JP6981979B2 - アルカリゲネス・フェーカリス由来の変異型3−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ並びにそれに関する方法および使用 - Google Patents
アルカリゲネス・フェーカリス由来の変異型3−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ並びにそれに関する方法および使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6981979B2 JP6981979B2 JP2018532408A JP2018532408A JP6981979B2 JP 6981979 B2 JP6981979 B2 JP 6981979B2 JP 2018532408 A JP2018532408 A JP 2018532408A JP 2018532408 A JP2018532408 A JP 2018532408A JP 6981979 B2 JP6981979 B2 JP 6981979B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hbdh
- seq
- amino acid
- mutant
- 187phe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
253Ile,233Lys,234Thr;又は,
253Ile,62Val,233Lys,234Thr;又は,
253Ile,62Val,147Arg,233Lys,234Thr;又は,
253Ile,39Gly,62Val,143Val,148Gly,233Lys,234Thr;又は,
253Ile,62Val,143Val,148Gly,233Lys,234Thr;又は,
62Val,111Leu,140Met,148Gly
(表2A〜D参照)。
配列番号1(アルカリゲネス・フェーカリス由来の3-HBDH)
MLKGKKAVVT GSTSGIGLAM ATELAKAGAD VVINGFGQPE DIERERSTLE SKFGVKAYYL 60
NADLSDAQAT RDFIAKAAEA LGGLDILVNN AGIQHTAPIE EFPVDKWNAI IALNLSAVFH 120
GTAAALPIMQ KQGWGRIINI ASAHGLVASV NKSAYVAAKH GVVGLTKVTA LENAGKGITC 180
NAICPGWVRT PLVEKQIEAI SQQKGIDIEA AARELLAEKQ PSLQFVTPEQ LGGAAVFLSS 240
AAADQMTGTT LSLDGGWTAR 260
配列番号2(アルカリゲネス・フェーカリス由来の3-HBDHの拡張コア配列(extended core sequence))
ADLSDAQATR DFIAKAAEAL GGLDILVNNA GIQHTAPIEE FPVDKWNAII ALNLSAVFHG 60
TAAALPIMQK QGWGRIINIA SAHGLVASVN KSAYVAAKHG VVGLTKVTAL ENAGKGITCN 120
AICPGWVRTP LVEKQIEAIS QQKGIDIEAA ARELLAEKQP SLQFVTPEQL GGAAVFLSSA 180
AADQMTGTTL SL 192
Ala,Leu,Val,Ile 別の脂肪族(Ala,Leu,Val,Ile)
別の非極性(Ala,Leu,Val,Ile,Gly,Met)
Gly,Met 別の非極性(Ala,Leu,Val,Ile,Gly,Met)
Asp,Glu 別の酸性(Asp,Glu)
Lys,Arg 別の塩基性(Lys,Arg)
Asn,Gln,Ser,Thr 別の極性(Asn,Gln,Ser,Thr)
His,Tyr,Trp,Phe 別の芳香族(His,Tyr,Trp,Phe)
Cys,Pro 無し
該変異型は,野生型3-HBDHに対し少なくとも3つのアミノ酸置換を有し,ここで,
配列番号1の位置253に相当する位置のアミノ酸がIle(253Ile),Ala(253Ala)又はCys(253Cys)に置換されている,
配列番号1の位置233に相当する位置のアミノ酸がSer(233Ser),Ile(233Ile),Ala(233Ala),Pro(233Pro),Arg(233Arg),Thr(233Thr),Lys(233Lys),又はCys(233Cys)に置換されている,及び
配列番号1の位置234に相当する位置のアミノ酸がThr(234Thr)に置換されている。
配列番号1の位置253に相当する位置のアミノ酸がIle(253Ile),Ala(253Ala)又はCys(253Cys),特にIle(253Ile)に置換されている;
配列番号1の位置18に相当する位置のアミノ酸がArg(18Arg),Lys(18Lys),Glu(18Glu),又はPro(18Pro)に置換されている;
配列番号1の位置19に相当する位置のアミノ酸がGly(19Gly)に置換されている;
配列番号1の位置33に相当する位置のアミノ酸がAla(33Ala),Leu(33Leu),又はThr(33Thr)に置換されている;
配列番号1の位置38に相当する位置のアミノ酸がLys(38Lys)に置換されている;
配列番号1の位置39に相当する位置のアミノ酸がGly(39Gly)に置換されている;
配列番号1の位置62に相当する位置のアミノ酸がPhe(62Phe),Met(62Met),Lys(62Lys),Arg(62Arg),Leu(62Leu),又はVal(62Val),特にVal(62Val)に置換されている;
配列番号1の位置125に相当する位置のアミノ酸がGly(125Gly)に置換されている;
配列番号1の位置143に相当する位置のアミノ酸がVal(143Val)に置換されている;
配列番号1の位置148に相当する位置のアミノ酸がGly(148Gly)に置換されている;
配列番号1の位置170に相当する位置のアミノ酸がGly(170Gly)に置換されている;
配列番号1の位置175に相当する位置のアミノ酸がThr(175Thr),Val(175Val),又はIle(175Ile)に置換されている;
配列番号1の位置187に相当する位置のアミノ酸がPhe(187Phe)に置換されている;
配列番号1の位置216に相当する位置のアミノ酸がVal(216Val)に置換されている;
配列番号1の位置233に相当する位置のアミノ酸がSer(233Ser),Ile(233Ile),Ala(233Ala),Pro(233Pro),Arg(233Arg),Thr(233Thr),Lys(233Lys),又はCys(233Cys),特にLys(233Lys)に置換されている;及び/又は
配列番号1の位置234に相当する位置のアミノ酸がThr(234Thr)に置換されている。
253Ile;
253Ile,233Lys,234Thr;
253Ile,62Val,233Lys,234Thr;
253Ile,62Val,147Arg,233Lys,234Thr;
253Ile,39Gly,62Val,143Val,148Gly,233Lys,234Thr;
253Ile,62Val,143Val,148Gly,233Lys,234Thr;又は
62Val,111Leu,140Met,148Gly;
特に,ここで,前記変異型3-HBDHは,少なくとも253Ile,62Val,143Val,143Val,148Gly,233Lys,234Thrの変異を有するかあるいはこれらの変異のみ有し,場合により
19Gly;
170Gly;
125Gly,187Phe;
18Glu,33Leu;
33Leu,125Gly,187Phe;
33Leu,125Gly,187Phe,216Val;
18Glu,187Phe;
33Leu,125Gly,175Val,187Phe;
175Val,216Val;
175Val,187Phe,216Val;
19Gly,125Gly, 187Phe;
125Gly,175Thr,187Phe;
19Gly,33Leu;
19Gly,175Ile;
19Gly,175Thr;
170Gly,175Thr;
18Glu,125Gly,187Phe;
33Leu,125Gly,175Thr,187Phe;
33Leu,125Gly,175Ile,187Phe;
33Leu,125Gly,170Gly,187Phe;
18Glu,175Ile,187Phe;
33Leu,125Gly,175Val,187Phe;
33Leu,125Gly,175Val,187Phe,216Val;
33Leu,125Gly,175Thr,187Phe;又は
33Leu,38Lys,39Gly,125Gly,175Val,187Pheとの組み合わせとして有する。
野生型3-HBDHに比べて増加した安定性,特に熱安定性;及び/又は
野生型3-HBDHに比べて増加した基質親和性,特に3-ヒドロキシ酪酸に対する親和性;及び/又は
野生型3-HBDHに比べて増加した補因子親和性,特にNAD又はその誘導体に対する親和性,ここで特に前記誘導体はカルバNADである。
a)3-HBDHの活性を促す条件下で該試料を本発明の変異型3-HBDHに接触させること;
b)3-ヒドロキシ酪酸をニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)又はその機能的に活性な誘導体と反応させること;および
c)前記NAD又はその誘導体の酸化還元状態の変化を決定すること;
により,前記試料における3-ヒドロキシ酪酸の量又は濃度を決定することを含む,方法に関する。
a)前記NAD又はその誘導体の酸化還元状態の変化を決定することは,(i)NAD又はその誘導体及び/又は(ii)NADH又はその誘導体の濃度を決定することを含む;及び/又は
b)前記NAD又はその誘導体の酸化還元状態の変化を決定することは,電気化学的又は光学的である;及び/又は
c)前記方法は,アセト酢酸及び/又はアセトンの量又は濃度を決定することを更に含む;及び/又は
d)前記方法は,グルコースの量又は濃度を決定することを更に含む;及び/又は
e)前記NADの誘導体はカルバNADである;及び/又は
f)変異型3-HBDHは,センサ,テストストリップ,テストエレメント,テストストリップデバイス,又は液体テストの一部である;及び/又は
g)前記試料は,体液,特に血液試料又は尿試料である。
アルカリゲネス・フェーカリス由来の3-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ(3-HBDH)の遺伝子(Database UniProtKB - D0VWQ0)を合成し,ベクターpKKt5にクローニングし,分子生物学の一般的な方法によりE. coli XL-1 Blue株で形質転換した。
実施例1に記載したように製造した3-HBDH変異型のライブラリを,以下の酵素の性質についてスクリーニングした:
熱安定性
3-ヒドロキシ酪酸に対する親和性
c-NAD(カルバNAD=人工補因子,US20120130062A1参照)に対する親和性
熱安定性:mtpを64℃で30分間インキュベートし,その後62.22 mM 3-ヒドロキシ酪酸; 4.15 mM cNAD; 0.1% Triton X-100; 200 mM Hepes pH 9.0で検査した。
3-ヒドロキシ酪酸に対する親和性:基質の量を減じた(すなわち,基質飽和未満)活性アッセイは、1.94 mM 3-ヒドロキシ酪酸; 4.15 mM cNAD; 0.1% Triton X-100; 200 mM Hepes pH 9.0で測定した。
cNADに対する親和性:補因子の量を減じた(すなわち,飽和未満)活性アッセイは、62.22 mM 3-ヒドロキシ酪酸; 0.032 mM cNAD; 0.1% Triton X-100; 200 mM Hepes pH 9.0で測定した。
実施例3から選択された変異型をpH7.5で測定し,最良の変異型をさらなる変異誘発のために選択した。
熱安定性についてはmtpを60〜90℃(酵素変異型の安定性による)30分間インキュベートし,その後150 mM 3-ヒドロキシ酪酸; 5 mM cNAD; 0.1% Triton X-100; 70 mM Mops pH 7.5で検査した。
β−ヒドロキシ酪酸に対する親和性についてはmtpを5 mM 3-ヒドロキシ酪酸; 5 mM cNAD; 0.1% Triton X-100; 70 mM Mops pH 7.5で測定した。
cNADに対する親和性についてはmtpを150 mM 3-ヒドロキシ酪酸; 0.5 mM cNAD; 0.1% Triton X-100; 70 mM Mops pH 7.5で測定した。
AFDH2: AFDH1+L253I
AFDH3: AFDH1+G233K+A234T+L253I
AFDH4: AFDH1+A62V+G233K+A234T+L253I
AFDH4+147R: AFDH1+A62V+V147R+G233K+A234T+L253I
AFDH5: AFDH1+P39G+A62R+A143V+A148G+G233K+A234T+L253I
AFDH6: AFDH1+A62V+A143V+A148G+G233K+A234T+L253I
AFDHx: AFDH1+A62V+E111L+I140M+A148G
AFDH1:アルカリゲネス・フェーカリス由来の野生型3-HBDH (配列番号1)
MLKGKKAVVT GSTSGIGLAM ATELAKAGAD VVINGFGQPE DIERERSTLE SKFGVKAYYL 60
NADLSDAQAT RDFIAKAAEA LGGLDILVNN AGIQHTAPIE EFPVDKWNAI IALNLSAVFH 120
GTAAALPIMQ KQGWGRIINI ASAHGLVASV NKSAYVAAKH GVVGLTKVTA LENAGKGITC 180
NAICPGWVRT PLVEKQIEAI SQQKGIDIEA AARELLAEKQ PSLQFVTPEQ LGGAAVFLSS 240
AAADQMTGTT LSLDGGWTAR 260
AFDH1の拡張コア配列 (配列番号2)
ADLSDAQATR DFIAKAAEAL GGLDILVNNA GIQHTAPIEE FPVDKWNAII ALNLSAVFHG 60
TAAALPIMQK QGWGRIINIA SAHGLVASVN KSAYVAAKHG VVGLTKVTAL ENAGKGITCN 120
AICPGWVRTP LVEKQIEAIS QQKGIDIEAA ARELLAEKQP SLQFVTPEQL GGAAVFLSSA 180
AADQMTGTTL SL 192
AFDH2:AFDH1+L253I (配列番号3)
MLKGKKAVVT GSTSGIGLAM ATELAKAGAD VVINGFGQPE DIERERSTLE SKFGVKAYYL 60
NADLSDAQAT RDFIAKAAEA LGGLDILVNN AGIQHTAPIE EFPVDKWNAI IALNLSAVFH 120
GTAAALPIMQ KQGWGRIINI ASAHGLVASV NKSAYVAAKH GVVGLTKVTA LENAGKGITC 180
NAICPGWVRT PLVEKQIEAI SQQKGIDIEA AARELLAEKQ PSLQFVTPEQ LGGAAVFLSS 240
AAADQMTGTT LSIDGGWTAR 260
AFDH3:AFDH1+G233K+A234T+L253I (配列番号4)
MLKGKKAVVT GSTSGIGLAM ATELAKAGAD VVINGFGQPE DIERERSTLE SKFGVKAYYL 60
NADLSDAQAT RDFIAKAAEA LGGLDILVNN AGIQHTAPIE EFPVDKWNAI IALNLSAVFH 120
GTAAALPIMQ KQGWGRIINI ASAHGLVASV NKSAYVAAKH GVVGLTKVTA LENAGKGITC 180
NAICPGWVRT PLVEKQIEAI SQQKGIDIEA AARELLAEKQ PSLQFVTPEQ LGKTAVFLSS 240
AAADQMTGTT LSIDGGWTAR 260
AFDH4:AFDH1+A62V+G233K+A234T+L253I (配列番号5)
MLKGKKAVVT GSTSGIGLAM ATELAKAGAD VVINGFGQPE DIERERSTLE SKFGVKAYYL 60
NVDLSDAQAT RDFIAKAAEA LGGLDILVNN AGIQHTAPIE EFPVDKWNAI IALNLSAVFH 120
GTAAALPIMQ KQGWGRIINI ASAHGLVASV NKSAYVAAKH GVVGLTKVTA LENAGKGITC 180
NAICPGWVRT PLVEKQIEAI SQQKGIDIEA AARELLAEKQ PSLQFVTPEQ LGKTAVFLSS 240
AAADQMTGTT LSIDGGWTAR 260
AFDH4+147R:AFDH1+A62V+V147R+G233K+A234T+L253I (配列番号6)
MLKGKKAVVT GSTSGIGLAM ATELAKAGAD VVINGFGQPE DIERERSTLE SKFGVKAYYL 60
NVDLSDAQAT RDFIAKAAEA LGGLDILVNN AGIQHTAPIE EFPVDKWNAI IALNLSAVFH 120
GTAAALPIMQ KQGWGRIINI ASAHGLRASV NKSAYVAAKH GVVGLTKVTA LENAGKGITC 180
NAICPGWVRT PLVEKQIEAI SQQKGIDIEA AARELLAEKQ PSLQFVTPEQ LGKTAVFLSS 240
AAADQMTGTT LSIDGGWTAR 260
AFDH5:AFDH1+P39G+A62R+A143V+A148G+G233K+A234T+L253I(配列番号7)
MLKGKKAVVT GSTSGIGLAM ATELAKAGAD VVINGFGQGE DIERERSTLE SKFGVKAYYL 60
NRDLSDAQAT RDFIAKAAEA LGGLDILVNN AGIQHTAPIE EFPVDKWNAI IALNLSAVFH 120
GTAAALPIMQ KQGWGRIINI ASVHGLVGSV NKSAYVAAKH GVVGLTKVTA LENAGKGITC 180
NAICPGWVRT PLVEKQIEAI SQQKGIDIEA AARELLAEKQ PSLQFVTPEQ LGKTAVFLSS 240
AAADQMTGTT LSIDGGWTAR 260
AFDH6:AFDH1+A62V+A143V+A148G+G233K+A234T+L253I(配列番号8)
MLKGKKAVVT GSTSGIGLAM ATELAKAGAD VVINGFGQPE DIERERSTLE SKFGVKAYYL 60
NVDLSDAQAT RDFIAKAAEA LGGLDILVNN AGIQHTAPIE EFPVDKWNAI IALNLSAVFH 120
GTAAALPIMQ KQGWGRIINI ASVHGLVGSV NKSAYVAAKH GVVGLTKVTA LENAGKGITC 180
NAICPGWVRT PLVEKQIEAI SQQKGIDIEA AARELLAEKQ PSLQFVTPEQ LGKTAVFLSS 240
AAADQMTGTT LSIDGGWTAR 260
AFDH A:AFDH6+33L+125G+175V+187F (配列番号9)
MLKGKKAVVT GSTSGIGLAM ATELAKAGAD VVLNGFGQPE DIERERSTLE SKFGVKAYYL 60
NVDLSDAQAT RDFIAKAAEA LGGLDILVNN AGIQHTAPIE EFPVDKWNAI IALNLSAVFH 120
GTAAGLPIMQ KQGWGRIINI ASVHGLVGSV NKSAYVAAKH GVVGLTKVTA LENAVKGITC 180
NAICPGFVRT PLVEKQIEAI SQQKGIDIEA AARELLAEKQ PSLQFVTPEQ LGKTAVFLSS 240
AAADQMTGTT LSIDGGWTAR 260
AFDH B:AFDH6+125G+175T+187F (配列番号10)
MLKGKKAVVT GSTSGIGLAM ATELAKAGAD VVINGFGQPE DIERERSTLE SKFGVKAYYL 60
NVDLSDAQAT RDFIAKAAEA LGGLDILVNN AGIQHTAPIE EFPVDKWNAI IALNLSAVFH 120
GTAAGLPIMQ KQGWGRIINI ASVHGLVGSV NKSAYVAAKH GVVGLTKVTA LENATKGITC 180
NAICPGFVRT PLVEKQIEAI SQQKGIDIEA AARELLAEKQ PSLQFVTPEQ LGKTAVFLSS 240
AAADQMTGTT LSIDGGWTAR 260
AFDH C:AFDH6+170G+175T (配列番号11)
MLKGKKAVVT GSTSGIGLAM ATELAKAGAD VVINGFGQPE DIERERSTLE SKFGVKAYYL 60
NVDLSDAQAT RDFIAKAAEA LGGLDILVNN AGIQHTAPIE EFPVDKWNAI IALNLSAVFH 120
GTAAALPIMQ KQGWGRIINI ASVHGLVGSV NKSAYVAAKH GVVGLTKVTG LENATKGITC 180
NAICPGWVRT PLVEKQIEAI SQQKGIDIEA AARELLAEKQ PSLQFVTPEQ LGKTAVFLSS 240
AAADQMTGTT LSIDGGWTAR 260
AFDH D:AFDH6+18E+125G+187F (配列番号12)
MLKGKKAVVT GSTSGIGEAM ATELAKAGAD VVINGFGQPE DIERERSTLE SKFGVKAYYL 60
NVDLSDAQAT RDFIAKAAEA LGGLDILVNN AGIQHTAPIE EFPVDKWNAI IALNLSAVFH 120
GTAAGLPIMQ KQGWGRIINI ASVHGLVGSV NKSAYVAAKH GVVGLTKVTA LENAGKGITC 180
NAICPGFVRT PLVEKQIEAI SQQKGIDIEA AARELLAEKQ PSLQFVTPEQ LGKTAVFLSS 240
AAADQMTGTT LSIDGGWTAR 260
AFDH E:AFDH6+33L+125G+175I+187F (配列番号13)
MLKGKKAVVT GSTSGIGLAM ATELAKAGAD VVLNGFGQPE DIERERSTLE SKFGVKAYYL 60
NVDLSDAQAT RDFIAKAAEA LGGLDILVNN AGIQHTAPIE EFPVDKWNAI IALNLSAVFH 120
GTAAGLPIMQ KQGWGRIINI ASVHGLVGSV NKSAYVAAKH GVVGLTKVTA LENAIKGITC 180
NAICPGFVRT PLVEKQIEAI SQQKGIDIEA AARELLAEKQ PSLQFVTPEQ LGKTAVFLSS 240
AAADQMTGTT LSIDGGWTAR 260
AFDH F:AFDH6+33L+125G+170G+187F (配列番号14)
MLKGKKAVVT GSTSGIGLAM ATELAKAGAD VVLNGFGQPE DIERERSTLE SKFGVKAYYL 60
NVDLSDAQAT RDFIAKAAEA LGGLDILVNN AGIQHTAPIE EFPVDKWNAI IALNLSAVFH 120
GTAAGLPIMQ KQGWGRIINI ASVHGLVGSV NKSAYVAAKH GVVGLTKVTG LENAGKGITC 180
NAICPGFVRT PLVEKQIEAI SQQKGIDIEA AARELLAEKQ PSLQFVTPEQ LGKTAVFLSS 240
AAADQMTGTT LSIDGGWTAR 260
AFDH G:AFDH6+33L+125G+175V+187F+216V (配列番号15)
MLKGKKAVVT GSTSGIGLAM ATELAKAGAD VVLNGFGQPE DIERERSTLE SKFGVKAYYL 60
NVDLSDAQAT RDFIAKAAEA LGGLDILVNN AGIQHTAPIE EFPVDKWNAI IALNLSAVFH 120
GTAAGLPIMQ KQGWGRIINI ASVHGLVGSV NKSAYVAAKH GVVGLTKVTA LENAVKGITC 180
NAICPGFVRT PLVEKQIEAI SQQKGIDIEA AARELVAEKQ PSLQFVTPEQ LGKTAVFLSS 240
AAADQMTGTT LSIDGGWTAR 260
AFDH H:AFDH6+33l+38K+39G+125G+175V+187F(配列番号16)
MLKGKKAVVT GSTSGIGLAM ATELAKAGAD VVLNGFGKGE DIERERSTLE SKFGVKAYYL 60
NVDLSDAQAT RDFIAKAAEA LGGLDILVNN AGIQHTAPIE EFPVDKWNAI IALNLSAVFH 120
GTAAGLPIMQ KQGWGRIINI ASVHGLVGSV NKSAYVAAKH GVVGLTKVTA LENAVKGITC 180
NAICPGFVRT PLVEKQIEAI SQQKGIDIEA AARELLAEKQ PSLQFVTPEQ LGKTAVFLSS 240
AAADQMTGTT LSIDGGWTAR 260
Claims (16)
- 野生型3-HBDHに比べて改善した性能を有するアルカリゲネス・フェーカリス由来の変異型3-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ(3-HBDH)であって,
該変異型は,配列番号1のアミノ酸配列(アルカリゲネス・フェーカリス由来の3-HBDH;野生型3-HBDH)又は配列番号2のアミノ酸配列(野生型3-HBDHの拡張コア配列)と少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含み,かつ
該変異型は,野生型3-HBDHに対し少なくとも3つのアミノ酸置換を有し,ここで,
配列番号1の位置253に相当する位置のアミノ酸がIle(253Ile),Ala(253Ala)又はCys(253Cys)に置換されており,
配列番号1の位置233に相当する位置のアミノ酸がSer(233Ser),Ile (233Ile),Ala(233Ala),Pro(233Pro),Arg(233Arg),Thr(233Thr),Lys(233Lys),又はCys(233Cys)に置換されており,かつ
配列番号1の位置234に相当する位置のアミノ酸がThr(234Thr)に置換されており、
ここで、野生型3-HBDHに比べて改善した性能は,
野生型3-HBDHに比べて増加した熱安定性;及び/又は
野生型3-HBDHに比べて増加した基質3-ヒドロキシ酪酸に対する親和性;及び/又は
野生型3-HBDHに比べて増加した補因子カルバNADに対する親和性である,前記変異型3-HBDH。 - 配列番号1の位置253に相当する位置のアミノ酸がIle(253Ile)に置換されている,請求項1に記載の変異型3-HBDH。
- 配列番号1の位置233に相当する位置のアミノ酸がLys(233Lys)に置換されている,請求項1又は2に記載の変異型3-HBDH。
- 配列番号1の位置18,19,33,38,39,62,125,143,148,170,175,187及び/又は216,特に少なくとも配列番号1の位置62,143及び/又は148に相当する1つ又は複数の位置に少なくとも1つの更なるアミノ酸置換を有する,請求項1〜3のいずれか1項に記載の変異型3-HBDH。
- 配列番号1の位置18に相当する位置のアミノ酸がArg(18Arg),Lys(18Lys),Glu(18Glu),又はPro(18Pro)に置換されている;
配列番号1の位置19に相当する位置のアミノ酸がGly(19Gly)に置換されている;
配列番号1の位置33に相当する位置のアミノ酸がAla(33Ala),Leu(33Leu),又はThr(33Thr)に置換されている;
配列番号1の位置38に相当する位置のアミノ酸がLys(38Lys)に置換されている;
配列番号1の位置39に相当する位置のアミノ酸がGly(39Gly)に置換されている;
配列番号1の位置62に相当する位置のアミノ酸がPhe(62Phe),Met(62Met),Lys(62Lys),Arg(62Arg),Leu(62Leu),又はVal(62Val),特にVal(62Val)に置換されている;
配列番号1の位置125に相当する位置のアミノ酸がGly(125Gly)に置換されている;
配列番号1の位置143に相当する位置のアミノ酸がVal(143Val)に置換されている;
配列番号1の位置148に相当する位置のアミノ酸がGly(148Gly)に置換されている;
配列番号1の位置170に相当する位置のアミノ酸がGly(170Gly)に置換されている;
配列番号1の位置175に相当する位置のアミノ酸がThr(175Thr),Val(175Val),又はIle(175Ile)に置換されている;
配列番号1の位置187に相当する位置のアミノ酸がPhe(187Phe)に置換されている;及び/又は
配列番号1の位置216に相当する位置のアミノ酸がVal(216Val)に置換されている,
請求項1〜4のいずれか1項に記載の変異型3-HBDH。 - 前記変異型3-HBDHは,配列番号1の位置に相当する各位置に,少なくとも以下の変異を有する:
253Ile,233Lys,234Thr;
253Ile,62Val,233Lys,234Thr;
253Ile,62Val,147Arg,233Lys,234Thr;
253Ile,39Gly,62Val,143Val,148Gly,233Lys,234Thr;又は
253Ile,62Val,143Val,148Gly,233Lys,234Thr,
特に,ここで,前記変異型3-HBDHは,少なくとも253Ile,62Val,143Val,143Val,148Gly,233Lys,234Thrの変異を有し,場合により
19Gly;
170Gly;
125Gly,187Phe;
18Glu,33Leu;
33Leu,125Gly,187Phe;
33Leu,125Gly,187Phe,216Val;
18Glu,187Phe;
33Leu,125Gly,175Val,187Phe;
175Val,216Val;
175Val,187Phe,216Val;
19Gly,125Gly,187Phe;
125Gly,175Thr,187Phe;
19Gly,33Leu;
19Gly,175Ile;
19Gly,175Thr;
170Gly,175Thr;
18Glu,125Gly,187Phe;
33Leu,125Gly,175Thr,187Phe;
33Leu,125Gly,175Ile,187Phe;
33Leu,125Gly,170Gly,187Phe;
18Glu,175Ile,187Phe;
33Leu,125Gly,175Val,187Phe;
33Leu,125Gly,175Val,187Phe,216Val;
33Leu,125Gly,175Thr,187Phe;又は
33Leu,38Lys,39Gly,125Gly,175Val,187Pheとの組み合わせとして有する,請求項1〜5のいずれか1項に記載の変異型3-HBDH。 - 前記変異型3-HBDHは,配列番号1〜16のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90%,95%,96%,97%,98%,又は99%同一なアミノ酸配列を含む又はから成る,
特に,ここで,前記変異型3-HBDHは,配列番号4〜16からなる群より選択される配列を含む又はから成る,請求項1〜6のいずれか1項に記載の変異型3-HBDH。 - 前記変異型3-HBDHは,野生型3-HBDHに比べて少なくとも2倍増加した熱安定性,好ましくは少なくとも3倍増加した熱安定性,好ましくは少なくとも4倍増加した熱安定性,より好ましくは少なくとも5倍増加した熱安定性を有することを特徴とする;並びに/あるいは
前記変異型3-HBDHは,野生型3-HBDHに比べて増加した基質3-ヒドロキシ酪酸に対する親和性及び/又は野生型3-HBDHに比べて増加した補因子カルバNADに対する親和性が,少なくとも5%,とりわけ特に少なくとも10%,さらにとりわけ特に少なくとも15%又は20%増加していることを特徴とする,請求項1〜7のいずれか1項に記載の変異型3-HBDH。 - 請求項1〜8のいずれか1項に記載の変異型3-HBDHをコードする核酸。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の変異型3-HBDH又は請求項9に記載の核酸を含む細胞。
- 試料における3-ヒドロキシ酪酸の量又は濃度を決定する方法であって,
a)3-HBDHの活性を促す条件下で該試料を請求項1〜8のいずれか1項に記載の変異型3-HBDHに接触させること;
b)3-ヒドロキシ酪酸をニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)又はその機能的に活性な誘導体と反応させること;および
c)前記NAD又はその誘導体の酸化還元状態の変化を決定すること;
により,前記試料における3-ヒドロキシ酪酸の量又は濃度を決定することを含む,方法。 - a)前記NAD又はその誘導体の酸化還元状態の変化を決定することは,(i)NAD又はその誘導体及び/又は(ii)NADH又はその誘導体の濃度を決定することを含む;及び/又は
b)前記NAD又はその誘導体の酸化還元状態の変化を決定することは,電気化学的又は光学的である;及び/又は
c)前記方法は,アセト酢酸及び/又はアセトンの量又は濃度を決定することを更に含む;及び/又は
d)前記方法は,グルコースの量又は濃度を決定することを更に含む;及び/又は
e)前記NADの機能的に活性な誘導体はカルバNADである;及び/又は
f)変異型3-HBDHは,センサ,テストストリップ,テストエレメント,テストストリップデバイス,又は液体テストの一部である;及び/又は
g)前記試料は,体液,特に血液試料又は尿試料である,
請求項11に記載の方法。 - 試料における3-ヒドロキシ酪酸の量又は濃度を決定するための請求項1〜8のいずれか1項に記載の変異型3-HBDHの使用。
- 試料における3-ヒドロキシ酪酸の量又は濃度を決定するためのデバイスであって、
請求項1〜8のいずれか1項に記載の変異型3-HBDH,そして場合により前記決定に必要なさらなる成分を含む,前記デバイス。 - 前記デバイスは,センサ,好ましくは,電気化学センサ又は光学センサ,あるいはテストストリップ,特にテストストリップであるか又は含むことを特徴とする,請求項14に記載のデバイス。
- 前記デバイスは,更に試料におけるグルコースの量又は濃度を決定することを可能にする,請求項14又は15に記載のデバイス。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201562270133P | 2015-12-21 | 2015-12-21 | |
US62/270,133 | 2015-12-21 | ||
EP16165421 | 2016-04-14 | ||
EP16165421.5 | 2016-04-14 | ||
PCT/EP2016/082257 WO2017109003A1 (en) | 2015-12-21 | 2016-12-21 | Mutant 3-hydroxybutyrate dehydrogenase from alcaligenes faecalis as well as methods and uses involving the same |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019505193A JP2019505193A (ja) | 2019-02-28 |
JP6981979B2 true JP6981979B2 (ja) | 2021-12-17 |
Family
ID=65524545
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018532408A Active JP6981979B2 (ja) | 2015-12-21 | 2016-12-21 | アルカリゲネス・フェーカリス由来の変異型3−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ並びにそれに関する方法および使用 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6981979B2 (ja) |
ES (1) | ES2803273T3 (ja) |
-
2016
- 2016-12-21 ES ES16826037T patent/ES2803273T3/es active Active
- 2016-12-21 JP JP2018532408A patent/JP6981979B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ES2803273T3 (es) | 2021-01-25 |
JP2019505193A (ja) | 2019-02-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10508267B2 (en) | Mutant 3-hydroxybutyrate dehydrogenase from alcaligenes faecalis as well as methods and uses involving the same | |
US10704029B2 (en) | Mutant 3-hydroxybutyrate dehydrogenase from Rhodobacter sphaeroides as well as methods and uses involving the same | |
JP5843924B2 (ja) | グルコース脱水素酵素とシトクロームとの融合蛋白質 | |
JP6185617B2 (ja) | ピロロキノリンキノン依存性可溶性グルコース脱水素酵素の改善された変異体 | |
RU2652913C2 (ru) | Новые варианты глюкозооксидазы | |
US9562874B2 (en) | Biosensor with improved interference characteristics | |
JP6427110B2 (ja) | アスペルギルスニガー由来の新規グルコース酸化酵素 | |
CA2782349C (en) | Mutant lactate oxidase with increased stability and product, methods and uses involving the same | |
JP7084867B2 (ja) | フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ改変体 | |
EP3559218A1 (en) | Glucose dehydrogenase variants with improved properties | |
JP6981979B2 (ja) | アルカリゲネス・フェーカリス由来の変異型3−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ並びにそれに関する方法および使用 | |
JP4067111B2 (ja) | His−Tag融合フェニルアラニン脱水素酵素を用いた固定化酵素チップによるL−フェニルアラニンの定量方法 | |
RU175461U1 (ru) | Устройство для определения содержания глюкозы, лактата, этанола и крахмала при совместном присутствии | |
JP7165493B2 (ja) | 保存安定性に優れたグルコースデヒドロゲナーゼ及び持続血糖測定 | |
US20210292804A1 (en) | Recombinant flavin-adenine dinucleotide glucose dehydrogenase and uses thereof | |
JP2023544722A (ja) | 操作された安定な乳酸オキシドレダクターゼ、その組成物、デバイス、キットおよび使用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20191220 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210119 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210413 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210518 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210721 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20211019 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20211118 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6981979 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |