピル（炭素数３）、ブチル基（炭素数４）、ペンチル基（炭素数５）、ヘキサノイル基（炭素数６）、ヘプタノイル基（炭素数７）、オクタノイル基（炭素数８）、ノナノイル基（炭素数９）、デカノイル基（炭素数１０）、ウンデカノイル基（炭素数１１）、ドデカノイル基（炭素数１２）、トリデカノイル基（炭素数１３）、テトラデカノイル基（炭素数１４）、ペンタデカノイル基（炭素数１５）、ヘキサデカノイル基（炭素数１６）、ヘプタデカノイル基（炭素数１７）、ステアロイル基（炭素数１８）、分岐型飽和脂肪酸であるイソプロピル（炭素数３）、イソブチル基（炭素数４）、イソペンチル基（炭素数５）、イソヘキサノイル基（炭素数６）、イソヘプタノイル基（炭素数７）、イソオクタノイル基（炭素数８）、イソノナノイル基（炭素数９）、イソデカノイル基（炭素数１０）、イソウンデカノイル基（炭素数１１）、イソドデカノイル基（炭素数１２）、イソトリデカノイル基（炭素数１３）、イソテトラデカノイル基（炭素数１４）、イソペンタデカノイル基（炭素数１５）、イソヘキサデカノイル基（炭素数１６）、イソパルミチル基（炭素数１６）、イソヘプタデカノイル基（炭素数１７）、イソステアロイル基（炭素数１８）、不飽和脂肪酸であるオレイル基（炭素数１８、不飽和炭素１個）、リノレニル基（炭素数１８、不飽和炭素２個）、α－リノレニル基（炭素数１８、不飽和炭素３個）、細胞膜成分であるコレステリル基の１種または２種以上の組み合わせである。
　前記魚由来ゼラチンが、ティラピア、タイまたはタラに由来する魚由来ゼラチンである。
　前記疎水化魚由来ゼラチンの分子量が５００００以上１０００００未満である。
　前記水溶性架橋用分子が、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ　ｄｉ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｓｕｃｃｉｎａｔｅ、Ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ　ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ）　ｅｔｈｅｒ　ｔｅｔｒａｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｇｌｕｔａｒａｔｅ、スクシンイミド化ポリ－Ｌ－グルタミン酸、アルデヒド基導入デンプン、アルデヒド基導入デキストランの群から選ばれる１種または２種以上の組合せである。
　前記魚由来ゼラチン水溶液に用いる水溶媒および前記水溶性架橋用分子水溶液に用いる水溶媒は、ｐＨ６．０以上ｐＨ８．０以下のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）である。
　前記接着成分として、さらに、疎水化されていない魚由来ゼラチンを含有する。
　前記疎水化魚由来ゼラチン水溶液が、常温で液体状である。
　本発明の組織接着剤の製造方法は、以下のことを特徴としている。
　構成アミノ酸１０００個当たりヒドロキシプロリンの数が９０個以下の魚由来ゼラチンを溶解させた溶液にアミン存在下で疎水性官能基を有する有機分子を添加して、前記魚由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の一部を前記疎水性官能基で置換して、疎水化魚由来ゼラチンを合成する工程と、
　前記疎水化魚由来ゼラチンをリン酸緩衝液に分散して疎水化魚由来ゼラチン水溶液を得て、この疎水化魚由来ゼラチン水溶液含む接着成分を調製する工程と、
　分子主鎖がアミド結合あるいはエチレングリコールユニットあるいは糖鎖を有し、かつ、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有する水溶性架橋用分子を、リン酸緩衝液に分散して、水溶性架橋用分子水溶液を含む硬化成分を調製する工程と、
を含む。
　前記接着成分を調製する工程は、前記疎水化魚由来ゼラチン水溶液と、魚由来ゼラチンをリン酸緩衝液に分散して調整した魚由来ゼラチン水溶液とを混合する工程を含む。
　前記疎水化魚由来ゼラチン水溶液と前記魚由来ゼラチン水溶液の重量比を１：９以上５：５未満として混合する。
　魚由来ゼラチン水溶液を含む接着成分と、
　分子主鎖がアミド結合またはエチレングリコールユニットまたは糖鎖を有し、かつ、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有する水溶性架橋用分子水溶液を含む硬化成分と
を混合する工程を含む。
本発明の組織接着剤は、水溶液中で疎水化魚由来ゼラチンと水溶性架橋用分子を均一に分散させて、組織接着剤を調製することができ、これにより接着特性が安定した組織接着剤を製造でき、また、ゲル状ではなく、液体状にすることができ、均一に組織に塗布することが可能な塗布性に優れた組織接着剤とすることができる。また、分子量を大きくすること、及び、前記疎水化ゼラチン同士のアミノ基同士を架橋用分子の活性エステル基あるいは酸無水物あるいはアルデヒド基で架橋して、化学的に強固な結合を形成することができる。更にまた、前記疎水性官能基を組織浸透させ（アンカーリングして）、物理的に強固な結合を形成して、接着強度を高くすることができるとともに、前記疎水化ゼラチンを創傷治癒過程において酵素（コラゲナーゼ）により容易に分解させることができ、生体親和性を高くすることができる。
　本発明の組織接着剤の製造方法は、構成アミノ酸１０００個当たりヒドロキシプロリンの数が９０個以下の魚由来ゼラチンを溶解させた溶液にアミン存在下で疎水性官能基を有する有機分子を添加して、前記魚由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の一部を前記疎水性官能基で置換して、疎水化魚由来ゼラチンを合成する工程と、前記疎水化魚由来ゼラチンをリン酸緩衝液に分散して、疎水化魚由来ゼラチンを含む水溶液からなる接着成分を調製する工程と、水溶性架橋用分子の分子主鎖がアミド結合あるいはエチレングリコールユニットあるいは糖鎖を有するとともに、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有する水溶性架橋用分子をリン酸緩衝液に分散して、水溶性架橋用分子を含む水溶液からなる硬化成分を調製する工程と、を有する構成なので、疎水化魚由来ゼラチンと水溶性架橋用分子を、水溶液中で均一に分散させて、組織接着剤を調製することができ、接着強度が高く、接着特性が安定し、塗布性に優れた組織接着剤を容易に製造できる。
　本発明の組織接着剤の製造方法は、前記疎水化魚由来ゼラチン水溶液と、魚由来ゼラチンをリン酸緩衝液に分散して調整した魚由来ゼラチン水溶液とを混合する工程を含むことが好ましく、これによって、疎水化魚由来ゼラチンと水溶性架橋用分子を、水溶液中で均一に分散させて、組織接着剤を調製することができ、接着強度が高く、接着特性が安定し、塗布性に優れた組織接着剤を容易に製造できる。また、疎水基の凝集を阻害でき、組織接着剤の接着強度を向上させることができる。
本発明の組織接着剤の一例を示す概略図である。 本発明の組織接着剤を用いた接着の一例を示す概略図である。 本発明の組織接着剤の一例を示す概略図である。 接着試験の概要図である。 接着試験の概要図である。 接着試験の概要図である。 接着強度の水溶性架橋用分子（４Ｓ－ＰＥＧ）の濃度依存性のグラフである。 接着強度の溶媒（ＰＢＳ）ｐＨ値依存性のグラフである。 試験例２－１の接着剤を用いた接着試験後の組織をヘマトキシリンとエオシンで染色した断面像である。試験例２－１の接着剤の作成条件は、Ｇｌｔｎ　４０ｗｔ％ｓｏｌｎ．４Ｓ－ＰＥＧ　４．５ｍＭ（０．１Ｍ　ＰＢＳ　ｐＨ６．０）である。 試験例２－２の接着剤を用いた接着試験後の組織をヘマトキシリンとエオシンで染色した断面像である。試験例２－２の接着剤の作成条件は、Ｇｌｔｎ　４０ｗｔ％ｓｏｌｎ．４Ｓ－ＰＥＧ　４．５ｍＭ（０．１Ｍ　ＰＢＳ　ｐＨ６．５）である。 試験例２－３の接着剤を用いた接着試験後の組織をヘマトキシリンとエオシンで染色した断面像である。試験例２－３の接着剤の作成条件は、Ｇｌｔｎ　４０ｗｔ％ｓｏｌｎ．４Ｓ－ＰＥＧ　４．５ｍＭ（０．１Ｍ　ＰＢＳ　ｐＨ７．０）である。 試験例２－４の接着剤を用いた接着試験後の組織をヘマトキシリンとエオシンで染色した断面像である。試験例２－４の接着剤の作成条件は、Ｇｌｔｎ　４０ｗｔ％ｓｏｌｎ．４Ｓ－ＰＥＧ　４．５ｍＭ（０．１Ｍ　ＰＢＳ　ｐＨ７．５）である。 ＧＲＦを用いた接着試験後の組織をヘマトキシリンとエオシンで染色した断面像である。 接着強度の接着時間依存性のグラフである。 接着強度の疎水基（Ｃｈｏｌ基）導入率依存性のグラフである。 接着強度の４Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性のグラフである。 実施例３－１の接着剤を用いた接着試験後の組織をヘマトキシリンとエオシンで染色した断面像である。実施例３－１の接着剤の作成条件は、４Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎ＝０：１０　４０ｗｔ％ｓｏｌｎ．（０．１Ｍ　ＰＢＳ　ｐＨ７．４）、４Ｓ－ＰＥＧ　４．５ｍＭ（０．１Ｍ　ＰＢＳ　ｐＨ７．４）である。 実施例３－２の接着剤を用いた接着試験後の組織をヘマトキシリンとエオシンで染色した断面像である。実施例３－２の接着剤の作成条件は、４Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎ＝１：９　４０ｗｔ％ｓｏｌｎ．（０．１Ｍ　ＰＢＳ　ｐＨ７．４）、４Ｓ－ＰＥＧ　４．５ｍＭ（０．１Ｍ　ＰＢＳ　ｐＨ７．４）である。 実施例３－３の接着剤を用いた接着試験後の組織をヘマトキシリンとエオシンで染色した断面像である。実施例３－３の接着剤の作成条件は、４Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎ＝３：７　４０ｗｔ％ｓｏｌｎ．（０．１Ｍ　ＰＢＳ　ｐＨ７．４）、４Ｓ－ＰＥＧ　４．５ｍＭ（０．１Ｍ　ＰＢＳ　ｐＨ７．４）である。 実施例３－４の接着剤を用いた接着試験後の組織をヘマトキシリンとエオシンで染色した断面像である。実施例３－４の接着剤の作成条件は、４Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎ＝５：５　４０ｗｔ％ｓｏｌｎ．（０．１Ｍ　ＰＢＳ　ｐＨ７．４）、４Ｓ－ＰＥＧ　４．５ｍＭ（０．１Ｍ　ＰＢＳ　ｐＨ７．４）である。 実施例３－５の接着剤を用いた接着試験後の組織をヘマトキシリンとエオシンで染色した断面像である。実施例３－５の接着剤の作成条件は、４Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎ＝７：３　４０ｗｔ％ｓｏｌｎ．（０．１Ｍ　ＰＢＳ　ｐＨ７．４）、４Ｓ－ＰＥＧ　４．５ｍＭ（０．１Ｍ　ＰＢＳ　ｐＨ７．４）である。 実施例３－６の接着剤を用いた接着試験後の組織をヘマトキシリンとエオシンで染色した断面像である。実施例３－６の接着剤の作成条件は、４Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎ＝９：１　４０ｗｔ％ｓｏｌｎ．（０．１Ｍ　ＰＢＳ　ｐＨ７．４）、４Ｓ－ＰＥＧ　４．５ｍＭ（０．１Ｍ　ＰＢＳ　ｐＨ７．４）である。 接着強度の７Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性のグラフである。 接着強度の４Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性のグラフである。 接着強度の７Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性のグラフである。 接着強度の２３Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性のグラフである。 接着強度の７０Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性のグラフである。 重量比１：９の組織接着剤の接着強度の疎水基導入率依存性を示すグラフである。 コレステリル化による疎水基導入率が4.9mol%、7.5mol%、12.2mol%の疎水化タラゼラチンを接着成分として使用した場合における、ブタ大動脈中膜の破断面の様子を示した顕微鏡写真である。
（本発明の実施形態）
　以下、添付図面を参照しながら、本発明の実施形態である組織接着剤及びその製造方法について説明する。
　本発明の実施形態である組織接着剤は、魚由来ゼラチン水溶液を含む接着成分と、水溶性架橋用分子水溶液を含む硬化成分とを混合して組織に塗布する組織接着剤である。なかでも、魚由来ゼラチンとして、側鎖に疎水性官能基を備えた疎水化魚由来ゼラチンを使用することが好ましい。
　図１では、疎水化魚由来ゼラチンと水溶性架橋用分子とを有する形態を例示している。
　前記疎水化魚由来ゼラチンは、２個以上のアミノ酸が直鎖状に連結された高分子である。前記アミノ酸として含まれるＬｙｓのアミノ基の一部が前記疎水性官能基で置換されている。Ｌｙｓは、タンパク質を構成するα－アミノ酸の一つであり、必須アミノ酸である。側鎖にε－アミノ基を持つアミノ酸である。
　Ｌｙｓのアミノ基の一部は、疎水性官能基で容易に置換でき、疎水化魚由来ゼラチンのＬｙｓのアミノ基の一部は疎水性官能基で置換されている。
　前記疎水化魚由来ゼラチンは、その構成アミノ酸１０００個当たり、次式（１）に示すヒドロキシプロリン（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ）の数が９０個以下の魚由来ゼラチンを主鎖とし、その側鎖にアミノ基と疎水性官能基とを備えていることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  
 
　魚由来ゼラチン骨格を用いることにより、酵素により容易に分解させることができ、生体親和性が高くできる。また、水溶媒への分散性を高めることができる。
　魚由来ゼラチンは、ティラピア、タイまたはタラのいずれかの魚由来ゼラチンであることが好ましい。これにより、水溶液中で均一に分散させて、組織接着剤を調製することができ、ゲル状ではなく、液体状にすることができ、均一に組織に塗布することが可能な塗布性に優れた組織接着剤とすることができる。
　疎水化魚由来ゼラチンの分子量は、５００００以上１０００００未満であることが好ましい。分子量を５００００以上とすることにより、接着強度を向上させることができる。また、疎水化魚由来ゼラチンは、魚ゼラチンを主骨格とするので、水溶媒への分散性が高く、分子量を５００００以上としても、ゲル化せず、液体状に保持できる。
　魚由来ゼラチンに導入した疎水性官能基は組織にアンカーリングして、魚由来ゼラチンを組織に強固に固定することができる。これにより、疎水化魚由来ゼラチンを組織に物理的に強固に接着させることができ、接着強度を向上させることができる。
　疎水性官能基として、例えば、次式（２）に示すコレステリル基を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  
　疎水性官能基としては、飽和脂肪酸であるエチル基（炭素数２）、プロピル（炭素数３）、ブチル基（炭素数４）、ペンチル基（炭素数５）、ヘキサノイル基（炭素数６）、ヘプタノイル基（炭素数７）、オクタノイル基（炭素数８）、ノナノイル基（炭素数９）、デカノイル基（炭素数１０）、ウンデカノイル基（炭素数１１）、ドデカノイル基（炭素数１２）、トリデカノイル基（炭素数１３）、テトラデカノイル基（炭素数１４）、ペンタデカノイル基（炭素数１５）、ヘキサデカノイル基（炭素数１６）、ヘプタデカノイル基（炭素数１７）、ステアロイル基（炭素数１８）、分岐型飽和脂肪酸であるイソプロピル（炭素数３）、イソブチル基（炭素数４）、イソペンチル基（炭素数５）、イソヘキサノイル基（炭素数６）、イソヘプタノイル基（炭素数７）、イソオクタノイル基（炭素数８）、イソノナノイル基（炭素数９）、イソデカノイル基（炭素数１０）、イソウンデカノイル基（炭素数１１）、イソドデカノイル基（炭素数１２）、イソトリデカノイル基（炭素数１３）、イソテトラデカノイル基（炭素数１４）、イソペンタデカノイル基（炭素数１５）、イソヘキサデカノイル基（炭素数１６）、イソパルミチル基（炭素数１６）、イソヘプタデカノイル基（炭素数１７）、イソステアロイル基（炭素数１８）、不飽和脂肪酸であるオレイル基（炭素数１８、不飽和炭素１個）、リノレニル基（炭素数１８、不飽和炭素２個）、α－リノレニル基（炭素数１８、不飽和炭素３個）、細胞膜成分であるコレステリル基の１種または２種以上の組み合わせを挙げることができる。これにより、疎水性官能基を組織に打ち込んで（アンカーリングして）物理的に強固な結合を形成して、接着強度を高くすることができる。
　水溶性架橋用分子は、水溶性架橋用分子の分子主鎖がアミド結合あるいはエチレングリコールユニットあるいは糖鎖を有するとともに、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有する。
　水溶性架橋用分子の分子主鎖がアミド結合あるいはエチレングリコールユニットあるいは糖鎖を有することにより、高い水溶性を示し、水溶媒中で分散性を高くすることができる。一分子内に２個以上の活性エステル基あるいは酸無水物あるいはアルデヒド基を有することにより、これらの水溶性架橋用分子は、疎水化魚由来ゼラチンの２つのアミノ基と反応して、結合することができ、２個以上の疎水化魚由来ゼラチンを架橋して、強固な接着構造体を形成することができる。
　前記活性エステル基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミジル基の１種または２種以上の組み合わせであることが好ましい。スクシンイミドは、生体内の代謝経路に存在するコハク酸の誘導体であり、アメリカ食品医薬品局で認可された組織接着剤（シーラント）に使用されている実績があるためである。
　水溶性架橋用分子は、４Ｓ－ＰＥＧ、ＰＥＧ－（ＳＳ）２、スクシンイミド化ポリ－Ｌ－グルタミン酸、アルデヒド基導入デンプン、アルデヒド基導入デキストランの群から選ばれる１種または２種以上の組合せを挙げることができる。
　例えば、水溶性架橋用分子として、次式（３）に示すＰｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ　ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ）　ｅｔｈｅｒ　ｔｅｔｒａｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｇｌｕｔａｒａｔｅ（略称：４Ｓ－ＰＥＧ）を挙げることができる。ｎは、６０以下が好ましい。分子量は１０，０００程度とすることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  
　水溶媒はリン酸緩衝液を用いることができる。そのｐＨ値は５～９とすることが好ましく、６～８とすることがより好ましい。これにより、生体組織を接着する際に、水溶媒を介して、疎水化魚由来ゼラチンと水溶性架橋用分子とを効率よく架橋反応させることができる。
＜本実施形態の組織接着剤を用いた組織の接着について＞
　次に、本実施形態の組織接着剤を用いた組織の接着について説明する。
　まず、２枚の平面視略矩形状（例えば、長さ１ｃｍ×幅１ｃｍ、高さ０．５ｃｍ）の組織を用意する。組織としては、疑似皮膚としてｃｏｌｌａｇｅｎ、ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、ｇｌｙｃｅｒｉｎ等の成分から成るコラーゲンケーシングを用いることができる。
　次に、液状の接着成分と液状の硬化成分と、ダブルシリンジ注射器を用いて、一方の組織の一面に塗布してから、前記一面上でこれらを混合する。
　次に、他方の組織を、前記接着剤の塗布部分を覆うように押しつけてから、その他面側に重りを置いて加重を付加した状態で一定時間放置する。
　なお、前記放置時間は、組織接着剤が固化するのに必要な時間であり、組織接着剤中の構成材料の割合によって適宜設定する。最大で１０分程度とすることが好ましい。また、この際、例えば、３７℃以下の温度で加熱してインキュベートすることが好ましい。これにより、硬化速度を上げることができる。なお、接着後固化するまで室温で放置してもよい。
　なお、組織接着剤は使用前に３７℃以下の温度にプレインキュベートしてから、塗布することが好ましい。
　図２は、本発明の実施形態である組織接着剤を用いた組織の接着の一例を示す概略図である。
　次式（４）で表される加水分解反応により、疎水化魚由来ゼラチンのアミノ基と架橋用分子の一の活性エステル基が反応して、アミド結合が形成する。その際、活性エステル基中のＮ－ヒドロキシスクシンイミドが遊離する。式（４）において、－ＣＯＯＲは、水溶性架橋用分子の活性エステル、－ＮＨ２は、疎水化魚由来ゼラチン中のアミノ基を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
  
　この架橋反応が連鎖的に行われることにより、複数の疎水化魚由来ゼラチンが水溶性架橋用分子により化学的に強固に結合された構造体が形成される。
　なお、この水溶性架橋用分子の活性エステル基は、疎水化魚由来ゼラチンおよび生体組織中に存在するコラーゲンなどのタンパク質のアミノ基とも反応して、アミド結合を形成する。これにより、より化学的に強固に結合された構造体が形成される。
　また、図２に示すように、疎水的な相互作用により、一定の分子量及び大きさを有する疎水性官能基が組織に浸透し、疎水化魚由来ゼラチンは、強固に組織に固定される。これにより、前記構造体は、物理的に強固に、組織の表面に接着される。
　さらに、接着成分は、疎水化魚由来ゼラチンと疎水化されていない魚由来ゼラチンを含有することがより好ましい。これによって、疎水基の凝集を阻害することができ、組織接着剤の接着強度を高めることができる。
＜組織接着剤の製造方法＞
　次に、本発明の実施形態である組織接着剤の製造方法の一例について説明する。
　本発明の実施形態である組織接着剤の製造方法は、魚由来ゼラチン水溶液を含む接着成分と、分子主鎖がアミド結合またはエチレングリコールユニットまたは糖鎖を有し、かつ、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有する水溶性架橋用分子水溶液を含む硬化成分とを混合する工程を含む。
　また、本発明の組織接着剤の製造方法は、より好ましくは、疎水化魚由来ゼラチン合成工程Ｓ１と、接着成分調製工程Ｓ２と、硬化成分調製工程Ｓ３と、を有する。
（疎水化魚由来ゼラチン合成工程Ｓ１）
　まず、その構成アミノ酸１０００個当たりヒドロキシプロリンの数が９０個以下の魚由来ゼラチンを溶解させた溶液に、アミン存在下で疎水性官能基を有する有機分子を添加して、前記魚由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の一部を前記疎水性官能基で置換して、疎水化魚由来ゼラチンを合成する。
　例えば、有機溶媒に溶解した魚由来ゼラチンにトリエチルアミン存在下で、アミノ基に反応性を有する疎水性官能基を有する酸クロライドを混合して、混合溶液を容器に調製する。
　有機溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いる。
　有機分子としては、例えば、次式（５）に示すコレステリルクロロフォルメイトを挙げることができる。
　次に、前記混合溶液を、不活性ガス雰囲気下、加熱し、攪拌する。例えば、窒素雰囲気下、加熱温度は８０℃とし、攪拌時間は一昼夜とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
  
　次に、この混合溶液を、氷冷したエタノール溶媒中に滴下する。次に、この溶液をガラスフィルター等で濾過する。
　更に、濾過物を有機溶媒で洗浄する。これにより、濾過物中の不純物を除去することができ、疎水化魚由来ゼラチンの純度を向上させることができる。この洗浄用の有機溶媒としては、例えば、エタノールあるいは酢酸エチルを用いる。
　以上の工程により、魚由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の一部を疎水性官能基で置換した疎水化魚由来ゼラチンを生成できる。
（接着成分調製工程Ｓ２）
　前記疎水化魚由来ゼラチンをリン酸緩衝液に分散して、疎水化魚由来ゼラチンを含む水溶液からなる接着成分を調製する。
　リン酸緩衝液のｐＨを適宜設定することにより、固化までの時間を適宜設定することができる。ｐＨ６～８の緩衝液を用いることにより、混合した際の架橋反応を早く進行させることができる。
（硬化成分調製工程Ｓ３）
　水溶性架橋用分子の分子主鎖がアミド結合あるいはエチレングリコールユニットあるいは糖鎖を有するとともに、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有する水溶性架橋用分子をリン酸緩衝液に分散して、水溶性架橋用分子を含む水溶液からなる硬化成分を調製する。
　リン酸緩衝液のｐＨを適宜設定することにより、固化までの時間を適宜設定することができる。ｐＨ６～８の緩衝液を用いることにより、混合した際の架橋反応を早く進行させることができる。
　以上の工程により、本発明の実施形態である組織接着剤を容易に製造できる。
　前記接着成分と、前記硬化成分とを混合して、組織に塗布してから、別の組織を張り合わせることにより、２つの組織を容易に接着できる。
＜組織接着剤の製造方法（別の一例）＞
　次に、本発明の実施形態である組織接着剤の製造方法の別の一例について説明する。
　本発明の実施形態である組織接着剤の製造方法の別の一例は、疎水化魚由来ゼラチン合成工程Ｓ１１と、疎水化魚由来ゼラチンを含む水溶液調製工程Ｓ１２と、魚由来ゼラチンを含む水溶液調製工程Ｓ１３と、接着成分調製工程とＳ１４と、硬化成分調製工程Ｓ１５と、を有する。
　疎水化魚由来ゼラチン合成工程Ｓ１１は、先に記載した疎水化魚由来ゼラチン合成工程Ｓ１と同一の工程である。
　疎水化魚由来ゼラチンを含む水溶液調製工程Ｓ１２は、先に記載した接着成分調製工程Ｓ２と同一の工程である。
（魚由来ゼラチンを含む水溶液調製工程Ｓ１３）
　魚由来ゼラチンをリン酸緩衝液に分散して、魚由来ゼラチンを含む水溶液を調製する。
　リン酸緩衝液のｐＨを適宜設定することにより、固化までの時間を適宜設定することができる。ｐＨ６～８の緩衝液を用いることにより、混合した際の架橋反応を早く進行させることができる。
（接着成分調製工程とＳ１４）
　前記疎水化魚由来ゼラチンを含む水溶液と、前記魚由来ゼラチンを含む水溶液とを混合して、混合溶液からなる接着成分を調製する。
重量比は１：９～５：５にすることが好ましく、１：９とすることがより好ましい。これにより、分散性を高めることができ、凝集を抑制できる。
　硬化成分調製工程Ｓ１５は、先に記載した硬化成分調製工程Ｓ３と同一の工程である。
　以上の工程により、本発明の実施形態である組織接着剤を容易に製造できる。
　前記接着成分と、前記硬化成分とを混合して、組織に塗布してから、別の組織を張り合わせることにより、２つの組織を容易に接着できる。
　前記接着成分と、前記硬化成分との体積比は１：１程度にすることが好ましい。分散性を高めることができる。
　本発明の実施形態である組織接着剤は、水溶液中で疎水化魚由来ゼラチンと水溶性架橋用分子を均一に分散させて、組織接着剤を調製することができ、これにより接着特性が安定した組織接着剤を製造でき、また、ゲル状ではなく、液体状にすることができ、均一に組織に塗布することが可能な塗布性に優れた組織接着剤とすることができる。また、分子量を大きくすること、及び、前記疎水化ゼラチン同士のアミノ基同士を架橋用分子の活性エステル基あるいは酸無水物で架橋して、化学的に強固な結合を形成することができる。更にまた、前記疎水性官能基を組織浸透させ（アンカーリングして）、物理的に強固な結合を形成して、接着強度を高くすることができるとともに、前記疎水化ゼラチンを創傷治癒過程において酵素（コラゲナーゼ）により容易に分解させることができ、生体親和性を高くすることができる。
　本発明の実施形態である組織接着剤は、前記疎水化魚由来ゼラチンが、２個以上のアミノ酸が直鎖状に連結された高分子であって、前記アミノ酸として含まれるＬｙｓのアミノ基の一部が前記疎水性官能基で置換されている構成なので、疎水化ゼラチン中に存在するアミノ基同士を、架橋用分子の活性エステル基で架橋して、化学的に強固な結合を形成することができ、接着強度を高くすることができるとともに、疎水化ゼラチンを創傷治癒過程において酵素（コラゲナーゼ）により容易に分解させることができ、生体親和性を高くすることができる。
　本発明の実施形態である組織接着剤は、前記疎水性官能基が飽和脂肪酸であるエチル基（炭素数２）、プロピル（炭素数３）、ブチル基（炭素数４）、ペンチル基（炭素数５）、ヘキサノイル基（炭素数６）、ヘプタノイル基（炭素数７）、オクタノイル基（炭素数８）、ノナノイル基（炭素数９）、デカノイル基（炭素数１０）、ウンデカノイル基（炭素数１１）、ドデカノイル基（炭素数１２）、トリデカノイル基（炭素数１３）、テトラデカノイル基（炭素数１４）、ペンタデカノイル基（炭素数１５）、ヘキサデカノイル基（炭素数１６）、ヘプタデカノイル基（炭素数１７）、ステアロイル基（炭素数１８）、分岐型飽和脂肪酸であるイソプロピル（炭素数３）、イソブチル基（炭素数４）、イソペンチル基（炭素数５）、イソヘキサノイル基（炭素数６）、イソヘプタノイル基（炭素数７）、イソオクタノイル基（炭素数８）、イソノナノイル基（炭素数９）、イソデカノイル基（炭素数１０）、イソウンデカノイル基（炭素数１１）、イソドデカノイル基（炭素数１２）、イソトリデカノイル基（炭素数１３）、イソテトラデカノイル基（炭素数１４）、イソペンタデカノイル基（炭素数１５）、イソヘキサデカノイル基（炭素数１６）、イソパルミチル基（炭素数１６）、イソヘプタデカノイル基（炭素数１７）、イソステアロイル基（炭素数１８）、不飽和脂肪酸であるオレイル基（炭素数１８、不飽和炭素１個）、リノレニル基（炭素数１８、不飽和炭素２個）、α－リノレニル基（炭素数１８、不飽和炭素３個）、細胞膜成分であるコレステリル基の１種または２種以上の組み合わせである構成なので、疎水性官能基を組織に打ち込んで（アンカーリングして）物理的に強固な結合を形成して、接着強度を高くすることができる。
　本発明の実施形態である組織接着剤は、前記魚由来ゼラチンが、ティラピア、タイまたはタラのいずれかの魚由来ゼラチンである構成なので、水溶液中で均一に分散させて、組織接着剤を調製することができ、これにより接着特性が安定した組織接着剤を製造でき、また、ゲル状ではなく、液体状にすることができ、均一に組織に塗布することが可能な塗布性に優れた組織接着剤とすることができる。
　本発明の実施形態である組織接着剤は、前記疎水化魚由来ゼラチンの分子量が５００００以上１０００００未満である構成なので、組織接着剤の結合を化学的に強固な結合にすることができる。
　本発明の実施形態である組織接着剤は、前記水溶性架橋用分子が、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ　ｄｉ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｓｕｃｃｉｎａｔｅ、Ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ　ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ）　ｅｔｈｅｒ　ｔｅｔｒａｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｇｌｕｔａｒａｔｅ、スクシンイミド化ポリ－Ｌ－グルタミン酸、アルデヒド基導入デンプン、アルデヒド基導入デキストランの群から選ばれる１種または２種以上の組合せである構成なので、水溶媒中で分散性高く溶解させることができる。また、疎水化ゼラチン同士のアミノ基同士および生体組織中に存在するコラーゲンなどのタンパク質のアミノ基同士を、架橋用分子の活性エステル基または酸無水物で架橋して、組織接着剤の結合を化学的に強固な結合にすることができる。
　本発明の実施形態である組織接着剤は、前記水溶液に用いる水溶媒が、ｐＨ６．０以上ｐＨ８．０以下のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）である構成なので、固化までの時間を適宜設定することができる。
　本発明の実施形態である組織接着剤は、構成アミノ酸１０００個当たりヒドロキシプロリンの数が９０個以下の魚由来ゼラチンを有する構成なので、疎水基の凝集を阻害でき、組織接着剤の接着強度を向上させることができる。
　本発明の実施形態である組織接着剤の製造方法は、構成アミノ酸１０００個当たりヒドロキシプロリンの数が９０個以下の魚由来ゼラチンを溶解させた溶液にアミン存在下で疎水性官能基を有する有機分子を添加して、前記魚由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の一部を前記疎水性官能基で置換して、疎水化魚由来ゼラチンを合成する工程と、前記疎水化魚由来ゼラチンをリン酸緩衝液に分散して、疎水化魚由来ゼラチンを含む水溶液からなる接着成分を調製する工程と、水溶性架橋用分子の分子主鎖がアミド結合あるいはエチレングリコールユニットあるいは糖鎖を有するとともに、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有する水溶性架橋用分子をリン酸緩衝液に分散して、水溶性架橋用分子を含む水溶液からなる硬化成分を調製する工程と、を有する構成なので、疎水化魚由来ゼラチンと水溶性架橋用分子を、水溶液中で均一に分散させて、組織接着剤を調製することができ、接着強度が高く、接着特性が安定し、塗布性に優れた組織接着剤を容易に製造できる。
　本発明の実施形態である組織接着剤の製造方法は、構成アミノ酸１０００個当たりヒドロキシプロリン（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ）の数が９０個以下の魚由来ゼラチンを溶解させた溶液にアミン存在下で疎水性官能基を有する有機分子を添加して、前記魚由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の一部を前記疎水性官能基で置換して、疎水化魚由来ゼラチンを合成する工程と、前記疎水化魚由来ゼラチンをリン酸緩衝液に分散して、疎水化魚由来ゼラチンを含む水溶液を調製する工程と、前記魚由来ゼラチンをリン酸緩衝液に分散して、魚由来ゼラチンを含む水溶液を調製する工程と、前記疎水化魚由来ゼラチンを含む水溶液と、前記魚由来ゼラチンを含む水溶液とを混合して、混合溶液からなる接着成分を調製する工程と、水溶性架橋用分子の分子主鎖がアミド結合あるいはエチレングリコールユニットあるいは糖鎖を有するとともに、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有する水溶性架橋用分子をリン酸緩衝液に分散して、水溶性架橋用分子を含む水溶液からなる硬化成分を調製する工程と、を有する構成なので、疎水化魚由来ゼラチンと水溶性架橋用分子を、水溶液中で均一に分散させて、組織接着剤を調製することができ、接着強度が高く、接着特性が安定し、塗布性に優れた組織接着剤を容易に製造できる。また、疎水基の凝集を阻害でき、組織接着剤の接着強度を向上させることができる。
　本発明の実施形態である組織接着剤の製造方法は、前記疎水化魚由来ゼラチンを含む溶液と魚由来ゼラチンを含む水溶液の重量比を１：９以上５：５未満として、前記混合溶液からなる接着成分を調製する構成なので、疎水基の凝集を阻害でき、組織接着剤の接着強度を向上させることができる。
　本発明の実施形態である組織接着剤及びその製造方法は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で、種々変更して実施することができる。本実施形態の具体例を以下の実施例で示す。しかし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（試験例１）
＜水溶性架橋用分子（４Ｓ－ＰＥＧ）濃度依存性評価用Ｇｌｔｎ／４Ｓ－ＰＥＧ組織接着剤の調製＞
　まず、魚ゼラチンとしてティラピア鱗由来魚ゼラチン（略称：Ｇｌｔｎ、ＭＷ：７０，０００、ヒドロキシプロリン含量：アミノ酸１０００個当たり７９個、新田ゼラチン製）、水溶性架橋用分子としてＰｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ　ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ）　ｅｔｈｅｒ　ｔｅｔｒａｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｇｌｕｔａｒａｔｅ（略称：４Ｓ－ＰＥＧ、ＭＷ：１０，０００、日油製）、生理食塩水（大塚製薬製）を用意した。
次に、０．１Ｍ、ｐＨ７．０のリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ、略称：ＰＢＳ）を調製した。
次に、Ｇｌｔｎ濃度が４０ｗｔ％となるようにＧｌｔｎを０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）に溶解して、ゼラチン溶液（Ｇｌｔｎ溶液）を調製した。
　次に、所定量の４Ｓ－ＰＥＧを０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０）に溶解して、５、７．５、１０、１５、１７ｍＭの５種の４Ｓ－ＰＥＧ溶液を調製した。
　次に、Ｇｌｔｎ溶液と５種の４Ｓ－ＰＥＧ溶液をそれぞれ体積比１：１で混合して、試験例１－１～１－５の組織接着剤を調製した。
　次に、これらの組織接着剤をあらかじめ３７℃にプレインキュベートしてから、接着試験を行い、接着強度を測定した。
＜接着試験（せん断引張測定）＞
　組織接着剤のせん断引張測定による接着試験を行った。
　図４～６は、接着試験の概要図である。
　まず、１０ｍｍ×３０ｍｍのブタ血管膜５０を２枚用意した。ブタ血管膜５０は一面側が中膜５１とされ、他面側が外膜５２とされている。
　次に、図４に示すように、１枚のブタ血管膜５０の一端側の中膜５１上に、１辺が約１２ｍｍの平面視正方形状で、厚さ０．５ｍｍのシリコンシートからなるマスク５３を配置した。マスク５３には、直径１０ｍｍの平面視円形状の孔部５４が設けられている。また、マスク５３の一辺側には、孔部５４につながるスリットが設けられている。
　次に、孔部５４から露出する中膜５１上に、組織接着剤６０を滴下した。
　その後、すぐに、もう１枚のブタ血管膜５０の一端側を、組織接着剤６０を介して中膜５１同士が重ね合うように配置した。
　次に、図５に示すように、重ね合わせたブタ血管膜５０の上に、重さ５０ｇの分銅５５を載せた。
　次に、インキュベータにおいて、３７℃で１０分間静置して、インキュベートした。
　次に、インキュベート後すぐに、図６に示すように、支持部６２、６３にブタ血管膜５０の他端側を挟みこみ固定してから、互いに逆方向に引っ張り、Ｔｅｘｔｕｒｅ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（英弘精機社製）にて、せん断引張測定を行った。
＜接着強度の水溶性架橋用分子（４Ｓ－ＰＥＧ）濃度依存性評価結果＞
　水溶性架橋用分子として用いた４Ｓ－ＰＥＧは、塩存在下において塩析が生じ、架橋後のバルク強度が落ちることが想定される。そのため、接着強度の水溶性架橋用分子（４Ｓ－ＰＥＧ）の濃度依存性を測定した。ティラピア鱗由来魚ゼラチン（Ｇｌｔｎ）は、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒に溶解した。
　図７に示す結果（接着強度の水溶性架橋用分子（４Ｓ－ＰＥＧ）の濃度依存性）が得られた。図７に示すように、４Ｓ－ＰＥＧ濃度が１５ｍＭのときに接着強度は極大値を示した。
　なお、Ｇｌｔｎの残存アミノ基はトリニトロベンゼンスルホン酸法により、１６９．６４μｍｏｌ／ｇであることから、アミノ基：スクシンイミジル基＝１：１となる条件は、４Ｓ－ＰＥＧ濃度１７ｍＭのときであるので、アミノ基：スクシンイミジル基＝１：１となるように架橋された状態となることにより、接着強度が極大となったものと推察された。
（試験例２）
＜溶媒ｐＨ値依存性評価用Ｇｌｔｎ／４Ｓ－ＰＥＧ組織接着剤の調製＞
　まず、ティラピア鱗由来魚ゼラチン（Ｇｌｔｎ）４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５のいずれかとした溶媒を用いて調製した。　
　次に、４．５ｍＭの４Ｓ－ＰＥＧ溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５のいずれかとした溶媒を用いて調製した。
　次に、同じｐＨ値のＧｌｔｎ溶液と４Ｓ－ＰＥＧ溶液を、体積比１：１で混合して、試験例２－１～２－４の組織接着剤を調製した。
　次に、これらの組織接着剤をあらかじめ３７℃にプレインキュベートしてから、接着試験を行い、接着強度を測定した。
　なお、比較のために、ゼラチンとホルムアルデヒドからなる市販の組織接着剤（Ｇｅｌａｔｉｎ　Ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ　Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ：ＧＲＦと表記する。）の接着強度の測定も行った。
＜接着強度の溶媒（ＰＢＳ）ｐＨ値依存性評価結果＞
　本組織接着剤の架橋反応はゼラチンのアミノ基が４Ｓ－ＰＥＧの活性エステルに対しての求核置換反応であり、反応速度はアミノ基のプロトネーション、つまり溶媒のｐＨ値に依存している。そのため、接着強度の溶媒（ＰＢＳ）ｐＨ値依存性を測定した。
　図８に示す結果（接着強度の溶媒（ＰＢＳ）ｐＨ値依存性）が得られた。図８に示すように、溶媒（ＰＢＳ）のｐＨ値が７．０のときに接着強度は極大値を示した。
　また、図９～図１２は、それぞれ試験例２－１～２－４の接着剤を用いた接着試験後の組織をヘマトキシリンとエオシンで染色した断面像である。各接着剤の作成条件は、Ｇｌｔｎ　４０ｗｔ％ｓｏｌｎ．４Ｓ－ＰＥＧ　４．５ｍＭ（０．１Ｍ　ＰＢＳ　ｐＨ６．０（試験例２－１）、６．５（試験例２－２）、７．０（試験例２－３）、７．５（試験例２－４））である。
　また、比較のため、図１３に、ＧＲＦを用いた接着試験後の組織をヘマトキシリンとエオシンで染色した断面像を示している。
　図９～図１３ではいずれも、観察された接着剤硬化物（上部）が破壊していた。
（実施例１）
＜４Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎ（１：９）／４Ｓ－ＰＥＧ組織接着剤の調製＞
　まず、Ｇｌｔｎ中の全アミノ基に対する疎水基（Ｃｈｏｌ）導入率が４ｍｏｌ％で疎水化したティラピア鱗由来魚ゼラチン（Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ）を調製した。
　次に、疎水化したティラピア鱗由来魚ゼラチン（４Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ）４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒を用いて調製した。
　次に、ティラピア鱗由来魚ゼラチン（Ｇｌｔｎ）４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒を用いて調製した。
　次に、Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液：Ｇｌｔｎ溶液＝１：９の混合比（重量比）となるように混合溶液を調製した。
　次に、１５ｍＭの４Ｓ－ＰＥＧ溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒を用いて調製した。
　次に、混合溶液と４Ｓ－ＰＥＧ溶液を、体積比１：１で混合して、実施例１の組織接着剤を調製した。
　次に、この組織接着剤を、あらかじめ３７℃にプレインキュベートしてから、接着試験を行い、接着時間１、３、５、１０、１５、３０、４５（ｍｉｎ）での接着強度を測定した。
＜接着強度の接着時間依存性評価結果＞
　図１４に示す結果（接着強度の接着時間依存性）が得られた。図１４に示すように、接着時間が１０分で、接着強度はほぼ最大値となり、飽和して、これ以後接着時間を長くしても、接着強度はあまり変化しなかった。
（実施例２）
＜０、４、７、２３、７０Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ／４Ｓ－ＰＥＧ組織接着剤の調製＞
　まず、Ｇｌｔｎ中の全アミノ基に対する疎水基（Ｃｈｏｌ基）導入率が４、７、２３、７０ｍｏｌ％で疎水化したティラピア鱗由来魚ゼラチン（Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ）を調製した。また、疎水化していないティラピア鱗由来魚ゼラチンも評価したが、これは０Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎと表記している。
　次に、これらの疎水化していないティラピア鱗由来魚ゼラチン（０Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ）及び疎水化したティラピア鱗由来魚ゼラチン（４、７、２３、７０Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ）の４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．４とした溶媒を用いて調製した。
　次に、４．５ｍＭの４Ｓ－ＰＥＧ溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．４とした溶媒を用いて調製した。
　次に、上記５種のＣｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液と４Ｓ－ＰＥＧ溶液をそれぞれ、体積比１：１で混合して、実施例２－１～２－５の組織接着剤を調製した。
　次に、この組織接着剤をあらかじめ３７℃にプレインキュベートしてから、接着試験を行い、接着強度を測定した。
　なお、比較のために、ゼラチンとホルムアルデヒドからなる市販の組織接着剤（Ｇｅｌａｔｉｎ　Ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ　Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ：ＧＲＦと表記する。）の接着強度の測定も行った。
＜接着強度の疎水基（Ｃｈｏｌ基）導入率依存性評価結果＞
　本研究は疎水基（Ｃｈｏｌ基）がＥＣＭの疎水性領域に対しての組織浸透能を持ったＣｈｏｌ－Ｇｌｔｎ／４Ｓ－ＰＥＧの創製を指向したものである。そのため、０、４、７、２３、７０Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎの４０ｗｔ％溶液と４Ｓ－ＰＥＧ溶液を体積比１：１で混合させた組織接着剤の接着強度評価を行い、接着強度の疎水基（Ｃｈｏｌ基）導入率依存性を評価した。
　図１５に示す結果（接着強度の疎水基（Ｃｈｏｌ基）導入率依存性）が得られた。
　図１５に示すように、４、７、２３、７０Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎは０Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎに比較して低い接着強度を示した。また、疎水化ゼラチンの中で、７Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎの接着強度が最も高く、４Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ及び２３Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎがそれに次ぐ接着強度であった。
この結果は、導入したＣｈｏｌ基が凝集し、組織浸透性に寄与し得なかったこと、及び、その凝集によって組織接着剤のバルク強度が低下したことによると考えられる。
　Ｃｈｏｌ－ＧｌｔｎにＧｌｔｎを混合することにより、Ｃｈｏｌ基の凝集を阻害でき、組織接着剤の接着強度を向上させることができる可能性がある。よって、実施例５、６で、Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の混合比を変える実験を行った。
（実施例３）
＜４Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎ（０：１０～９：１）／４Ｓ－ＰＥＧ組織接着剤の調製＞
　まず、４Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎの４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．４とした溶媒を用いて調製した。
　次に、ティラピア鱗由来魚ゼラチン（Ｇｌｔｎ）４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．４とした溶媒を用いて調製した。
　次に、４Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液を重量比０：１０、１：９、３：７、５：５、７：３、９：１として、６種の混合溶液を調製した。
　次に、４．５ｍＭの４Ｓ－ＰＥＧ溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．４とした溶媒を用いて調製した。
　次に、６種のＣｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液と４Ｓ－ＰＥＧ溶液をそれぞれ、体積比１：１で混合した。
　これにより、実施例３－１～３－６の組織接着剤を調製した。
　この組織接着剤をあらかじめ３７℃にプレインキュベートしてから、接着試験を行い、接着強度を測定した。
　なお、比較のために、ゼラチンとホルムアルデヒドからなる市販の組織接着剤（Ｇｅｌａｔｉｎ　Ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ　Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ：ＧＲＦと表記する。）の接着強度の測定も行った。
＜接着強度の４Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性評価結果＞
　図１６に示す結果（接着強度の４Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性）が得られた。
　図１６に示すように、４Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液：Ｇｌｔｎ溶液＝１：９（重量比）の時に最も高い接着強度を示した。また、５：５（重量比）は、Ｇｌｔｎ単独のものに比較して高い接着強度を示した。
　図１７～２２は、それぞれ実施例３－１～３－５の接着剤を用いた接着試験後の組織をヘマトキシリンとエオシンで染色した断面像である。
　各接着剤の作成条件は、４Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎ＝０：１０（実施例３－１）、１：９（実施例３－２）、３：７（実施例３－３）、５：５（実施例３－４）、７：３（実施例３－５）、９：１（実施例３－６）　４０ｗｔ％ｓｏｌｎ．（０．１Ｍ　ＰＢＳ　ｐＨ７．４）、４Ｓ－ＰＥＧ　４．５ｍＭ（０．１Ｍ　ＰＢＳ　ｐＨ７．４）である。
　図１７～図２２ではいずれも、観察された接着剤硬化物（上部）が破壊していた。
（実施例４）
＜７Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎ（０：１０～９：１）／４Ｓ－ＰＥＧ組織接着剤の調製＞
　まず、７Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ、Ｇｌｔｎの４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．４とした溶媒を用いて調製した。
　次に、ティラピア鱗由来魚ゼラチン（Ｇｌｔｎ）４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．４とした溶媒を用いて調製した。
　次に、７Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液を重量比０：１０、１：９、３：７、５：５、７：３、９：１として、６種の混合溶液を調製した。
　次に、４．５ｍＭの４Ｓ－ＰＥＧ溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．４とした溶媒を用いて調製した。
　次に、７Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液を重量比０：１０、１：９、３：７、５：５、７：３、９：１として、６種の混合溶液を調製した。
　次に、６種のＣｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液と４Ｓ－ＰＥＧ溶液をそれぞれ、体積比１：１で混合して、実施例４－１～４－６の組織接着剤を調製した。
　この組織接着剤をあらかじめ３７℃にプレインキュベートしてから、接着試験を行い、接着強度を測定した。
　なお、比較のために、ゼラチンとホルムアルデヒドからなる市販の組織接着剤（Ｇｅｌａｔｉｎ　Ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ　Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ：ＧＲＦと表記する。）の接着強度の測定も行った。
＜接着強度の７Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性評価結果＞
　図２３に示す結果（接着強度の７Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性）が得られた。
　図２３に示すように、７Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液：Ｇｌｔｎ溶液＝１：９（重量比）の時に最も高い接着強度を示した。また、５：５（重量比）は、Ｇｌｔｎ単独のものに比較して高い接着強度を示した。
（実施例５）
＜４Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎ（０：１０、１：９、５：５）／４Ｓ－ＰＥＧ組織接着剤の調製＞
　まず、疎水基（Ｃｈｏｌ）導入率が４％で疎水化したティラピア鱗由来魚ゼラチン（４Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ）を調製した。
　次に、疎水化したティラピア鱗由来魚ゼラチン（４Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ）４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒を用いて調製した。
　次に、ティラピア鱗由来魚ゼラチン（Ｇｌｔｎ）４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒を用いて調製した。
　次に、４Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液：Ｇｌｔｎ溶液＝０：１０、１：９、５：５（重量比）となるようにして、３種の混合溶液を調製した。
　次に、１５ｍＭの４Ｓ－ＰＥＧ溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒を用いて調製した。
　次に、３種の混合溶液と４Ｓ－ＰＥＧ溶液をそれぞれ、体積比１：１で混合して、実施例５－１～５－３の組織接着剤を調製した。
　この組織接着剤をあらかじめ３７℃にプレインキュベートしてから、接着試験を行い、接着強度を測定した。
　なお、比較のために、ゼラチンとホルムアルデヒドからなる市販の組織接着剤（Ｇｅｌａｔｉｎ　Ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ　Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ：ＧＲＦと表記する。）の接着強度の測定も行った。
＜接着強度の４Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性評価結果＞
　図２４に示す結果（接着強度の４Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性）が得られた。
　図２４に示すように、４Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液：Ｇｌｔｎ溶液＝１：９（重量比）の時に最も高い接着強度を示した。
（実施例６）
＜７Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎ（０：１０、１：９、５：５）／４Ｓ－ＰＥＧ組織接着剤の調製＞
　まず、疎水基（Ｃｈｏｌ）導入率が７％で疎水化したティラピア鱗由来魚ゼラチン（７Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ）を調製した。
　次に、疎水化したティラピア鱗由来魚ゼラチン（７Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ）４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒を用いて調製した。
　次に、ティラピア鱗由来魚ゼラチン（Ｇｌｔｎ）４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒を用いて調製した。
　次に、７Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液：Ｇｌｔｎ溶液＝０：１０、１：９、５：５（重量比）となるようにして、３種の混合溶液を調製した。
　次に、１５ｍＭの４Ｓ－ＰＥＧ溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒を用いて調製した。
　次に、３種の混合溶液と４Ｓ－ＰＥＧ溶液をそれぞれ、体積比１：１で混合して、実施例６－１～６－３の組織接着剤を調製した。
　この組織接着剤をあらかじめ３７℃にプレインキュベートしてから、接着試験を行い、接着強度を測定した。
　なお、比較のために、ゼラチンとホルムアルデヒドからなる市販の組織接着剤（Ｇｅｌａｔｉｎ　Ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ　Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ：ＧＲＦと表記する。）の接着強度の測定も行った。
＜接着強度の７Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性評価結果＞
　図２５に示す結果（接着強度の７Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性）が得られた。
　図２５に示すように、７Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液：Ｇｌｔｎ溶液＝１：９（重量比）の時に最も高い接着強度を示した。
（実施例７）
＜２３Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎ（０：１０、１：９、５：５）／４Ｓ－ＰＥＧ組織接着剤の調製＞
　まず、疎水基（Ｃｈｏｌ）導入率が２３％で疎水化したティラピア鱗由来魚ゼラチン（２３Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ）を調製した。
　次に、疎水化したティラピア鱗由来魚ゼラチン（２３Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ）４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒を用いて調製した。
　次に、ティラピア鱗由来魚ゼラチン（Ｇｌｔｎ）４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒を用いて調製した。
　次に、２３Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液：Ｇｌｔｎ溶液＝０：１０、１：９、５：５（重量比）となるようにして、３種の混合溶液を調製した。
　次に、１５ｍＭの４Ｓ－ＰＥＧ溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒を用いて調製した。
　次に、３種の混合溶液と４Ｓ－ＰＥＧ溶液をそれぞれ、体積比１：１で混合して、実施例７－１～７－３の組織接着剤を調製した。
　この組織接着剤をあらかじめ３７℃にプレインキュベートしてから、接着試験を行い、接着強度を測定した。
　なお、比較のために、ゼラチンとホルムアルデヒドからなる市販の組織接着剤（Ｇｅｌａｔｉｎ　Ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ　Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ：ＧＲＦと表記する。）の接着強度の測定も行った。
＜接着強度の２３Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性評価結果＞
　図２６に示す結果（接着強度の２３Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性）が得られた。
　図２６に示すように、２３Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液：Ｇｌｔｎ溶液＝０：１０（重量比）の時に最も高い接着強度を示した
（実施例８）
＜７０Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎ（０：１０、１：９、５：５）／４Ｓ－ＰＥＧ組織接着剤の調製＞
　まず、疎水基（Ｃｈｏｌ）導入率が７０％で疎水化したティラピア鱗由来魚ゼラチン（７０Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ）を調製した。
　次に、疎水化したティラピア鱗由来魚ゼラチン（７０Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ）４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒を用いて調製した。
　次に、ティラピア鱗由来魚ゼラチン（Ｇｌｔｎ）４０ｗｔ％溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒を用いて調製した。
　次に、７０Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液：Ｇｌｔｎ溶液＝０：１０、１：９、５：５（重量比）となるようにして、３種の混合溶液を調製した。
　次に、１５ｍＭの４Ｓ－ＰＥＧ溶液を、０．１ＭのＰＢＳであって、ｐＨ７．０とした溶媒を用いて調製した。
　次に、３種の混合溶液と４Ｓ－ＰＥＧ溶液をそれぞれ、体積比１：１で混合して、実施例８－１～８－３の組織接着剤を調製した。
　この組織接着剤をあらかじめ３７℃にプレインキュベートしてから、接着試験を行い、接着強度を測定した。
　なお、比較のために、ゼラチンとホルムアルデヒドからなる市販の組織接着剤（Ｇｅｌａｔｉｎ　Ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ　Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ：ＧＲＦと表記する。）の接着強度の測定も行った。
＜接着強度の７０Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性評価結果＞
　図２７に示す結果（接着強度の７０Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液とＧｌｔｎ溶液の重量比依存性）が得られた。
　図２７に示すように、７０Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ溶液：Ｇｌｔｎ溶液＝０：１０（重量比）の時に最も高い接着強度を示した
　図７－２７の結果から、４－７０Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎは重量比１：９の組織接着剤が重量比５：５の組織接着剤に比較して高い接着強度を示した。
　図２８は、重量比１：９の組織接着剤の接着強度の疎水基導入率依存性を示すグラフである。
　図２８から分かるように、重量比１：９では、７Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎの組織接着剤の接着強度が極大値を取った。
　実施例で調製した組織接着剤はすべて、ゲル状ではなく、液体状のままで使用でき、分子量２００００程度としたブタゼラチンを用いた組織接着剤に比べて、取り扱い容易性が非常に高いものであった。
　また、重量比１：９の７Ｃｈｏｌ－Ｇｌｔｎ／Ｇｌｔｎの４０ｗｔ％溶液（０．１ＭのＰＢＳ、ｐＨ７．０）と１５ｍＭの４Ｓ－ＰＥＧ溶液（０．１ＭのＰＢＳ、ｐＨ７．０）の混合溶液を用いて調製した組織接着剤が最も高い接着強度を示したが、他の実施例で調製した組織接着剤も、市販のＧＲＦに比べて、高い接着強度を示した。
　表１～５に、各試験例、実施例の調製条件、試験条件をまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
（実施例９）疎水化タラゼラチンと4S-PEGとからなる組織接着剤のシーリング効果の評価
（１）ブタ大動脈に対する耐圧強度測定
（１－１）実験方法
　タラゼラチン(cGltn)のアミノ基を一部ヘキサノイル化したHx－cGltnと4S-PEGとからなる組織接着剤のブタ大動脈に対する接着強度を検討した。
　具体的には、タラゼラチンは、分子量：153,000、ヒドロキシプロリン含量：アミノ酸1000個当たり50個のものを使用した。
　そして、疎水化していない40％cGltnを接着成分として調整し（Org-cGltn溶液またはOrgと記載する）、水溶性架橋剤4S-PEGを含む水溶液を硬化成分として調整し（4S-PEG溶液）、この接着成分と硬化成分とをそれぞれ200μlずつ混合することで、厚さ1.0mmシーラント（組織接着剤）の調製を行った。
　同様に、ヘキサノイル基導入率が2.1mol%、8.5mol%、18.3mol%の疎水化cGltnを接着成分として調製し（2.1Hx、8.5Hx、18.3Hxと記載する）、この接着成分と硬化成分とをそれぞれ200μlずつ混合することで、厚さ1.0mmシーラント（組織接着剤）の調製を行った。
　なお、4S-PEGの濃度は、cGltnあるいは疎水化cGltn中のアミノ基と4S-PEG中のスクシンイミド基が1対1となるように設定した。
　そして、それぞれのシーラント（組織接着剤）の塗布後、5.0 g/mm2の荷重により10分間の圧着を行い、耐圧試験を行った。シーラント（組織接着剤）の耐圧試験はASTM (F2392-04, Standard Test Method for Burst Strength of Surgical Sealants)に従い、ブタ大動脈に対する耐圧強度の測定を行った。
（１－２）結果
　結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　表６から、疎水化していないOrg-cGltnを接着成分として使用した場合と比較して、疎水化cGltnを接着成分として使用した場合は、2.1Hx、8.5Hx、18.3Hxのすべてにおいて、約2倍以上の耐圧強度を示した。2.1Hxにおいても高い値を示したことから、少ない疎水基導入率でも組織との強い界面強度が得られたと考えられる。
　タラゼラチンにおいては、疎水化することが接着強度の向上に極めて有効であることが確認された。
 
（実施例１０）ラット臓器に対するシーラントの定性的評価
　疎水化していない40％cGltnを接着成分として調整し（Org-cGltn溶液）、水溶性架橋剤4S-PEGを含む水溶液を硬化成分として調整し（4S-PEG溶液）、この接着成分と硬化成分とを混合して、シーラント（組織接着剤）を調整した。このシーラント（組織接着剤）をラットの臓器表面に対して50μl滴下した。37℃生理食塩水中に3日間静置し、残存している接着剤量によって定性的に評価した。
　同様に、疎水基導入率が2.1mol%の疎水化cGltnを接着成分として調整し（2.1Hx）、この接着成分と硬化成分とを混合して、シーラント（組織接着剤）を調製した。このシーラント（組織接着剤）をラットの臓器表面に対して50μl滴下した。37℃生理食塩水中に3日間静置し、残存している接着剤量によって定性的に評価した。
　その結果、接着成分として疎水化cGltn（2.1Hx）を用いることにより、特に肺表面および腎臓表面への接着性が向上することが明らかとなった。一方、接着成分としてOrg-cGltn溶液を用いた場合には、臓器に対する接着性はほとんど確認されなかった。
 
（実施例１１）疎水基導入率の影響の検討
（１）実験方法
（１－１）タラゼラチン(cGltn)のアミノ基を一部コレステリル化したChol-cGltnを接着成分として調製し（Org-cGltn溶液またはOrgと記載する）、水溶性架橋剤4S-PEGを含む水溶液を硬化成分として調製し（4S-PEG溶液）、この接着成分と硬化成分とを混合することで、シーラント（組織接着剤）の調製を行った。
　同様に、コレステリル化による疎水基導入率が4.9mol%、7.5mol%、12.2mol%の疎水化cGltnを接着成分として調整し、この接着成分と硬化成分とを混合することでシーラント（組織接着剤）の調製を行った。
　被着体には新鮮なブタ大動脈中膜を用い、このブタ大動脈中膜にシーラント（組織接着剤）を適用して、圧着後、接着面に対して垂直方向に剥離するときの強度を接着強度とした。
（１－２）詳細な条件は、下記の通りである。
・Applied force（圧着荷重）5.0 g/ mm2
・Contact time　（圧着時間）  5 min
・solution pH : 0.1M PBS (pH8)
・NH2/4S-PEG中のNHS比 =1/0.85 (NHS:N-hydroxysuccinimide)
・Chol-cGltn、cGltn濃度：40w/v%
・Control：市販品のGRFグルー
（２）結果
　接着強度は、コレステリル基を導入に伴い、7.5mol%まで増加し、その後減少した。最大接着強度は、未修飾のcGltn（Org）と比較して1.5倍、市販品と比較して13.8倍の高かった。また、図２９に示した破断面の様子から、7.5 mol%のChol-cGltnの場合、組織界面に接着剤が残存していることから、コレステリル化により高い界面接着性を有していることが明らかとなった。
（３）その他の疎水基
　上記（１）と同様の条件で、プロピル基（Pro）、ヘキサノイル基（Hx）、ラウリル基（Lau）についても疎水基導入率が接着強度に与える影響について検討した。
　結果を表７に示す。表７では、上記のコレステリル基による結果も併せて記載している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表７に示したように、タラゼラチンにおいては、各種の疎水基によって疎水化することが接着強度の向上に極めて有効であることが確認された。また、プロピル基（Pro）、ヘキサノイル基（Hx）、ラウリル基（Lau）では、疎水基導入率に依存して接着強度が高まることが確認された。
　本発明の組織接着剤及びその製造方法は、接着強度を高めるとともに、ゲル状ではなく、液体状のままで使用でき、取り扱い容易性を高めた組織接着剤に関するものなので、組織接着剤、組織封止剤（Ｓｅａｌａｎｔ）、止血剤等を必要とする産業等において利用可能性がある。
１１　疎水化魚由来ゼラチン
１２　疎水基（コレステリル基）
１３　アミノ基
１４　ヒドロキシクロリン
２１　水溶性架橋用分子
２２　架橋部　
３１、３２　組織
４１　組織接着剤
５０　ブタ血管膜
５１　中膜
５２　外膜
５３　マスク
５４　孔部
５５　重り
６０　組織接着剤
６２、６３　支持部

Claims (15)

  1. 　魚由来ゼラチン水溶液を含む接着成分と、水溶性架橋用分子水溶液を含む硬化成分とを混合して組織に塗布する組織接着剤であって、
    　前記水溶性架橋用分子の分子主鎖がアミド結合またはエチレングリコールユニットまたは糖鎖を有するとともに、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有することを特徴とする組織接着剤。
  2. 　前記接着成分の前記魚由来ゼラチンが、側鎖に疎水性官能基を備えた疎水化魚由来ゼラチンであることを特徴とする請求項１に記載の組織接着剤。
  3. 　前記魚由来ゼラチンは、その構成アミノ酸１０００個当たりヒドロキシプロリンの数が９０個以下の魚由来ゼラチンを主鎖としていることを特徴とする請求項１に記載の組織接着剤。
  4. 　前記疎水化魚由来ゼラチンはＬｙｓを含み、かつ、Ｌｙｓのアミノ基の一部が疎水性官能基で置換されていることを特徴とする請求項２に記載の組織接着剤。
  5. 　前記疎水性官能基が飽和脂肪酸であるエチル基（炭素数２）、プロピル（炭素数３）、ブチル基（炭素数４）、ペンチル基（炭素数５）、ヘキサノイル基（炭素数６）、ヘプタノイル基（炭素数７）、オクタノイル基（炭素数８）、ノナノイル基（炭素数９）、デカノイル基（炭素数１０）、ウンデカノイル基（炭素数１１）、ドデカノイル基（炭素数１２）、トリデカノイル基（炭素数１３）、テトラデカノイル基（炭素数１４）、ペンタデカノイル基（炭素数１５）、ヘキサデカノイル基（炭素数１６）、ヘプタデカノイル基（炭素数１７）、ステアロイル基（炭素数１８）、分岐型飽和脂肪酸であるイソプロピル（炭素数３）、イソブチル基（炭素数４）、イソペンチル基（炭素数５）、イソヘキサノイル基（炭素数６）、イソヘプタノイル基（炭素数７）、イソオクタノイル基（炭素数８）、イソノナノイル基（炭素数９）、イソデカノイル基（炭素数１０）、イソウンデカノイル基（炭素数１１）、イソドデカノイル基（炭素数１２）、イソトリデカノイル基（炭素数１３）、イソテトラデカノイル基（炭素数１４）、イソペンタデカノイル基（炭素数１５）、イソヘキサデカノイル基（炭素数１６）、イソパルミチル基（炭素数１６）、イソヘプタデカノイル基（炭素数１７）、イソステアロイル基（炭素数１８）、不飽和脂肪酸であるオレイル基（炭素数１８、不飽和炭素１個）、リノレニル基（炭素数１８、不飽和炭素２個）、α－リノレニル基（炭素数１８、不飽和炭素３個）、細胞膜成分であるコレステリル基の１種または２種以上の組み合わせであることを特徴とする請求項２に記載の組織接着剤。
  6. 　前記魚由来ゼラチンが、ティラピア、タイまたはタラに由来する魚由来ゼラチンであることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の組織接着剤。
  7. 　前記疎水化魚由来ゼラチンの分子量が５００００以上１０００００未満であることを特徴とする請求項２に記載の組織接着剤。
  8. 　前記水溶性架橋用分子が、Polyethyleneglycol di-succinimidyl succinate、Pentaerythritol poly（ethylene glycol） ether tetrasuccinimidyl glutarate、スクシンイミド化ポリ－Ｌ－グルタミン酸の群から選ばれる１種または２種以上の組合せであることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の組織接着剤。
  9. 　前記魚由来ゼラチン水溶液に用いる水溶媒および前記水溶性架橋用分子水溶液に用いる水溶媒は、ｐＨ６．０以上ｐＨ８．０以下のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）であることを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載の組織接着剤。
  10. 　前記接着成分として、さらに、疎水化されていない魚由来ゼラチンを含有することを特徴とする請求項２に記載の組織接着剤。
  11. 　前記疎水化魚由来ゼラチン水溶液が、常温で液体状であることを特徴とする請求項２に記載の組織接着剤。
  12. 　構成アミノ酸１０００個当たりヒドロキシプロリンの数が９０個以下の魚由来ゼラチンを溶解させた溶液にアミン存在下で疎水性官能基を有する有機分子を添加して、前記魚由来ゼラチンの側鎖のアミノ基の一部を前記疎水性官能基で置換して、疎水化魚由来ゼラチンを合成する工程と、
    　前記疎水化魚由来ゼラチンをリン酸緩衝液に分散して疎水化魚由来ゼラチン水溶液を得て、この疎水化魚由来ゼラチン水溶液含む接着成分を調製する工程と、
    　分子主鎖がアミド結合あるいはエチレングリコールユニットあるいは糖鎖を有し、かつ、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有する水溶性架橋用分子を、リン酸緩衝液に分散して、水溶性架橋用分子水溶液を含む硬化成分を調製する工程と、
    　を含むことを特徴とする組織接着剤の製造方法。
  13. 　前記接着成分を調製する工程は、前記疎水化魚由来ゼラチン水溶液と、魚由来ゼラチンをリン酸緩衝液に分散して調整した魚由来ゼラチン水溶液とを混合する工程を含むことを特徴とする請求項１２に記載の組織接着剤の製造方法。
  14. 　前記疎水化魚由来ゼラチン水溶液と前記魚由来ゼラチン水溶液の重量比を１：９以上５：５未満として混合することを特徴とする請求項１３に記載の組織接着剤の製造方法。
  15. 　魚由来ゼラチン水溶液を含む接着成分と、
    　分子主鎖がアミド結合またはエチレングリコールユニットまたは糖鎖を有し、かつ、２個以上の活性エステル基または酸無水物またはアルデヒド基を有する水溶性架橋用分子水溶液を含む硬化成分とを混合する工程を含むことを特徴とする組織接着剤の製造方法。
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