JPS611398A - 酵素的分析方法 - Google Patents

酵素的分析方法

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JPS611398A
JPS611398A JP60059688A JP5968885A JPS611398A JP S611398 A JPS611398 A JP S611398A JP 60059688 A JP60059688 A JP 60059688A JP 5968885 A JP5968885 A JP 5968885A JP S611398 A JPS611398 A JP S611398A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 こ発明は、サンプル媒体中の分析対象を酵素反応により
検出する方法に関する。この発明特に、限定的ではない
が、ポリヌクレオチド分析対象に適用することができる
。
〔従来の技術〕
核酸ハイブリダイゼーション測定は、ヒトの遺伝的疾患
の診断、及びそのキャリヤーの検出のために実際的な重
要性が増加しつつある〔例えば。
パンブリーレ／　−）　（Ｂａｎｂｕｒｙ　Ｒｅｐａｒ
ｔ　）　１４、ヒト疾患への組換ＤＮＡの適用、Ｓ、Ｔ
、　Ｃａ５ｋｅｙ及びＲ，Ｌ、　Ｗｈ　ｉ　ｔ　ｅ編、
コールドスプリングバーパーラＮシトリ−，１９８３を
参照のこと〕。これらの測定方法はさらに、ウィルス及
び細菌を含む病原生物の同定のため、並びに細菌におい
て抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子の同定のため
にも価値がある。
一般に使用される方法は、安全性、コスト及び限定され
た商品寿命の問題を伴う放射化学的標識グローブを使用
するグローブに付加された化学ルミネスセンス物質、螢
光物質又は燐光物質を用いる他の方法が提案されている
（　ＥＰ　７０６８７）が、これらの方法が測定のため
に典型的に用いられる単一コピー遺伝子の１０−１８モ
ルの存在を検出するために必要とされる感度を有するか
否か疑わしい。
他の方法は、プローブをビオチンに付着し、そして検出
のために適当な酵素に連結されたアビジンを使用する方
法である（　ＧＢ　２０１９４０８　）。この方法の感
度はアジピンに付加することができる検出用酵素の分子
の数により限定される。
ＥＰ　　２７０３６は、グローブと酵素との接合体を使
用し、次にこの酵素が第１反応を行い、この反応が第２
反応系のための「モジュレータ−」を生成し又は除去す
る測定系を提案している。この場合前記モジュレータ−
は第２反応系において触媒反応を生じさせるが、この触
媒反応中にモノニレ−ターの正味の消費は生じない。従
ってこのものは、第１反応系と第２反応系との間の増幅
因子を提供する。このモジュレータ−は酵素活性化物質
でも阻害物質でもよく、あるいは第２反応系のための循
環的に再生可能な基質であってもよいっ増幅を達成する
ために第２反応系を用いる測定系が同様にＷｏ　８１１
００７２５に開示されており、この方法は循環する基質
に関連し、そしてＥＰ４９６０６　には同様の系が開示
されており、この系においては第２反応の速度を上昇せ
しめる「促進物質」を第１反応が生成せしめる。
エンザイムリンクドイムノアッセイ系においては、標識
酵素がグローブに接合するのが一般的であり、このこと
は酵素で触媒される反応が生ずる前に過剰の酵素を非常
に効率的に除去しなければならないことを意味し、そう
しなければ誤った陽性の結果が得られる。このことは無
視できない問題点をもたらし、そして高いシグナル／ノ
イズ比を得ることが困難である。
ＥＰ６２２７７　はリボヌクレアーゼＡに基礎を置く酵
素の使用を開示している。す？ヌクレアーゼＡＦｉＳ−
被プチドと称される２０残基ポリペプチドとＳ−蛋白質
と称される１０４残基ポリペプチドとく切断することが
できる。Ｓ−啄プチドもＳ−蛋白質も単独では酵素活性
を有しないが、これらはリボヌクレアーゼＳと称される
接合体を形成し、このものはＩＪ　ｇヌクレアーゼ活性
を有する。
上記の開示における提案は、分析対象の類似体をＳ−ペ
プチドにより標識し、こうすることによって測定媒体が
標識された類似体と非標識分析対象とを含有するように
する方法である。次に、分析対象分子又は類似体分子の
いずれかに付着することができる抗体が導入される。従
って、抗体との結合に対して分析対象が類似体と競争し
、そして次に非結合炉体分子上のＳ−ペプチドは添加さ
れたＳ−蛋白質と結合できるように開放されておシ、そ
して酵素活性を発生せしめる。増加する濃度の分析対象
を添加することにより、触媒活性と分析対象の濃度とを
関連ずける排除曲線（ｄｉｓｐｌａｃｅ−ｍｅｎｔ　ｃ
ｕｒｖｅ　）が構成され、そしてこの関係曲線を用いて
未知分析対象濃度を決定することが提案される。リテヌ
クレアーゼＳの活性は典型的には分光法又は螢光法によ
り測定される。Ｓ−−！！グチド／Ｓ−蛋白質の組合わ
せを用いるこの方法は複雑で且つ困難であり、そして原
理的に、反応速度の差の測定による分析対象の測定は感
度、精度及び実施の容易さに限界を強いるであろう。
〔発明が解決しようとする問題点及び問題点を解決するための手段〕
この発明の１つの観点に従えば、第１の酵素の酵素的に
不活性な小断片を担持する測定成分を使用すること、該
酵素の酵素的に不活性な相補的蛋白質断片を添加して、
前記小断片に接合せしめそして活性な第１酵素を生成せ
しめること、及び該酵素により触媒される反応を行って
検出可能な結果を導くことを含んで成るサンプル媒体中
の分析対象の検出方法において、前記測定成分が前記分
析対象と結合する特異的認識グローブであり、前記第１
酵素が基質を第１生成物に転換する反応を触媒し、該第
１生成物がそれ自体として又は該第１生成物により開始
される追加の１反応もしくは複数の１連の反応により生
成する次の生成物として第２酵素の必須成分であり、該
必須成分によって該第２酵素が完全なものとされそして
検出可能な結果を導く反応を触媒することを特徴とする
方法が提供される。
第１酵素の前記小断片は好ましくは全酵素蛋白質の小ペ
プチド断片である。この小ペプチド断片は結合条件に対
して不活性でおることができるが、完全酵素は条件例え
ば極端な温度、−１塩濃度等により深刻な影響を受ける
活性を有するかもしれない。好ましくはこれはリボヌク
レアーゼＳ−ペプチドであり、そして相補断片はリビヌ
クレア−ゼＳ−蛋白質である。次に、生成したリボヌク
レアーゼＳ酵素は合成基質の前記第１生成物への転換を
適切に触媒する。合成基質は好ましくは、式Ｒ−Ｘ（式
中、Ｒはピリミジン３′−ホスフェート成分であυ、モ
してＸは前記第１生成物を生成する除去基であってこの
Ｘは該３′−ホスフェート基を介してＲに連結している
）で表わされるピリミジン３′−ホスホジエステル化合
物である。従ってＲはＣｐ又はＵｐとして表わすことが
でき、ここでＣ＝シチソン、Ｕ＝ウリノン、そしてｐ＝
ホスフェートであり、又はこれらのピリミジン類似体で
あり、そして場合によっては例えば５′−ヒドロキシ保
護基によυ置換されている。
先行技術の提案に卓越するこの発明の利点は、第２増幅
によりもたらされる高い感度を保って、そして酵素断片
（例えば５−−（グチド及びＳ−蛋白質）の両者がパッ
クグラウンド「ノイズ」を生じさせる酵素活性を有さす
そのため特異的酵素活性が結合したＳ−ペプチドにより
形成される接合体触媒のみから生じ、そして大酵素蛋白
質断片の過剰量を除去する必要がないという事実により
もたらされる高いシグナル対ノイズ比を伴って、分析対
象を酵素的に検出するための簡単で且つ直接的な方法が
提供されることである。
合成基質、例えばＲ−ＸＩ：これを「補欠分子族生成物
質ｊ　（ｐｒｏｓｔｈｅｔｏｇｅｎ　）と称することが
できる〕は、それ自体新規であると考えられる。従って
この発明は他の観点において、酵素により開裂されて他
の酵素の触媒活性のために必須な成分又はその前駆体を
生成する合成補欠分子族生成物質を提供する。好ましく
は、補欠分子族生成物質は弐Ｒ−Ｘ（式中Ｒはピリミジ
ン３′−ホスフェートであり、そしてＸは該３′−ホス
フェート基を介してＲに連結している除去基であり、そ
してそれから酵素的に切断されて他の酵素の必須成分又
はその前駆体を生成することができる）で表わされるピ
リミシン３′−ホスホジエステル化合物である。
この発明の他の観点は、その濃度が検出されるべき分析
対象の存在に関連する第１酵素が検出可能な生成物を導
く第１酵素反応を触媒するエンザイムリンクドイムノア
ッセイ法において、前記第１酵素のための基質が合成化
合物であってこの化合物は該第１酵素によって開裂され
て直接的に又はｌもしくは複数の追加の反応にょ）他の
酵素の触媒活性のために必須の成分を生成し、該成分に
よって該他の酵素が活性化されて検出可能な結果を導く
第２酵素反応を触媒することを特徴とする方法に関する
。
従ってこの発明はエンザイムリンクド検出系の原理を用
いるが、次の様にして多オーダーの感度の増強が得られ
る。すなわち第１触媒を使用し、この第１触媒が直接的
又は間接的に補酵素又は補欠分子族を生成せしめ、これ
らは他のそして異る触媒中心の部分であり、触媒活性の
ために前記補酵素又は補欠分子族に絶対的に依存する酵
素を用いる。従って第１酵素反応は補酵素又は補欠分子
族を直接に生成することができ、あるいは例えば酵素的
に補酵素又は補欠分子族に転換される前駆体を生成する
ことができる。次に、直接的に又は間接的に生成された
補酵素又は補欠分子族は適当なアＩ酵素と一緒になシホ
ロ酵素を生成し、検出可能な結果、例えば色素の生成を
導く第２反応系を触媒する前記ホロ酵素を用いることＫ
よシその量を測定することができる。
好ましい測定方法を次の反応方式１に示す。
以下余白 グローブを、ハイブリダイゼーションを妨害しない態様
において、好ましくはグローブの遊離端の一方において
、適当なスペーサー基により、例えばヌクレイツク・ア
シド・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ　）　、　Ｖｏｔｌｌ　（１９８３）　＋、６５
９−６６９　頁に記載されている方法を用いて、成分Ａ
１に付加する。適切に厳重な（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ　
）条件下でのハイブリダイゼーションに続き、Ａ２の添
加がプローブに結合した酵素的活性種ＡＩＡ２（反応方
式１においてｇｏと称する）をもたらす。
これがこの発明における認識段階である。この第１酵素
Ｅ。が標的ＤＮＡに固定された状態で補欠分子族基質Ｒ
−Ｘに触媒的に作用して補酵素又は補欠分子族前駆体Ｘ
−ＯＨを放出し、次にこのＸ−ＯＨが、必要な場合には
酵素Ｅ１により触媒される過程において補酵素にの活性
形に転換された後、不活性酵素Ｅ２ｉと一緒になシ酵素
的に活性な検出ホロ酵素ＥｉａＸ’をもたらす。幾つか
の場合にはＥｏで触媒される反応が補酵素又は補欠分子
族を直接生成し、この場合酵素Ｅｌを用いる転換段階は
省略される。感度の増強は、原理的には、生成したＸ′
のすべての分子がＥ２ａＸ’の活性分子を生じさせるこ
とができること、及び生成したＥｚａＸ’の分子の数が
グローブに結合したＥ。のそれを大きく上まわることか
ら生ずる。この発明においてＸ′は酵素Ｅ　２　ａ　Ｘ
’の触媒中心の部分でアリ、そして基質のアレステリッ
クアクチペーターではない。このものは触媒活性のため
に絶対的に必要であり、そして従来技術の幾つかの提案
の場合のように存在する酵素反応のための単なる速度上
昇剤ではない。
酵素Ｅ鵞ａＸ’は基質Ｓからの容易に検出される生成物
Ｐの生成を触媒する。
この発明の例はＡＩ断片及びＡ２断片としてそれぞれＳ
−ペゾチド（Ｓｐｅｐ）及びＳ−蛋白質（Ｓｐｒ　）を
使用し、これらはウシ膵臓リボヌクレアーゼＣＦ：、Ｃ
３，１，２７，５）をズブチリシン（ＥＣ３、４，２１
，１４）によって蛋白質分解的に切断することによって
得られる。酵素的に不活性なＳ−ペプチド及びＳ−蛋白
質は非常に高い親和性をもって結合して十分なＩＪ　、
ｙヌクレアーゼＳ活性を有するリボヌクレアーゼＳを生
成することができることはよく知られている。
活性なハイブリダイズしたグローブ−Ａ＋−Ａ２複合体
（ハイブリダイズしたグローブ−酵素Ｅｏ　　）は、Ｃ
ｐＸ又ｉｊ：ＵｐＸ（ここで、Ｘは３′−ホスホジエス
テル結合（ｐ）を介してシチジンＣＣ）又はウリジン（
Ｕ）ヌクレオチドに連結しているであろう〕の形を有す
る補欠分子族生成基質Ｒ−Ｘに作用する。「除去基Ｊ　
Ｘ−ＯＨは補欠分子族又は補酵素前駆体、例えばチアミ
ン、リホフラビン、ピリドキサール又はピリドキシンで
ある。
ウシ膵臓リボヌクレアーゼＡが次の反応を触媒すること
はよく知られている。
ＣｐＸ→ シチジン２／、３／−サイクリックホスフェート＋Ｘ−
０ＨＵｐＸ→ ウリジン２／、３／−サイクリックホスフェート＋Ｘ−
ＯＨここで、Ｘ−、ＯＨは第一アルコールでなければな
らないが、リボヌクレアーゼで触媒される反応における
適切な除去基として機能するためには七の構造に他の幾
つかの制限が存在する。〔概観のために、Ｆ、　Ｒ，Ｒ
ｌｃｈａｒｄａ及び）１．Ｗ、　Ｗｙｅｋｏ　ｆ　ｆ　
＋デ・エンチムス（Ｔｈｅ　ＦＪｎｚｙｍｅｓ　）　、
　ＶｏＬ　３　＊　第３版。
１９７１　、　Ｐ、Ｄ、　Ｂｏｙｓｒ編、６４７−８０
６頁を参照のこと〕。
前記反応方式において使用することができる種種の成分
の種類の幾つかの例を次の第１表に記載する。
第１表 ゼＩＣ２，７，１，３５）　　５−ホスフェートＸ−Ｏ
ＨＢ　！　　　　　　　　　Ｘ’□ （ＥＣ２，７，１，３５） Ｘ′から酵素Ｅｚａ　Ｘ’を生成する適当なアポ酵素は
当業者にとって自明であり、発色、螢光又はルミネッセ
ンスによるＰの検出のための系も同様である〔例えば、
）ＬＨａｒｒｌｇ及びり、Ａ、Ｈｏｐｋｉｎｓｏｎ　＋
ハンドノック・オツ・エンチム・エレクトロフォーレシ
ス・イン・ヒューマンーゼネティクス（Ｈａｎｄｂｏｏ
ｋ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｓ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓ
ｉｓｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　）　、　１
９７６　、ノース・ホランドー／４’ブリッジング社（
Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌ　ｌａｎｄＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　
Ｃｏ、　）を参照のこと〕。
次に、一層詳細な記載によりこの発明を説明する。但し
、この記載によりこの発明の範囲を限定するものではな
い。
Ａ、グローブ ポリヌクレオチド分析対象とハイブリダイズするために
必要な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドゾローブは
固相法、すなわちＧａ１ｔ等（Ｍ、Ｊ。
Ｇａ１ｔ等、１９８２　）により記載されたカイゼルグ
ルーポリジメチルアクリルアミド支持体上でのホスホト
リエステル法により合成することができる。
この検出系はまた、遺伝子グローブを用いる方法以外の
方法においても応用することができる。
すなわち、原理的には、この発明を用いて、現在の非放
射性法よシ高い感度で任意の抗原抗体反応を監視するこ
とができる。
Ｂ、グローブ−８−−（グチド誘導体の合成３−．２ゾ
チドをプローゾ分子に連結するために常用の日常的方法
を用いることができる。このような方法はＥＰ６２２７
７　に記載されている。同様に、この開示はリボヌクレ
アーゼＡの５ｐｅｐ　−８ｐｒズブチリシン切断生成物
の変形、又はその類似体の使用、そしてさらに他の切断
され得る酵素に言及している。この発明も同様にそのよ
うな変形を包含する。
ＲＮアーゼＳの調製方法及びＳ−ペプチドとＳ−蛋白質
への分離が、それぞれＤｏｓｃｈｅｒ　（１９６９）、
並びにＣｈａｖｅｒｓ及びＳｃｈｅｒａｇｓ　（１９８
０）により記載されている。
２官能試薬８ＰＤＰ　［ｎ−サクシニミジル３−（２−
ピリジルジチオ）グルピオネート〕とＳ−ペプチドとの
反応が１モルのペプチドに対して１モルの試薬を含有す
る誘導体をもたらす。Ｎ−末端リジンのα−アミン基に
おける置換が好ましい。
この残基はＳ−ペプチド−８−蛋白質の相互作用に有意
に寄与しないからである。
以下余白 ５−ｐｅｐｔｉｄ＠ ｕ−Ｌｙｓ この誘導体（１）はチオール試薬に対して反応性であり
、そしてこれを用いて、Ｒｏｙｅｈｏｕｄｈｕｒｙ等（
１９７６）の方法により「Ｇ−テイル化」されそしてＣ
ｈｅｎｇ等（１９８３）の方法に従ってＮ−アセチル−
Ｎ′−（ｐ−グリオキシルベンゾイル）システアミンと
反応したオリゴ９ヌクレオチドに連結することができる
。この反応式は次のように示される。
以下余白 グローブ中の配列に相補的な配列を含有するＤＮＡの存
在を検出するための化合物（ロ）の使用は次のように表
わすことができる。
ＮＡ Ｓ−８ＣＨ，、ＣＨ２Ｃ０８ｐｅｐ　＋Ｓｐｒ増幅及び
検出系へ 上記の式においてジグザグ線はグローブの相補配列及び
ＤＮＡ中の標的配列を示す。
反応（１１）は任意的なものということができるが、１
−かじ、Ｓ−ペプチド断片が比較的小さいβ−メルカブ
トググルオニル基のみを担持し、これは大きなプローブ
−１１（Ａ複合体に比べて酵素活性を低下せしめること
がないであろうという利点をもたらす。この段階は、Ｓ
−蛋白質−８−ペプチド複合体が、ＩＩＮＡが固定され
ているマ）　ＩＪクスから遊離されるという追加の利点
をもたらす。
二　グローブ−８−ペプチド誘導体のための酵素的検出
系 着色溶液又は支持マ）　ＩＪクヌ上のスポットを支える
検出系が好ましい。このような検出系はこの方法の適用
を簡単化し、そして拡大するからである。しかしながら
、特殊な装置、例えばルミネセンスモニター、螢光針又
は分光光度計を用いることにより一層高い感度が達成さ
れる。
この系のための一般的な反応連鎖を次に示す。
“以下余白 （第１触媒） Ｐ−８ｐｅｐ＋Ｓｐｒ　−＋８二区匣」上記の反応連鎖
中の記号は次の意味を有する。
Ｐ−１３ｐｅｐ　　ニブローブ−８−ペプチド誘導体。
Ｓｐｒ　　　：　ＲＮアーゼ由来のＳ−蛋白質。
５１Ｃ１：除去基としての補酵素又は前駆体０１′を含
有する訳アーゼのための ホスホジエステル基質。
修飾酵素：　Ａｐｏ　１と結合するために必要な補酵素
の形を生じさせる活性酵素。
Ａｐｏｌ：Ｃ１を補酵素とする酵素的に不活性なアポ酵
素。
Ｈｏ１ｏ　１　：　Ａｐｏ　１と補酵素Ｃ４との結合に
よって形成される活性ホロ酵素。
Ｓ２二着色生成物Ｐ＊をもたらすＨｏ１ｏ　ｌ用基質。
酵素的に活性な成分が長方形で囲んであり、これにより
触媒される反応が点線矢印で示しである。
Ｓ−ペプチド；Ｓ−蛋白質の相互作用 この系はＳ−ペプチドとＳ−蛋白質との強く且つ特異的
な結合を利用する。この相互作用は、解離定数（Ｋｄｉ
ｓｇ　）を決定することができない程強い親和性を有す
る。Ｒｌｃｈａｒｄｓ及びＶｉ　ｔｈａｙａｔｈｉｌ（
１９５６，ａ、ｂ）によるＫｄ　ｉ　ｓ　ｓの上限は５
Ｘ１０−９Ｍでありた。ＲＮＮアーゼは、天然ＲＮアー
ゼＡの活性〔タカハシ等（１９６９）］に非常に類似し
た酵素活性を示す。
以下の説明において、カッブリング補酵素Ｃ１の種類及
び最終検出系（Ｓ２→Ｐ＊）について特定の提案を行う
。しかしながら、他のカノノリング酵素及び他の可視化
方法に基礎を置く多数の可能な代替法が存在する。
る検出系 この場合、グローブ−８−ペプチド−Ｓ−蛋白質複合体
による酵素活性のための基質は次のタイｆ（ＩＩＤのも
のである。
この反応式中、Ｃはシトシン（又は他のピリノン塩基）
である。
基質ａＩＤ（Ｃｐリゴフラビン）の合成基質Ｃｐリゾフ
ラビンは、リゾフラビンのリゾチル側鎖の末端ヒドロキ
シル残基に３′ホスフエートを介して連結されたシチジ
ンから成る基質（至）を合成するために、ＩＪ　、１／
ヌクレア一ゼ八作用の第１段階の可逆性を利用して調製
することができる。
ＲＮアーゼＡの高い加水分解活性のため、反応を水溶液
中で行えば、基質の少収量のみが予想される。従って、
反応を５０％ホルムアミド中−２０℃において、アクッ
キング基として可能な最高濃度の親核成分として必要な
第１アルコール基を有するリボフラビンを用いて行った
。
実験 １、ｃｐｌＪｙｈ”フラビンの酵素的製造全容ｆｉｌ１
３０４Ｌ／の５０　ｖ／ｖ　％ホルムアミド／緩衝液（
ｐＨ６，５０）中６００１ｎｇのシチジン２／　、　３
／−サイクリックホスフェート、Ｈのり？フラピン及び
１　ｍｇ７ｊｎｌ　のリボヌクレアーゼＡを用いて一２
０℃にて反応を行った。
（この反応は、リボフラビンのルミフラビンへの分解を
回避するため、反応混合物に光を当てず且つ酸性側に維
持しなければならない。）反応の進行を薄層クロマトグ
ラフィーを用いて監視した。アリコート（１００μりを
規則的な間隔（５日）で取シ出し、そしてＷｈａｔｍａ
ｎ　ｐＬＫＳｆ　　シリカゲルグレート上で、標準（５
μｇ）、すなわちリボフラビン、シチジン２／　、　３
／−サイクリックホスフェート及びシチジンアデノシン
ホスホジエステル（ＣｐＡ）に対してクロマトグラフし
た（第１図）。
Ｈ２Ｏ（４０）：ピリジン（１０）：氷酢酸（１）；ｐ
Ｈ５，８０から成る溶剤を使用した。
生成物はインキュベーションの１１日後にＲｆ値０．８
７を有するスポットとしてクロマトグラフ上に現われ始
めた。このＲｆに対してり？フラビンのＲｆは０．７９
．シチジン／、３′−サイクリックホスフェートのＲｆ
は０．９５、そしてＣｐＡのＲｆは０．８９であった。
３１日後２りマトダラム上でＲｆｏ、８７のスポットが
優勢になった時に反応を停止した。
■０反応の停止 この時間で反応混合物中のＩＪ　／ヌクレアーゼを不活
性化することが必要であった。生成物を水性環境中で酵
素に暴露すればそれがシチジン３′−ホスフェートとり
？フラビンに分解するからである。
従ってインキ−ベート混合物をｐＨ５，４０にてフエノ
ール抽出することにょ）リゲヌクレアーゼを除去した。
インキュベート混合物をフェノールで３回抽出し、そし
て−緒にした水相をクロロホルムで１回抽出した。この
方法は、反応混合物中に存在する多量のホルムアミドの
除去を促進するという追加の利点を有していた。
一緒にした水相の容量をロータリーエバポレーターによ
り５５℃にて減少せしめ、この後シリカｆ　／ｌ／　カ
ラム上で生成物を未反応のＩＪ　Ｈフラビン及びシチジ
ン２′、３′−サイクリックホスフェートから分離した
。
未反応のリボフラビン及びシチジン２’、３’＝ｖイク
リツクホスフエートからの生成物の分離を、中圧クロマ
トグラフ　イー　（５ｔｉｌ１等、１９７８）を用いて
行った。
段階■からのフェノール抽出及びクロロホルム抽出され
たアリコートＣＩｏｎ／）をシリカゲル（メルクシリカ
ゲル６０）のカラムに適用し、セしてＨ２Ｏ（４０）：
ピリジン（ＩＱ）：氷酢酸（１）を用いて酸素不含窒素
の陽圧１５　ｌｂｓ／１ｎ２（１，０５Ｋｇ／ｆｆ１２
）のもとで溶出した（第２図）。
両分をプールし、そして前記の薄層クロマトグラフィー
により測定した（第３図）。
両分Ａ（第２図、及び第３図中のトラック４）を、最終
容量１ｄの０．１Ｍエチレンジアミン緩衝液（ｐｔ（６
，５０）中２■のリボフラビンを含有する混合物中、室
温にて２時間、す〆ヌクレアーゼの基質として試験した
。得られたクロマトグラムはＲｆ　Ｏ，８７ノスｄｅ　
ｙトがＲｆＯ，７９（すｓ７ラビン）のスポットとＲｆ
　Ｏ，９６（シチジン３′−ホスフェート）のスポット
の２つに分かれたことを示し、生成物がＲＮアーゼにょ
シその構成成分に加水分解されたことが示された（第４
図）。
両分Ａ（第２図）をプールし、そしてロータリーエバポ
レーターで５５℃にて処理し固形物を得た。しかしなが
ら、フェノール抽出において除去されずそして中圧クロ
マトグラフィーにおいて移動相と共に移動したホルムア
ミドの残留物が残った。
第１反応 補酵素の所望の活性形ＦＭＮは、容易に調製することが
でき、る酵素であるリゲンラビンキナーゼ（フラ？キナ
ーセ：　ＥＣ２，７，１，２６）ノ作用ＫＪ、　Ｆ）生
ずる。
補酵素としてＦＭＮを用いる検出酵素には多くの候補が
あり、これにはグリコレートオキシダーゼ［ＥＣ１，１
，３，Ｉ　Ｓｃｈｕｍａｎ及びＭａｓｓｅｙ　（１９７
１）］〔これから、ＩＭＫＢｒに対する透析により蘭を
除去することができる；Ｍａｓｓｅｙ及びＣｕｒ　ｔｉ
（１９６６））：Ｌ−ヒドロキシ酸オキシダーゼ（ＥＣ
１，１，３，１５、ナカノ等（１９６８））；並び゛に
ゾロチカム（Ｚｏｒｏｔｉｅｕｍ　）　由来のオロテー
トレダクターゼ（ＥＣ１，３，１，１４、Ｓｗｅｌ　１
等（１９６０））が含まれるが、特に好ましいものは肺
炎球菌Ｌ−ラクテートオキシダーゼ（ＥＣ１、１３，１
２，４、ウダカ等（１９５９））である。
この酵素は次の反応（１）： ラクテート＋０２→アセテ−）　＋Ｃｏ２＋Ｈ２０（１
）を触媒し、この反応は測定のためには不便であるｄし
かしながら、カタラーゼの存在下で、この反応は次のよ
うになる〔ウダカ等（１９５９））。
ラクテート＋Σ０２→　ピルイー）　十Ｈ２０（ｉｉ）
従って、酵素反応は次のようになる。
ラクテート＋０２→ピルベート＋Ｈ２０□　　　（ｉｌ
ｏこのことは、この反応と、Ｈ２Ｏ２を検出するための
迅速且つ鋭敏な方法の１つ、例えばホースラディツシュ
・パーオキシダーゼ（Ｋａｓ及びＣ５ｒｎａ（１９８０
）］により触媒される色原体基質である５−アミンサリ
チル酸又はジアニシジンとの反応とをカッシリングさせ
る機会を示している。
他の方法は、ＦＭＮの生成を７ラゲドキシンの発生とカ
ップリングさせる方法である。アボフラゲドキシンはＦ
ＭＮ又はＦＡＤのためのよく記載されている検出手段で
あり、この系においてはアイ蛋白質と組合わされたフラ
ビンヌクレオチドの螢光の変化の程度が未知溶液中のヌ
クレオチドの量を決定するために使用される〔Ｍａｙｈ
ｓｗ及びＷａｇｇｌｌｌに（１９８０）：ａ及びｂ〕。
しかしながら、この発明の目的のために螢光法は感度が
十分でなく、従ってエンザイムリンクドアノセイ、例え
ば精製されたりダクターゼにより触媒されるＮＡＤＨに
よるチトクロームＣのフラボトキシン介在還元を使用す
ることができる。
上記の補酵素カップリング測定のためにＦＭＮと組合わ
された酵素が提案されるが、使用し得る酵素の範囲を補
酵素としてＦＡＤを使用する酵素にまで拡張することが
できる。これはＦＭＮアデニルトランスフェラーゼによ
り触媒される追加の反応を含むであろう［Ｇｌｂｓｏｎ
等（１９５５）、並びに５ｃｈｒｅａｋｅ及びＫｏｒｎ
ｂｅｒｇ　（１９’　５０　）　）。
ＦＭＮ　＋　ＡＴＰ　ＨＦＡＤ　十ＰＰ　　　　　　（
ｉｖ）ここで、ＦＭＮはフラゲキナーゼ反応により生じ
たものである。
例えばこれはＤ−アミノ酸オキシダーゼをカンプリング
酵素として使用することを可能にするであろう。このオ
キシダーゼからのアポ酵素はＫＢｒ透析法［Ｍａｓａｅ
ｙ及びＣｕｒｉｔ（１９６６）：］により容易に調製さ
れ、そして−２０℃において少なくとも数ケ月間安定で
ある。・や−オキシダーゼにより触媒される反応とのカ
ップリングによるＤ−アミノ酸オキシダーゼの測定はよ
く記載されておシ、そして酵素の色原体的可視化の機会
を提供する〔ラダ及びナカニシ（１９８０）　］。
他のＦＡＤ酵ｉ、例えばグルコースオキシダーゼ、Ｌ−
アミノ酸オキシダーゼ及びキサンチンオキシダーゼを同
様にして使用することができる〔ラグ及びナカニシ（１
９８０））。どの系が最も好都合であるかはまだ確立さ
れていないが、これらの酵素のそれぞれは容易に入手す
ることができ、そしてこれを処理して安定なアポ酵素を
得ることができる。
アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２、６
，１，１）はα−オキソグルタレート（αＯＧ）と（Ｓ
）−アスパルテート（Ａｓｐ　）との反応を触媒してオ
キサロ酢酸（ＯＡＡ）及び（Ｓ）−グルタメ−）（Ｇｌ
ｕ）を生成せしめる。この酵素は補酵素としてピリドキ
サールホスフェートを含有し、セしてホロ酵素は容易且
つ可逆的に遊離補酵素とアポ酵素とに分かれる［：　Ｍ
ａｒｔｉｎｅｚ−Ｃａｒｒｉｏｎ等（１９７０）］。こ
のホロ酵素のための鋭敏な測定法（ナノモル濃度）がＲ
ａｊ（１９８２）により記載されておシ、この方法は、
グルタメートデヒドロゲナーゼにより触媒される反応と
連係された着色され還元されたネオテトラゾリウム誘導
体Ｉ　ＮＴ＊の形成に基礎を置いている。
ホロ１としてアスパルテートアミノトランスフェラーゼ
を用いるブローブーＳ−ペプチド検出のための方法は次
のように示される。
以下余白 Ｉ四匪粗 ここで５１Ｃ１はＣ１成分としてピリドキサール（Ｐｙ
）、ピリドキサミン又はピリドキサールを有するシチジ
ン３′−ホスホジエステルである。
生成物の１つとしてピリドキサールをもたラスＲＮアー
ゼのための可能な基質（Ｓ１Ｃ１）は次のように加水分
解される化合物（ＩＶ）である。
以下余白 化合物■はＣｐベンジルについて発表されている方法［
Ｂｅｒｎａｒｄ及びＷｉｔｚｅｌ　（１９６１）　）と
同様にして合成することができる。上記の反応によって
生成した水和物（ヒトレート）として示されているピリ
ドキサールは、ピリドキサールキナーゼ（ＥＣ２，７，
１，３５）により触媒される反応において、必要なピリ
ドキサールホスフェートに転換される。
他の可能な基質には次の化合物（至）〜（■）が含まれ
る。
（Ｖ）　　　　　　　　ＣＭ） 上記の式中Ｃｐはジチゾン３′−ホスホリル−であり、
そしてＲはＨ−又は−〇−Ｐ（ＯＨ）２　のいずれかで
ある。
化合物（Ｖ）はＲＮＮアーゼによる加水分解の後ピリド
キサールを生成し、この物質は、キナーゼで触媒される
反応の前に追加の段階として測定系中でビリドキソール
オキシダーゼ（ＥＣ１，４，３，５）を用いてピリドキ
サールに転換される。化合物（至）の燐酸化形である化
合物（Ｖｌ）をＲＮＮアーゼの基質として使用する場合
、オキシダーゼの作用によりピリドキサールホスフェー
トが直接生成するであろう。化合物（Ｖｌ［）　（シチ
ジン３′−ホスホリル基がピリドキサールのフェノール
性酸素においてホスホトエステル法結されている）は、
ＲＮアーゼで触媒される加水分解のもとて直接ピリドキ
サールホスフェートを生成するであろう。しかしながら
、除去基の酸素原子上の大きな置換基は酵素的特異性の
点から許容されないことが知られるから、この基質は好
ましくない。
化合物（ト）及びＣＭ）は、ホルムアミド／水、又は他
の非プロトン性溶剤／水混合物中で縮合反応を触媒する
ためにＲＮアーゼを使用することにょ）酵素的に製造す
ることができる（　Ｆｉｎｄｌｅｙ、Ｍａ　ｔ　ｈ　Ｉ
　ａ　ｓ及びＲａｂｉｎ　（１９６２））。化合物（Ｖ
ｌ及び（Ｍ）と同様に、化合物（至））を合成するため
に、適切に保護された反応体と共にホスホトリエステル
法を用いる化学合成法を使用することができる。
アＩ酵素であるアポグルタミン酵−アスノソラギン酸ト
ランスフェラーゼ（Ａｐｏ　１　）の調製法はすでに記
載されてお！ｌ）　［Ｍａｒｔｌｎｅｚ−Ｃａｒｒｉｏ
ｎ（１９７０）、Ａｒｒｉｏ−Ｄｕｐｏｎｔ　Ｍ、　（
１９７２）　）、そして次の段階、すなわちまずピリド
キサールホスフェートを親和性の低いピリドキサミンホ
スフェートで置換し、そして次にグルクロマトグラフィ
ーにより後者を除去することにより最もうまく行われる
。補酵素は長基間安定である。良好なシグナル対ノイ黛
比のためにはピリドキサールホスフェートのすべてを除
去することが必要であるが、これはケト酸で処理しそし
て次にＮａ　ＢＨ４で処理する阻害段階により保証され
る。この段階はアポ酵素標品中のすべての残留酵素活性
を不活性化する。
ピリドキサールホスフェートとアポ酵素とからのホロト
ランスアミナーゼの基構成はＭ、Ａｒｒｉｏ−Ｄｕｐｏ
ｎｔ　（１９７２）により報告に記載されている。
典型的には、０．１μＭ又はこれよシ高い濃度のアポト
ランスフェラーゼを使用する。この濃度は、この系にお
いて生成するある低濃度のピリドキサールホスフェート
を実質上化学量論的にホロトランスアミナーゼに転換す
るのを保証するのに十分である。
２重補酵素カッシリングを用いる２重増幅系理論的には
、必要なだけの感度を有する測定系を構成するために「
カスケード」を形成することができることが明らかであ
る。
次に、潜在的に非常に鋭敏な系を記載する。この２重増
幅は次のようにして生ずる。第１触媒が補酵素（最終的
にはＦＡＤとなる）を開放し、これがアポオキシダーゼ
と一緒になって第２補酵素ピリドキサールホスフエート
を生成せしめ、今度はこれが第２アポ酵素を活性化する
。
以下余白 プローブ−酵素切断 前記のように、この発明の１つの観点は第１酵素反応を
行うのに先立って、検出系から第１酵素（反応方式１に
おけるＥ。）を取シ出す可能性に存在する。このことは
、第１反応、感度増強及び検出ヲポリヌクレオチド分析
対象及びオリゴヌクレオチドグローブを含有しない溶液
中で行うことができるという利点を有する。グローブ−
酵素断片の結合のこの切断は、大酵素断片との接合によ
って酵素を完成する前に行うことができ、あるいは接合
の後であって基質を添加する前に行うことができる。例
えば、分析対象がポリヌクレオチドであり、グローブが
該分析対象とノ・イブリダイズし得るオリゴヌクレオチ
ドであり、そして小酵素断片がジスルフィド結合を介し
て該オリゴヌクレオチド連結しているＳ−ペプチドであ
る場合、この結合は常用の還元剤、例えばジチオスレイ
）　−ル又はβ−メルカプトエタノールを用いて切断し
Ｓ−ペプチドを再度遊離せしめることができる。
すなわち、５ｐｅｐ−グローブをサングルに添加し、そ
して未結合５ｐｅｐ　　−グローブを洗浄により除去ス
ル。次にＳ−ペプチドをグローブから切断し、そして過
剰のＳ−蛋白質と反応せしめることにより酵素接合体を
形成することができる。あるいは、Ｓ−蛋白質を５ｐｅ
ｐ　スプローゾに添加し、次にグローブから接合体を切
断することができる。特定の例として次のものを挙げる
ことができる。（１）分析対象を支持体、例えば重合性
又は吸着性固体に固定化し；　（ｉ）固定化された分析
対象を溶液中で過剰の５ｐｅｐ　−プローブと反応せし
め；仙）結合した分析対象−８ｐｅｐ−グローブ複合体
を伴う前記支持体を溶液から取り出し、そして洗浄して
未結合　　□８ｐｅｐ−プローブを除去し；ＯＶ）該支
持体を切断剤の溶液に浸漬し、この切断剤が支持体から
Ｓ　ｐｅｐを切断してこれを溶液中に移行させ：　（Ｖ
）　Ｓ−蛋白質を溶液に加えて酵素接合体を生成せしめ
、そして酵素反応を行って検出可能な結果を発生せしめ
る。段階（Ｖ）においては、Ｓ−蛋白質と共にすべての
他の試薬を一度に溶液に添加して測定反応を完了するこ
とができよう。上記に代る方法として、Ｓ−ペプチドを
まず支持体上に固定化し、次の切断段階により分析対象
及びグローブを除去し、支持体上の３−ｏグチドとＳ−
蛋白質とを接合せしめる。この方法においては、第１酵
素反応、及びおそらくそれに続く反応を支持体上で行う
ことができ、この方法は反応の検出可能な結果を同定す
るために一層容易でアシそして一層鋭敏であろう。
第１酵素によって触媒される反応に先立ってグローブか
ら第１酵素を分離することは、グローブ及び分析対象が
酵素の活性を妨害しない点において有利である。同様に
、小酵素断片（Ｓｐｅｐ）を大断片（Ｓｐｒ　）との接
合の前にプローブから切断することにより、グローブ又
は分析対象が接合を妨害するのが防止される。
補欠分子族生成物質 合成補欠分子族生成物質の概念は、上記の特定の例にお
ける場合よシ一層一般的に適用することができる。例え
ば、ＧＢ２０１９４０８に記載されているように、例え
ばビオチン−アビジン連結によってグローブに間接的に
連結された第１酵素としてリボヌクレアーゼ（ＲＮアー
ゼ）を使用することができる。次にこのＲＮアーゼが前
記の新規な合成補欠分子族生成物質Ｒ−Ｘ基質に作用し
て補酵素前駆体をもたらし、そして第２酵素反応を介し
て最終的に検出可能な結果を導くことができる。
さらに、補欠分子族生成物質反応のための第１酵素がＲ
Ｎアーゼである必要はない。第２反応のための適当な補
酵素又は補欠分子族を用いて出発する場合、第１反応と
して合成出発物質（新規な補欠分子族生成物質）の酵素
触媒的切断を含む反応方式を確立することができる。例
えば、補欠分子族生成物質がアシル化された補酵素であ
り、そして第１酵素が該補酵素からアシル基を切断する
エステラーゼであってもよい。もしエステラーゼが不活
性なペプチド断片と蛋白質断片とに切断され得るもので
あれば、ＲＮアーゼ５ｐｅｐ／Ｓｐｒ　　について前記
したのと同様にしてそれを使用することができる。エス
テラーゼがこのように切断され得ないのであれば、これ
を全体として、例えば直接に、又はビオチン／アビジン
により、しかし好ましくはＲＮアーゼ５ｐｅｐ　／　Ｓ
ｐｒにより、プローブに連結することができる。この最
後の方法においては、５ｐｅｐが前記のようにしてプロ
ーブに連結され、そしてＳｐｒが酵素に連結される。蛋
白質を連結するための一般的方法当業界においてよく知
られておシ、これを用いてＳｐｒ断片と酵素とを連結す
ることができる。Ｓ−蛋白質が他の蛋白質の担体として
機能するこの方法は次のように表示することができる。
Ｐ−８ｐｅｐ　＋１→Ｐ−８ｐｅｐ−−−８ｐｒ−Ｅｘ
ＳＣ−玄−Ｓ　＋Ｃ・ Ｓ−ニペー戸 上記の式中、５ｐｒ−Ｅｘは共有結合した酵素分子を含
むＳ−蛋白質であり、他の記号は前記の通シである。
次の記載はピリドキサールホスフェート及ヒフラビン補
酵素を使用する方法についてであるが、他の検出系を構
成するために任意の適切な補因子を使用することができ
よう。
カップリング補酵素としてピリドキサールを用いる系 この方法を用いる場合、最終検出系は前記のものと同じ
であろう。Ｓ−蛋白質に付加される第１触媒は加水分解
酵素、例えばプロテアーゼ、被ブチダーゼ、アミダーゼ
又はエステラーゼ等の広範囲から選択される任意のもの
であってよく、そして特にスロンビン又は血液凝固系の
他の特異的プロテアーゼの１つであってよい。第１触媒
（Ｅｘ）としてスロンビンを用いる場合、合成補欠分子
゛族生酸物質すなわち補酵素生成物質Ｓ、Ｃ１は次の式
（４）〜■で示されるような物質であってよい。
以下余白 （■）　　　　　　　　　　（■） 上記の式において、Ｒ２はＨ−又は−ｐｏ（ＯＨ）２で
あり、そしてＲ１はこれらの化合物がスロンビン作用の
良好な基質であるようにスロンビンの既知の特異性に基
いて設計されたアシル基であるＣ　Ｍａｇｎｕ＠ａｏｎ
　（１９７１）　、及びその中の参照文献〕。
式（■）の化合物の加水分解はピリドキサミン（ホスフ
ェート）をもたらし、そして式（ＩＸ）及び（Ｘ）の両
化合物はピリドキサール又はピリドキサールホスフェー
トを放出する。式（■）及び（Ｘ）の化合物中のアルデ
ヒド（ヒトレート）基カーＣＨ２０Ｈにより置き換えら
れ、そしてピリドキソールオキシダーゼを介してカンプ
リングが行われれば、阻害的でなくそして酸化されにく
いことが明らかであろう。
化合物（Ｓ〜（Ｘ）は、Ｈａｒｒｉｓｏｎ及びＨａｒｒ
ｔｓｏｎ　（１９７Ｌ　）により記載されたような簡単
な方法により、ＲＣＯＯＨ及びピリドキサール誘導体か
ら合成することができる。適当なＲＣＯＯＨの調製はＬ
ｉｅｍ及びＳｃｈｅｒａｇｅ　（１９７４）に記載され
ているようにして行うことができる。
コリンエステラーゼのための補酵素発生基質、並びに化
合物（ＸＩ）及び（イ））の構造：以下余白 ＋　　　　　　　　　　　　＋ （式中、ＲはＨ又は−Ｐ（ｏＨ）２テある。）基質（Ｘ
［）及び（Ｘ［ｌ）は、ピリドキサール中の適当な基奪
保護した後、エステル化のための常法を用いることによ
り合成することができる（　Ｈａｒｒｉｓｏｎ及びＨａ
ｒｒｉｓｏｎ　（１９７１）　〕。ピリドキサールのア
ルデヒド基（上にヒトレートとして示しである）とコリ
ンエステラーゼの活性部位中の基との反応を防止するた
め、ビリドキソールを除去基として使用し、そしてピリ
ドキソールオキシダーゼ及びキナーゼを上記の修飾酵素
として使用することができる。
カップリング補酵素としてフラビン誘導体を用いケ邑 この系は、前記のフラビンカップリング測定のための最
終検出系及び前項に記載した第１触媒を使用するであろ
う。使用される基質（ｓｌｃｌ）のタイｆはスロンビン
作用のために構造（ＸＩＶ）を有し、そしてコリンエス
テラーゼが第１酵素である場合には構造（ＸＶ）を有す
るであろう。
Ｒ１−Ｃ−０−ＣＨ２ ０（ＣＨＯＩ（）。
ＣＨ２ 式（脂）　：　Ｒ１＝被プチド断片 式（ＸＶ）　：　Ｒ＋　”　”Ｈｓ エステル（ＸＭ）及び（ＸＶ）の化学合成はＨａｒｒｉ
ｓｏｎ及びＨａｒｒｌｓｏｎ　（１９７１）に記載され
た方法の１つによって行われ、例えばカルゲン酸Ｒ１Ｃ
００Ｉ（によるフラビンのカルデジイミド介在エステル
化、及びＨＰＬＣによる基質の精製により行われる。
以下余白 参照文献 Ａｒｒｉｏ−Ｄｕｐｏｎｔ　、Ｍ、　（１９７２）ヨー
ロピアン・ツヤ−ナル・オブ・バイオケミストリー（Ｆ
、ｕｒｏｐｅａｎＪ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　３０．３
０７゜Ｂａｒｎａｒｄ、　Ｅ、　Ａ、及びＷｉｔｚｅｌ
　、　Ｈ，（１９６２）バイオケミカル・アンド・バイ
オフィジカル・リサーチコミーニケーションス（Ｂｉｏ
ｃｂｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。
Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　）　７　、２８９　。
Ｂｒｏｗｎ　、　Ｄ、　Ｍ、及びＴｏｄｄ　、　Ａ、　
Ｒ，（１９５３）ツヤ−ナル・オプ・ケミカル・ソシエ
テ４−　（Ｊ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　）２０４０゜ Ｃｈａｖｅｒｓ、Ｌ、Ｇ、及びＳｃｈｅｒａｇａ、　Ｈ
，Ａ、　（１９８０）バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈ
ｅｒｎｉｇｔｒｙ）　１９．９９６゜Ｃｈｅｎｇ　＋　
Ｓ、　−Ｙ、　、　Ｃ１ｅｎｎ　、　Ｔ、　Ｍ、及びＰ
ａａｔａｎ＋　Ｉ−（１９８３）ニー−クレイツク・ア
シズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　
）　１１．６５９゜Ｃｈｏｏｎｇ、　Ｙ、　Ｓ、　、　
５ｈｅｐｈｅｒｄ　、　Ｍ、　Ｇ、及び５ｕｌｌｉｖａ
ｎ。
Ｐ、　Ａ、　（１９７５）バイオケミカル・ツヤ−ナル
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・ユナイテッド・スティソ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔ、　　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　Ｕ、　Ｓ、Ａ
、　）　６旦、Ｎｏ、１゜１１５−１１８゜ 以下余白
【図面の簡単な説明】
第１図はＣｐ　！Ｊ　ｚフラビン調製の反応経過を示す
クロマトグラムであって２８４　ｎｍ及び３６０ｎｍの
紫外線のもとで観察したものであシ；第２図は上記反応
混合物の中圧クロマトグラフィーにおける溶出の様子を
２７０　ｎｍの吸収によ）観察したものであり、Ｈ２Ｏ
（４０）　：ピリジン（１０）：酢酸（１）中１．０５
ｋｐ／σ２の窒素圧により行ったものであシ； 第３図は上記フラッシュクロマトグラフィーからの溶出
精製物の薄層クロマトグラムであり；そして、 第４図はＲＮアーゼ１ｍｙ／ｍｌと共にインキユベート
シた後のカラム画分Ａの薄層クロマトグラムである。 以下余白 手続補正書ｃ方式） 昭和６０年　７月２７日 特許庁長官　宇　賀　道　部　殿 １、事件の表示 昭和６０年　特許願　　第５９６８８号２、発明の名称 酵素的分析方法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 名称　　ユニバーシティ　カレンジ　ロンドン４、代理
人 ６、　補正の対象 〔］）図面 伐）明細書 ７、　補正の内容 （１）図面の浄書（内容に変更なし） （２）明細書の浄書（ｌ　） ８、添附書類の目録

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、第１酵素の酵素的に不活性な小断片を担持する測定
    成分を使用すること、該酵素の酵素的に不活性な相補的
    蛋白質断片を添加して前記小断片に接合せしめそして活
    性な第１酵素を生成せしめること、及び該酵素により触
    媒される反応を行って検出可能な結果を導くことを含ん
    で成るサンプル媒体中の分析対象の検出方法において、
    前記測定成分が前記分析対象と結合する特異的認識プロ
    ーブであり、前記第１酵素が基質を第１生成物に転換す
    る反応を触媒し、該第１生成物がそれ自体として又は該
    第１生成物により開始される追加の１反応もしくは複数
    の１連の反応により生成する次の生成物として第２酵素
    の必須成分であり、該必須成分によって該第２酵素が完
    全なものとされそして検出可能な結果を導く反応を触媒
    することを特徴とする方法。 ２、前記第１酵素の小断片が全酵素蛋白質の小ペプチド
    断片である特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、前記小断片がリボヌクレアーゼＳ−ペプチドであり
    、そして前記相補断片がリボヌクレアーゼＳ−蛋白質で
    ある特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、前記Ｓ−ペプチドとＳ−蛋白質とが接合してリボヌ
    クレアーゼＳ酵素を形成し、該Ｓ酵素が合成基質の前記
    第１生成物への転換を触媒する特許請求の範囲第３項記
    載の方法。 ５、前記合成基質が式Ｒ−Ｘ（式中、Ｒはピリミジン３
    ′−ホスフェート成分であり、Ｘは前記第１生成物を生
    成する除去基であり、そしてＸは前記３′−ホスフェー
    ト基を介してＲに連結されている）で表わされるピリミ
    ジン３′−ホスホジエステル化合物である特許請求の範
    囲第４項記載の方法。 ６、酵素的に不活性なリボヌクレアーゼＳ−ペプチドを
    標識として使用し、これに酵素的に不活性なリボヌクレ
    アーゼＳ−蛋白質が接合してリボヌクレアーゼ酵素が生
    成すること、及び該リボヌクレアーゼ酵素によって触媒
    される反応を行って分析対象の存在を示すことを含んで
    成るサンプル媒体中の分析対象の検出方法において、前
    記リボヌクレアーゼにより触媒される反応が式Ｒ−Ｘ（
    式中、Ｒはピリミジン３′−ホスフェート成分であり、
    そしてＸは該３′−ホスフェート基を介してＲに連結さ
    れている除去基である）で表わされる合成基質に対して
    行われ、該反応の除去基生成物が第２酵素の補因子もし
    くは補欠分子族であり、又は該補因子もしくは補欠分子
    族の前駆体であり、そして該第２酵素により触媒される
    反応が、サンプル媒体中の分析対象の存在を示す検出可
    能な結果導きながら行われることを特徴とする方法。 ７、次の式： Ｒ−Ｘ （式中、Ｒはピリミジン３′−ホスフェートであり、そ
    してＸは該３′−ホスフェート基を介してＲに連結され
    ている除去基であり、そしてそれから切断されて酵素の
    必須成分又はそのための前駆体を生成することができる
    。） で表わされるピリミジン３′−ホスホジエステル化合物
    。 ８、リボヌクレアーゼにより触媒される反応の除去基生
    成物がリボフラビン、チアミン、ピリドキサール、ピリ
    ドキシン及びピリドキシンホスフェートから成る群から
    選ばれる特許請求の範囲第５項又は第６項記載の方法、
    あるいは第７項記載の化合物。 ９、前記除去基生成物がリボフラビンモノヌクレオチド
    、フラビンアデニンジヌクレオチド、チアミンジホスフ
    ェート及びピリドキサール５−ホスフェートから成る群
    から選ばれた補酵素又は補欠分子族に転換される特許請
    求の範囲第８項記載の方法又は化合物。 １０、酵素により切断され他の酵素の触媒活性に必須な
    成分又はその前駆体を生成することができる合成補欠分
    子族生成化合物。 １１、その濃度が検出されるべき分析対象の存在に関連
    する第１酵素が検出可能な生成物を導く第１酵素反応を
    触媒するエンザイムリンクドイムノアッセイ法において
    、前記第１酵素のための基質が合成化合物であってこの
    化合物は該第１酵素によって開裂されて直接的に又は１
    もしくは複数の追加の反応により他の酵素の触媒活性の
    ために必須の成分を生成し、該成分によって該他の酵素
    が活性化されて検出可能な結果を導く第２酵素反応を触
    媒することを特徴とする方法。
JP60059688A 1984-03-26 1985-03-26 酵素的分析方法 Granted JPS611398A (ja)

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GB8407736 1984-03-26
GB848407736A GB8407736D0 (en) 1984-03-26 1984-03-26 Detecting specific polynucleotide sequences

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JPS611398A true JPS611398A (ja) 1986-01-07
JPH0586199B2 JPH0586199B2 (ja) 1993-12-10

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JP60059688A Granted JPS611398A (ja) 1984-03-26 1985-03-26 酵素的分析方法

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US (2) US4745054A (ja)
EP (2) EP0461731B1 (ja)
JP (1) JPS611398A (ja)
AT (1) ATE108454T1 (ja)
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