JPH09500027A

JPH09500027A - 液体の安定なチオール活性化剤

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Publication number: JPH09500027A
Application number: JP7529150A
Authority: JP
Inventors: ジェイルー、キャリー; エスイエイン、フレデリック
Original assignee: ベックマンインスツルメンツインコーポレーテッド
Priority date: 1994-05-06
Filing date: 1995-05-05
Publication date: 1997-01-07
Anticipated expiration: 2020-02-16
Also published as: AU2436795A; DE69527686D1; WO1995030769A1; ES2180632T3; EP0707658B1; CA2165808A1; EP0707658A1; DE69527686T2; US5700653A; JP3619865B2; AU692547B2; ATE221919T1

Abstract

(57)【要約】水性の、液体−安定なチオール活性化剤溶液が開示されている。その溶液はチオール活性化剤、例えばＮ−アセチル−Ｌ−システインと安定化剤、例えばマンニトールとを含むことができる。チオールは前記水溶液中で、保存条件下では少なくとも約１年間、開放ビン条件下では少なくとも約２８日間は安定である。前記溶液はクレアチンキナーゼ触媒活性の再活性化剤として使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】液体の安定なチオール活性化剤背景本発明は液体安定チオール活性化剤に関するものである。より詳細に述べるならば、本発明は酵素検定において試薬として有用な液体安定チオール活性化剤に関するものである。診断的及び治療的決定は、種々の生理的流体中の種々の生物学的分子の迅速、正確かつ再現性のある検出及び定量を可能にする試薬及び方法によって促進される。関心とする生物学的分子は例えばアミノ酸、蛋白質、核酸またはステロイドまたはこれらの誘導体または代謝産物などの、天然または人工的に生産される物質である。生理的流体とは血液、血漿、血清、尿、羊水、胸膜液及び脳脊髄液を含む。生理的流体のサンプル中の生物学的分子が、その生物学的分子の環境中にある物質、例えばその生物学的分子を含む溶液中の基質など、に及ぼすその生物学的分子の活性、影響または効果を検出することにより検出されることは稀ではない。生理的流体のテストサンプルを、生体内（in vivo）環境から非−生体生理学的な生体外（in vitro）環境に移す場合−−例えば患者の生理的流体のサンプルを試験管にとる場合−−テストサンプル中の多くの生物学的分子の活性は急速に低下する。そこで生物学的分子の生体内状態に等しい正常活性を正確に検定するためには、生物学的分子の活性を生体外で検定する前に、またはその検定時にその生物学的分子を再活性化することが必要である。関心とする種々の生物学的分子の再活性化には多くの異なるチオール化合物が用いられている。酵素は適した基質との反応を触媒する蛋白質である。生理的流体サンプル中に存在する酵素またはその酵素の触媒活性の検出及び定量は、例えば疾病状態のようなからだの状態について重要な情報を提供する。クレアチンキナーゼ¹は全身の筋組織及び脳に存在する酵素である。クレアチンキナーゼは燐酸クレアチンからアデノシン二燐酸²への燐酸転移を触媒し、それによってアデノシン三燐酸³を形成する。こうしてクレアチンキナーゼは下記の可逆反応をどちらの方向にも触媒する：患者の生理的流体サンプル中のクレアチンキナーゼ及びそのイソ酵素の触媒活性の検定は筋肉病変、心臓疾患、心筋梗塞、進行性筋ジストロフィーのような筋疾患、並びに種々の神経系疾患及び精神障害の診断のための最も重要な臨床試験の１つである。クレアチンキナーゼ触媒活性の試験に最も広く用いられる試験の１つはヘキソキナーゼ／グルコース−６−燐酸脱水素酵素検定である。これは簡単に“クレアチンキナーゼ検定”と呼ばれる。クレアチンキナーゼ検定は、一般には、次に記す反応中の還元型β−ニコチナミドアデニンジヌクレオチド（燐酸）の生成による波長約３４０ｎｍ⁴における吸光度の変化を分光光度計を用いて測定することによって行われる：生理的流体サンプルに存在するクレアチンキナーゼは生体内環境から取り出されると、可逆的であるとはいえ、速やかに不活性化される。テストサンプル中のクレアチンキナーゼ活性の生体内等価活性を正確に測定するために、クレアチンキナーゼを再活性化してその触媒活性を回復させる。再活性化は、クレアチンキナーゼ検定の実施前に適したチオール化合物をテストサンプルに加えることによって実現する。クレアチンキナーゼ活性検定の前にさらにキレート剤もテストサンプルに加えることが多い。これはクレアチンキナーゼの触媒活性を阻害するかも知れない不都合な金属イオン、例えばＦｅ⁺⁺が存在する場合にはそれを除去するためのものである。生理的流体のテストサンプル中に存在するクレアチンキナーゼを再活性化するためには種々のチオール⁵化合物、例えばメルカプトエタノール、モノチオグリセロール、グルタチオン及びＮ−アセチル−Ｌ−システイン⁶が用いられてきた。クレアチンキナーゼに適したチオール活性化剤は次のようないくつかの要求を満たさなければならない；クレアチンキナーゼ触媒活性を速やかに、本質的に完全に再活性化する、テストサンプル中の蛋白質を沈殿しない、溶液に十分溶解する、不快臭がないなど。その上チオール活性化剤は凍結乾燥試薬キットに入れることができるように、凍結乾燥もでき、液化して使用することもできなければならない。さらに液化され、または再構成されたチオール活性化剤は、液体試薬として利用できるように、溶液中で少なくとも或る程度の最小の安定性はもっていなければならない。チオールＮ−アセチル−Ｌ−システインはこれらの要求に適合し、４℃で１週間貯蔵した血清サンプル中でクレアチンキナーゼ触媒活性の少なくとも約９９％を回復できることが知られている。そこでＮ−アセチル−Ｌ−システインはクレアチンキナーゼの再活性化剤として有用である。ＮＡＣはクレアチンキナーゼの酸化スルフヒドリル官能基を還元することによって作用し、それによってクレアチンキナーゼ触媒活性を復活させると考えられる。残念ながらＮＡＣを含む多くのチオール活性化剤は溶液中では不安定になり、速やかに品質が低下する。そこで多くのチオールは粉末状で貯蔵される。溶液中のチオールの質の低下はチオールのスルフヒドリル基の自己酸化によると考えられる。チオールの自己酸化はチオール溶液中のある種の多価金属カチオン（例えばＦｅ⁺⁺）の存在によって加速される。チオール活性化剤ＮＡＣの水溶液は４℃で約２４時間だけ安定である。そこで、生理的流体のテストサンプル中に存在するクレアチンキナーゼの再活性化剤として使用する約２４時間以上前につくられたＮＡＣ溶液を使用しても、クレアチンキナーゼの触媒活性を正確に検定することはできないであろう。水溶液中のチオール活性化剤、例えばＮＡＣ、の品質低下はそのチオール水溶液にキレート剤を添加することによって幾分遅らせることができる。キレート剤はチオール溶液からある種の金属イオンを除去するようにはたらく。キレート剤、例えばＥＤＴＡ⁷、ＥＧＴＡ⁸、及びＢＨＮ⁹などを用いてＦｅ⁺⁺のような多価金属カチオンをチオール活性化剤溶液から除去することができる。これによって水溶液中のチオールの安定性は改善する。例えば４℃で保存しているＮＡＣ水溶液にＥＤＴＡの適量を加えると溶液中に存在するＮＡＣの安定寿命が、したがって有用期間が約２４時間から約５日間に増加することは公知である。溶液中では不安定であることがよく知られているため、ＮＡＣのようなチオール活性化剤は一般には凍結乾燥粉末として貯蔵される。凍結乾燥した粉末は使用時に水で再構成され、生物学的分子を活性化する。チオールの再構成は誤差を生じる傾向があり、時間を消費し、種々の汚染物質を溶液内に導き、酵素化学的臨床検査室及び病院環境などの多量検定には明らかに不適当である。その上チオール粉末の再構成は、液体の安定な試薬を多量に必要とする自動検定処理法及びその機器の速度及び効率の完全な利用を阻害する。さらに再構成されたチオール溶液は不安定で、再構成されたチオール溶液に１つ以上のキレート剤を含ませても急速に品質が低下する。そこで液体安定チオール溶液並びにそのような液体安定チオール溶液の製法が必要とされている。概要本発明は、生物学的分子を活性化するチオール活性化剤（活性体）、液体中でチオール活性化剤を安定化できる安定化剤、及びチオール活性化剤と安定化剤と金属とを溶解できる液体を含んでなる組成物に関する。重要なことは、チオール活性化剤が液体中で長期間安定であることである。その組成物は生物学的分子の活性を促進するための金属イオンと、その他の不都合なイオンをその液体から除去するためのキレート剤も含むことができる。本発明のその他の実施態様はチオール活性化剤、例えば遊離ラジカルスカベンジャーのような安定化剤、金属イオン、キレート剤、及びチオール活性化剤と安定化剤と金属イオンとキレート剤を溶解するための水性緩衝液を含む液体の安定なチオール活性化剤溶液である。緩衝液は液体安定チオール活性化剤溶液を好適には生理的ｐＨに維持できる。液体安定チオール活性化剤を作るための本発明の範囲内の方法は、チオール活性化剤、安定化剤、金属イオン及びキレート剤を溶解できる液体を選択し、チオール活性化剤を緩衝液に加え、安定化剤を緩衝液に加え、金属イオンを緩衝液に加え、そしてキレート剤を緩衝液に加える各工程を有することができる。クレアチンキナーゼの検定は、液体安定チオール活性化剤溶液を調製し、テストサンプルを液体安定チオール活性化剤溶液に加え、そしてテストサンプル中のクレアチンキナーゼ活性を検出することにより、本発明に従って実施される。本発明は、ＥＤＴＡ及びマンニトールをあらかじめ決めた濃度に溶液に加えることによって安定なＮＡＣ水溶液を調製する方法も含む。最後に、本発明はクレアチンキナーゼを検定するための水性試薬も含む。この試薬は、液体を生理的ｐＨに維持するための緩衝液、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、エチレンジアミン四酢酸、マンニトール、マグネシウム；それにグルコースも含むことができる。この試薬ではエチレンジアミン四酢酸及びマンニトールの濃度を選択し、緩衝液中のＮ−アセチル−Ｌ−システインの安定性を改善することができる。説明本発明は、液体安定チオール活性化剤溶液が、そのチオール活性化剤を含む液体に安定化剤を加えることによって作られるという発見に基づくものである。我々の発明の前にはチオール活性化剤、例えばＮ−アセチル−Ｌ−システインなどの液体安定チオール溶液は未知であった。液体安定チオール活性化剤溶液として使用する適した組成物は、生物学的分子を活性化するチオール活性化剤、液体中のチオール活性化剤を安定化することができる安定化剤、及びチオール活性化剤及び安定化剤を溶解できる液体を含むことができる。このような組成物が、液体中で長期間安定である溶解チオール活性化剤の製造を可能にすることを我々は見いだした。溶液中に存在するチオール活性化剤は次に示すようないかなる適したチオールであってもよい；グルタチオン、臭化２−アミノエチルイソチオウロニウム、チオグリコール酸、システイン、メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、モノチオグリセロール、グルタチオン及びＮ−アセチル−Ｌ−システイン。液体安定チオール活性化剤溶液をクレアチンキナーゼ試薬として用いる場合、チオール活性化剤はＮ−アセチル−Ｌ−システインであることが好ましい、なぜならばそれはクレアチンキナーゼの再活性化に有効であることが知られているからである。チオール活性化剤は、例えばクレアチンキナーゼ及び脂肪酸合成酵素などの種々の酵素及び２、３のリポ蛋白質を含む種々の生物学的分子を活性化するようにはたらく；この場合生物学的分子の三次元コンフォメーション構造（したがって生物学的活性）は少なくとも一部は、その分子中の−ＳＨ基の存在に依存する。組成物中に存在する安定化剤は、溶液中の選択されたチオール活性化剤を安定化できるいかなる物質でもよい。種々の遊離ラジカルスカベンジャー、例えばイノシトール、トコフェロール、マンニトール、スーパーオキシドジムターゼ、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、Ｎ−２−メルカプトプロピオニルグリシン、ジメチルチオ尿素、グルタチオン、２１−アミノステロイド類、デフェロキサミン、アロプリノール、ジメチルスルフォキシド及びコエンチームＱなどが安定化剤として使用できる。液体安定チオール溶液をクレアチンキナーゼ試薬として用いる場合には安定化剤は好適にはイノシトールかマンニトールである。水溶液中のＮＡＣを安定化するためにはマンニトールが特に適していることを我々は見いだした。遊離ラジカル掃去性安定化剤はチオール活性化剤水溶液中約５ｍｍｏｌ／Ｌ¹⁰ から約５５０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられる。チオール水溶液中の約５ｍｍｏｌ／Ｌ以下の遊離ラジカルスカベンジャーはかなりの量のチオールを安定化するには不十分である。チオール水溶液中の約５５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上の遊離ラジカルはその溶液 ¹⁰ “ｍｍｏｌ／Ｌ”は１リットルあたりのミリモル数を意味する。溶媒中の溶質の濃度の単位。に溶解するのはむずかしい。好適には安定化剤はチオール活性化剤水溶液中、約３５ｍｍｏｌ／Ｌから約１００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられる。我々はこれを有効な安定化剤の濃度範囲と決めている。安定化剤として使用される遊離ラジカルスカベンジャーは特にクレアチンキナーゼ試薬に存在するチオールを安定化するために用いられる。クレアチンキナーゼ試薬は生理的流体サンプル中に存在するクレアチンキナーゼを再活性化するために用いられる。一般的にはクレアチンキナーゼ検定は再活性化したクレアチンキナーゼ触媒活性を分光光学的吸光度測定法によって検出する。分光光学的検定法をこの目的で用いる場合、チオール活性化剤溶液（これはクレアチンキナーゼ試薬として用いられる）中に存在する安定化剤は測定波長ではほぼ透明であり、したがってクレアチンキナーゼ触媒活性を評価するために用いる吸光度測定を不当に妨害しないことが重要である。約６００〜７００ｎｍ以下の波長、例えば約３４０ｎｍを用いて、クレアチンキナーゼ検定中のクレアチンキナーゼ触媒活性による吸光度増加を分光光学的に測定することがよくある。クレアチンキナーゼ検定における試薬として液体安定チオール活性化剤溶液を用いる場合、組成物の液体成分は、クレアチンキナーゼ活性検定に一般に用いられる約３００ｎｍ〜約７００ｎｍの典型的測定波長では低い吸光度をもつイミダゾール緩衝液からなるのが好適である。液体安定チオール溶液はキレート剤も含むことができる。キレート剤はチオール活性化剤溶液中に存在する好ましくない金属イオン、例えば鉄イオンをキレート化することによってはたらくと考えられる。もしその溶液が鉄イオンを全く含まないならば、その溶液におけるキレート剤の必要は著しく減る。使用キレート剤の量に関する制約は、チオール活性化剤溶液中に存在する有用金属イオン、例えばＭｇ、の過量のキレート化がおこり得るほど多量に存在することは望ましくないということである。キレート剤、例えばＥＤＴＡ、ＥＧＴＡまたはＢＨＮがチオール水溶液に存在するとき、そのキレート剤は約０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌ〜約４ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で使用するのが好適である。チオール水溶液中の約０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌ以下のキレート剤濃度は溶液中に存在するかも知れないかなりの量の好ましくない金属イオンを除去するには十分でない。約４ｍｍｏｌ／Ｌ以上のキレート剤は有用金属イオン、例えばＭｇ⁺⁺の過量のキレート化をおこす。マグネシウムカチオンはクレアチン検定において重要な役割を演じ、したがって所望の金属イオンである。キレート剤が、我々によって有効キレート剤濃度範囲と決められた約０．５ｍｍｏｌ／Ｌ〜約２ｍｍｏｌ／Ｌの濃度範囲でチオール水溶液中に存在するのがより好適である。クレアチンキナーゼ検定試薬として用いるためにＮＡＣ溶液を用意し、そのＮＡＣ水溶液にはＥＤＴＡも用いる場合、約３５ｍｍｏｌ／Ｌ〜約１００ｍｍｏｌ／Ｌのマンニトールまたはイノシトール、及び約０．５ｍｍｏｌ／Ｌ〜約２ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡをＮＡＣ水溶液に用いるのが好適である、というのは、マンニトール及びＥＤＴＡのこのような濃度がＮＡＣの有用な安定化水溶液を作ることを我々が見いだしたからである。組成物に用いられる液体は、組成物中のそれぞれの所望濃度の成分すべての溶媒としてはたらくことができる適した液体、例えば水、である。上記組成物をクレアチンキナーゼ試薬として用いる場合、好適には上記液体は、上記液体を約６−８の生理的ｐＨに維持することができる緩衝溶液である。最も好適にはクレアチンキナーゼ試薬のｐＨは約２５℃で約６．７である；このとき最も正確な酵素測定ができる。液体安定チオール溶液は生物学的分子の活性を促進することのできる金属イオンも含むことができる。活性化すべき生物学的分子がクレアチンキナーゼである場合にはその金属イオンは好適にはマグネシウムカチオンである。マグネシウムカチオンは、クレアチンキナーゼがＡＤＰからＡＴＰへの燐酸化を触媒している間、ＡＤＰと配位化合物を作ることによって機能すると考えられる。液体安定チオール活性化剤溶液は、チオール活性化剤を溶解できる緩衝液と、安定化剤と、金属イオンとキレート剤とを先ず最初に選択することによって準備される。溶液を作る方法の次の段階はチオール活性化剤、安定化剤、金属イオン及びキレート剤を緩衝液に加えることである。本発明の重要な側面は、組成物の液中に存在するチオール活性化剤は、その組成物を約４℃で遮光した気密ビンまたはその他の容器に貯蔵した場合、少なくとも約１年間はその活性化能力を実質上減らさずに維持することができるという点である。我々の発明の組成物中のチオール活性化剤はそのような保存状態で約２または３年も液状で安定である。その上、我々の発明の範囲内の組成物のチオール活性化剤は少なくとも約２８日の開放ビン寿命（すなわち使用する溶液部分及び残りの保存部分をその溶液を再び使用するまで約４℃で開放容器中で保存する有効期間）をもち、その間この組成物はチオール活性化能力を実質上変化されずに保持することが見いだされた。我々の発明の安定チオール溶液は、調製して４℃で開放ビン中に保存した後、６０日以上も溶液中チオールの開放ビン安定性を保持することができる。その間このような条件下で保存した溶液中のチオールの安定性には顕著な変化は見られない。チオールの安定性を実質的に未変化に保持することは、我々の発明のチオール溶液が指示された保存条件下で指示された期間を通じて使用でき、生体外環境におかれた生物学的分子をその分子の生体内と等価の生物学的活性まで復活させることができることを意味する。上記組成物は、糖分子、例えばグルコースを含み、それによってクレアチンキナーゼ検定の検出可能な最終産物の生成を助けることもできる。本発明による好適な液体安定チオール活性化剤溶液はチオール活性化剤と、安定化剤と、金属イオンと、キレート剤と、これら４成分を溶解できる緩衝液とを含むことができる。また、緩衝液は、液体安定チオール活性化剤溶液を生理的ｐＨに保持することができるように選択される。我々が発見したこのような溶液は、溶液中で安定である溶解チオール活性化剤並びにそのチオール活性化能力を実質的に減らさずに保有するチオール活性化剤を提供する。本発明によりクレアチンキナーゼ検定用の液体安定試薬を作ることができる。このクレアチンキナーゼ試薬はクレアチンキナーゼまたはクレアチンキナーゼイソ酵素を全く含まない。クレアチンキナーゼ試薬は生理的ｐＨ、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、エチレンジアミン四酢酸、マンニトール、マグネシウム及びグルコースを保持するための緩衝水溶液であり、ここでエチレンジアミン四酢酸及びマンニトールの濃度は緩衝液中のＮ− アセチル−Ｌ−システインの安定性を改良するように選択される。好適クレアチンキナーゼ試薬はＥＤＴＡ及びマンニトールと共に液体安定ＮＡＣを溶解した水溶液である。我々の発明によるもう一つの方法は、ＥＤＴＡ、マンニトール、マグネシウムカチオン及びＮＡＣを緩衝溶液に適切な濃度で加えることによってＮＡＣの安定な水溶液を作るためのものである。我々の発明の範囲内にはクレアチンキナーゼの検定も含まれる。この検定は液体安定チオール活性化剤を調製し、テストサンプルをその液体安定チオール活性化剤に加え、テストサンプル中のクレアチンキナーゼを検出することによって行われる。本発明はテストサンプル中のクレアチンキナーゼを再活性化するためのクレアチンキナーゼ試薬として使用できる安定ＮＡＣ水溶液を提供する。本発明はクレアチンキナーゼコントロール試薬中に存在するクレアチンキナーゼの活性を維持するためのクレアチンキナーゼコントロール試薬を包含しない。クレアチンキナーゼ試薬は好適にはマンニトールまたはイノシトールと、ＮＡＣとを水溶液として含む。我々はマンニトールが水溶液中のＮＡＣに対して明らかな安定化効果を有することを見いだした。マンニトールとＥＤＴＡの両方がＮＡＣ水溶液に用いられるのが最も好適である。ＥＤＴＡとマンニトールとの組合わせにより、２８日間４１℃のストレスをかけた後のクレアチンキナーゼ試薬のＮＡＣ活性が９６％回復することを我々は見いだした；開放ビンに入れた場合の機器内安定性（２−８℃）に関しては、クレアチンキナーゼ緩衝液中のＮＡＣ活性はシンクロン^R ＣＸ４ＣＥ^R 臨床化学自動分析器（ベックマンインスツルメント社）で２８日後には１００％回復した。しかしクレアチンキナーゼ緩衝液中にＥＤＴＡ及びマンニトールがない場合は、ＮＡＣ活性は１３日間の４１℃ストレス後に完全に失われた。クレアチンキナーゼ緩衝液に３５．０ｍｍｏｌ／Ｌのマンニトールを加えると、水溶液中のＮＡＣ安定性を同一に維持しながらＥＤＴＡ濃度を２．０から０．５０ｍｍｏｌ／Ｌに減らすことができた。クレアチンキナーゼ試薬中のＥＤＴＡ濃度が低いことは、ＥＤＴＡによるＭｇ⁺²のキレート化を減らすから好ましい。例例１（クレアチンキナーゼ緩衝試薬の調製）クレアチンキナーゼ緩衝溶液は、１１８．９ｍｍｏｌ／Ｌのイミダゾール（分子量６８．１）（カルビオケム、サンディエゴ、カリフォルニア）、１１．８９ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸マグネシウム（Ｈ₂Ｏ）₄ （分子量２１４．５）（Ｊ．Ｔ．ベイカー社）、２３．８ｍｍｏｌ／ＬのＤ−グルコース（分子量１８０．２）（ファンスティールラボラトリース社）、及び２３．７７ｍｍｏｌ／ＬのＮ−アセチル−Ｌ−システイン（分子量１６３．２）（ベーリンガーマンハイムビオケミカルス、インディアナポリス、インディアナ）を含むように調製された。すべての緩衝溶液に用いた溶媒は電離水であった。緩衝溶液のｐＨは、氷酢酸か、または水性イミダゾールの１ｍｏｌ／Ｌ溶液のどちらかを用いて２５℃で６．７に調節された。その他のクレアチン緩衝溶液もＥＤＴＡ二ナトリウム（分子量３７２．２０）及びマンニトール（分子量１８２．１７）を前記の濃度範囲で含むように調製された。これは後に記載する表によって示される。クレアチンキナーゼ検定はベックマン―インスツルメント社（フラトン、カリフォルニア）のシンクロン^R 臨床化学自動分析器を用いて行われた。シンクロン^R 装置は３試薬（Ａ、Ｂ、Ｃ）コンパートメントカートリッジシステムを用いている。コンパートメントＡは前記のように作られたクレアチンキナーゼ緩衝溶液を含む。コンパートメントＢはクレアチンキナーゼを測定するヘキソキナーゼ／グルコース−６−燐酸脱水素酵素検定のためのｐＨ６．５コエンチーム溶液を含む。シンクロン^R カートリッジコンパートメントＢのコエンチーム溶液は、少なくとも適切な量のヘキソキナーゼ、Ｇ６ＰＤＨ、ＡＭＰ、ＮＡＤＰ、ＡＤＰ及びＰ’，Ｐ⁵−ジペンタ−Ｐを電離水に溶解することによって調製された。コンパートメントＣは少なくもクレアチン燐酸を電離水に混ぜ合わせ、そのｐＨを８．５に調節することによって作られた酵素基質を含んでいた。約１２μＬのテストサンプルアリコートをシンクロン^R 機器によって分析し、クレアチンキナーゼ検定を行うときに、これにコンパートメントＡ緩衝液２２２ μＬとコンパートメントＢ溶液２２μＬとコンパートメントＣ溶液２０μＬとを加える。例２（ＮＡＣ検定）ＮＡＣ安定性の研究を行い、コンパートメントＡクレアチンキナーゼ緩衝試薬中のＮＡＣの安定性を測定した。遊離ＳＨ基を測定するエルマン（Ellman）の試薬¹¹を用いて、調製されたすべてのクレアチンキナーゼ緩衝溶液のＮＡＣ濃度を検定した。該当するＮＡＣ検定反応は次のようである：Ｒ−ＳＨ＋ジチオビスニトロベンゾエート―−→ Ｒ−Ｓ−Ｓ−ニトロベンゾエート＋チオニトロベンゾエート ¹¹ エルマン（Ellman，G.L.）ら、Biochem.Pharmacol.、７巻、８８ページ（１９６１）ＤＵ^R ７５００分光光度計（ベックマン―インスツルメンツ社）を用いて、反応溶液の吸光度を４０５ｎｍで測定した。例３（クレアチンキナーゼ緩衝液中のＮＡＣの安定化剤としてのＥＤＴＡ）当業者には公知のように、クレアチンキナーゼ緩衝溶液中のＮＡＣは緩衝溶液中では不安定になるが、ＥＤＴＡの存在によりＮＡＣ水溶液は或る程度安定になり得ることを確認するための実験が行われた。ｐＨ６．７の８種類のクレアチンキナーゼ緩衝溶液（Ａ〜Ｈ）を表１に示すように作り、フラクショナル―フラクトリアル（fractional-factorial）スクリーニング実験を計画した。これら８つの溶液は表１に示すように、イミダゾール、酢酸マグネシウム、Ｄ−グルコース及びＥＤＴＡを含み、または含まずに作られた。表中“１”はその成分がクレアチンキナーゼ緩衝溶液に存在することを意味し、“０”はその成分が存在しないことを意味する。８つの溶液の各々は０．３８８ｇＮＡＣ／１００ｍｌで作られた。イミダゾールが存在する場合はその濃度は０．８１０ｇ／１００ｍｌであった。酢酸マグネシウムが存在する場合、その濃度は０．２５５ｇ／１００ｍｌであった。グルコースが存在するときには、その濃度は０．４２９ｇ／１００ｍｌであった。（表１によって示されるように）作られた８つのクレアチンキナーゼ緩衝溶液の１つにＥＤＴＡが存在する場合は、クレアチンキナーゼ緩衝溶液１００ｍｌにつき０．０８９ｇの濃度のＥＤＴＡが存在した。溶液調製日を“０日”として記録した。８クレアチンキナーゼ緩衝溶液の各々の半分（５０ｍｌ）を５℃で保存し、残り半分（５０ｍｌ）を４１ ℃で保存した。こうして調製された８つのクレアチンキナーゼ緩衝溶液の各々の半分の５℃及び４１℃におけるストレス試験（ＮＡＣ水溶液安定性の試験）が行われた。緩衝液調製日後の３、５、７及び１３日目に、ＮＡＣのエルマン試薬検定を行い、その結果をＤＵ^R ７５００分光光度計を用いて４０５ｎｍで読み取り、添付の表に示すように吸光単位Ａを測定した。表２は４１℃ストレス試験の結果を示す。ＥＤＴＡがない場合（すなわちクレアチンキナーゼ緩衝溶液Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ）、クレアチンキナーゼ緩衝溶液中のＮＡＣは急速に不安定になる。クレアチンキナーゼ緩衝溶液中にＥＤＴＡが存在すると、予想通り、著しいＮＡＣ品質低下を緩衝液調製後約５日目まで遅らせることができた。こうして水溶液中のＮＡＣ安定性はクレアチンキナーゼ緩衝溶液中２．０ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡの存在によって有意に改善した。例４（クレアチンキナーゼ緩衝液中のＮＡＣ安定性に関するマンニトールの影響）ＥＤＴＡを全く含まないクレアチンキナーゼ緩衝溶液にマンニトールを加えた。クレアチンキナーゼ緩衝液中に５９ｍｍｏｌ／Ｌ（０．９ｇ／１００ｍｌ）のマンニトールが存在すると、ＮＡＣストレス安定性（４１℃Ｃ）は有意に改善することがわかった。こうしてＮＡＣ含有緩衝溶液に４１℃のストレスを１３日間かけた後、ＮＡＣ活性は約３０％しか減少しないことがわかった。緩衝液にマンニトールもＥＤＴＡも存在しない場合、表３に示すように、４１℃ストレス試験下で約１３日後にはＮＡＣ安定性は無視できるほど小さかった。こうしてクレアチンキナーゼ水性緩衝溶液中に存在するＮＡＣに対してマンニトールはそれ自体顕著な安定化効果をもたらすことが発見された。例５（クレアチンキナーゼ緩衝液中のＮＡＣ安定性に関するＥＤＴＡ及びマンニトールの組み合わせの存在の効果）ＥＤＴＡとマンニトールとの組合わせがＥＤＴＡまたはマンニトール単独に比較してクレアチンキナーゼ緩衝液中のＮＡＣ安定性を有意に改善することが見いだされた。ＥＤＴＡとマンニトールとの併用がクレアチンキナーゼ緩衝液中のＮＡＣ安定性に及ぼす効果を測定するために、緩衝液中のＥＤＴＡ及びマンニトールの濃度を最適化するための要因分析実験（factorial experiment）が計画された。こうして表４に示すように１番から４番までの４クレアチンキナーゼ緩衝液が作られた。その他の、異なる濃度のマンニトール及びＥＤＴＡの組合わせ（示されていない）も行われた（すなわちマンニトール濃度５０、７５及び１００ｍｍｏｌ／Ｌ、並びにＥＤＴＡ濃度０．５、１及び１．５ｍｍｏｌ／Ｌ）。その結果は、３５ｍｍｏｌ／Ｌのマンニトールを加えることによって、クレアチンキナーゼ中のＥＤＴＡ濃度は２．０ｍｍｏｌ／Ｌから０．５０ｍｍｏｌ／Ｌに減らすことができ、それでもクレアチンキナーゼ緩衝液中のＮＡＣの安定性を同一に維持することができることを示した（表５参照。ここで１−４の溶液は表４に示した１−４の溶液と同じものである）。クレアチンキナーゼ緩衝液中のＥＤＴＡ濃度のこのような減少は、ＥＤＴＡによるＭｇ⁺²カチオンのキレート化を減らすから好ましい。表６に示すように、１．１８ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡと５９．０ｍｍｏｌ／Ｌのマンニトールの組合わせ（すなわち表４及び５の溶液４）はｐＨ６．７のクレアチンキナーゼ緩衝液のＮＡＣを安定化するために最適な条件であった。結果は２８日間４１℃のストレスをかけたクレアチンキナーゼ緩衝液のＮＡＣ活性が９６％回収されたことを示した。機器内（on-instrument）（すなわち開放ビン使用）安定性（チオール活性化剤溶液の２〜８℃保存）では、開放ビン期間の２８日間とシンクロン^R ＣＸ４ＣＡ^R における使用後、クレアチンキナーゼ緩衝液中のＮＡＣ活性はまだ実質的に１００％であった（表６参照）。本発明をいくつかの好適な実施態様に関してかなり詳細に述べたが、本発明の教示の範囲内でその他の実施態様も可能である。例えば広範囲の種類のチオール、安定化剤及びキレート剤が権利を請求する組成物及び方法の範囲内にある。

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）生物学的分子を活性化するためのチオール活性化剤；（ｂ）チオール活性化剤を安定化するための安定化剤；及び（ｃ）チオール活性化剤と安定化剤とを溶解できる液体であって、溶解したチオール活性化剤がその液体中で安定化剤によって安定化する液体を含んでなる組成物。２．チオール活性化剤が、グルタチオン、臭化２−アミノエチルイソチオウロニウム、チオグリコール酸、システイン、メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、モノチオグリセロール、グルタチオン、ジチオエリトレイトール及びＮ−アセチル−Ｌ−システインからなる群から選択される請求の範囲第１項記載の組成物。３．チオール活性化剤がＮ−アセチル−Ｌ−システインである請求の範囲第２項記載の組成物。４．安定化剤が遊離ラジカルスカベンジャーである請求の範囲第１項記載の組成物。５．遊離ラジカルスカベンジャーがイノシトール、トコフェロール、マンニトール、スーパーオキシドジムターゼ、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、Ｎ−２−メルカプトプロピオニルグリシン、ジメチルチオ尿素、グルタチオン、２１−アミノステロイド類、デフェロキサミン、アロプリノール、ジメチルスルフォキシド及びコエンチームＱからなる群から選択される請求の範囲第４項記載の組成物。６．液体が、その液体を生理的ｐＨに維持することができる緩衝水溶液を含んでなる請求の範囲第１項記載の組成物。７．液体から所望でない金属イオンを除去するためのキレート剤をさらに含む請求の範囲第１項記載の組成物。８．キレート剤が液体中に約０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌから約４ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で存在する請求の範囲第７項記載の組成物。９．キレート剤がＥＧＴＡ、ＢＨＮ及びＥＤＴＡからなる群から選択される請求の範囲第７項記載の組成物。１０．チオール活性化剤が保存条件下で、少なくとも約１年間は実質的に減少しないチオール活性化能力を保有する請求の範囲第１項記載の組成物。１１．チオール活性化剤が保存条件下で、少なくとも約２年間は実質的に減少しないチオール活性化能力を保有する請求の範囲第１項記載の組成物。１２．チオール活性化剤が開放ビン条件で、少なくとも約２８日間は実質的に減少しないチオール活性化能力を保有する請求の範囲第１項記載の組成物。１３．チオール活性化剤が開放ビン条件下で、少なくとも約６０日間は実質的に減少しないチオール活性化能力を保有する請求の範囲第１項記載の組成物。１４．生物学的分子の活性化を促進することができる金属イオンをさらに含む請求の範囲第１項記載の組成物。１５．金属イオンがマグネシウムカチオンである請求の範囲第１４項記載の組成物。１６．安定化剤が液体中に約組成物５ｍｍｏｌ／Ｌから約５５０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で存在する請求の範囲第１項記載の組成物。１７．（ａ）生物学的分子を活性化するためのチオール活性化剤、（ｂ）チオール活性化剤を安定化するための遊離ラジカルスカベンジャー、（ｃ）生物学的分子の活性を促進するための金属イオン、（ｄ）キレート剤、及び（ｅ）チオール活性化剤、安定化剤、金属イオン及びキレート剤を緩衝液に溶解させて、溶液中に存在するチオールの顕著な品質低下を保存条件下で少なくとも約１年間、開放ビン条件下で少なくとも約２８日間阻止して安定に保つ液体安定チオール活性化剤溶液を形成することができる水性緩衝液を含んでなる液体の安定なチオール活性化剤溶液。１８．（ａ）水性緩衝液；（ｂ）Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン；（ｃ）エチレンジアミン四酢酸；（ｄ）マンニトール；及び（ｅ）マグネシウムを含んでなり、ここでエチレンジアミン四酢酸とマンニトールの濃度が水性緩衝液中のＮ−アセチル−Ｌ−システインを安定化するように選択されるクレアチンキナーゼ検定のための試薬。１９．（ａ）チオール活性化剤と安定化剤とを溶解するための液体を選択し；（ｂ）チオール活性化剤を前記液体に添加し；そして（ｃ）前記液体に溶解したチオール活性化剤を安定化することができる安定化剤を前記液体に添加し；それによって液体の安定なチオール活性化剤溶液を作る各工程を含んでなり、ここで、前記溶液中でチオール活性化剤は安定であり、そのチオール活性化能力は保存条件下で少なくとも約１年間、開放ビン条件下で少なくとも約２８日間は実質的に減少せずに保有される液体の安定なチオール活性化剤溶液の製造方法。２０．（ａ）水性緩衝液を選択し；（ｂ）ＥＤＴＡを前記緩衝液に添加し；そして（ｃ）マンニトールを前記緩衝液に添加する各工程を含んでなり、ここで前記緩衝液はＥＤＴＡとマンニトールとを溶解することができて、この方法により安定なＮＡＣの水溶液が得られる安定なＮＡＣの水溶液の製造方法。２１．（ａ）液体の安定なチオール活性化剤溶液を調製し；（ｂ）生理的流体の試験サンプルを液体の安定なチオール活性化剤に加え；そして（ｃ）試験サンプル中のクレアチンキナーゼ活性を検出する各工程を含んでなるクレアチンキナーゼ活性の検定法。