WO2018079538A1

WO2018079538A1 - 止血材

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Publication number: WO2018079538A1
Application number: PCT/JP2017/038325
Authority: WO
Inventors: 田口　哲志
Original assignee: 国立研究開発法人物質・材料研究機構
Priority date: 2016-10-26
Filing date: 2017-10-24
Publication date: 2018-05-03
Also published as: US11052171B2; JP2019216755A; US20190247537A1

Abstract

簡易且つ安全に製造することができ、ウイルス感染の危険性が無く、Ｃａイオンが無くとも血液を凝固することができる止血材を提供する。（１）イミノ基を介して、疎水性基が結合されてなるゼラチン誘導体を含む第１剤であって、該ゼラチン誘導体は（ａ）重量平均分子量が１０，０００～５０，０００であり、（ｂ）該疎水性基が炭素数６～１８のアルキル基であり、且つ（ｃ）該ゼラチン誘導体中のイミノ基／アミノ基（モル比）が１／９９～３０／７０である、第１剤、及び（２）該ゼラチン誘導体の架橋剤を含む第２剤からなる止血材。

Description

止血材

　本発明は止血材に関し、詳細には疎水性基が結合されてなるゼラチン誘導体を含む止血材に関する。

　止血材は、外科切開口、皮膚創傷等に適用して出血を止めるための材料であり、呼吸器外科、消化器外科、心臓血管外科、口腔外科等、種々の外科手術において使用されている。現在、使用されている主な止血材としては、コラーゲン系止血材、ゼラチン系止血材及びフィブリン系止血材がある。

　コラーゲン系止血材としては、仔牛真皮由来のアテロコラーゲンを綿線維状に紡糸加工し、ポリエポキシ化合物で架橋処理した後、シート状にしたものがある（インテグラン（商標）、（株）高研）。また、ゼラチン系止血材としては、架橋された粒子状のゼラチンとヒトトロンビンを併用するものがある（Ｆｌｏｓｅａｌ（商標）、バクスター社）。これらの止血材は、コラーゲン又はゼラチンの架橋処理、シート化又は粒子化処理の手間が煩瑣であるという問題がある。また、ヒトトロンビンは血液製剤から得られるためウイルス感染の恐れがある。

　ゼラチン-レゾルシン混合液とホルマリン溶液を混合して出血部位に適用し、該部位で架橋させて使用するものもある。しかし、ホルマリンは、生体内のタンパク質とも架橋反応を起こして、組織毒性を有するという問題がある。

　フィブリン系止血材は、生体における血液凝固の第二段階において、フィブリノゲンが重合してフィブリンとなり、血液凝固の第一段階で生成する血小板血栓に絡み付いて該血栓を強固にして止血する現象を利用したものである。フィブリンは血管等の組織への接着性も有するため、吻合部や損傷部の組織を接着することによって、結果的に血液の漏出を抑制する効果（以下、「シーリング効果」という）も有する。このシーリング効果を止血効果と呼ぶ場合もあるが、これは血液凝固効果とは別異の効果である。例えばウシ血清アルブミンをグルタルアルデヒドで架橋して用いるシーラント（バイオグルー（商標）、ＣｒｙｏＬｉｆｅ, Ｉｎｃ．製）は、シーリング効果を有するが、血液凝固効果は有さず、本発明における止血材には該当しない。一方、上述のコラーゲン系止血材は血液凝固効果を有するがシーリング効果は有しない。これらに対してフィブリン系のものは、シーリング効果と、血液凝固効果との双方を利用できることから、臨床への応用も盛んに試みられており、例えばＴｉｓｓｅｅｌＶＨ（商標、バクスター社）、Ｅｖｉｃｅｌ（商標、ジョンソン・エンド・ジョンソン社）等の製品がある。

　しかし、フィブリン系止血材は血液製剤から作られるため、ウイルス感染の恐れがある。また、フィブリノゲンが重合してフィブリンになるためにはＣａイオンが存在しなければならず、上記製品にはトロンビン、第ＸＩＩＩ因子に加えて塩化カルシウム溶液が備わってはいるものの、クエン酸ナトリウム等の抗血液凝固剤を含む血液を使用している場合には、十分な血液凝固効果を得ることが難しいという問題がある。

　ところで、本発明者は組織への優れた接着性を示す、疎水性基が結合されてなるゼラチン誘導体（以下「疎水化ゼラチン」という場合がある）を用いた外科用シーラントの開発を進めてきた（例えば特許文献１、特許文献２）。該外科用シーラントは、組織に対して優れた接着性を有し、適用後は生体内で速やかに分解される。さらに、該外科用シーラントを耐滅菌性、製造の簡易性及び安全性の点等で改良し、優れたシーリング効果を奏する外科用シーラントを開発した（特許文献３）。

ＷＯ２０１２／０４６７１７号ＷＯ２０１４／１１２２０８号特許第５９９５１２８号公報

　本発明者は、上記外科用シーラントについてさらに研究を進めて行く中で、該外科用シーラントが、上記従来の止血材における問題を解決できる、優れた止血材となることを見出し、本発明を完成した。

　即ち、本発明は、下記のものである：
（１）イミノ基を介して、疎水性基が結合されてなるゼラチン誘導体を含む第１剤であって、該ゼラチン誘導体は
（ａ）重量平均分子量が１０，０００～５０，０００であり、
（ｂ）該疎水性基が炭素数６～１８のアルキル基であり、且つ
（ｃ）該ゼラチン誘導体中のイミノ基／アミノ基（モル比）が１／９９～３０／７０である、
第１剤、及び
（２）該ゼラチン誘導体の架橋剤を含む第２剤
からなる止血材。

　上記背景技術の項で述べたとおり、従来、ゼラチンは止血材に利用されているが、疎水化ゼラチンを利用した止血材は無い。疎水化ゼラチンは、原料ゼラチンより顕著に優れた血液凝固効果を奏する。この理由は、本発明を限定する趣旨ではないが、疎水性基によって赤血球等の血液中に存在する細胞との親和性が向上するためであると考えられる。該血液凝固効果は、Ｃａイオンが無くとも奏されるので、本発明の止血材は輸血製剤使用下においても有用である。さらに、本発明の止血材は、上述のとおり優れたシーリング効果も奏し、同じく血液凝固効果とシーリング効果の双方を奏するフィブリン系止血材に比べて、双方の効果において勝り、且つ、ウイルス感染の危険性もない。本発明の止血材は、種々の外科手術において大変有用である。

図１は、原料ゼラチン、及びゼラチン誘導体のＦＴ－ＩＲスペクトルである。図２は、実施例２と比較例１のＩｎ　ｖｉｔｒｏでの血液凝固時間を比較して示すグラフである。実施例１～５と比較例１、及び実施例６～１０と比較例２のＩｎ　ｖｉｔｒｏでの血液凝固時間を比較して示すグラフである。Ｃａイオンを添加した場合の図３ａと同様の比較を示すグラフである。実施例１１～１５と比較例３、及び実施例１６～２０と比較例４のＩｎ　ｖｉｔｒｏでの血液凝固時間を比較して示すグラフである。Ｃａイオンを添加した場合の図４ａと同様の比較を示すグラフである。実施例２１～２５と比較例５、及び実施例２６～３０と比較例６のＩｎ　ｖｉｔｒｏでの血液凝固時間を比較して示すグラフである。Ｃａイオンを添加した場合の図５ａと同様の比較を示すグラフである。実施例３１～３５と比較例７、及び実施例３６～４０と比較例８のＩｎ　ｖｉｔｒｏでの血液凝固時間を比較して示すグラフである。Ｃａイオンを添加した場合の図６ａと同様の比較を示すグラフである。

＜第１剤＞
　本発明の止血材において、第１剤はゼラチン誘導体を含む。該ゼラチン誘導体はイミノ基、好ましくは、－ＮＨ－、を介して結合された疎水性基を有し、下記式（１）で示される構造を有する。

ＧｌｔｎＮＨ－ＣＨＲ^１Ｒ^２　　　　　　　　（１）

上式において、「Ｇｌｔｎ」はゼラチン残基であり、Ｒ^１は疎水性基であり、Ｒ^２は水素原子又は疎水性基である。Ｎは、ゼラチン中の主としてリジン（Ｌｙｓ）のε－アミノ基由来である。好ましくは、Ｒ^２が水素原子である。該式（１）のＮＨ構造は、例えばＦＴ‐ＩＲスペクトルにおいて３３００ｃｍ^－１付近のバンドにより検出することができる。図１は、ゼラチン誘導体（Ｍｗ１３、０００のスケトウダラゼラチンをドデシル基で置換したもの、スペクトル１：誘導化率４．２モル％；スペクトル２：８．９モル％）のＦＴ－ＩＲスペクトルを、原料ゼラチンのそれと比較して示すものである。疎水性基の量が増えるにつれ、３３００ｃｍ^－１付近のＮ－Ｈの振動及び２９００ｃｍ^－１付近のＣ－Ｈの振動が強くなっていることが分かる。

　Ｒ^２が疎水性基である場合、Ｒ^１と同じでも互いに異なっていてもよい。疎水性基は、炭素数６～１８のアルキル基であり、分岐を有していてもよい。該アルキル基の例としては、ヘキシル基、オクチル基（又はカプリル基）、ノニル基（又はペラルゴルニル基）、デシル基、ドデジシル基（又はラウリル基）、テトラデシル基（又はミリスチル基）等が挙げられる。好ましくは、Ｒ^１が炭素数６～１５、より好ましくは７～１３、最も好ましくは７～１１の直鎖アルキル基であり、Ｒ^２が水素原子である。

　該ゼラチン誘導体中の誘導化率は、疎水性基が結合されたイミノ基の、原料ゼラチン中のアミノ基量に対するモル％で、１～３０モル％、好ましくは１～２０モル％、より好ましくは５～１０モル％である。言い換えれば、得られたゼラチン誘導体におけるイミノ基／アミノ基（モル比）は、1／９９～３０／７０、好ましくは1／９９～２０／８０、より好ましくは５／９５～１０／９０である。該誘導化率は、原料ゼラチン中のアミノ基と、疎水性基を結合した後のアミノ基量を、2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸法によって定量することで、或いは、ＮＭＲ等により疎水性基の同定及び定量を行うことによって求めることができる。

　該ゼラチン誘導体は、重量平均分子量（Ｍｗ）が１０，０００～５０，０００、好ましくは１０，０００～４０，０００、より好ましくは２０，０００～３５，０００である。前記範囲内において、優れた耐電子線滅菌性を示す。該分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により定法に従い測定することができる。

　原料ゼラチンは、天然由来、化学合成、発酵法、又は遺伝子組換えにより得られるゼラチンのいずれであってもよい。好ましくは、天然由来、例えばウシ、ブタ、魚由来のゼラチンであり、より好ましくは冷水魚由来、例えばタイ及びタラ、最も好ましくはタラ、特にスケトウダラのゼラチンが使用される。冷水魚由来のゼラチンはブタ等のゼラチンに比べて、イミノ酸の含有量が少なく、高濃度でも常温～低温流動性に優れた止血材を与えることができる。

　該原料ゼラチンは酸処理ゼラチン、アルカリ処理ゼラチンのいずれであってもよい。好ましくはアルカリ処理ゼラチンである。また、該ゼラチンの分子量の範囲は、ゼラチン誘導体が上述の平均分子量（Ｍｗ）の範囲となるような範囲であればよい。

　第１剤は、上記ゼラチン誘導体に加えて、誘導体化されていないゼラチンを含んでもよい。該ゼラチンとしては、上述の各種ゼラチンを用いることができる。誘導体化されていないゼラチンの量は、ゼラチン誘導体との合計重量の０～９９ｗｔ％であり、好ましくは、０～５０ｗｔ％である。

　第１剤は、水性溶媒をさらに含み、該ゼラチン誘導体を該水性溶媒に溶解又は分散して水性溶液（以下、単に「水溶液」という場合がある）として供されることが利便性の点で好ましい。該水性溶媒としては、超純水、生理食塩水、ホウ酸、リン酸、炭酸等各種無機塩緩衝液又はこれらの混合物を用いることができる。好ましくはｐＨ８～１１、より好ましくはｐＨ９～１０、最も好ましくは９．３～９．７のホウ酸緩衝液が使用される。該水性溶媒は、ゼラチン誘導体が１０～８０ｗ／ｖ％、好ましくは１５～３０ｗ／ｖ％となるような量で使用される。この時のイオン強度は、０．０１～０．５Ｍ、好ましくは、０．０５～０．２である。誘導体化されていないゼラチンを含む場合には、ゼラチン誘導体との合計重量が上記濃度となる量である。

＜第２剤＞
本発明において、第２剤はゼラチン誘導体の架橋剤であり、ゼラチン誘導体と反応して、水、血液等の体液に不溶性の構造体を形成する。該架橋剤としては、ゼラチン中のアミノ基、主として側鎖の第一級アミノ基、と反応性の官能基を分子中に少なくとも２つ以上有するものの少なくとも一種が使用される。架橋剤の例としては、ゲニピン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドもしくはＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミドで活性化された多塩基酸、アルデヒド化合物、酸無水物、ジチオカーボネート及びジイソチオシアンネートが挙げられる。

　多塩基酸としては、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、グルタル酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、オキサロ酢酸、cis－アコニット酸、２－ケトグルタル酸、ポリ酒石酸、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等が例示され、これらのカルボキシル基が活性エステル化されたもの、例えばジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ジスクシンイミジルタートレート（ＤＳＴ）等を使用することができる。

　また、ポリエチレングリコールもしくはポリエチレングリコールエーテルの、多塩基酸エステルで、該多塩基酸の、ポリエチレングリコールと反応していないカルボキシル基の少なくとも１つが活性エステル化されたもの、例えば4,7,10,13,16-ペンタオキサノナデカン二酸ジ(N-スクシンイミジル)、及び下記式で表されるポリエチレングリコール　ジ（スクシンイミジル　スクシネート）（ＳＳ－ＰＥＧ－ＳＳ）:

（ｎはＭｎが約20,000となる数）；
さらに、下記式で表されるペンタエリスリトール‐ポリエチレングリコールエーテル　テトラスクシンイミジル　グルタレート（４Ｓ－ＰＥＧ）：

（ｎはＭｗが約３，０００～３０，０００、好ましくは５，０００～２７，０００、より好ましくは１５，０００～２５，０００となる数）；
が挙げられる。

　アルデヒド化合物としては、１分子中に２つ以上のアルデヒド基が導入された、アルデヒド基導入多糖類、例えばアルデヒド基導入デンプン、アルデヒド基導入デキストラン、及びアルデヒド基導入ヒアルロン酸が、酸無水物としては、無水グルタル酸、無水マレイン酸、及び無水コハク酸が、ジイソチオシアンネートとしてはヘキサメチレンジイソチオシアネート等が例示される。これらのうち、上記活性化ポリエチレングリコール多塩基酸エステル、及びアルデヒド基導入多糖類が好ましく使用される。

　これらの架橋剤は、ゼラチン誘導体のアミノ基１当量に対して、該架橋剤中の官能基、例えばＮ－ヒドロキシスクシンイミドで活性化されたエステル基、が０．１～３当量、好ましくは０．２～２当量、より好ましくは０．３～１．５当量、最も好ましくは０．３～０．８当量となる量で供される。２種以上の架橋剤の混合物を用いてもよく、その場合はそれらの合計当量が上記範囲となる量とする。

　第２剤も、該架橋剤を溶解するための水性溶媒をさらに含むことが好ましい。但し、該架橋剤と該水性溶媒とを別々の容器で供し、使用に際して、使用の約２時間前以後に、両者を適量混合して水性溶液（以下、単に「水溶液」という場合がある）として使用することが好ましい。該水性溶媒については、第１剤について上記したものを使用することができる。好ましくは、ｐＨ３～８、より好ましくはｐＨ４～６のリン酸緩衝液が使用される。最も好ましくは、第１剤の水溶液と第２剤の水溶液を同体積で混合した際に、ｐＨが約８～約１０となるように双方の水性溶媒のイオン強度が調整される。例えば、第１剤水溶液をｐＨ９、イオン強度０．０５～０．１のホウ酸緩衝液とし、第２剤水溶液をｐＨ４、イオン強度０．０１～０．０３のリン酸緩衝液とすることで、同体積で混合した際に上記範囲のｐＨとすることができる。又は、第１剤水溶液をｐＨ１０、イオン強度０．０５～０．１のホウ酸緩衝溶液として、第２剤水溶液をｐＨ４、イオン強度０．０１～０．０７のリン酸緩衝溶液としてもよい。

第２剤は、第１剤中のアミノ基の当量に対する第２剤中の官能基の当量、即ち（第２剤中の官能基当量／第１剤中のアミノ基当量）が、上記範囲になるように調整される。２種以上の架橋剤の混合物を用いてもよく、その場合はそれらの合計が上記範囲となる量とする。

＜添加剤＞
　上記第１剤及び／又は第２剤は、各種添加剤を本発明の目的を阻害しない量でさらに含んでよい。該添加剤としては、着色料、ｐＨ調整剤、粘度調整剤、保存剤等が挙げられる。好ましくは、止血材の適用箇所が分かり易いように、第１剤あるいは２剤水溶液中に着色料、例えばブリリアントブルーを添加する。添加量は、例えば１０～１００μg／ｍＬであってよい。

＜製造方法＞
　本発明の止血材は、第１剤と第２剤を個別に調製することによって得ることができる。
［第１剤の調製法］
（１）原料ゼラチン水性溶液の調製
　出発材料のゼラチンを５～５０ｗｔ／ｖ％となる量で、４０～９０℃で加熱して水性溶媒に溶解する。該水性溶媒としては、水と水溶性有機溶媒との混合物を用いる。該水溶性有機溶媒としては、炭素数１～３のアルコール、エステル等を用いることができ、好ましくはエタノールが使用される。

（２）誘導体化
　工程（１）で得られたゼラチン水溶液に、導入する疎水性基を有する誘導体化薬剤を添加し、所定時間撹拌して反応させる。該誘導体化薬剤としては、該疎水性基を有するアルデヒドもしくはケトン、例えばドデカナール、テトラデカナール、デシルエチルケトンが使用される。反応温度は３０～８０℃、反応時間は０．５～１２時間であり、通常、撹拌するだけでゼラチンのアミノ基にシッフ塩基（～Ｎ＝ＣＲ^１Ｒ^２）を介してアルキル基が結合されたゼラチンを得ることができる。アルデヒドの使用量は、所望の誘導化率に相当する化学量論量に対して１～４倍とする。より好ましくは、１～２倍とする。

　次いで、該シッフ塩基を還元して上記式（１）の構造とする。還元剤としてはシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ_３ＣＮ）、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ（ＯＡｃ）_３）、２－ピコリンボラン、ピリジンボラン等の、公知の還元剤を使用することができる。これらのうち、２－ピコリンボランが好ましい。ピコリンボランは安定性であり、水性溶媒中でアルデヒドもしくはケトンの還元アミノ化反応を一段（ワンポット）で行うことが可能である。また、８０～９０％の収率を達成することができ、これはシアノ水素化ホウ素ナトリウムが７０～７５％であるのに比べて顕著に高い。２－ピコリンボランの使用量は、誘導体化薬剤の当量に対して１～３当量であることが好ましい。

（３）精製
　工程（２）で得られた反応溶液を、大過剰の貧溶媒、例えば冷エタノールに加えて、ゼラチン誘導体を沈殿させる。該沈殿を濾別した後、エタノール等で洗浄して、最終生成物を得る。

（４）第１剤の調製
　工程（３）で得られたゼラチン誘導体を、ホウ酸緩衝液等の水性溶媒に上述の範囲となる量で溶解することが好ましい。所望により、誘導体化されていないゼラチン、その他添加剤を添加してよい。得られた第１剤を、例えばポリプロピレン等のプラスチック製ディスペンサ等の所定の容器に充填する。好ましくは、止血材を患部に適用する際に使用する、先端部で両剤を混合することができるダブルシリンジ型ディスペンサ等の一方に第１剤の水溶液を充填する。

［第２剤の調製法］
第２剤として例示した上記各架橋剤は、公知の方法で合成してもよいし、市販されているものを使用してもよい。該架橋剤と、それを溶解するための、例えばリン酸緩衝液等の水性溶媒を別々の容器、例えば架橋剤をガラス製のバイアルに、水性溶媒をプラスチックボトルに入れて供し、使用する約２時間前以降に該架橋剤を該水性溶媒に溶解する。

＜放射線滅菌＞
次いで、ディスペンサに充填された水溶液の形態の第１剤、バイアルに充填された粉末形態の架橋剤、及びボトルに充填された該架橋剤を溶解するための水性溶媒を夫々放射線滅菌する。あるいは、バイアルに充填された粉末形態のゼラチン誘導体（第１剤有効成分）、及びボトルに充填された該ゼラチン誘導体を溶解するための水性溶媒（第１剤溶媒）、バイアルに充填された粉末形態の架橋剤（第２剤有効成分）、及びボトルに充填された該架橋剤を溶解するための水性溶媒（第２剤溶媒）を夫々放射線滅菌する。該放射線としては、電子線、ガンマ線、制動放射線が挙げられ、電子線滅菌が好ましい。吸収線量としては、従来広く用いられている（第十四改正日本薬局方、第二部、参考情報、第1235頁、右欄、2.2　放射線法）２５ｋＧｙか、それ以上であればよく、好ましくは２５ｋＧｙ～４５ｋＧｙである。滅菌された第１剤と、第２剤及び水性溶媒の所定量と、使用方法を記載する指示書と組み合わされて、止血材のキットとして供されてもよいし、使用者の要求に応じた量及び組み合わせで供されてもよい。

＜組織への適用方法＞
　本発明の止血材は、呼吸器外科、消化器外科、心臓血管外科、口腔外科等、種々の外科手術における切開口、皮膚創傷等に適用することができる。特に止血を必要とする肝切除部には有効である。また、塞栓材として脳動脈瘤あるいは静脈瘤内の血液を凝固する目的で、或いは癌の塞栓療法において使用することもできる。止血材の適用方法の一例としては、上述のとおり第２剤を、好ましくは使用直前に水溶液とする。その際の架橋剤の濃度は、既に述べたとおりである。得られた第２剤水溶液を、既に第１剤水溶液が充填されているダブルシリンジ型ディスペンサの空いている方のシリンジに充填してプランジャーを押圧することによって、又は、ダブルシリンジを備えるエアアシストスプレーで噴霧して、患部に施与する。

　以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

［実施例１～４０］
＜第１剤の調製＞
　表１に示すゼラチン誘導体１～１０を調製した。例としてゼラチン誘導体２について説明する。なお、表１において「疎水性基」に示す炭素数は上記式（１）のＣＨＲ^１Ｒ^２全体の炭素数である。
　スケトウダラ由来のゼラチン（Ｍｗ＝２０，０００、新田ゼラチン（株）製）１００ｇを水３５０ｍＬに溶解し、得られた水溶液にエタノール１４０ｍＬを加えて５０℃にて撹拌した。ゼラチンのアミノ基に対して、誘導化率１０モル％に相当する化学量論量の１．５当量のデカナールを５ｍＬエタノールに溶解して、ゼラチン溶液に混合し、次いでデカナールの約１．５当量の２－ピコリンボランを加えて、１８時間撹拌した。反応溶液の１０倍体積量の冷エタノール中に該反応溶液を滴下して、生成されたゼラチン誘導体を再沈殿させ、吸引ろ過を行った。得られた沈殿物の約５倍体積量の冷エタノール中に該沈殿物を入れ、１時間撹拌しながら洗浄後吸引ろ過を行った。この洗浄を３回行った後、２日間真空乾燥して、デシル基が導入された白色のゼラチン誘導体を、収率約８４％で得た。誘導化率は、トリニトロベンゼンスルホン酸を用いた比色法により確認した。

　スケトウダラ由来のゼラチンのＭｗ及び誘導化率を変え、デカナールに代えてオクタナール又はウンデカナールを用いたことを除き、上述の方法と同様の方法で、他のゼラチン誘導体を調製した。

　得られたゼラチン誘導体を、ｐＨ９.０又はｐＨ９．５の０．１Ｍホウ酸緩衝液に、１５ｗ／ｖ％で溶解し、得られた溶液を、２ｍＬのポリプロピレン製ダブルシリンジ型ディスペンサに充填し、各第１剤とした。

＜第２剤の調製＞
　第２剤として、ペンタエリスリトール‐ポリエチレングリコールエーテル　テトラスクシンイミジル　グルタレート（４Ｓ－ＰＥＧ、Ｍｗ＝２０，０００又は１０，０００、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いた。下記各評価の直前に、ブリリアントブルーを１００μg/ｍＬで含むｐＨ４のリン酸緩衝液に、第１剤と同体積用いた場合に、第１剤の残存アミノ基に対して４Ｓ－ＰＥＧのスクシンイミドエステル基の当量比（モル比）が０．５となる量の４Ｓ－ＰＥＧを溶解し、得られた水溶液を第１剤と同じディスペンサの空いている方のシリンジに収納して第２剤とした。以上のようにして表２に示す実施例１～４０の止血材を得た。

［比較例１～８］
　第１剤として、誘導化していないゼラチン（Ｍｗ＝２０，０００又は３５，０００）を用いたことを除き、実施例と同様にして表３に示す比較用止血材を調製した。

［評価］
１．Ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの血液凝固速度の評価
　５ｍＬガラスバイアルに、血液（豚全血、輸血用クエン酸ナトリウム０．３２４％(１２．６ｍＭ)含む）を入れ、そこに実施例２の止血材を添加した後、直ちに長さ１５ｍｍのテフロンコートされた撹拌子を入れ、該バイアルを３７℃に加熱したホットプレート上に置いて、２８０ｒｐｍで撹拌し、血液の凝固により該撹拌子が回転しなくなるまでの時間を測定した。血液と止血材の合計体積を１ｍＬとし、血液量を２５０μＬ（止血材の体積割合０．７５）、５００μＬ（止血材の体積割合０．５）、７５０μＬ（止血材の体積割合０．２５）とし、各体積割合について３回測定を行い、平均値を求めた。比較例１についても同様の測定を行った。結果を表４、及び図２に示す。

２．Ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのＣａイオン添加時の血液凝固速度の評価
　豚全血に、２５１．９ｍＭの塩化カルシウム水溶液を、豚全血に対して体積比１／２０量（豚全血中Ｃａ濃度０．０４８ｗｔ％に相当）添加して混合した後に、止血材を添加したことを除き、評価１と同様の方法で撹拌子が回転しなくなるまでの時間を測定した。比較例１についても同様の測定を行った。結果を表４及び図２に示す。

　図２は、実施例２と比較例１のＩｎ　ｖｉｖｏでの血液凝固時間を比較して示すグラフである。止血材の割合が多くなる（止血剤の割合０．７５）と、ゼラチンの誘導化の有無、Ｃａイオンの有無によらず、血液凝固時間はほぼ同じであった。Ｃａイオンが添加されていない場合、比較例１は止血材量が低くなるにつれて血液凝固時間が顕著に長くなった。これに対して、実施例２の血液凝固時間はＣａイオンの有無の影響を受けることなく、短い血液凝固時間を示した。この事は、疎水化ゼラチンを用いれば、血液中のフィブリンの血液凝固作用が期待できない場合であっても、十分な血液凝固効果が得られることを示す。

３．止血材の体積割合０．５におけるＩｎ　ｖｉｔｒｏでの血液凝固速度の評価
　実施例１、３～４０の止血材についても、上記１及び２と同様の方法で血液凝固時間を測定し、疎水性基の炭素数、誘導化率、ゼラチンの分子量、ホウ酸緩衝液のｐＨ、架橋剤の分子量、及びＣａイオンの有無の血液凝固速度への影響を調べた。そのうち、止血材の体積割合が０．５の場合の結果を、図３ａ～図６ｂのグラフに示す。各図において、「Ｏｒｇ」はゼラチンを誘導化していない点でのみ異なる比較例を意味し、例えば図３ａの左端の「Ｏｒｇ」は比較例１であり、中央部の「Ｏｒｇ」は比較例２である。また、図３ａ等の「Ｃａ（－）」はＣａイオンを添加していない場合であり、図３ｂ等の「Ｃａ（＋）」はＣａイオンを添加した場合を示す。

　図３ａ～図６ｂに示すとおり、ほとんどの実施例の止血材は、ゼラチンが誘導化されていない点でのみ異なる比較例と比べて、血液凝固が速かった。疎水性基の炭素数が大きい止血材のなかには、比較例よりも凝固が遅いものもあったが、これらの基は上皮組織への親和性が高いので、ｉｎ　ｖｉｖｏでは凝固がより速くなると考えられる。例えば、実施例８の止血材は、図３aでは比較例２とほぼ同程度の凝固時間であるが、表５に示すとおり、後述するＩｎ　ｖｉｖｏでの出血量は比較例２に比べて顕著に少なかった。
また、種々の要因のうち、第１剤のｐＨ及び第２剤の分子量が血液凝固時間に対する影響が大きいことが分かった。例えば、第１剤のｐＨが９．５（図４ａ）の場合、同ｐＨが９．０（図３ａ）の場合に比べて、総ての例で血液凝固が速かった。また、第２剤の分子量が２０，０００の場合（図３ａ）、１０，０００の場合（図５ａ）より血液凝固が速かった。ここから、これらの要因を調整することで、所望の血液凝固速度に調整することが可能であることが分かる。
Ｃａイオンが添加された場合、特に第２剤の分子量が小さい場合、却って血液凝固が遅い傾向があったが、その理由については不明である。

４．Ｉｎ　ｖｉｖｏでの出血量による評価
　実施例８、比較例２の血液凝固効果を、村上らの評価法（Colloids and Surfaces B:Biointerfaces 65(2008)186-189）に準じて、下記手順により室温における出血量により比較した。
（１）ペントバルビタールナトリウム（ソムノペンチル（商標）、大日本住友薬品（株））を腹腔内注射した７週齢のラット（Wisterラット、平均体重約３００ｇ）を医療用コルク板上に固定し、腹部を切開した。
（２）漿液を注意深く除去した後、肝臓の下に予め重さを測定した濾紙を、及び該濾紙の下にパラフィルム（登録商標）を敷いた。パラフィルムは、次第ににじみ出る漿液を濾紙が吸収するのを防止する。
（３）コルク板を水平位置から約４５°傾けて肝臓から濾紙へと血が流れるようにした。
（４）ラットの肝臓を、消毒した針（１８Ｇ、３８ｍｍ、テルモ社製）で突き刺した直後、止血材を施与して３分間放置した後、濾紙の重さ（ｍｇ）を測定した（ｗ１）。
（５）参照実験として、肝臓を針で突き刺さずに止血材を施与し、３分間放置した後の濾紙の重さを測定した（ｗ３）。
（６）出血量（ｗ１－ｗ３）（ｍｇ）を求めて比較した。結果を表５に示す。
　なお、今回は止血材間の比較を目的とするので、止血材を使用しない場合の出血量（ｗ２）の測定は割愛した。

　表５において、参考値は村上らの上記文献に記載のフィブリン系止血材（ＴｉｓｓｅｅｌＶＨ（商標）、バクスター社）の値である（第１８８頁、右欄）。同表に示すとおり、実施例８の止血材は誘導化していないゼラチンを用いた止血材（比較例２）より顕著に出血量（ｗ１－ｗ３）が少なく、優れた血液凝固効果が確認された。実施例８の出血量は参考値の約３倍であったが、同文献では平均体重２４．３ｇのマウスが使用されているのに対し、今回の実験では平均体重３００ｇのラットを用いた点、及び止血材自体の使用量も約２．５倍量（340.7／137.0 ）であった点を考慮し、使用量当たりの出血量（（ｗ１－ｗ３）／ｗ３）で比べると両者はほぼ同等であり、また体重当たりの出血量は、実施例８は0.39（ｍｇ／ｇ）であり参考値1.80（ｍｇ／ｇ）に比べて顕著に少ない。血液凝固速度も速く、上記特許第５９９５１２８号に示したとおり、組織への接着力及び膜強度も強いことから、本発明の止血材は総合的にフィブリン系止血材より優れる。

　本発明の止血材は優れた血液凝固効果を奏し、心臓血管外科、消化器外科、呼吸器外科、整形外科、口腔外科等、臨床手術での使用に大変有用である。

Claims

（１）イミノ基を介して、疎水性基が結合されてなるゼラチン誘導体を含む第１剤であって、該ゼラチン誘導体は
（ａ）重量平均分子量が１０，０００～５０，０００であり、
（ｂ）該疎水性基が炭素数６～１８のアルキル基であり、且つ
（ｃ）該ゼラチン誘導体中のイミノ基／アミノ基（モル比）が１／９９～３０／７０である、
第１剤、及び
（２）該ゼラチン誘導体の架橋剤を含む第２剤
からなる止血材。
該ゼラチンが、冷水魚由来のゼラチンである、請求項１記載の止血材。
該冷水魚がスケトウダラである、請求項２記載の止血材。
該アルキル基が直鎖アルキル基である、請求項１～３のいずれか１項記載のアルキル基。
該架橋剤が、少なくとも２つの活性化されたエステル基を有する、ポリエチレングリコールエーテル多塩基酸エステルである、請求項１～４のいずれか１項記載の止血材。
該架橋剤が、重量平均分子量３，０００～３０，０００を有するペンタエリスリトール‐ポリエチレングリコールエーテル　テトラスクシンイミジル　グルタレートである、請求項５記載の止血材。
（該架橋剤の官能基の当量／該ゼラチン誘導体のアミノ基の当量）が０．１～３となる量で使用される、求項１～６のいずれか１項記載の止血材。