DE3586183T2 - Enzymatisches verfahren zur bestimmung von analyten und substrate hierzu. - Google Patents

Enzymatisches verfahren zur bestimmung von analyten und substrate hierzu.

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Description

  • Die Erfindung betrifft Verfahren zur Bestimmung von Analyten in Probenmedien mittels enzymatischer Reaktionen. Sie ist insbesondere, jedoch nicht ausschließlich, auf die Bestimmung von Polynucleotidanalyten anwendbar.
  • Nucleinsäurehybridisierungsassays sind von zunehmender praktischer Richtigkeit bei der Diagnose von und der Bestimmung von Trägern von menschlichen Erbkrankheiten (beispielsweise siehe Banbury Report 14, Recombinant DNA Applications to Human Diseases, ed. S.T.Caskey & R.L. White, Cold Spring Harbor Laboratory, 1983). Sie sind ebenfalls wertvoll für die Identifizierung von pathogenen Organismen einschließlich Viren und Bakterien und zur Identifizierung von Genen, welche in den letztgenannten Resistenz gegenüber Antibiotika ergeben.
  • Üblicherweise angewandte Arbeitsweisen schließen die Verwendung von radiochemisch markierten Sonden mit den damit verbundenen Problemen der Sicherheit, der Kosten und der begrenzten Lagerzeit ein. Alternative Methoden zum Nachweis wurden vorgeschlagen, in welchen ein chemilumineszierendes, fluoreszierendes oder phosphoreszierendes Material an die Sonde gebunden wird (EP 70687), jedoch ist es zweifelhaft, ob solche Methoden die erforderliche Empfindlichkeit besitzen, um die Anwesenheit von 10&supmin;¹&sup8; mol eines einzigen Copygens, welche typischerweise für die Bestimmung verfügbar sind, nachzuweisen.
  • Ein anderer Versuch war es, für Nachweiszwecke die Sonde an Biotin zu binden und mit einem geeigneten Enzym gekuppeltes Avidin zu verwenden (GB 2019408). Die Empfindlichkeit dieser Methode ist auf die Anzahl der Moleküle des Detektorenzyms, welche an Avidin gebunden werden können, begrenzt.
  • Die EP 27036 schlägt ein Assaysystem unter Verwendung eines Konjugates zwischen einer Sonde und einem Enzym vor, wobei das Enzym dann an einer primären Reaktion teilnimmt, welche einen "Modulator" für ein sekundäres Reaktionssystem bildet oder entfernt; der Modulator ist eine Substanz, welche Veranlassung zu einem katalytischen Ereignis in dem sekundären Reaktionssystem gibt, die jedoch keinen Nettoverbrauch während des katalytischen Ereignisses erfährt. Dies gibt daher Anlaß für einen Verstärkungsfaktor zwischen dem primären und dem sekundären Reaktionssystem. Der Modulator kann ein Enzymaktivator oder -inhibitor sein, oder ein zyklisch regenerierfähiges Substrat für das zweite System.
  • Assaysysteme unter Verwendung von sekundären Reaktionen zur Herbeiführung einer Vervielfältigung sind ebenfalls in der WO 81/00725 beschrieben, welche sich auf die Verwendung von cyclisierenden Substraten bezieht, und in der EP 49606, welche sich auf die primäre Reaktion unter Bildung eines "Förderstoffes" ("facilitator") bezieht, welcher die Geschwindigkeit der sekundären Reaktion erhöht.
  • In enzymgebundenen Immunoassaysystemen ist es für das markierende Enzym üblich, daß es an die Sonde konjugiert ist, und dies bedeutet, daß überschüssiges Enzym in sehr effizienter Weise entfernt werden muß, bevor die enzymkatalysierte Reaktion stattfindet, da sonst ein falsches positives Ergebnis erhalten wird. Dies gibt Anlaß zu beträchtlichen Problemen und ein hohes Signal/Rauschverhältnis ist nur schwierig zu erreichen.
  • Die EP 62277 beschreibt die Verwendung eines Enzyms auf Basis von Ribonuclease A. Ribonuclease A kann in ein Polypeptid mit 20 Resten, bezeichnet als S-Peptid, und ein Polypeptid mit 104 Resten, bezeichnet als S-Protein, gespalten werden. Weder das S-Peptid noch das S-Protein alleine haben enzymatische Aktivität, jedoch bilden sie ein Konjugat, bezeichnet Ribonuclease S, das Ribonucleaseaktivität besitzt. Der Vorschlag in dieser Veröffentlichung ist, ein Analoges des Analyten mit dem S-Peptid zu markieren, so daß das Assaymedium ein markiertes Analoges und nichtmarkierten Analyten enthält. Ein Antikörper wird dann eingeführt, der seinerseits entweder an die Analytmoleküle oder die Analogmoleküle binden kann. Der Analyt steht daher in Konkurrenz mit dem Analogen für das Binden des Antikörpers, und S-Peptid auf ungebundenen Analogmolekülen sind dann frei, um mit dem zugesetzten S-Protein zu kombinieren und enzymatische Aktivität zu bilden. Durch Zugabe steigender Konzentrationen des Analyten wird eine Verdrängungskurve konstruiert, welche die katalytische Aktivität mit der Analytkonzentration in Beziehung setzt, und es wird vorgeschlagen, daß diese Referenzkurve dazu verwendet wird, unbekannte Analytkonzentrationen zu bestimmen. Die Ribonuclease-S-aktivität wird typischerweise unter Verwendung spektrophotometrischer oder fluorometrischer Arbeitsweisen bestimmt. Diese Methode zur Verwendung der S-Peptid/S-Protein-Kombination erscheint kompliziert und schwierig, und im Prinzip scheint die Bestimmung des Analyten durch Messung der Unterschiede in der Reaktionsgeschwindigkeit Beschränkungen hinsichtlich der Empfindlichkeit, der Genauigkeit und der Einfachheit der Durchführung mit sich zu bringen.
  • Gemäß einer Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einem Probenmedium, das die Verwendung einer Assaykomponente, die eine enzymatisch inaktive, kleine Fraktion bzw. Fragment eines pirmären Enzyms trägt, und die Zugabe einer komplementären, enzymatisch inaktiven Proteinfraktion des Enzyms, um mit der genannten kleinen Fraktion zu konjugieren und ein aktives pirmäres Enzym zu produzieren, und die Durchführung einer durch das genannte Enzym katalysierten Reaktion umfaßt, die zu einem nachweisbaren Ergebnis führt, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Assaykomponente eine spezifische Erkennungssonde ist, die an den Analyten bindet, und das genannte primäre Enzym eine Reakion katalysiert, die ein Substrat in ein primäres Produkt umwandelt, das selbst oder als ein folgendes Produkt, das in einer weiteren Reaktion oder einer Reihe von weiteren Reaktionen produziert wird, die durch das genannte primäre Produkt eingeleitet wird bzw. werden, ein wesentlicher Bestandteil für die katalytische Aktivität eines zweiten Enzyms ist, das hierdurch vervollständigt wird und eine Reaktion katalysiert, die zu einem nachweisbaren Ergebnis führt.
  • Die genannte kleine Fraktion des primären Enzyms ist bevorzugt eine kleinere Peptidfraktion des Gesamtenzymproteins. Eine solche kleine Peptidfraktion kann gegenüber den Bindungsbedingungen inert sein, während bei einem kompletten Enzym dessen Aktivität durch die Bedingungen wie Temperaturextreme, pH, Salzkonzentration, etc., schwerwiegend beeinträchtigt sein könnten. Geeignet ist ein Ribonuclease-S-Peptid, und die komplementäre Fraktion ist das Ribonuclease-S-Protein. Das erhaltene Ribonuclease-S-enzym katalysiert dann in geeigneter Weise die Umwandlung eines synthetischen Substrates in dieses primäre Produkt. Das synthetische Substrat ist geeigneterweise eine Pyrimidin-3'-phosphodiesterverbindung der Formel R-X, worin R eine Pyrimidin-3'-phosphateinheit ist und X eine austretende Gruppe ist, welche dieses primäre Produkt bildet, wobei X an R' durch die 3'-Phosphatgruppe gebunden ist. R kann daher als Cp oder Up wiedergegeben werden, worin C = Cytidin, U = Uridin und p = Phosphat sind, oder Pyrimidinanaloge hiervon und wahlweise substituiert, z.B. mit einer 5'-Hydroxyschutzgruppe.
  • Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung gegenüber den früheren Vorschlägen ist, daß sie ein einfaches und direktes Verfahren zum enzymatischen Nachweis des Analyten liefert, mit hoher Empfindlichkeit, welche aus der sekundären Vervielfachung herrührt, und einem hohen Signal/Rauschverhältnis, das aus der Tatsache herrührt, daß keines der Enzymbruchstücke (z.B. S-Peptid und S-Protein) enzymatische Aktivität besitzt, welche zu einem "Untergrundrauschen" Anlaß geben könnten, so daß die spezifische enzymatische Aktivität nur von dem durch gebundenes S-Peptid erzeugten Konjugatkatalysator herrührt, und keine Notwendigkeit zur Entfernung des Überschusses der größeren Enzymproteinfraktion besteht.
  • Synthetische Substratverbindungen wie R-X (welche als "Prosthetogene" bezeichnet werden können) werden per se als neu angesehen. Daher verwendet die vorliegende Erfindung bevorzugt eine synthetische Prosthetogenverbindung, welche durch ein Enzym spaltbar ist, um eine für die katalytische Aktivität des anderen Enzyms wesentliche Komponente oder einen Vorläufer hierfür zu bilden, insbesondere eine Pyrimidin-3'-phosphodiesterverbindung der Formel R-X, worin R ein Pyrimidin-3'-phosphat ist und X eine abspaltende Gruppe ist, die an R über die 3'- Phosphatgruppe gebunden ist und hiervon enzymatisch abspaltbar ist, um eine essentielle Komponente eines anderen Enzyms oder einen Vorläufer hierfür zu bilden.
  • Die vorliegende Erfindung verwendet daher das Prinzip eines an ein Enzym gebundenen Nachweissystems, jedoch wird eine Verbesserung der Empfindlichkeit von vielen Größenordnungen erhalten, indem der primäre Katalysator zur Erzeugung, direkt oder indirekt, eines Coenzyms oder einer prosthetischen Gruppe eingesetzt wird, die Teil eines anderen und verschiedenen katalytischen Zentrums ist, unter Verwendung eines Enzyms, das absolut von diesem Coenzym oder dieser prosthetischen Gruppe für die katalytische Aktivität abhängt. Die primäre enzymatische Reaktion kann daher ein Coenzym oder eine prosthetische Gruppe direkt bilden, oder sie kann eine Vorläuferverbindung bilden, welche dann, z.B. enzymatisch, zu dem Coenzym oder der prosthetischen Gruppe umgewandelt wird. Das Coenzym oder die prosthetische Gruppe, gleichgültig ob sie direkt oder indirekt gebildet wurden, wird dann mit einem geeigneten Apoenzym zur Bildung eines Holoenzyms kombiniert, dessen Menge unter Verwendung des Holoenzyms zur Katalyse eines sekundären Reaktionssystems, das zu einem nachweisbaren Ergebnis führt, wie der Bildung eines Farbstoffes, bestimmt werden kann.
  • Eine bevorzugte Arbeitsweise der Untersuchung ist in dem folgenden Schema 1 gezeigt. SCHEMA 1 Analyt Sonde-A&sub1; Hybridisierung Erkennung KomponenteA&sub2; hybridis. - Enzym. Eo Sonde Enzym E&sub1; primäre Reaktionen Empfindlichkeitssteigerung (nachgewiesenes Produkt) Nachweis
  • Alle Katalysatoren sind in Kästchen und über einem Pfeil angeodnet, der die katalysierte Reaktion anzeigt. Das primäre Enzym ist Eo und das nachweisende, aktive Holoenzym E2aX'.
  • Die Sonde ist an eine Komponente A&sub1; in einer solchen Weise gebunden, daß sie die Hybridisierung nicht stört, vorzugsweise an einem der freien Enden der Sonde, mittels einer geeigneten Abstandsgruppe, wobei z.B. die in Nucleic Acid Research, Vol.11 (1983) pp.659-669 beschriebene Methodologie angewandt wird. Im Anschluß an die Hybridisierung unter geeigneten strikten Bedingungen ergibt die Addition von A&sub2; eine enzymatisch aktive Spezies, A&sub1;A&sub2;, welche im Schema 1 mit Eo bezeichnet ist und an die Sonde gebunden ist. Dies ist die Erkennungsphase der Erfindung. Dieses primäre Enzym, Eo, wirkt katalytisch, während es an der Target-DNA auf einem Prosthetogensubstrat R-X immobilisiert ist, um das Coenzym oder den prosthetischen Gruppenvorläufer X-OH freizusetzen, der/die ihrerseits im Anschluß an die Umwandlung, wo dies notwendig ist, in die aktive Form des Coenzyms X' in einem durch das Enzym E&sub1; katalysierten Prozeß mit einem inaktiven Apoenzym E2i unter Bildung des enzymatisch aktiven Nachweis-Holoenzyms E2aX' kombinieren. In einigen Fällen ergibt die Eo-katalysierte Reaktion ein Coenzym oder eine prosthetische Gruppe direkt, in diesem Fall wird die Umwandlungsstufe unter Verwendung des Enzyms E&sub1; ausgelassen. Die Empfindlichkeitssteigerung rührt daher, daß im Prinzip jedes gebildete Molekül von X' Anlaß zu einem aktiven Molekül von E2aX' geben kann, und daß die Anzahl der erzeugten Moleküle von E2aX' in starkem Maße diejenige der an die Sonde gebundenen Eo übersteigen. Bei der vorliegenden Erfindung ist X' ein Teil des katalytischen Zentrums des Enzyms E2aX' und kein allosterischer Aktivator des Substrates. Es ist für die katalytische Aktivität absolut erforderlich und kein bloßer Geschwindigkeitspromotor für eine existierende enzymatische Reaktion, wie dies bei einigen der Vorschläge des Standes der Technik der Fall ist. Das Enzym E2aX' katalysiert die Bildung eines leicht nachgewiesenen Produktes P aus einem Substrat S.
  • Ein Beispiel der Erfindung verwendet als Fragmente A&sub1; und A&sub2; S-Peptid (Spep) bzw. S-Protein (Spr), die von Rinderpancreasribonuclease (EC 3.1.27.5) durch proteolytische Spaltung mit Subtilisin (EC 3.4.21.14) abstammen. Es ist wohlbekannt, daß enzymatisch inaktives S-Peptid und S-Protein mit sehr hoher Affinität unter Erzeugung von Ribonuclease S, die volle enzymatische Aktivität der Ribonuclease A besitzt, kombinieren können.
  • Der aktivierte hybridisierte Sonde-A&sub1;-A&sub2;-komplex (hybridisiertes Sondenenzym Eo) wirkt auf das Prosthetogensubstrat R-X, das z.B. die Form CpX oder UpX hat, worin X über eine 3'-Phosphodiesterbindung (p) an Cytidin- (C) oder Uridin-nucleosid (U) gebunden wäre. Die "spaltende Gruppe" X-OH ist eine prosthetische Gruppe oder ein Coenzymvorläufer, wie Thiamin, Riboflavin, Pyridoxal oder Pyridoxin.
  • Es ist wohlbekannt, daß Rinderpancreasribonuclease A die folgenden Reaktionen Katalysiert:
  • CpX T Cytidin-2',3'-cyclisches-Phosphat + X-OH
  • UpX T Uridin-2',3'-cyclisches-Phosphat + X-OH,
  • worin, obwohl X-OH ein primärer Alkohol sein muß, es einige andere Beschränkungen hinsichtlich seiner Struktur gibt, damit er als geeignete Abspaltgruppe in der durch Ribonuclease katalysierten Reaktion wirkt. (Für einen Überblick siehe F.R. Richards und H.W.Wyckhoff, in "The Enzymes", Vol.3, 3.Auflage, 1971, ed. P.D. Boyer, pp.647-806).
  • Einige Beispiele der Art der verschiedenen Komponenten, welche in dem Schema verwendet werden können, sind in Tabelle 1 angegeben. TABELLE 1 Riboflavin Thiamin Pyridoxal Pyridoxin Pyridoxinphosphat Riboflavinkinase Riboflavinkinase + FMN-Adenyltransferase Thiaminpyrophosphokinase Pyridoxalkinase Pyridoxin-4-dehydrogenase + Pyridoxalkinase Pyridoxin-4-dehydrogenase Flavinmononucleotid (FMN) Flavinadenindinucleotid (FAD) Thiamindiphosphat Pyridoxal-5-phosphat
  • Geeignete Apoenzyme zur Bildung des Enzyms E 2aX' aus X' sind für den Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich, ebenso Systeme zum Nachweis von P durch Farbbildung, Fluoreszenz oder Lumineszenz (siehe z.B. H. Harris und D.A. Hopkinson, Handbook of Enzyme Electrophoresis in Human Genetics, 1976, North-Holland Publishing Co.).
  • Die Erfindung wird aus der folgenden, mehr ins einzelne gehenden Beschreibung verständlicher, welche anband von Beispielen gegeben wird und nicht als Beschränkung des Umfangs der Erfindung angesehen werden soll.
    • A - DIE SONDEN
  • Oligonucleotidsonden mit den erforderlichen Basensequenzen für die Hybridisierung mit Polynucleotidanalyten können nach der Festphasen-Phosphotriestermethode auf einem Kieselguhr-Polydimethylacrylamidträger synthetisiert werden, wie im einzelnen von Gait et al. [M.J. Gait et al. 1982] beschrieben.
  • Das Nachweissystem kann ebenfalls bei anderen Arbeitsweisen als solchen unter Verwendung von Genproben angewandt werden So kann im Prinzip eine beliebige Antigen-Antikörper-Wechselwirkung mit größerer Empfindlichkeit als derzeitige nicht-radioaktive Methoden unter Anwendung der vorliegenden Erfindung überwacht werden.
    • B - SYNTHESE VON SONDE-S-PEPTIDDERIVATEN
  • Konventionelle und routinemäßige Arbeitsweisen können zum Binden von S-Peptid an Sondenmoleküle angewandt werden. Solche Arbeitsweisen sind in der EP 62277 diskutiert. In gleicher Weise bezieht sich dieses Veröffentlichung auf die Anwendung von Modifikationen der oder Analogen von Spep-Spr-Subtilisinspaltprodukten von Ribonuclease A und ebenfalls auf andere spaltbare Enzyme. Die vorliegende Erfindung umfaßt in vergleichbarer Weise solche Varianten.
  • Methoden zur Herstellung von RNase-S und zur Trennung in S-Peptid und S-Protein wurden von Doscher (1969) bzw. Chavers & Scheraga (1980) beschrieben.
  • Die Reaktion des bifunktionellen Reagens SPDP (n-Succinimidyl- 3-(2-pyridyldithio)propionat) mit dem S-Peptid gibt ein Derivat, das 1 mol des Reagens pro mol des Peptids enthält. Die Substitution an der α-Aminogruppe des N-entständigen Lysins ist eine bevorzugte Stellung, da dieser Rest nicht signifikant zu der S-Peptid-S-Protein-Wechselwirkung beiträgt. NH&sub2;-Lys-S-Peptid
  • Dieses Derivat, I, ist reaktionsfähig gegenüber Thiolreagentien und kann so zum Kuppeln an Oligonucleotid verwendet werden, das nach der Methode von Roychoudhury et al (1976) "G-tailed" wurde und mit N-Acetyl-N'-(p-glyoxylbenzoyl)cysteamin nach den Methoden von Cheng et al (1983) umgesetzt wurde. Das Reaktionsschema ist wie folgt. Sonde Addition +Dithiothreit + Verbindung I Verbindung II
  • Die Verwendung der Verbindung II zum Nachweis der Anwesenheit von DNA, welche Sequenzen komplementär zu denjenigen in der Sonde enthält, kann wie folgt wiedergegeben werden: Dithiothreit Vervielfachungs- und Nachweissystem
  • worin die Zick-Zack-Linien die komplementären Sequenzen der Sonde und die Targetsequenzen in der DNA wiedergeben.
  • Die Reaktion (ii) kann als wahlweise angesehen werden, jedoch kann sie dadurch Vorteile bieten, daß das S-Peptidfragment nur die relativ kleine β-Mercaptopropionylgruppe trägt, welche weniger wahrscheinlich zur Verminderung der enzymatischen Aktivität als der große Sonden-DNA-komplex beiträgt. Diese Stufe bietet den zusätzlichen Vorteil, daß der S-Protein-S-Peptid- Komplex von der Matrix befreit würde, auf welcher die DNA immobilisiert worden ist.
    • C - ENZYMNACHWEISSYSTEME FÜR DAS SONDEN-S-PEPTIDDERIVAT
  • Ein Nachweissystem, das eine gefärbte Lösung oder einen gefärbten Fleck auf einer Trägermatrix ergibt, ist bevorzugt, da dies die Anwendung der Technologie vereinfacht und somit erweitert. Größere Empfindlichkeit kann jedoch bei Verwendung von spezialisierten Instrumenten wie Lumineszenzmonitoren, Fluorometern oder Spektrophotometern erreicht werden.
  • Eine allgemeine Reaktionsfolge für das System ist wie folgt: (primärer Katalysator) modifiz. Enzym
  • worin:
  • P-Spep: Sonden-S-Peptidderivat.
  • Spr: Das von RNase abstammende S-Protein
  • S&sub1;C&sub1;: ein Phosphodiestersubstrat für RNase, enthaltend das Coenzym oder den Coenzymvorläufer C&sub1;' als abspaltende Gruppe.
  • Modifizierende Enzyme: Aktive Enzyme, welche die Form des für die Kombinatuion mit Apo 1 erforderlichen Coenzyms erzeugen.
  • Apo 1: Das enzymatisch inaktive Apoenzym, für welches C&sub1; das Coenzym ist.
  • Holo 1: Das aktiv Holoenzym, gebildet durch Kombination von Apo mit dem Coenzym C&sub1;.
  • S&sub2;: Das Substrat für Holo 1, welches das gefärbte Produkt P* ergibt.
  • Enzymatisch aktive Komponenten sind in den Kästchen angegeben, wobei die gestrichelten Pfeile auf die katalysierten Reaktionen zeigen.
    • Die Wechselwirkung S-Peptid: S-Protein
  • Das System nutzt die enge und spezifische Bindung des S-Peptids an das S-Protein aus. Diese Wechselwirkung ist von einer solch hohen Affinität, daß es sich als unmöglich erwiesen hat, einen Wert für die Dissoziationskonstante (Kdiss) zu bestimmen, jedoch wurde ein oberer Grenzwert für Kdiss auf 5 x 10&supmin;&sup9; M von Richards & Vithayathil (1959 a,b) gesetzt. Daher würde bei einer Konzentration von S-Proteinkatalysator von 10&supmin;&sup7; M oder weniger 95% der Sonde in primären Katalysator umgewandelt werden. RNase-S zeigt enzymatische Aktivitäten, welche denjenigen der nativen RNase-A sehr ähnlich sind (Takahashi et al (1969)).
  • In der folgenden Darstellung sind spezifische Vorschläge für die Art des kuppelnden Coenzyms, C&sub1;, und des letztlichen Nachweissystems (S&sub2; T P*) gegeben. Jedoch gibt es eine große Anzahl von alternativen möglichen Prozessen, welche auf anderen Kupplungscoenzymen und anderen Arbeitsweisen zur Sichtbarmachung basieren.
    • Das Nachweissystem mit Riboflavin als kuppelndem Coenzym
  • In diesem Fall wäre das Substrat für die enzymatische Wirkung des Sonden-S-Peptid - S-Protein-komplexes von folgendem Typ (III). Cytidin-2'3'phosphat Riboflavin
  • worin C = Cytosin (oder eine andere Pyrimidinbase).
    • Synthese des Substrates III (Cp-Riboflavin)
  • Das Substrat Cp-Riboflavin kann unter Ausnutzung der Reversibilität der ersten Stufe der Ribonuclease-A-Wirkung auf die Synthese eines Substrates III, das aus über die 3'-Phosphateinheit an den endständigen Hydroxylreste der Ribitylseitenkette von Riboflavin gebundenen Cytidin besteht, hergestellt werden. RNase A 50% Formamid Ethylendiamin pH 6 50 R = Riboflavin
  • Wegen der hohen hydrolytischen Aktivität von RNase-A wären nur kleine Ausbeuten des Substrates zu erwarten, falls die Reaktion in wässriger Lösung durchgeführt würde. Daher wurde die Reaktion in 50%igem Formamid bei -20ºC mit der höchst möglichen Konzentration von Riboflavin als angreifender Gruppe und der erforderlichen primären Alkoholgruppe als Nucleophil durchgeführt.
    • Experimentelles I. Enzym-katalysierte Herstellung von Cp-Riboflavin
  • Die Reaktion wurde bei -20ºC mit 600 mg Cytidin-2',3'-cyclischem-phosphat, 1 g Riboflavin und 1 mg/ml Ribonuclease-A in einem Gesamtvolumen von 1130 ml 50% Vol/Vol Formamid/Puffer ph 6,50 durchgeführt.
  • (Die Reaktionsmischung muß vor Licht bewahrt werden und auf der sauren Seite der Neutralität, um den Abbau von Riboflavin in Lumiflavin zu vermeiden.)
  • Der Fortschritt der Reaktion wurde unter Anwendung der Dünnschichtchromatographie überwacht. Gleiche Teile (100 ul) wurden in regelmäßigen Intervallen (5 Tage) abgezogen und auf Whatman PLK Sf Kieselerdegelplatten gegenüber Standards, (5 ug) von Riboflavin, Cytidin-2',3'-cyclischem-phosphat und Cytidinadenosinphosphodiester (CpA) chromatographiert (Fig.1).
  • Das verwendete Lösungsmittel war H&sub2;O, 40 : Pyridin, 10 : Eisessig, 1; pH 5,80.
  • Das Produkt begann auf den Chromatographien nach 11 Tagen Inkubation als ein Fleck mit einem Rf-Wert von 0,87 zu erscheinen, verglichen mit den Rf-Werten von 0,79 für Riboflavin, 0,95 für Cytidin-2',3'-cyclischem-phosphat und 0,89 für CpA. Die Reaktion wurde nach 31 Tagen abgebrochen, wenn der Hauptfleck auf den Chromatographien derjenige bei Rf 0,87 war.
    • II. Abstoppender Reaktion
  • An dieser Stelle war es wesentlich, die Ribonuclease in der Inkubationsmischung zu inaktivieren, da eine Exposition des Produktes gegenüber dem Enzym in einer wässrigen Umgebung sein Aufbrechen in Cytidin-3'-phosphat und Riboflavin ergeben hätte.
  • Daher wurde die Ribonuclease durch Phenolextraktion des Inkubates bei pH 5,40 entfernt.
  • Das Inkubat wurde mit Phenol dreimal extrahiert und die vereinigten wässrigen Phasen wurden einmal mit Chloroform extrahiert. Dieser Arbeitsschritt hatte den zusätzlichen Vorteil, daß er die Entfernung eines großen Prozentsatzes des in dem Reaktionsgemisch vorhandenen Formamids erleichterte.
  • Die vereinigten wässrigen Phasen wurden im Volumen durch Rotationsverdampfung bei 55ºC vor der Abtrennung des Produktes von nichtumgesetztem Riboflavin und Cytidin-2',3'-cylischem-phosphat auf Kieselerdegelsäulen reduziert.
    • III. Trennung des Produktes von nichtumgesetzten Bestandteilen (Kurzwegchromatographie)
  • Die Trennung des Produktes von nichtumgesetztem Riboflavin und Cytidin-2',3'-cyclischem-phosphat wurde unter Anwendung der Mitteldruckchromatographie (Still et al., 1978) durchgeführt.
  • Ein Aliquot des mit Phenol und Chloroform extrahierten Inkubates aus Stufe II (10 ml) wurde auf eine Säule aus Kieselerdegel (Merck silican gel 60) aufgegeben und mit H&sub2;O,40 : Pyridin, 10 : Eisessig, 1 unter einem Überdruck von sauerstofffreiem Stickstoff von 15 lbs/in² (1,05 kg/cm²) eluiert. (Fig.2).
  • Die Fraktionen wurden zusammengegeben und mittels Dünnschichtchromatographie, wie zuvor beschrieben, untersucht. (Fig.3).
  • Die Fraktion A (Fig. 2 und Spur 4, Fig. 3) wurden als Substrat für Ribonuclease durch Inkubieren eines Aliquots (100 ul) in einer 2 mg Ribonuclease in einem Endvolumen von 1 ml 0,1 M Ethylendiaminpuffer (ph 6,50) für 2 h bei Zimmertemperatur getestet. Das erhaltene Chromatogramm zeigte, daß der Fleck bei Rf 0,87 in 2 Flecke von Rf 0,79 (Riboflavin) und 0,96 (Cytidin-3'-phosphat) aufgelöst war, was anzeigt, daß das Produkt durch RNase in die es bildenden Bestandteile hydrolysiert worden war. (Fig. 4).
  • Fraktion A (Fig. 2) wurde zusammengegeben und bei 55ºC rotationsverdampft, um einen Feststoff zu erhalten. Jedoch verblieb ein restliches Volumen an Formamid, das während des Phenolextraktionsprotokolls nicht entfernt wurde und das mit der mobilen Phase während der Mitteldruckchromatographie gewandert war. Die Entfernung des Formamids liefert das Substrat in fester Form.
    • Primäre Reaktionen
  • Die gewünschte aktive Form des Coenzyms, FMN, wird durch Einwirkung von Riboflavinkinase (Flavokinase: EC 2.7.1.26), einem einfach herzustellenden Enzym, gebildet.
  • Es gibt mehrere Möglichkeiten für das Nachweissystem unter Verwendung von FMN als Coenzym, einschließlich Glycolatoxidase [EC 1.1.3.1 Schuman & Massey (1971)], aus denen FMN durch Dialyse gegen 1 M KBr entfernt werden kann [Massey & Curti (1966)] L-Hydroxysäureoxidase [EC 1.1.3.15, Nakano et al (1968)] und Orotatreductase aus Zoroticum [EC 1.3.1.14, Swell et al.(1960)] jedoch ist Pneumococcen-L-Lactatoxidase [EC 1.13.12.4, Udaka et al. (1959)] eine besonders bevorzugte Möglichkeit.
  • Dieses Enzym katalysiert die Reaktion (i):
  • Lactat + O&sub2; T Acetat + CO&sub2; + H&sub2;O ... (i)
  • welche für Assayzwecke ungeeignet ist. Bei Anwesenheit von Catalase in der Reaktion ergibt sich jedoch (Udaka et al.(1959)]:
  • Lactat + 1/2O&sub2; T Pyruvat + H&sub2;O ... (ii)
  • Daher ist die enzymatische Reaktion:
  • Lactat + O&sub2; T Pyruvat + H&sub2;O&sub2; ... (iii)
  • Dies bietet die Gelegenheit zum Kuppeln der Reaktion zu einer der raschen und empfindlichen Methoden zum Nachweis von H&sub2;O&sub2;, wie der Reaktion mit den chromogenen Substraten, 5-Aminosalicyclsäure oder Dianisidin, katalysiert durch Meerrettich- Peroxidase [Kas & Cerna (1980)].
  • Eine Alternative besteht in der Erzeugung von FMN an die Bildung von Flavodoxin. Apoflavodoxin ist ein gut dokumentierter Nachweisstoff für FMN oder FAD in einem System, in welchem das Ausmaß der Änderung der Fluoreszenz des Flavinnucleotids bei der Kombination mit dem Apoprotein benutzt wird, um die Menge des Nucleotids in einer unbekannten Lösung zu bestimmen [Mayhew & Wassink (1980): a + b]. Jedoch wäre die Fluoreszenzmethode nicht ausreichend empfindlich für die vorliegenden Zwecke, so daß ein enzymgebundener Assay benutzt werden kann, z.B. die Flavodoxin-vermittelte Reduktion von Cytochrom c durch NADPH, katalysiert durch die gereinigte Reductase [Shin (1971)].
  • Obwohl FMN-gekuppelte Enzyme für die zuvor beschriebenen Coenzym-kuppelnden Assays vorgeschlagen werden, kann der Bereich von verwendbaren Enzymen auf solche, welche FAD als Coenzym verwenden, erweitert werden. Dies würde die durch FMN-Adenyltransferase katalysierte Extrareaktion einschließen: [Gibson et al (1955 und Schrecker & Kornberg (1950)]
  • FMN + ATP FAD + PP ... (iv)
  • worin FMN aus der Flavokinasereaktion herrühren würde.
  • Es würde es z.B. möglich machen, D-Aminosäureoxidase als Kupplungsenzym zu verwenden. Das Apoenzym aus dieser Oxidase wird leicht nach der KBr-Dialysemethode hergestellt [Massey & Curti (1966)], und es ist für wenigstens mehrere Monate bei der Lagerung bei -20ºC stabil. Der Assay von D-Aminosäureoxidase durch Kuppeln mit einer Peroxidase-katalysierten Reaktion ist wohldokumentiert und bietet die Möglichkeit einer chromogenen Sichtbarmachung des Enzyms [Tsuge & Nakanishi (1980)].
  • Andere FAD-Enzyme könnten in ähnlicher Weise verwendet werden, einschließlich Glucoseoxidase; L-Aminosäureoxidase und Xanthinoxidase [Tsuge & Nakanishi (1980)]. Es bleibt noch festzustellen, welches System das günstigste wäre, jedoch ist jedes dieser Enzyme leicht erhältlich und kann zum Erhalt stabiler Apoenzyme behandelt werden.
    • Das Nachweissystem unter Verwendung von Pyridoxalphosphat als Kupplungscoenzym
  • Aspartataminotransferase (EC 2.6.1.1.) katalysiert die Reaktion von α-Oxoglutarat (αOG) mit (S)-Aspartat (Asp) unter Bildung von Oxaloessigsäure (OAA) und (S)-Glutamat (Glu). Das Enzym enthält Pyridoxalphosphat als Coenzym, und das Holoenzym kann leicht und reversibel in das freie Coenzym und Apoenzym aufgelöst werden [Martinez-Carrion et al. 1970]. Ein empfindlicher Assay auf das Holoenzym (nanomolare Konzentrationen) wurde von Raj (1982) beschrieben, basierend auf der Bildung eines gefärbten, reduzierten Neotetrazoliumderivates INT*-Rot, gekuppelt an die durch Glutamatdehydrogenase katalysierte Reaktion.
  • Eine Arbeitsweise für den Sonden-S-Peptidnachweis unter Verwendung von Aspartataminotransferase als Holo 1 ist wie folgt: primärer Katalys. KINASE Apotransaminase + Py P Holotransaminase GLUTAMATDEHYDROGENASE DIAPHORASE
  • worin S&sub1;C&sub1; ein Cytidin-3'-phosphodiester mit Pyridoxal-(Py), Pyridoxamin- oder Pyridoxal als C&sub1;-Einheit ist.
  • Ein mögliches Substrat (S&sub1;C&sub1;) für RNase-Wirkung, welches Pyridoxal als eines der Produkte ergibt, ist die Verbindung IV, welche wie folgt hydrolysiert wird:
  • Die Verbindung IV kann nach einer Arbeitsweise synthetisiert werden, die der für Cp-Benzyl veröffentlichten [Bernard & Witzel 1961] ähnlich ist. Pyridoxal, gezeigt als das Hydrat, das nach der oben angegebenen Reaktion gebildet wird, wird in das Pyridoxalphosphat umgewandelt, das in der durch Pyridoxalkinase (EC 2.7.1.35) katalysierten Reaktion erforderlich ist. Andere mögliche Substrate schließen die Verbindungen V - VII ein:
  • worin Cp Cytidin-3'-phosphoryl- bedeutet und R entweder H- oder -O-P(OH)&sub2; ist.
  • Die Verbindung V ergibt bei der Hydrolyse durch RNase-S Pyridoxol, welches in Pyridoxal unter Verwendung von Pyridoxoloxidase (EC 1.4.3.5) in dem Assaysystem als zusätzliche Stufe vor der Kinase-katalysierten Reaktion umgewandelt wird. Falls die Verbindung VI, die phosphorylierte Form der Verbindung V, als Substrat für RNase-S verwendet wird, würde Pyridoxalphosphat direkt durch Einwirkung der Oxidase gebildet werden. Die Verbindung VII, in welcher die Cytidin-3'-phosphorylgruppe in einer Phosphodiesterbindung an dem phenolischen Sauerstoff des Pyridoxals vorliegt, würde bei der RNase-katalysierten Hydrolyse ebenfalls Pyridoxalphosphat direkt ergeben. Jedoch ist es bekannt, daß die enzymatische Spezifität derart ist, daß großvolumige Substituenten an dem Sauerstoffatom der abspaltenden Gruppe kaum toleriert werden, so daß dieses Substrat weniger bevorzugt sein könnte.
  • Die Verbindungen V und VI können enzymatisch durch Verwendung von RNase zur Katalyse der Kondensationsreaktion in Formamid/Wasser oder anderen Mischungen aus aprotischem Lösungsmittel/Wasser hergestellt werden [Findlay, Mathias & Rabin (1962)]. Die chemische Synthese unter Verwendung einer Annäherung auf Phosphotriesterbasis mit geeignet geschützten Reaktionsteilnehmern kann zur Synthese der Verbindung VII wie auch der Verbindungen V und VI verwendet werden.
  • Eine Herstellung des Apoenzyms Apo-glutamin-asparagin-transaminase (Apo 1) wurde beschrieben [Martinez-Carrion (1970), Arrio-Dupont M. (1972)], und sie wird am besten in Stufen durchgeführt: zuerst Ersatz des Pyridoxalphosphates durch das weniger affine Pyridoxaminphosphat und dann Entfernung des letzteren unter Einsatz der Gelchromatographie. Das Apoenzym ist für lange Zeitspannen stabil. Die Entfernung des gesamten Pyridoxalphosphates ist wesentlich für ein gutes Signal-zu- Rauschverhältnis, jedoch wird dies durch eine Inhibitionsstufe sichergestellt, welche die Behandlung mit einer Ketosäure und dann NaBH&sub4;, welches irgendwelche verbleibende enzymatische Aktivität bei der Herstellung des Apoenzyms inaktiviert, einschließt.
  • Die Rekonstitution von Holotransaminase aus Pyridoxalphosphat und dem Apoenzym wurde in einer eleganten Veröffentlichung von M. Arrio-Dupont (1972) beschrieben. Typischerweise wird eine Konzentration der Apotransaminase von 0,1 uM oder größer angewandt. Diese Konzentration reicht aus, um eine im wesentlichen stöchiometrische Umwandlung in Holotransaminase von einer beliebig niedrigen Konzentration des in dem System gebildeten Pyridoxalphosphats sicherzustellen.
    • DOPPEL-VERVIELFACHUNGSSYSTEM UNTER ANWENDUNG EINER DOPPEL-COENZYM- KUPPLUNG
  • Es ist klar, daß im Prinzip "Kaskaden" aufgebaut werden können, um die Assaysysteme so empfindlich wie gewünscht zu machen.
  • Ein potentiell sehr empfindliches System wird im folgenden beschrieben. Die Doppel-Vervielfältigung geht von dem primären Katalysator aus, welcher ein Coenzym (eventuell FAD) freisetzt, das mit einer Apooxidase zur Bildung eines zweiten Coenzyms, Pyridoxalphosphat, kombiniert, das seinerseits das zweite Apoenzym aktiviert. S&sub1;-Flavin KINASE ADENYLTRANSFERASE Apo-Pyridoxol-oxidase Holo-Pyridoxal-Oxidase Apo Aspartat + Pyridoxal- transaminase Pyridoxol P Holo Aspartat-transaminase GLUTAMAT DIAPHORASE
    • SONDEN-ENZYM-SPALTUNG
  • Wie zuvor angegeben, liegt eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Möglichkeit, das primäre Enzym (Eo in Schema 1) aus dem Nachweissystem vor Durchführung der primären Enzymreaktion zu entfernen. Dies hat den Vorteil, daß die primären Reaktionen, Empfindlichkeitssteigerung und Nachweis, in freier Lösung abseits von dem Polynucleotidanalyten und der Oligonucleotidsonde durchgeführt werden können. Diese Spaltung der Sonden-Enzym-Fraktionsbindung kann durchgeführt werden, bevor an die größere Enzymfraktion zur Vervollständigung des Enzyms konjugiert wird, oder nach der Konjugation jedoch vor Zugabe des Substrates. Beispielsweise gilt: falls der Analyt ein Polynucleotid ist, ist die Sonde ein hiermit hybridisierbares Oligonucleotid, und die kleinere Enzymfraktion ist ein S-Peptid, gebunden an das Oligonucleotid über eine Disulfidbindung; diese Bindung kann unter Verwendung konventioneller Reduktionsmittel wie Dithiothreit oder β-Mercaptoethanol unter erneuter Freisetzung des S-Peptides gespalten werden. So kann die Spep-Sonde zu der Probe zugesetzt werden und nichtgebundene Spep-Sonde kann durch Waschen entfernt werden. Dann wird das S-Peptid von der Sonde abgespalten und mit überschüssigem S-Protein zur Bildung des Enzymkonjugates umgesetzt; oder auch das S-Protein kann zu der Spep-Sonde zugesetzt werden, gefolgt von der Spaltung des Konjugates aus der Sonde. Ein spezifisches Beispiel würde einschließen: (i) Immobilisieren des Analyten auf einem Träger wie einem polymeren oder absorbierenden Feststoff; (ii) Umsetzen des immobilisierten Analyten mit überschüssiger Spep-Sonde in Lösung; (iii) Entfernen des Trägers mit seinem hieran gebundenen Komplex Analyt-Spep-Sonde aus der Lösung, und Waschen zur Entfernung irgendwelcher nichtgebundenen Spep-Sonde; (iv) Eintauchen des Trägers in eine Lösung eines Spaltmittels, welches das Spep von dem Träger spaltet, so daß es in Lösung übergeht; (v) Zugabe von S-Protein zu der Lösung zur Bildung des Enzymkonjugates und Durchführung der enzymatischen Reaktionen zur Erzeugung des nachweisbaren Ergebnisses. Stufe (v) könnte die Einzelzugabe aller anderen Reagentien zu der Lösung zusammen mit dem S-Protein zum Abschluß der Assayreaktionen einschließen. Als eine Alternative könnte das S-Peptid zu Beginn auf einem Träger immobilisiert werden, so daß die nachfolgende Spaltstufe den Analyten und die Sonde entfernt, wobei das S-Protein zur Konjugation mit dem S-Peptid auf dem Träger verbleibt. In dieser Weise kann/können die primäre enzymatische Reaktion und möglicherweise die nachfolgenden Reaktionen auf dem Träger stattfinden, was zur Identifizierung des nachweisbaren Ergebnisses der Reaktionen einfacher und empfindlicher sein könnte.
  • Die Trennung des primären Enzyms von der Sonde vor der Durchführung der durch das primäre Enzym katalysierten Reaktion könnte vorteilhaft sein, da die Sonde und der Analyt dann nicht die Aktivität des Enzyms stören würden. In ähnlicher Weise vermeidet das Abspalten der Fraktion des kleinen Enzyms (Spep) von der Sonde vor deren Konjugation mit der größeren Fraktion (Spr), daß die Sonde oder der Analyt die Konjugation stören.
    • Prosthetogene
  • Das Konzept der synthetischen Prosthetogene kann allgemeiner als in den zuvor erläuterten spezifischen Beispielen angewandt werden. Beispielsweise kann Ribonuclease (RNase) als ein primäres Enzym verwendet werden, das indirekt an die Sonde gebunden ist, z.B. durch eine Biotin-Avidinbindung, wie in GB 2019408 beschrieben. Die RNase kann dann auf das neue synthetische Prosthetogen R-X-Substrat, das zuvor beschrieben wurde, unter Bildung eines Coenzymvorläufers einwirken, was letztlich zu einem nachweisbaren Ergebnis über die sekundäre enzymatische Reaktion führt.
  • Darüber hinaus muß das primäre Enzym für die Prosthetogenreaktion nicht RNase sein. Beim Starten mit einem geeigneten Coenzym oder einer geeigneten prosthetischen Gruppe für die sekundäre Reaktion wird ein Reaktionsschema aufgestellt, das als primäre Reaktion die enzymatisch katalysierte Spaltung eines synthetischen Ausgangsmaterials (des neuen Prosthetogens) aufweist. Beispielsweise kann das Prosthetogen ein acyliertes Coenzym und das primäre Enzym eine Esterase sein, welche die Acylgruppe von dem Coenzym abspaltet. Falls die Esterase in inaktives Peptid und Proteinfragmente spaltbar ist, kann sie für RNase Spep/Spr verwendet werden, wie zuvor beschrieben. Falls sie in dieser Weise nicht spaltbar ist, kann sie als ganzes an die Sonde gebunden werden, z.B. direkt, oder über Biotin/Avidin, jedoch vorzugsweise über RNase Spep/Spr. Bei der letztgenannten Durchführungsweise wird Spep an die Sonde, wie zuvor beschrieben, gebunden, und Spr wird an das Enzym gebunden. Allgemeine Methoden zum Reinigen von Proteinen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und können zum Binden des Spr-Fragmentes an das Enzym verwendet werden. Diese Arbeitsweise, bei welcher Spr- Protein als Träger für andere Enzyme dient, kann wie folgt wiedergegeben werden: modifiz. Enzyme (s) Holo 1
    • Schlüssel
  • Spr - Ex : S-Protein, enthaltend ein kovalent gebundenes Enzymmolekül, Ex. Andere Spezien sind wie zuvor beschrieben.
  • Die folgende Beschreibung gilt für Arbeitsweisen, bei denen Pyridoxalphosphat und Flavincoenzyme verwendet werden, jedoch könnte ein beliebiger geeigneter Cofaktor verwendet werden, um andere Nachweissysteme zu bilden.
    • Systeme mit Pyridoxal als Kupplungscoenzym
  • Mit dieser Arbeitsweise würde das letztliche Nachweissystem dem zuvor beschriebenen identisch sein. Der primäre Katalysator, gebunden an das S-Protein, könnte ein beliebiger aus einer großen Auswahl von hydrolytischen Enzymen wie Proteasen, Peptidasen, Amidasen oder Esterasen sein, und insbesondere Thrombin oder eine der anderen spezifischen Proteasen des Blutgerinnungssystems. Mit Thrombin als primärem Katalysator (Ex) könnte das synthetische Prosthetogencoenzym erzeugende Substrat S&sub1;C&sub1; Verbindungen wie VIII - X sein:
  • worin R&sub2; entweder H- oder -PO.(OH)&sub2; ist und R&sub1; eine Acylgruppe ist, die im Hinblick auf die bekannte Spezifität von Thrombin ausgelegt ist, um die Verbindung zu einem guten Substrat für die Thrombinwirkung zu machen (Magnusson (1971) und dortige Literaturstellen). Die Hydrolyse von VIII ergibt Pyridoxamin (Phosphat), und IX und X setzen beide Pyridoxal oder Pyridoxalphosphat frei. Falls die Aldehyd (Hydrat)-Gruppe in IX und X durch eine -CH&sub2;OH-Gruppe ersetzt wird und das Kuppeln durch Pyridoxoloxidase bewirkt wird, sollte sich dies weniger hemmend und weniger anfällig gegenüber Oxidation erweisen.
  • Die Verbindungen VIII - X können aus R&sub1;COOH und dem Pyridoxalderivat mittels direkter Methoden synthetisiert werden, wie den von Harrison & Harrison (1971) beschriebenen Methoden. Die Herstellung von geeigneten R&sub1;COOH-Derivaten würde erfolgen, wie dies von Liem & Scheraga (1974) beschrieben ist.
  • Strukturen von Coenzym-erzeugenden Substraten für Cholinesterase und die Verbindungen XI und XII: worin R=H oder - (OH)&sub2;
  • Die Substrate XI und XII können durch Verwendung einer der üblichen Methoden zur Veresterung (Harrison & Harrison (1971)) mit anschließendem Schutz der geeigneten Gruppen in Pyroxidal synthetisiert werden. Zur Vermeidung irgendwelcher Reaktion der Aldehydgruppe des Pyridoxals (oben als Hydrat gezeigt) mit einer Gruppe an dem aktiven Platz von Cholinesterase kann Pyridoxol die abspaltende Gruppe sein und Pyridoxoloxidase und die Kinase als modifizierende Enzyme verwendet werden, wie zuvor beschrieben.
    • Systeme mit Flavinderivaten als Kupplungscoenzyme
  • Solche Systeme würden die Enddetektoren für Flavin-gekuppelte Assays, die zuvor beschrieben wurden, und die in dem vorangegangenen Abschnitt beschriebenen, primären Katalysatoren benutzen. Die Typen von Substraten (S&sub1;C&sub1;), welche verwendet würden, hätten die Struktur XIV für die Thrombinwirkung und XV für den Fall, in welchem Cholinesterase der primäre Katalysator ist: XIV, R&sub1; = Peptid - Fragment XV, R&sub1; = CH&sub3;
  • Die chemischen Synthesen der Ester XIV und XV gehören zu einer der Methoden, wie sie von Harrison & Harrison (1971) beschrieben wurden; beispielsweise die durch Carbodiimid vermittelte Veresterung von Flavin mit der Carbonsäure R&sub1;COOH, mit Reinigung des Substrates durch HPLC.
    • Literaturstellen
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Claims (8)

1. Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einem Probemedium, das die Verwendung einer Assaykomponente, die eine enzymatisch inaktive, kleine Fraktion bzw. Fragment eines primären Enzyms trägt, und die Zugabe einer komplementären, enzymalisch inaktiven Proteinfraktion des Enzyms, um mit der genannten kleinen Fraktion zu konjugieren und ein aktives primäres Enzym zu produzieren, und die Durchführung einer durch das genannte Enzym katalysierten Reaktion umfaßt, die zu einem nachweisbaren Ergebnis führt, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Assaykomponente eine spezifische Erkennungssonde ist, die an den Analyten bindet, und das genannte primäre Enzym eine Reaktion katalysiert, die ein Substrat in ein primäres Produkt umwandelt, das selbst oder als ein folgendes Produkt, das in einer weiteren Reaktion oder in einer Reihe von Reaktionen produziert wird, die durch das genannte primäre Produkt eingeleitet wird bzw. werden, ein wesentlicher Bestandteil eines zweiten Enzyms ist, das dadurch vervollständigt wird und eine Reaktion katalysiert, die zu einem nachweisbaren Ergebnis führt.
2. Nachweisverfahren nach Anspruch 1, worin die genannte kleine Fraktion des primären Enzyms eine kleine Peptid-Fraktion des gesamten Enzymproteins ist.
3. Nachweisverfahren nach Anspruch 2, worin die genannte kleine Fraktion ein Ribonuclease-S-Peptid und die komplementäre Fraktion das Ribonuclease-S-Protein ist.
4. Nachweisverfahren nach Anspruch 3, worin das S-Peptid und das S-Protein konjugieren, um ein Ribonuclease-S-Enzym zu bilden, das ein synthetisches Substrat zum genannten primären Produkt katalysiert.
5. Nachweisverfahren nach Anspruch 4, worin das genannte synthetische Substrat eine Pyrimidin-3'-phosphodiesterverbindung der Formel R-X ist, in der R einen Pyrimidin-3'-phosphatgruppe bedeutet und X eine austretende Gruppe ist, die das genannte primäre Produkt bildet, wobei X an R uber die 3'-Phosphatgruppe gebunden ist.
6. Nachweisverfahren nach Anspruch 5, worin die austretende Gruppe, die das Produkt in der durch Ribonuclease katalysierten Reaktion ist, aus Riboflavin, Thiamin, Pyridoxal, Pyridoxin und Pyridoxinphosphat gewahlt ist.
7. Nachweisverfahren nach Anspruch 6, worin die genannte austretende Gruppe, das Produkt, in Flavinmononucleotid, Flavinadenindinucleotid, Thiamindiphosphat und Pyridoxal-5-phosphat umgewandelt wird.
8. Pyrimidin-3'-phosphodiesterverbindung, die für die Verwendung als ein genanntes Substrat im Verfahren nach Anspruch 1 geeignet ist, wobei die genannte Verbindung die Formel R-X aufweist, in der R ein Pyrimidin-3'-phosphat bedeutet und X eine austretende Gruppe ist, die an R über die 3'-Phosphatgruppe gebunden und von dieser spaltbar ist, um einen wesentlichen Bestandteil eines Enzyms oder einen Vorläufer für dasselbe herzustellen.
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