CN112494710B - 一种转谷氨酰胺酶促交联的双网络粘合剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种转谷氨酰胺酶促交联的双网络粘合剂及其制备方法,通过对明胶的简单处理,与葡聚糖醛混合,在生理条件下,即可在转谷氨酰胺酶的促进作用下交联形成双网络粘合剂。本发明双网络的特性不仅增强了粘合剂本体强度,而且通过葡聚糖醛的引入,提高了粘合剂的粘合性能。且本发明具有原料合成简单,粘合剂可注射,易于施用的特点。利用本发明的这些特性,其可作为外科密封剂和医用粘合剂等应用于临床,在人体内部伤口修复等领域具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医用组织工程材料技术领域,更加具体地说,涉及一种转谷氨酰胺酶促交联的双网络粘合剂及制备方法。
背景技术
目前,随着生物粘合剂在组织工程领域的广泛应用,对形成粘合剂的方式提出了更高的要求,从生物学角度来看,采用酶促进交联形成粘合剂的方式与传统化学交联粘合剂相比具有更多的优点。如转谷氨酰胺酶(Transglutaminase,以下采用TGase代指)是一类催化酰基转移反应酶,可通过胺的导入、分子内和分子间的交联、脱胺基作用这三种途径来使蛋白质的结构发生改变,从而可以使蛋白质形成高分子的聚合物。且TGase广泛存在于人体、动植物和微生物中,具有优秀的生物相容性(Griffin M,Casadio R,Bergamini CM.Biochemical Journal,2002,368(2):377)。
在水凝胶的领域中,通过TGase催化促进水凝胶的形成的方式已有一定的基础。如Hago E E就介绍了在TGase存在的条件下,采用冻融循环法制备的互穿性聚合物网络交联PVA/GE水凝胶具有更优良的力学性能,且在细胞毒性表征实验中也有优秀表现(Hago E E,Li X.Advances in Materials Science and Engineering,2013,2013-2021)。此外,Broguiere N等人利用TGase促进透明质酸的交联,并将其应用于三维神经网络的构建,也充分体现了TGase作为交联剂具有优秀的生物相容性(Broguiere N,Isenmann L,Zenobi-Wong M.Biomaterials,2016,99:47-55.)。综上,近些年的研究表明,酶的催化作用在水凝胶的形成过程中可以发挥重要的增益作用。而TGase促进交联这种具有良好生物相容性的交联方式亦可用于生物组织粘合剂的合成,然而相关报道和体系仍非常有限。
Hu B H等通过合理的设计赖氨酸和谷氨酰胺合成底物肽,在TGase催化下,与生物相容性聚合物偶联,数分钟内形成了具有粘合性能的水凝胶,在伤口修复领域具有一定的优势(Hu B H,Messersmith P B.Orthodontics and Craniofacial Research,2005,8(3):145-149.)。但是也存在着合成修饰方法复杂不易实行,缺少与组织表面作用基团粘合能力提升有限的缺点。
可见,现有的酶促交联粘合剂仍存在着合成方法复杂,本体强度不足,粘合能力有限的问题。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足,提出一种转谷氨酰胺酶促交联形成的粘合剂及制备方法。所述粘合剂具有生物相容性好,使用方法简单及可注射原位形成的特点。本发明通过对明胶的简单处理,与葡聚糖醛混合,在生理条件下,即可在TGase的促进作用下交联形成双网络粘合剂。本发明双网络的特性不仅增强了粘合剂本体强度,而且通过葡聚糖醛的引入,提高了粘合剂的粘合性能。且本发明具有原料合成简单,粘合剂可注射,易于施用的特点。利用本发明的这些特性,其可作为外科密封剂和医用粘合剂等应用于临床,在人体内部伤口修复等领域具有很好的应用前景。
本发明的技术目的通过以下技术方案予以实现。
一种转谷氨酰胺酶促交联的双网络粘合剂,由转谷氨酰胺酶催化处理后的明胶与葡聚糖醛发生交联反应形成的,可通过注射方式在生理条件下原位形成,具有双交联网络的特点。且具有较好的粘合性能,粘合强度可达10-32kPa。
上述转谷氨酰胺酶促交联的双网络粘合剂的制备方法,按照下述步骤进行制备:
步骤1,将葡聚糖均匀分散在水中加入氧化剂进行氧化处理,得到氧化度为20%-60%的葡聚糖醛,再将葡聚糖醛均匀分散在磷酸盐缓冲溶液中,以得到葡聚糖醛溶液
在步骤1中,在进行氧化处理时,将反应液在去离子水中透析24-48小时,后经冻干后得到葡聚糖醛。
在步骤1中,氧化剂为高碘酸钠,与葡聚糖摩尔比为(0.1-10):1,优选(1—6):1。
在步骤1中,根据葡聚糖质量和数均分子量进行葡聚糖摩尔数的计算,即葡聚糖重复单元数量。
在步骤1得到葡聚糖醛溶液中,葡聚糖醛浓度为50-150mg/mL,优选60—120mg/mL。
步骤2,在30-45℃的条件下将明胶粉末均匀分散在磷酸盐缓冲溶液中,以形成明胶溶液,将其与步骤1中的葡聚糖醛溶液进行混合,以得到混合溶液;明胶溶液与葡聚糖醛溶液的体积比为(1-5):1;
在步骤2得到明胶溶液中,明胶浓度为100-300mg/mL,优选100—200mg/mL。
在步骤2中,明胶溶液与葡聚糖醛溶液的体积比为(1-3):1。
步骤3,将转谷氨酰胺酶均匀分散在磷酸盐缓冲溶液中,以得到转谷氨酰胺酶溶液,再将转谷氨酰胺酶溶液和步骤2得到的混合溶液进行混合,静置以得到粘合剂,转谷氨酰胺酶溶液和步骤2得到的混合溶液体积比为1:(2—7)
在步骤3得到转谷氨酰胺酶溶液中,转谷氨酰胺酶浓度为25-150mg/mL,优选50—100mg/mL。
在步骤3中,转谷氨酰胺酶溶液和步骤2得到的混合溶液体积比为1:(3—5)。
在步骤3中,将转谷氨酰胺酶溶液和步骤2得到的混合溶液进行混合后,置于30—40℃的水浴条件下静置200-600秒后,形成粘合剂。
在本发明的步骤1、步骤2和步骤3中,磷酸盐缓冲溶液为pH=6.4-7.3,磷酸盐浓度为1-200mM的磷酸盐缓冲液(水溶液)。
具体来说,形成水凝胶的反应原理如下化学式所示
1.TGase促进明胶交联形成第一层交联网络
2.明胶与ODex发生席夫碱反应形成第二层交联网络
首先在37℃下把明胶粉末溶解,并与一定比例的葡聚糖醛混合后。再加入相应比例的TGase后会催化明胶中的谷氨酰胺残基与氨基发生反应形成酰胺键,组成粘合剂的第一层网络,同时葡聚糖醛与明胶裸露的氨基也会发生席夫碱反应,形成席夫碱键,组成粘合剂的第二层网络。因为本身葡聚糖醛上有未反应掉的醛基,其又可以与组织表面的氨基反应,增强粘合性能。
本发明利用转谷氨酰胺酶催化促进明胶与葡聚糖醛的交联形成了双网络粘合剂,其具有生物相容性好,可酶降解,合成方法简便,可通过注射器注射的方式在生理条件下原位形成的特点。降低了传统化学交联原位粘合剂的生物毒性。且粘合剂利用葡聚糖醛上的醛基于明胶中的氨基发生席夫碱反应,形成了席夫碱键,与酶催化形成的共价键形成双交联网络,增强了粘合剂的本体强度,压缩模量高达36kPa。且葡聚糖醛上未反应的醛基也使得粘合剂具有一定的粘合性能,粘合强度达到32.5kPa,因此本发明可以在体内进行伤口的粘合以及血液渗漏的修复等。本发明在模拟人体生理环境条件下形成粘合剂,反应条件温和,且原液可通过注射器注射施用,使得其具有原位形成的优势。本发明中成本较低,操作简便易于应用推广,具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明粘合剂的可注射性测试照片。
图2是本发明粘合剂的压缩模量测试结果图,其中Gel代指明胶,而ODex代指葡聚糖醛,TG指转谷氨酰胺酶,Gel—ODex—TG—(1—4)对应着实施案例1—4(下同)。
图3是本发明粘合剂采用湿态下的肠衣为粘结物,利用搭接剪切的方式,使用万能拉力机进行粘合性能的测试结果图。
图4是本发明中不同样品的储能模量G'和损耗模量G”随着频率变化曲线图。
图5为本发明实施例中水凝胶压缩性能测试示意图。
图6为本发明实施例中水凝胶粘合性能测试示意图。
图7为本发明实施例中成胶时间测试结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。药品厂商及规格如下所示。
粘合剂压缩性能测试:将粘合剂原液注入模具,制备成直径为10mm,高为13mm的圆柱状水凝胶,采用电子万能试验机进行压缩性能的测试,如图5所示,压缩速度为5mm/min,当接触力为0.02N时开始记录。每种样品三组平行实验,记录相应压缩模量。
粘合剂粘合性能测试:为测定水凝胶粘合强度,采用湿态下的肠衣为粘结物,利用搭接剪切的方式进行测试。将肠衣放置于PB缓冲液中浸泡,以保证其湿润状态。预制备好原料(溶于PB的ODex溶液,溶于PB的明胶溶液,四种不同浓度的TGase溶液)。肠衣上取长为1.5cm、宽为1.75cm作为待测界面,测试前涂抹混合均匀后的几种原料,与另一肠衣粘合,最终长6.5cm。静置5min,使用万能拉力机分别进行测试,将两端未涂抹粘合剂的胶原膜夹在夹具上,通过拉扯两张肠衣作用于粘合部位,记录相应的数据,计算抗拉伸剪切强度。每种样品三组平行实验,如图6所示。
实施案例1
称取2g数均分子量40000的葡聚糖粉末溶解在160ml去离子水中,室温搅拌至完全溶解;称取1.9g的NaIO4粉末溶解在40ml去离子水中,搅拌至完全溶解;将NaIO4溶液加入到葡聚糖溶液中,避光,以搅拌速率200rpm持续搅拌24h;向NaIO4和葡聚糖混合溶液中加入0.95g的二甘醇,室温搅拌1h;反应完毕后,在去离子水中透析72h,-40℃冻干后制得氧化度为50%的葡聚糖醛。将11mg葡聚糖醛样品溶解于100μl的pH=7.2-7.4的磷酸盐缓冲液中,搅拌至完全溶解。
称取1.5g明胶粉末,溶于5ml的pH=7.2-7.4的磷酸盐缓冲液中,在36℃水浴条件下静置1小时后,取200μl的上述明胶溶液与上述的葡聚糖醛溶液混合均匀后,待用。称取100mgTGase酶粉末,溶于4ml的pH=7.2-7.4的磷酸盐缓冲液,以涡旋搅拌均匀,取100μl待用。
随后采用搭接剪切法测定粘合剂粘合强度,将上述明胶与葡聚糖醛的混合溶液与TGase酶溶液以3:1的比例混合均匀。使用预先润湿的肠衣作为粘合材料,测试前涂抹混合均匀后的上述原液,与另一相同肠衣粘合,肠衣本体长5cm,在37℃湿润环境下静置5min后测试(形成粘合剂并粘合两个肠衣),粘合强度为11.3kPa。
实施案例2
称取2g数均分子量40000的葡聚糖粉末溶解在160ml去离子水中,室温搅拌至完全溶解;称取1.9g的NaIO4粉末溶解在40ml去离子水中,搅拌至完全溶解;将NaIO4溶液加入到葡聚糖溶液中,避光,以搅拌速率200rpm持续搅拌24h;向NaIO4和葡聚糖混合溶液中加入0.95g的二甘醇,室温搅拌1h;反应完毕后,在去离子水中透析72h,-40℃冻干后制得氧化度为50%的葡聚糖醛。将11mg葡聚糖醛样品溶解于100μl的pH=7.2-7.4的磷酸盐缓冲液中,搅拌至完全溶解。
称取1.5g明胶粉末,溶于5ml的pH=7.2-7.4的磷酸盐缓冲液中,在36℃水浴条件下静置1小时后,取200μl的上述明胶溶液与上述的葡聚糖醛溶液混合均匀后,待用。称取200mgTGase酶粉末,溶于4ml的pH=7.2-7.4的磷酸盐缓冲液,以涡旋搅拌均匀,取100μl待用。
随后采用搭接剪切法测定粘合剂粘合强度,将上述明胶与葡聚糖醛的混合溶液与TGase酶溶液以3:1的比例混合均匀。使用预先润湿的肠衣作为粘合材料,测试前涂抹混合均匀后的上述原液,与另一相同肠衣粘合,肠衣本体长5cm,在37℃湿润环境下静置5min后测试,粘合强度为23.2kPa。
实施案例3
称取2g数均分子量40000的葡聚糖粉末溶解在160ml去离子水中,室温搅拌至完全溶解;称取1.9g的NaIO4粉末溶解在40ml去离子水中,搅拌至完全溶解;将NaIO4溶液加入到葡聚糖溶液中,避光,以搅拌速率200rpm持续搅拌24h;向NaIO4和葡聚糖混合溶液中加入0.95g的二甘醇,室温搅拌1h;反应完毕后,在去离子水中透析72h,-40℃冻干后制得氧化度为50%的葡聚糖醛。将11mg葡聚糖醛样品溶解于100μl的pH=7.2-7.4的磷酸盐缓冲液中,搅拌至完全溶解。
称取1.5g明胶粉末,溶于5ml的pH=7.2-7.4的磷酸盐缓冲液中,在36℃水浴条件下静置1小时后,取200μl的上述明胶溶液与上述的葡聚糖醛溶液混合均匀后,待用。称取300mgTGase酶粉末,溶于4ml的pH=7.2-7.4的磷酸盐缓冲液,以涡旋搅拌均匀,取100μl待用。
随后采用搭接剪切法测定粘合剂粘合强度,将上述明胶与葡聚糖醛的混合溶液与TGase酶溶液以3:1的比例混合均匀。使用预先润湿的肠衣作为粘合材料,测试前涂抹混合均匀后的上述原液,与另一相同肠衣粘合,肠衣本体长5cm,在37℃湿润环境下静置5min后测试,粘合强度为15.9kPa。
实施案例4
称取2g数均分子量40000的葡聚糖粉末溶解在160ml去离子水中,室温搅拌至完全溶解;称取1.9g的NaIO4粉末溶解在40ml去离子水中,搅拌至完全溶解;将NaIO4溶液加入到葡聚糖溶液中,避光,以搅拌速率200rpm持续搅拌24h;向NaIO4和葡聚糖混合溶液中加入0.95g的二甘醇,室温搅拌1h;反应完毕后,在去离子水中透析72h,-40℃冻干后制得氧化度为50%的葡聚糖醛。将11mg葡聚糖醛样品溶解于100μl的pH=7.2-7.4的磷酸盐缓冲液中,搅拌至完全溶解。
称取1.5g明胶粉末,溶于5ml的pH=7.2-7.4的磷酸盐缓冲液中,在36℃水浴条件下静置1小时后,取200μl的上述明胶溶液与上述的葡聚糖醛溶液混合均匀后,待用。称取400mgTGase酶粉末,溶于4ml的pH=7.2-7.4的磷酸盐缓冲液,以涡旋搅拌均匀,取100μl待用。
随后采用搭接剪切法测定粘合剂粘合强度,将上述明胶与葡聚糖醛的混合溶液与TGase酶溶液以3:1的比例混合均匀。使用预先润湿的肠衣作为粘合材料,测试前涂抹混合均匀后的上述原液,与另一相同肠衣粘合,肠衣本体长5cm,在37℃湿润环境下静置5min后测试,粘合强度为17.5kPa。
如附图1所示,采用5ml注射器验证粘合剂的可注射性(粘合剂原液混合后,经过一定时间才会形成凝胶,如200—600s)。同时采用小瓶倒置的方法验证了粘合剂的形成,可以看出粘合剂呈淡黄色且可以适应复杂的形状。
如附图2所示,采用电子万能试验机进行粘合剂压缩性能的测试(测的是形变为60%时的模量),可以看出随着TG含量的增加粘合剂压缩模量变大,强度从11.4-36kPa,最大能达到36kPa左右。如附图3所示,可以看出TG的加入能提高粘合剂的粘合性能,粘合强度从10.6-32.5kPa,最大粘合性能能够达到32.5kPa。
将Gel-ODex(对照组)、Gel-ODex-TG-2(实施案例2)、Gel-ODex-TG-4(实施案例4)三种样品(因为当时测试的时候主要表征酶的作用所以没有测全)制备成直径为15mm,高为1mm的圆柱体水凝胶,并利用DHR流变仪测试他们的流变性能,固定应变为1%,动态频率扫描中频率为0.1-10Hz,记录储能模量G′和损耗模量G″随频率的变化情况。本次测试在室温下进行,如附图4所示。由图可以看出,Gel-ODex-TG双交联网络水凝胶损耗模量均较小,通过增加体系中TGase的浓度,可以提高其储能模量。当体系中TGase的浓度为25mg/mL时,体系交联密度达到最大,得到较致密的网络结构,储能模量最高可达500Pa左右。综合两种数据,说明Gel-ODex-TG双交联网络水凝胶具有良好的流变性能,从而满足实际应用中的力学要求。
在组织粘合剂中,材料需要通过注射器以液体状态注入,然后通过原位交联的方式成胶,因此成胶时间非常的重要。如果成胶时间太短,可能在注射前发生体系交联从而导致注射过程中发生堵塞或结构破裂。又由于采用生物相容性高的天然高分子制备成水凝胶,如果凝胶时间太长,低分子量的物质可能发生溶解,因此需要有合适的成胶时间。本次实验所制得样品的凝胶时间如附图7所示。
根据图7中左图信息我们可以看出,无论在明胶中添加ODex发生席夫碱反应或者添加TGase发生酶促交联反应,均能使凝胶时间大大缩短,成胶时间控制在十分钟以内,能够满足原位成胶对时间的要求。而且Gel-ODex-TG双交联网络水凝胶体系中,在控制明胶浓度和ODex浓度保持不变的前提下,逐渐升高TGase的浓度,凝胶速度也会随之增快,当体系中TGase的浓度为25mg/mL时,凝胶时间最短,只需三分钟即可形成稳定的三维网络结构,在可注射水凝胶粘合剂领域中具有一定的优势。
根据本发明内容进行工艺参数的调整,均可实现转谷氨酰胺酶促交联的双网络粘合剂的制备,经测试,表现出与本发明基本一致的性能,本发明的粘合剂在组织工程领域中的应用。以上对本发明做了示例性的描述,应该说明的是,在不脱离本发明的核心的情况下,任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种转谷氨酰胺酶促交联的双网络粘合剂,其特征在于,按照下述步骤进行制备:
步骤1,将葡聚糖均匀分散在水中加入氧化剂进行氧化处理,得到氧化度为20%-60%的葡聚糖醛,再将葡聚糖醛均匀分散在磷酸盐缓冲溶液中,以得到葡聚糖醛溶液,葡聚糖醛浓度为50-150mg/mL;
步骤2,在30-45℃的条件下将明胶粉末均匀分散在磷酸盐缓冲溶液中,以形成明胶溶液,明胶浓度为100-300mg/mL;将其与步骤1中的葡聚糖醛溶液进行混合,以得到混合溶液;明胶溶液与葡聚糖醛溶液的体积比为(1-5):1;
步骤3,将转谷氨酰胺酶均匀分散在磷酸盐缓冲溶液中,以得到转谷氨酰胺酶溶液,转谷氨酰胺酶浓度为25-150mg/mL;将转谷氨酰胺酶溶液和步骤2得到的混合溶液进行混合,静置得到粘合剂,转谷氨酰胺酶溶液和步骤2得到的混合溶液体积比为1:(2—7)。
2.根据权利要求1所述的一种转谷氨酰胺酶促交联的双网络粘合剂,其特征在于,在步骤1中,氧化剂为高碘酸钠,其与葡聚糖的摩尔比为(0.1-10):1;葡聚糖醛浓度为60—120mg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种转谷氨酰胺酶促交联的双网络粘合剂,其特征在于,在步骤2中,明胶溶液与葡聚糖醛溶液的体积比为(1-3):1,明胶浓度为100—200mg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种转谷氨酰胺酶促交联的双网络粘合剂,其特征在于,在步骤3中,转谷氨酰胺酶浓度为50—100mg/mL,转谷氨酰胺酶溶液和步骤2得到的混合溶液体积比为1:(3—5);将转谷氨酰胺酶溶液和步骤2得到的混合溶液进行混合后,置于30—40℃的水浴条件下静置200-600秒后,形成粘合剂。
5.根据权利要求1所述的一种转谷氨酰胺酶促交联的双网络粘合剂,其特征在于,在步骤1、步骤2和步骤3中,磷酸盐缓冲溶液为pH=6.4-7.3,磷酸盐浓度为1-200mM的磷酸盐缓冲液。
6.一种转谷氨酰胺酶促交联的双网络粘合剂的制备方法,其特征在于,按照下述步骤进行制备:
步骤1,将葡聚糖均匀分散在水中加入氧化剂进行氧化处理,得到氧化度为20%-60%的葡聚糖醛,再将葡聚糖醛均匀分散在磷酸盐缓冲溶液中,以得到葡聚糖醛溶液,葡聚糖醛浓度为50-150mg/mL;
步骤2,在30-45℃的条件下将明胶粉末均匀分散在磷酸盐缓冲溶液中,以形成明胶溶液,明胶浓度为100-300mg/mL;将其与步骤1中的葡聚糖醛溶液进行混合,以得到混合溶液;明胶溶液与葡聚糖醛溶液的体积比为(1-5):1;
步骤3,将转谷氨酰胺酶均匀分散在磷酸盐缓冲溶液中,以得到转谷氨酰胺酶溶液,转谷氨酰胺酶浓度为25-150mg/mL;将转谷氨酰胺酶溶液和步骤2得到的混合溶液进行混合,静置得到粘合剂,转谷氨酰胺酶溶液和步骤2得到的混合溶液体积比为1:(2—7)。
7.根据权利要求6所述的一种转谷氨酰胺酶促交联的双网络粘合剂的制备方法,其特征在于,在步骤1中,氧化剂为高碘酸钠,其与葡聚糖的摩尔比为(0.1-10):1;葡聚糖醛浓度为60—120mg/mL;在步骤2中,明胶溶液与葡聚糖醛溶液的体积比为(1-3):1,明胶浓度为100—200mg/mL。
8.根据权利要求6所述的一种转谷氨酰胺酶促交联的双网络粘合剂的制备方法,其特征在于,在步骤3中,转谷氨酰胺酶浓度为50—100mg/mL,转谷氨酰胺酶溶液和步骤2得到的混合溶液体积比为1:(3—5);将转谷氨酰胺酶溶液和步骤2得到的混合溶液进行混合后,置于30—40℃的水浴条件下静置200-600秒后,形成粘合剂。
9.根据权利要求6所述的一种转谷氨酰胺酶促交联的双网络粘合剂的制备方法,其特征在于,在步骤1、步骤2和步骤3中,磷酸盐缓冲溶液为pH=6.4-7.3,磷酸盐浓度为1-200mM的磷酸盐缓冲液。
10.根据权利要求1—5之一所述的一种转谷氨酰胺酶促交联的双网络粘合剂在组织工程领域中的应用。
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