JPH0586199B2 - - Google Patents
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〔産業上の利用分野〕
こ発明は、サンプル媒体中の分析対象を酵素反
応により検出する方法に関する。この発明特に、
限定的ではないが、ポリヌクレオチド分析対象に
適用することができる。 〔従来の技術〕 核酸ハイブリダイゼーシヨン測定は、ヒトの遺
伝的疾患の診断、及びそのキヤリヤーの検出のた
めに実際的な重要性が増加しつつある〔例えば、
バンブリーレポート(Banbury Repart)14、ヒ
ト疾患への組換DNAの適用、S.T.Caskey及びR.
L.White編、コールドスプリングハーバーラボラ
トリー、1983を参照のこと〕。これらの測定方法
はさらに、ウイルス及び細菌を含む病原生物の同
定のため、並びに細菌において抗生物質に対する
耐性を付与する遺伝子の同定のためにも価値があ
る。 一般に使用される方法は、安全性、コスト及び
限定された商品寿命の問題を伴う放射化学的標識
プローブを使用するプローブに付加された化学ル
ミネスセンス物質、螢光物質又は燐光物質を用い
る他の方法が提案されている(EP 70687)が、
これらの方法が測定のために典型的に用いられる
単一コピー遺伝子の10-18モルの存在を検出する
ために必要とされる感度を有するか否か疑わし
い。 他の方法は、プローブをビオチンに付着し、そ
して検出のために適当な酵素に連結されたアビジ
ンを使用する方法である(GB 2019408)。この
方法の感度はアジビンに付加することができる検
出用酵素の分子の数により限定される。 EP 27036は、プローブと酵素との接合体を使
用し、次にこの酵素が第1反応を行い、この反応
が第2反応系のための「モジユレーター」を生成
し又は除去する測定系を提案している。この場合
前記モジユレーターは第2反応系において触媒反
応を生じさせるが、この触媒反応中にモジユレー
ターの正味の消費は生じない。従つてこのもの
は、第1反応系と第2反応系との間の増幅因子を
提供する。このモジユレーターは酵素活性化物質
でも阻害物質でもよく、あるいは第2反応系のた
めの循環的に再生可能な基質であつてもよい。 増幅を達成するために第2反応系を用いる測定
系が同様にWO 81/00725に開示されており、こ
の方法は循環する基質に関連し、そしてEP
49606には同様の系が開示されており、この系に
おいては第2反応の速度を上昇せしめる「促進物
質」を第1反応が生成せしめる。 エンザイムリンクドイムノアツセイ系において
は、識標酵素がプローブに接合するのが一般的で
あり、このことは酵素で触媒される反応が生ずる
前に過剰の酵素を非常に効率的に除去しなければ
ならないことを意味し、そうしなければ誤つた陽
性の結果が得られる。このことは無視できない問
題点をもたらし、そして高いシグナル/ノイズ比
を得ることが困難である。 EP62277はリボヌクレアーゼAに基礎を置く酵
素の使用を開示している。リボヌクレアーゼAは
S−ペプチドと称される20残基ポリペプチドとS
−蛋白質と称される104残基ポリペプチドとに切
断することができる。S−ペプチドもS−蛋白質
も単独では酵素活性を有しないが、これらはリボ
ヌクレアーゼSと称される接合体を形成し、この
ものはリボヌクレアーゼ活性を有する。上記の開
示における提案は、分析対象の類似体をS−ペプ
チドにより標識し、こうすることによつて測定媒
体が標識された類似体と非標識分析対象とを含有
するようにする方法である。次に、分析対象分子
又は類似体分子のいずれかに付着することができ
る抗体が導入される。従つて、抗体との結合に対
して分析対象が類似体と競争し、そして次に非結
合類体分子上のS−ペプチドは添加されたS−蛋
白質と結合できるように開放されており、そして
酵素活性を発生せしめる。増加する濃度の分析対
象を添加することにより、触媒活性と分析対象の
濃度とを関連ずける排除曲線(displace−ment
curve)が構成され、そしてこの関係曲線を用い
て未知分析対象濃度を決定することが提案され
る。リボヌクレアーゼSの活性は典型的には分光
法又は螢光法により測定される。S−ペプチド/
S−蛋白質の組合わせを用いるこの方法は複雑で
且つ困難であり、そして原理的に、反応速度の差
の測定による分析対象の測定は感度、精度及び実
施の容易さに限界を強いるであろう。 〔発明が解決しようとする問題点及び問題点を解
決するための手段〕 この発明の1つの観点に従えば、第1の酵素の
酵素的に不活性な小断片を担持する測定成分を使
用すること、該酵素の酵素的に不活性な相補的蛋
白質断片を添加して、前記小断片に接合せしめそ
して活性な第1酵素を生成せしめること、及び該
酵素により触媒される反応を行つて検出可能な結
果を導くことを含んで成るサンプル媒体中の分析
対象の検出方法において、前記測定成分が前記分
析対象と結合する特異的認識プローブであり、前
記第1酵素が基質を第1生成物に転換する反応を
触媒し、該第1生成物がそれ自体として又は該第
1生成物により開始される追加の1反応もしくは
複数の1連の反応により生成する次の生成物とし
て第2酵素の必須成分であり、該必須成分によつ
て該第2酵素が完全なものとされそして検出可能
な結果を導く反応を触媒することを特徴とする方
法が提供される。 第1酵素の前記小断片は好ましくは全酵素蛋白
質の小ペプチド断片である。この小ペプチド断片
は結合条件に対して不活性であることができる
が、完全酵素は条件例えば極端な温度、PH、塩濃
度等により深刻な影響を受ける活性を有するかも
しれない。好ましくはこれはリボヌクレアーゼS
−ペプチドであり、そして相補断片はリボヌクレ
アーゼS−蛋白質である。次に、生成したリボヌ
クレアーゼS酵素は合成基質の前記第1生成物へ
の転換を適切に触媒する。合成基質は好ましく
は、式R−X(式中、Rはピリミジン3′−ホスフ
エート成分であり、そしてXは前記第1生成物を
生成する除去基であつてこのXは該3′−ホスフエ
ート基を介してRに連結している)で表わされる
ピリミジン3′−ホスホジエステル化合物である。
従つてRはCp又はUpとして表わすことができ、
ここでC=シチジン、U=ウリジン、そしてp=
ホスフエートであり、又はこれらのピリミジン類
似体であり、そして場合によつては例えば5′−ヒ
ドロキシ保護基により置換されている。 先行技術の提案に卓越するこの発明の利点は、
第2増幅によりもたらされる高い感度を保つて、
そして酵素断片(例えばS−ペプチド及びS−蛋
白質)の両者がバツクグラウンド「ノイズ」を生
じさせる酵素活性を有さずそのため特異的酵素活
性が結合したS−ペプチドにより形成される接合
体触媒のみから生じ、そして大酵素蛋白質断片の
過剰量を除去する必要がないという事実によりも
たらされる高いシグナル対ノイズ比を伴つて、分
析対象を酵素的に検出するための簡単で且つ直接
的な方法が提供されることである。 合成基質、例えばR−X〔これを「補欠分子族
生成物質」(prosthetogen)と称することができ
る〕は、それ自体新規であると考えられる。従つ
てこの発明は他の観点において、酵素により開裂
されて他の酵素の触媒活性のために必須な成分又
はその前駆体を生成する合成補欠分子族生成物質
を提供する。好ましくは、補欠分子族生成物質は
式R−X(式中Rはピリミジン3′−ホスフエート
であり、そしてXは該3′−ホスフエート基を介し
てRに連結している除去基であり、そしてそれか
ら酵素的に切断されて他の酵素の必須成分又はそ
の前駆体を生成することができる)で表わされる
ピリミジン3′−ホスホジエステル化合物である。 この発明の他の観点は、その濃度が検出される
べき分析対象の存在に関連する第1酵素が検出可
能な生成物を導く第1酵素反応を触媒するエンザ
イムリンクドイムノアツセイ法において、前記第
1酵素のための基質が合成化合物であつてこの化
合物は該第1酵素によつて開裂されて直接的に又
は1もしくは複数の追加の反応により他の酵素の
触媒活性のために必須の成分を生成し、該成分に
よつて該他の酵素が活性化されて検出可能な結果
を導く第2酵素反応を触媒することを特徴とする
方法に関する。 従つてこの発明はエンザイムリンクド検出系の
原理を用いるが、次の様にして多オーダーの感度
の増強が得られる。すなわち第1触媒を使用し、
この第1触媒が直接的又は間接的に補酵素又は補
欠分子族を生成せしめ、これらは他のそして異る
触媒中心の部分であり、触媒活性のために前記補
酵素又は補欠分子族に絶対的に依存する酵素を用
いる。従つて第1酵素反応は補酵素又は補欠分子
族を直接に生成することができ、あるいは例えば
酵素的に補酵素又は補欠分子族に転換される前駆
体を生成することができる。次に、直接的に又は
間接的に生成された補酵素又は補欠分子族は適当
なアポ酵素と一緒になりホロ酵素を生成し、検出
可能な結果、例えば色素の生成を導く第2反応系
を触媒する前記ホロ酵素を用いることによりその
量を測定することができる。 好ましい測定方法を次の反応方式1に示す。
応により検出する方法に関する。この発明特に、
限定的ではないが、ポリヌクレオチド分析対象に
適用することができる。 〔従来の技術〕 核酸ハイブリダイゼーシヨン測定は、ヒトの遺
伝的疾患の診断、及びそのキヤリヤーの検出のた
めに実際的な重要性が増加しつつある〔例えば、
バンブリーレポート(Banbury Repart)14、ヒ
ト疾患への組換DNAの適用、S.T.Caskey及びR.
L.White編、コールドスプリングハーバーラボラ
トリー、1983を参照のこと〕。これらの測定方法
はさらに、ウイルス及び細菌を含む病原生物の同
定のため、並びに細菌において抗生物質に対する
耐性を付与する遺伝子の同定のためにも価値があ
る。 一般に使用される方法は、安全性、コスト及び
限定された商品寿命の問題を伴う放射化学的標識
プローブを使用するプローブに付加された化学ル
ミネスセンス物質、螢光物質又は燐光物質を用い
る他の方法が提案されている(EP 70687)が、
これらの方法が測定のために典型的に用いられる
単一コピー遺伝子の10-18モルの存在を検出する
ために必要とされる感度を有するか否か疑わし
い。 他の方法は、プローブをビオチンに付着し、そ
して検出のために適当な酵素に連結されたアビジ
ンを使用する方法である(GB 2019408)。この
方法の感度はアジビンに付加することができる検
出用酵素の分子の数により限定される。 EP 27036は、プローブと酵素との接合体を使
用し、次にこの酵素が第1反応を行い、この反応
が第2反応系のための「モジユレーター」を生成
し又は除去する測定系を提案している。この場合
前記モジユレーターは第2反応系において触媒反
応を生じさせるが、この触媒反応中にモジユレー
ターの正味の消費は生じない。従つてこのもの
は、第1反応系と第2反応系との間の増幅因子を
提供する。このモジユレーターは酵素活性化物質
でも阻害物質でもよく、あるいは第2反応系のた
めの循環的に再生可能な基質であつてもよい。 増幅を達成するために第2反応系を用いる測定
系が同様にWO 81/00725に開示されており、こ
の方法は循環する基質に関連し、そしてEP
49606には同様の系が開示されており、この系に
おいては第2反応の速度を上昇せしめる「促進物
質」を第1反応が生成せしめる。 エンザイムリンクドイムノアツセイ系において
は、識標酵素がプローブに接合するのが一般的で
あり、このことは酵素で触媒される反応が生ずる
前に過剰の酵素を非常に効率的に除去しなければ
ならないことを意味し、そうしなければ誤つた陽
性の結果が得られる。このことは無視できない問
題点をもたらし、そして高いシグナル/ノイズ比
を得ることが困難である。 EP62277はリボヌクレアーゼAに基礎を置く酵
素の使用を開示している。リボヌクレアーゼAは
S−ペプチドと称される20残基ポリペプチドとS
−蛋白質と称される104残基ポリペプチドとに切
断することができる。S−ペプチドもS−蛋白質
も単独では酵素活性を有しないが、これらはリボ
ヌクレアーゼSと称される接合体を形成し、この
ものはリボヌクレアーゼ活性を有する。上記の開
示における提案は、分析対象の類似体をS−ペプ
チドにより標識し、こうすることによつて測定媒
体が標識された類似体と非標識分析対象とを含有
するようにする方法である。次に、分析対象分子
又は類似体分子のいずれかに付着することができ
る抗体が導入される。従つて、抗体との結合に対
して分析対象が類似体と競争し、そして次に非結
合類体分子上のS−ペプチドは添加されたS−蛋
白質と結合できるように開放されており、そして
酵素活性を発生せしめる。増加する濃度の分析対
象を添加することにより、触媒活性と分析対象の
濃度とを関連ずける排除曲線(displace−ment
curve)が構成され、そしてこの関係曲線を用い
て未知分析対象濃度を決定することが提案され
る。リボヌクレアーゼSの活性は典型的には分光
法又は螢光法により測定される。S−ペプチド/
S−蛋白質の組合わせを用いるこの方法は複雑で
且つ困難であり、そして原理的に、反応速度の差
の測定による分析対象の測定は感度、精度及び実
施の容易さに限界を強いるであろう。 〔発明が解決しようとする問題点及び問題点を解
決するための手段〕 この発明の1つの観点に従えば、第1の酵素の
酵素的に不活性な小断片を担持する測定成分を使
用すること、該酵素の酵素的に不活性な相補的蛋
白質断片を添加して、前記小断片に接合せしめそ
して活性な第1酵素を生成せしめること、及び該
酵素により触媒される反応を行つて検出可能な結
果を導くことを含んで成るサンプル媒体中の分析
対象の検出方法において、前記測定成分が前記分
析対象と結合する特異的認識プローブであり、前
記第1酵素が基質を第1生成物に転換する反応を
触媒し、該第1生成物がそれ自体として又は該第
1生成物により開始される追加の1反応もしくは
複数の1連の反応により生成する次の生成物とし
て第2酵素の必須成分であり、該必須成分によつ
て該第2酵素が完全なものとされそして検出可能
な結果を導く反応を触媒することを特徴とする方
法が提供される。 第1酵素の前記小断片は好ましくは全酵素蛋白
質の小ペプチド断片である。この小ペプチド断片
は結合条件に対して不活性であることができる
が、完全酵素は条件例えば極端な温度、PH、塩濃
度等により深刻な影響を受ける活性を有するかも
しれない。好ましくはこれはリボヌクレアーゼS
−ペプチドであり、そして相補断片はリボヌクレ
アーゼS−蛋白質である。次に、生成したリボヌ
クレアーゼS酵素は合成基質の前記第1生成物へ
の転換を適切に触媒する。合成基質は好ましく
は、式R−X(式中、Rはピリミジン3′−ホスフ
エート成分であり、そしてXは前記第1生成物を
生成する除去基であつてこのXは該3′−ホスフエ
ート基を介してRに連結している)で表わされる
ピリミジン3′−ホスホジエステル化合物である。
従つてRはCp又はUpとして表わすことができ、
ここでC=シチジン、U=ウリジン、そしてp=
ホスフエートであり、又はこれらのピリミジン類
似体であり、そして場合によつては例えば5′−ヒ
ドロキシ保護基により置換されている。 先行技術の提案に卓越するこの発明の利点は、
第2増幅によりもたらされる高い感度を保つて、
そして酵素断片(例えばS−ペプチド及びS−蛋
白質)の両者がバツクグラウンド「ノイズ」を生
じさせる酵素活性を有さずそのため特異的酵素活
性が結合したS−ペプチドにより形成される接合
体触媒のみから生じ、そして大酵素蛋白質断片の
過剰量を除去する必要がないという事実によりも
たらされる高いシグナル対ノイズ比を伴つて、分
析対象を酵素的に検出するための簡単で且つ直接
的な方法が提供されることである。 合成基質、例えばR−X〔これを「補欠分子族
生成物質」(prosthetogen)と称することができ
る〕は、それ自体新規であると考えられる。従つ
てこの発明は他の観点において、酵素により開裂
されて他の酵素の触媒活性のために必須な成分又
はその前駆体を生成する合成補欠分子族生成物質
を提供する。好ましくは、補欠分子族生成物質は
式R−X(式中Rはピリミジン3′−ホスフエート
であり、そしてXは該3′−ホスフエート基を介し
てRに連結している除去基であり、そしてそれか
ら酵素的に切断されて他の酵素の必須成分又はそ
の前駆体を生成することができる)で表わされる
ピリミジン3′−ホスホジエステル化合物である。 この発明の他の観点は、その濃度が検出される
べき分析対象の存在に関連する第1酵素が検出可
能な生成物を導く第1酵素反応を触媒するエンザ
イムリンクドイムノアツセイ法において、前記第
1酵素のための基質が合成化合物であつてこの化
合物は該第1酵素によつて開裂されて直接的に又
は1もしくは複数の追加の反応により他の酵素の
触媒活性のために必須の成分を生成し、該成分に
よつて該他の酵素が活性化されて検出可能な結果
を導く第2酵素反応を触媒することを特徴とする
方法に関する。 従つてこの発明はエンザイムリンクド検出系の
原理を用いるが、次の様にして多オーダーの感度
の増強が得られる。すなわち第1触媒を使用し、
この第1触媒が直接的又は間接的に補酵素又は補
欠分子族を生成せしめ、これらは他のそして異る
触媒中心の部分であり、触媒活性のために前記補
酵素又は補欠分子族に絶対的に依存する酵素を用
いる。従つて第1酵素反応は補酵素又は補欠分子
族を直接に生成することができ、あるいは例えば
酵素的に補酵素又は補欠分子族に転換される前駆
体を生成することができる。次に、直接的に又は
間接的に生成された補酵素又は補欠分子族は適当
なアポ酵素と一緒になりホロ酵素を生成し、検出
可能な結果、例えば色素の生成を導く第2反応系
を触媒する前記ホロ酵素を用いることによりその
量を測定することができる。 好ましい測定方法を次の反応方式1に示す。
【化】
すべての触媒は箱で囲んであり、そしてこれに
より触媒される反応がその下に矢印で示してあ
る。第1酵素はE0であり、そして検出活性ホロ
酵素はE2aX′である。 プローブを、ハイブリダイゼーシヨンを妨害し
ない態様において、好ましくはプローブの遊離端
の一方において、適当なスペーサー基により、例
えばヌクレイツク・アシド・リサーチ(Nucleic
Acid Research)、Vol11(1983)、659−669頁に
記載されている方法を用いて、成分A1に付加す
る。適切に厳重な(stringency)条件下でのハイ
ブリダイゼーシヨンに続き、A2の添加がプロー
ブに結合した酵素的活性種A1A2(反応方式1にお
いてE0と称する)をもたらす。これがこの発明
における認識段階である。この第1酵素E0が標
的DNAに固定された状態で補欠分子族基質R−
Xに触媒的に作用して補酵素又は補欠分子族前駆
体X−OHを放出し、次にこのX−OHが、必要
な場合には酵素E1により触媒される過程におい
て補酵素X′の活性形に転換された後、不活性酵
素E2iと一緒になり酵素的に活性な検出ホロ酵素
E2aX′をもたらす。幾つかの場合にはE0で触媒さ
れる反応が補酵素又は補欠分子族を直接生成し、
この場合酵素E1を用いる転換段階は省略される。
感度の増強は、原理的には、生成したX′のすべ
ての分子がE2aX′の活性分子を生じさせることが
できること、及び生成したE2aX′の分子の数がプ
ローブに結合したE0のそれを大きく上まねるこ
とから生ずる。この発明においてX′は酵素E2a
X′の触媒中心の部分であり、そして基質のアレ
ステリツクアクチベーターではない。このものは
触媒活性のために絶対的に必要であり、そして従
来技術の幾つかの提案の場合のように存在する酵
素反応のための単なる速度上昇例ではない。酵素
E2aX′は基質Sからの容易に検出される生成物P
の生成を触媒する。 この発明の例はA1断片及びA2断片としてそれ
ぞれS−ペプチド(Spep)及びS−蛋白質
(Spr)を使用し、これらはウシ膵臓リボヌクレ
アーゼ(EC3.1.27.5)をズブチリシン
(EC3.4.21.14)によつて蛋白質分解的に切断する
ことによつて得られる。酵素的に不活性なS−ペ
プチド及びS−蛋白質は非常に高い親和性をもつ
て結合して十分なリボヌクレアーゼS活性を有す
るリボヌクレアーゼSを生成することができるこ
とはよく知られている。 活性なハイブリダイズしたプローブ−A1−A2
複合体(ハイブリダイズしたプローブ−酵素E0)
は、CpX又はUpX〔ここで、Xは3′−ホスホジエ
ステル結合(p)を介してシチジン(C)又はウ
リジン(U)ヌクレオチドに連結しているであろ
う〕の形を有する補欠分子族生成基質R−Xに作
用する。「除去基」X−OHは補欠分子族又は補
酵素前駆体、例えばチアミン、リボフラビン、ピ
リドキサール又はピリドキシンである。 ウシ膵臓リボヌクレアーゼAが次の反応を触媒
することはよく知られている。 CpX→ シチジン2′,3′−サイクリツクホスフエート+
X−OH UpX→ ウリジン2′,3′−サイクリツクホスフエート+
X−OH ここで、X−OHは第一アルコールであければ
ならないが、リボヌクレアーゼで触媒される反応
における適切な除去基として機能するためにはそ
の構造に他の幾つかの制限が存在する。(概観の
ために、F.R.Richards及びH.W.Wyckoff、ザ・
エンチムス(The Enzymes)、Vol3、第3版、
1971、P.D.Boyer編、647−806頁を参照のこと〕。 前記反応方式において使用することができる種
種の成分の種類の幾つかの例を次の第1表に記載
する。
より触媒される反応がその下に矢印で示してあ
る。第1酵素はE0であり、そして検出活性ホロ
酵素はE2aX′である。 プローブを、ハイブリダイゼーシヨンを妨害し
ない態様において、好ましくはプローブの遊離端
の一方において、適当なスペーサー基により、例
えばヌクレイツク・アシド・リサーチ(Nucleic
Acid Research)、Vol11(1983)、659−669頁に
記載されている方法を用いて、成分A1に付加す
る。適切に厳重な(stringency)条件下でのハイ
ブリダイゼーシヨンに続き、A2の添加がプロー
ブに結合した酵素的活性種A1A2(反応方式1にお
いてE0と称する)をもたらす。これがこの発明
における認識段階である。この第1酵素E0が標
的DNAに固定された状態で補欠分子族基質R−
Xに触媒的に作用して補酵素又は補欠分子族前駆
体X−OHを放出し、次にこのX−OHが、必要
な場合には酵素E1により触媒される過程におい
て補酵素X′の活性形に転換された後、不活性酵
素E2iと一緒になり酵素的に活性な検出ホロ酵素
E2aX′をもたらす。幾つかの場合にはE0で触媒さ
れる反応が補酵素又は補欠分子族を直接生成し、
この場合酵素E1を用いる転換段階は省略される。
感度の増強は、原理的には、生成したX′のすべ
ての分子がE2aX′の活性分子を生じさせることが
できること、及び生成したE2aX′の分子の数がプ
ローブに結合したE0のそれを大きく上まねるこ
とから生ずる。この発明においてX′は酵素E2a
X′の触媒中心の部分であり、そして基質のアレ
ステリツクアクチベーターではない。このものは
触媒活性のために絶対的に必要であり、そして従
来技術の幾つかの提案の場合のように存在する酵
素反応のための単なる速度上昇例ではない。酵素
E2aX′は基質Sからの容易に検出される生成物P
の生成を触媒する。 この発明の例はA1断片及びA2断片としてそれ
ぞれS−ペプチド(Spep)及びS−蛋白質
(Spr)を使用し、これらはウシ膵臓リボヌクレ
アーゼ(EC3.1.27.5)をズブチリシン
(EC3.4.21.14)によつて蛋白質分解的に切断する
ことによつて得られる。酵素的に不活性なS−ペ
プチド及びS−蛋白質は非常に高い親和性をもつ
て結合して十分なリボヌクレアーゼS活性を有す
るリボヌクレアーゼSを生成することができるこ
とはよく知られている。 活性なハイブリダイズしたプローブ−A1−A2
複合体(ハイブリダイズしたプローブ−酵素E0)
は、CpX又はUpX〔ここで、Xは3′−ホスホジエ
ステル結合(p)を介してシチジン(C)又はウ
リジン(U)ヌクレオチドに連結しているであろ
う〕の形を有する補欠分子族生成基質R−Xに作
用する。「除去基」X−OHは補欠分子族又は補
酵素前駆体、例えばチアミン、リボフラビン、ピ
リドキサール又はピリドキシンである。 ウシ膵臓リボヌクレアーゼAが次の反応を触媒
することはよく知られている。 CpX→ シチジン2′,3′−サイクリツクホスフエート+
X−OH UpX→ ウリジン2′,3′−サイクリツクホスフエート+
X−OH ここで、X−OHは第一アルコールであければ
ならないが、リボヌクレアーゼで触媒される反応
における適切な除去基として機能するためにはそ
の構造に他の幾つかの制限が存在する。(概観の
ために、F.R.Richards及びH.W.Wyckoff、ザ・
エンチムス(The Enzymes)、Vol3、第3版、
1971、P.D.Boyer編、647−806頁を参照のこと〕。 前記反応方式において使用することができる種
種の成分の種類の幾つかの例を次の第1表に記載
する。
【表】
X′から酵素E2aX′を生成する適当なアポ酵素は
当業者にとつて自明であり、発色、螢光又はルミ
ネツセンスによるPの検出のための系も同様であ
る〔例えば、H.Harris及びD.A.Hopkinson,ハ
ンドブツク・オブ・エンチム・エレクトロフオー
レシス・イン・ヒユーマン・ゼネテイクス
(Handbook of Enzyme Electrophoresis in
Human Genetics)、1976、ノース・ホランド・
パブリツシング社(North−Holland
Publishing、Co.)を参照のこと〕。 次に、一層詳細な記載によりこの発明を説明す
る。但し、この記載によりこの発明の範囲を限定
するものではない。 A プローブ ポリヌクレオチド分析対象とハイブリダイズす
るために必要な塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドプローブは固相法、すなわちGait等(M.J.
Gait等、1982)により記載されたカイゼルグル
−ポリジメチルアクリルアミド支持体上でのホス
ホトリエステル法により合成することができる。 この検出系はまた、遺伝子プローブを用いる方
法以外の方法においても応用することができる。
すなわち、原理的には、この発明を用いて、現在
の非放射性法より高い感度で任意の抗原抗体反応
を監視することができる。 B プローブ−S−ペプチド誘導体の合成 S−ペプチドをプローブ分子に連結するために
常用の日常的方法を用いることができる。このよ
うな方法はEP62277に記載されている。同様に、
この開示はリボヌクレアーゼAのSpep−Sprズブ
チリシン切断生成物の変形、又はその類似体の使
用、そしてさらに他の切断され得る酵素に言及し
ている。この発明も同様にそのような変形を包含
する。 RNアーゼSの調製方法及びS−ペプチドとS
−蛋白質への分離が、それぞれDoscher(1969)、
並びにChavers及びScherage(1980)により記載
されている。 2官能試薬SPDP〔n−サクシニミジル3−(2
−ピリジルジチオ)プロピオネート〕とS−ペプ
チドとの反応が1モルのペプチドに対して1モル
の試薬を含有する誘導体をもたらす。N−末端リ
ジンのα−アミン基における置換が好ましい。こ
の残基はS−ペプチド−S−蛋白質の相互作用に
有意に寄与しないからである。
当業者にとつて自明であり、発色、螢光又はルミ
ネツセンスによるPの検出のための系も同様であ
る〔例えば、H.Harris及びD.A.Hopkinson,ハ
ンドブツク・オブ・エンチム・エレクトロフオー
レシス・イン・ヒユーマン・ゼネテイクス
(Handbook of Enzyme Electrophoresis in
Human Genetics)、1976、ノース・ホランド・
パブリツシング社(North−Holland
Publishing、Co.)を参照のこと〕。 次に、一層詳細な記載によりこの発明を説明す
る。但し、この記載によりこの発明の範囲を限定
するものではない。 A プローブ ポリヌクレオチド分析対象とハイブリダイズす
るために必要な塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドプローブは固相法、すなわちGait等(M.J.
Gait等、1982)により記載されたカイゼルグル
−ポリジメチルアクリルアミド支持体上でのホス
ホトリエステル法により合成することができる。 この検出系はまた、遺伝子プローブを用いる方
法以外の方法においても応用することができる。
すなわち、原理的には、この発明を用いて、現在
の非放射性法より高い感度で任意の抗原抗体反応
を監視することができる。 B プローブ−S−ペプチド誘導体の合成 S−ペプチドをプローブ分子に連結するために
常用の日常的方法を用いることができる。このよ
うな方法はEP62277に記載されている。同様に、
この開示はリボヌクレアーゼAのSpep−Sprズブ
チリシン切断生成物の変形、又はその類似体の使
用、そしてさらに他の切断され得る酵素に言及し
ている。この発明も同様にそのような変形を包含
する。 RNアーゼSの調製方法及びS−ペプチドとS
−蛋白質への分離が、それぞれDoscher(1969)、
並びにChavers及びScherage(1980)により記載
されている。 2官能試薬SPDP〔n−サクシニミジル3−(2
−ピリジルジチオ)プロピオネート〕とS−ペプ
チドとの反応が1モルのペプチドに対して1モル
の試薬を含有する誘導体をもたらす。N−末端リ
ジンのα−アミン基における置換が好ましい。こ
の残基はS−ペプチド−S−蛋白質の相互作用に
有意に寄与しないからである。
【化】
この誘導体()はチオール試薬に対して反応
性であり、そしてこれを用いて、Roychoudhury
等(1976)の方法により「G−テイル化」されそ
してCheng等(1983)の方法に従つてN−アセチ
ル−N′−(p−グリオキシルベンゾイル)システ
アミンと反応したオリゴヌクレオチドに連結する
ことができる。この反応式は次のように示され
る。
性であり、そしてこれを用いて、Roychoudhury
等(1976)の方法により「G−テイル化」されそ
してCheng等(1983)の方法に従つてN−アセチ
ル−N′−(p−グリオキシルベンゾイル)システ
アミンと反応したオリゴヌクレオチドに連結する
ことができる。この反応式は次のように示され
る。
【化】
プローブ中の配列に相補的な配列を含有する
DNAの存在を検出するための化合物()の使
用は次のように表わすことができる。
DNAの存在を検出するための化合物()の使
用は次のように表わすことができる。
【化】
上記の式においてジグザグ線はプローブの相補
配列及びDNA中の標的配列を示す。 反応(ii)は任意的なものということができるが、
しかし、S−ペプチド断片が比較的小さいβ−メ
ルカプトプロピオニル基のみを担持し、これは大
きなプローブ−DNA複合体に比べて酵素活性を
低下せしめることがないであろうという利点をも
たらす。この段階は、S−蛋白質−S−ペプチド
複合体が、DNAが固定されているマトリクスか
ら遊離されるという追加の利点をもたらす。 C プローブ−S−ペプチド誘導体のための酵素
的検出系 着色溶液又は支持マトリクス上のスポツトを支
える検出系が好ましい。このような検出系はこの
方法の適用を簡単化し、そして拡大するからであ
る。しかしながら、特殊な装置、例えばルミネセ
ンスモニター、螢光計又は分光光度計を用いるこ
とにより一層高い感度が達成される。 この系のための一般的な反応連鎖を次に示す。
配列及びDNA中の標的配列を示す。 反応(ii)は任意的なものということができるが、
しかし、S−ペプチド断片が比較的小さいβ−メ
ルカプトプロピオニル基のみを担持し、これは大
きなプローブ−DNA複合体に比べて酵素活性を
低下せしめることがないであろうという利点をも
たらす。この段階は、S−蛋白質−S−ペプチド
複合体が、DNAが固定されているマトリクスか
ら遊離されるという追加の利点をもたらす。 C プローブ−S−ペプチド誘導体のための酵素
的検出系 着色溶液又は支持マトリクス上のスポツトを支
える検出系が好ましい。このような検出系はこの
方法の適用を簡単化し、そして拡大するからであ
る。しかしながら、特殊な装置、例えばルミネセ
ンスモニター、螢光計又は分光光度計を用いるこ
とにより一層高い感度が達成される。 この系のための一般的な反応連鎖を次に示す。
【化】
上記の反応連鎖中の記号は次の意味を有する。
P−Spep :プローブ−S−ペプチド誘導体。
Spr :RNアーゼ由来のS−蛋白質。
S1C1
:除去基としての補酵素又は前駆体C′1を含有す
るRNアーゼのためのホスホジエステル基質。 修飾酵素
:Apo1と結合するために必要な補酵素の形を生
じさせる活性酵素。 Apo 1
:C1を補酵素とする酵素的に不活性なアポ酵素。 Holo 1
:Apo1と補酵素C1との結合によつて形成される
活性ホロ酵素。 S2 :着色生成物P*をもたらすHolo 1用基質。 酵素的に活性な成分が長方形で囲んであり、こ
れにより触媒される反応が点線矢印で示してあ
る。 S−ペプチド:S−蛋白質の相互作用 この系はS−ペプチドとS−蛋白質との強く且
つ特異的な結合を利用する。この相互作用は、解
離定数(Kdiss)を決定することができない程強
い親和性を有する。Richards及びVithayathil
(1956,a,b)によるKdissの上限は5×10-9M
であつた。RNアーゼSは、天然RNアーゼAの
活性〔タカハシ等(1969)〕に非常に類似した酵
素活性を示す。 以下の説明において、カツプリング補酵素C1
の種類及び最終検出系(S2→P*)について特定
の提案を行う。しかしながら、他のカツプリング
酵素及び他の可視化方法に基礎を置く多数の可能
な代替法が存在する。 カツプリング補酵素としてリボフラビンを使用す
る検出系 この場合、プローブ−S−ペプチド−S−蛋白
質複合体による酵素活性のための基質は次のタイ
プ()のものである。
:除去基としての補酵素又は前駆体C′1を含有す
るRNアーゼのためのホスホジエステル基質。 修飾酵素
:Apo1と結合するために必要な補酵素の形を生
じさせる活性酵素。 Apo 1
:C1を補酵素とする酵素的に不活性なアポ酵素。 Holo 1
:Apo1と補酵素C1との結合によつて形成される
活性ホロ酵素。 S2 :着色生成物P*をもたらすHolo 1用基質。 酵素的に活性な成分が長方形で囲んであり、こ
れにより触媒される反応が点線矢印で示してあ
る。 S−ペプチド:S−蛋白質の相互作用 この系はS−ペプチドとS−蛋白質との強く且
つ特異的な結合を利用する。この相互作用は、解
離定数(Kdiss)を決定することができない程強
い親和性を有する。Richards及びVithayathil
(1956,a,b)によるKdissの上限は5×10-9M
であつた。RNアーゼSは、天然RNアーゼAの
活性〔タカハシ等(1969)〕に非常に類似した酵
素活性を示す。 以下の説明において、カツプリング補酵素C1
の種類及び最終検出系(S2→P*)について特定
の提案を行う。しかしながら、他のカツプリング
酵素及び他の可視化方法に基礎を置く多数の可能
な代替法が存在する。 カツプリング補酵素としてリボフラビンを使用す
る検出系 この場合、プローブ−S−ペプチド−S−蛋白
質複合体による酵素活性のための基質は次のタイ
プ()のものである。
【化】
この反応式中、Cはシトシン(又は他のピリジ
ン塩基)である。 基質()(Cpリボフラビン)の合成 基質Cpリボフラビンは、リボフラビンのリビ
チル側鎖の末端ヒドロキシル残基に3′ホスフエー
トを介して連結されたシチジンから成る基質
()を合成するために、リボヌクレアーゼA作
用の第1段階の可逆性を利用して調製することが
できる。
ン塩基)である。 基質()(Cpリボフラビン)の合成 基質Cpリボフラビンは、リボフラビンのリビ
チル側鎖の末端ヒドロキシル残基に3′ホスフエー
トを介して連結されたシチジンから成る基質
()を合成するために、リボヌクレアーゼA作
用の第1段階の可逆性を利用して調製することが
できる。
【化】
RNアーゼAの高い加水分解活性のため、反応
を水溶液中で行えば、基質の少収量のみが予想さ
れる。従つて、反応を50%ホルムアミド中−20℃
において、アタツキング基として可能な最高濃度
の親核成分として必要な第1アルコール基を有す
るリボフラビンを用いて行つた。 実 験 Cpリボフラビンの酵素的製造 全容量1130mlの50v/v%ホルムアミド/緩衝
液(PH6.50)中600mgのシチジン2′,3′−サイクリ
ツクホスフエート、1gのリボフラビン及び1
mg/mlのリボヌクレアーゼAを用いて−20℃にて
反応を行つた。 (この反応は、リボフラビンのルミフラビンへ
の分解を回避するため、反応混合物に光を当てず
且つ酸性側に維持しなければならない。) 反応の進行を薄層クロマトグラフイーを用いて
監視した。アリコート(100μl)を規則的な間隔
(5日)で取り出し、そしてWhatman PLK Sf
シリカゲルプレート上で、標準(5μg)、すなわ
ちリボフラビン、シチジン2′,3′−サイクリツク
ホスフエート及びシチジンアデノシンホスホジエ
ステル(CpA)に対してクロマトグラフした
(第1図)。 H2O(40):ピリジン(10):氷酢酸(1);PH
5.80から成る溶剤を使用した。 生成物はインキユベーシヨンの11日後にRf値
0.87を有するスポツトとしてクロマトグラフ上に
現われ始めた。このRfに対してリボフラビンの
Rfは0.79、シチジン2′,3′−サイクリツクホスフ
エートのRfは0.95、そしてCpAのRfは0.89であつ
た。31日後クロマトグラム上でRf0.87のスポツト
が優勢になつた時に反応を停止した。 反応の停止 この時間で反応混合物中のリボヌクレアーゼを
不活性化することが必要であつた。生成物を水性
環境中で酵素に暴露すればそれがシチジン3′−ホ
スフエートとリボフラビンに分解するからであ
る。 従つてインキユベート混合物をPH5.40にてフエ
ノール抽出することによりリボヌクレアーゼを除
去した。 インキユベート混合物をフエノールで3回抽出
し、そして一緒にした水相をクロロホルムで1回
抽出した。この方法は、反応混合物中に存在する
多量のホルムアミドの除去を促進するという追加
の利点を有していた。 一緒にした水相の容量をロータリーエバポレー
ターにより55℃にて減少せしめ、この後シリカゲ
ルカラム上で生成物を未反応のリボフラビン及び
シチジン2′,3′−サイクリツクホスフエートから
分離した。 未反応成分からの生成物の分離(フラツシユ
クロマトグラフイー) 未反応のリボフラビン及びシチジン2′,3′−サ
イクリツクホスフエートからの生成物の分離を、
中圧クロマトグラフイー(Still等、1978)を用い
て行つた。 段階からのフエノール抽出及びクロロホルム
抽出されたアリコート(10ml)をシリカゲル(メ
ルクシリカゲル60)のカラムに適用し、そして
H2O(40):ピリジン(10):氷酢酸(1)を用い
て酸素不含窒素の陽圧151bs/in2(1.05Kg/cm2)
のもとで溶出した(第2図)。 画分をプールし、そして前記の薄層クロマトグ
ラフイーにより測定した(第3図)。 画分A(第2図、及び第3図中のトラツク4)
を、最終容量1mlの0.1Mエチレンジアミン緩衝
液(PH6.50)中2mgのリボフラミンを含有する混
合物中、室温にて2時間、リボヌクレアーゼの基
質として試験した。得られたクロマトグラムは
Rf0.87のスポツトがRf0.79(リボフラビン)のス
ポツトとRf0.96(シチジン,3′−ホスフエート)
のスポツトの2つに分かれたことを示し、生成物
がRNアーゼによりその構成成分に加水分解され
たことが示された(第4図)。 画分A(第2図)をプールし、そしてロータリ
ーエバポレーターで55℃にて処理し固形物を得
た。しかしながら、フエノール抽出において除去
されずそして中圧クロマトグラフイーにおいて移
動相と共に移動したホルムアミドの残留物が残つ
た。 第1反応 補酵素の所望の活性形FMNは、容易に調製す
ることができる酵素であるリボフラビンキナーゼ
(フラボキナーゼ:EC2.7.1.26)の作用により生
ずる。 補酵素としてFMNを用いる検出酵素には多く
の候補があり、これにはグリコレートオキシダー
ゼ(EC1.1.3.1Schuman及びMassey(1971)〕〔こ
れから、1MKBrに対する透析によりFMNを除
去することができる;Massey及びCurti
(1966)〕;L−ヒドロキシ酸オキシダーゼ
〔EC1.1.3.15、ナカノ等(1968)〕;並びにゾロチ
カム(Zoroticum)由来のオロテートレダクター
ゼ〔EC1.3.1.14,Swell等(1960)〕が含まれる
が、特に好ましいものは肺炎球菌L−ラクテート
オキシダーゼ〔EC1.13.12.4、ウダカ等(1959)〕
である。 この酵素は次の反応(i): ラクテート+O2→アセテート+CO2+H2O (i) を触媒し、この反応は測定のためには不便であ
る。しかしながら、カタラーゼの存在下で、この
反応は次のようになる〔ウダカ等(1959)〕。 ラクテート+1/2O2→ピルベート+H2O (ii) 従つて、酵素反応は次のようになる。 ラクテート+O2→ピルベート+H2O2 (iii) このことは、この反応と、H2O2を検出するた
めの迅速且つ鋭敏な方法の1つ、例えばホースラ
デイツシユ・パーオキシダーゼ〔Kas及びCerna
(1980)〕により触媒される色原体基質である5−
アミノサリチル酸又はジアニシジンとの反応とを
カツプリングさせる機会を示している。 他の方法は、FMNの生成をフラボドキシンの
発生とカツプリングさせる方法である。アポフラ
ボドキシンはFMN又はFADのためのよく記載さ
れている検出手段であり、この系においてはアポ
蛋白質と組合わされたフラビンヌクレオチドの螢
光の変化の程度が未知溶液中のヌクレオチドの量
を決定するために使用される〔Mayhew及び
Wassink(1980):a及びb〕。しかしながら、こ
の発明の目的のために螢光法は感度が十分でな
く、従つてエンザイムリンクドアツセイ、例えば
精製されたリダクターゼにより触媒される
NADHによるチトクロームCのフラボドキシン
介在還元を使用することができる。 上記の補酵素カツプリング測定のためにFMN
と組合わされた酵素が提案されるが、使用し得る
酵素の範囲を補酵素としてFADを使用する酵素
にまで拡張することができる。これはFMNアデ
ニルトランスフエラーゼにより触媒される追加の
反応を含むであろう〔Gibson等(1955)、並びに
Schrecke及びKornberg(1950)〕。 FMN+ATPFAD+PP (iv) ここで、FMNはフラボキナーゼ反応により生
じたものである。 例えばこれはD−アミノ酸オキシダーゼをカツ
プリング酵素として使用することを可能にするで
あろう。このオキシダーゼからのアポ酵素は
KBr透析法〔Massey及びCurit(1966)〕により容
易に調製され、そして−20℃において少なくとも
数ケ月間安定である。パーオキシダーゼにより触
媒される反応とのカツプリングによるD−アミノ
酸オキシダーゼの測定はよく記載されており、そ
して酵素の色原体的可視化の機会を提供する〔ツ
ゲ及びナカニシ(1980)〕。 他のFAD酵素、例えばグルコースオキシダー
ゼ、L−アミノ酸オキシダーゼ及びキサンチンオ
キシダーゼを同様にして使用することができる
〔ツゲ及びナカニシ(1980)〕。どの系が最も好都
合であるかはまだ確立されていないが、これらの
酵素のそれぞれは容易に入手することができ、そ
してこれを処理して安定なアポ酵素を得ることが
できる。 カツプリング補酵素としてピリドキサールホスフ
エートを使用する検出系 アスパルテートアミノトランスフエラーゼ
(EC2.6.1.1)はα.オキソグルタレート(αOG)と
(S)−アスパルテート(Asp)との反応を触媒し
てオキサロ酢酸(OAA)及び(S)−グルタメー
ト(Glu)を生成せしめる。この酵素は補酵素と
してピリドキサールホスフエートを含有し、そし
てホロ酵素は容易且つ可逆的に遊離補酵素とアポ
酵素とに分かれる〔Martinez−Carrion等
(1970)〕。のホロ酵素のための鋭敏な測定法(ナ
ノモル濃度)がRaj(1982)により記載されてお
り、この方法は、グルタメートデヒドロゲナーゼ
により触媒される反応と連係された着色され還元
されたネオテトラゾリウム誘導体INT*の形成に
基礎を置いている。 ホロ1としてアスパルテートアミノトランスフ
エラーゼを用いるプローブ−S−ペプチド検出の
ための方法は次のように示される。
を水溶液中で行えば、基質の少収量のみが予想さ
れる。従つて、反応を50%ホルムアミド中−20℃
において、アタツキング基として可能な最高濃度
の親核成分として必要な第1アルコール基を有す
るリボフラビンを用いて行つた。 実 験 Cpリボフラビンの酵素的製造 全容量1130mlの50v/v%ホルムアミド/緩衝
液(PH6.50)中600mgのシチジン2′,3′−サイクリ
ツクホスフエート、1gのリボフラビン及び1
mg/mlのリボヌクレアーゼAを用いて−20℃にて
反応を行つた。 (この反応は、リボフラビンのルミフラビンへ
の分解を回避するため、反応混合物に光を当てず
且つ酸性側に維持しなければならない。) 反応の進行を薄層クロマトグラフイーを用いて
監視した。アリコート(100μl)を規則的な間隔
(5日)で取り出し、そしてWhatman PLK Sf
シリカゲルプレート上で、標準(5μg)、すなわ
ちリボフラビン、シチジン2′,3′−サイクリツク
ホスフエート及びシチジンアデノシンホスホジエ
ステル(CpA)に対してクロマトグラフした
(第1図)。 H2O(40):ピリジン(10):氷酢酸(1);PH
5.80から成る溶剤を使用した。 生成物はインキユベーシヨンの11日後にRf値
0.87を有するスポツトとしてクロマトグラフ上に
現われ始めた。このRfに対してリボフラビンの
Rfは0.79、シチジン2′,3′−サイクリツクホスフ
エートのRfは0.95、そしてCpAのRfは0.89であつ
た。31日後クロマトグラム上でRf0.87のスポツト
が優勢になつた時に反応を停止した。 反応の停止 この時間で反応混合物中のリボヌクレアーゼを
不活性化することが必要であつた。生成物を水性
環境中で酵素に暴露すればそれがシチジン3′−ホ
スフエートとリボフラビンに分解するからであ
る。 従つてインキユベート混合物をPH5.40にてフエ
ノール抽出することによりリボヌクレアーゼを除
去した。 インキユベート混合物をフエノールで3回抽出
し、そして一緒にした水相をクロロホルムで1回
抽出した。この方法は、反応混合物中に存在する
多量のホルムアミドの除去を促進するという追加
の利点を有していた。 一緒にした水相の容量をロータリーエバポレー
ターにより55℃にて減少せしめ、この後シリカゲ
ルカラム上で生成物を未反応のリボフラビン及び
シチジン2′,3′−サイクリツクホスフエートから
分離した。 未反応成分からの生成物の分離(フラツシユ
クロマトグラフイー) 未反応のリボフラビン及びシチジン2′,3′−サ
イクリツクホスフエートからの生成物の分離を、
中圧クロマトグラフイー(Still等、1978)を用い
て行つた。 段階からのフエノール抽出及びクロロホルム
抽出されたアリコート(10ml)をシリカゲル(メ
ルクシリカゲル60)のカラムに適用し、そして
H2O(40):ピリジン(10):氷酢酸(1)を用い
て酸素不含窒素の陽圧151bs/in2(1.05Kg/cm2)
のもとで溶出した(第2図)。 画分をプールし、そして前記の薄層クロマトグ
ラフイーにより測定した(第3図)。 画分A(第2図、及び第3図中のトラツク4)
を、最終容量1mlの0.1Mエチレンジアミン緩衝
液(PH6.50)中2mgのリボフラミンを含有する混
合物中、室温にて2時間、リボヌクレアーゼの基
質として試験した。得られたクロマトグラムは
Rf0.87のスポツトがRf0.79(リボフラビン)のス
ポツトとRf0.96(シチジン,3′−ホスフエート)
のスポツトの2つに分かれたことを示し、生成物
がRNアーゼによりその構成成分に加水分解され
たことが示された(第4図)。 画分A(第2図)をプールし、そしてロータリ
ーエバポレーターで55℃にて処理し固形物を得
た。しかしながら、フエノール抽出において除去
されずそして中圧クロマトグラフイーにおいて移
動相と共に移動したホルムアミドの残留物が残つ
た。 第1反応 補酵素の所望の活性形FMNは、容易に調製す
ることができる酵素であるリボフラビンキナーゼ
(フラボキナーゼ:EC2.7.1.26)の作用により生
ずる。 補酵素としてFMNを用いる検出酵素には多く
の候補があり、これにはグリコレートオキシダー
ゼ(EC1.1.3.1Schuman及びMassey(1971)〕〔こ
れから、1MKBrに対する透析によりFMNを除
去することができる;Massey及びCurti
(1966)〕;L−ヒドロキシ酸オキシダーゼ
〔EC1.1.3.15、ナカノ等(1968)〕;並びにゾロチ
カム(Zoroticum)由来のオロテートレダクター
ゼ〔EC1.3.1.14,Swell等(1960)〕が含まれる
が、特に好ましいものは肺炎球菌L−ラクテート
オキシダーゼ〔EC1.13.12.4、ウダカ等(1959)〕
である。 この酵素は次の反応(i): ラクテート+O2→アセテート+CO2+H2O (i) を触媒し、この反応は測定のためには不便であ
る。しかしながら、カタラーゼの存在下で、この
反応は次のようになる〔ウダカ等(1959)〕。 ラクテート+1/2O2→ピルベート+H2O (ii) 従つて、酵素反応は次のようになる。 ラクテート+O2→ピルベート+H2O2 (iii) このことは、この反応と、H2O2を検出するた
めの迅速且つ鋭敏な方法の1つ、例えばホースラ
デイツシユ・パーオキシダーゼ〔Kas及びCerna
(1980)〕により触媒される色原体基質である5−
アミノサリチル酸又はジアニシジンとの反応とを
カツプリングさせる機会を示している。 他の方法は、FMNの生成をフラボドキシンの
発生とカツプリングさせる方法である。アポフラ
ボドキシンはFMN又はFADのためのよく記載さ
れている検出手段であり、この系においてはアポ
蛋白質と組合わされたフラビンヌクレオチドの螢
光の変化の程度が未知溶液中のヌクレオチドの量
を決定するために使用される〔Mayhew及び
Wassink(1980):a及びb〕。しかしながら、こ
の発明の目的のために螢光法は感度が十分でな
く、従つてエンザイムリンクドアツセイ、例えば
精製されたリダクターゼにより触媒される
NADHによるチトクロームCのフラボドキシン
介在還元を使用することができる。 上記の補酵素カツプリング測定のためにFMN
と組合わされた酵素が提案されるが、使用し得る
酵素の範囲を補酵素としてFADを使用する酵素
にまで拡張することができる。これはFMNアデ
ニルトランスフエラーゼにより触媒される追加の
反応を含むであろう〔Gibson等(1955)、並びに
Schrecke及びKornberg(1950)〕。 FMN+ATPFAD+PP (iv) ここで、FMNはフラボキナーゼ反応により生
じたものである。 例えばこれはD−アミノ酸オキシダーゼをカツ
プリング酵素として使用することを可能にするで
あろう。このオキシダーゼからのアポ酵素は
KBr透析法〔Massey及びCurit(1966)〕により容
易に調製され、そして−20℃において少なくとも
数ケ月間安定である。パーオキシダーゼにより触
媒される反応とのカツプリングによるD−アミノ
酸オキシダーゼの測定はよく記載されており、そ
して酵素の色原体的可視化の機会を提供する〔ツ
ゲ及びナカニシ(1980)〕。 他のFAD酵素、例えばグルコースオキシダー
ゼ、L−アミノ酸オキシダーゼ及びキサンチンオ
キシダーゼを同様にして使用することができる
〔ツゲ及びナカニシ(1980)〕。どの系が最も好都
合であるかはまだ確立されていないが、これらの
酵素のそれぞれは容易に入手することができ、そ
してこれを処理して安定なアポ酵素を得ることが
できる。 カツプリング補酵素としてピリドキサールホスフ
エートを使用する検出系 アスパルテートアミノトランスフエラーゼ
(EC2.6.1.1)はα.オキソグルタレート(αOG)と
(S)−アスパルテート(Asp)との反応を触媒し
てオキサロ酢酸(OAA)及び(S)−グルタメー
ト(Glu)を生成せしめる。この酵素は補酵素と
してピリドキサールホスフエートを含有し、そし
てホロ酵素は容易且つ可逆的に遊離補酵素とアポ
酵素とに分かれる〔Martinez−Carrion等
(1970)〕。のホロ酵素のための鋭敏な測定法(ナ
ノモル濃度)がRaj(1982)により記載されてお
り、この方法は、グルタメートデヒドロゲナーゼ
により触媒される反応と連係された着色され還元
されたネオテトラゾリウム誘導体INT*の形成に
基礎を置いている。 ホロ1としてアスパルテートアミノトランスフ
エラーゼを用いるプローブ−S−ペプチド検出の
ための方法は次のように示される。
【化】
ここでS1C1はC1成分としてピリドキサール
(Py)、ピリドキサミン又はピリドキサールを有
するシチジン3′−ホスホジエステルである。 生成物の1つとしてピリドキサールをもたらす
RNアーゼのための可能な基質(S1C1)は次のよ
うに加水分解される化合物()である。
(Py)、ピリドキサミン又はピリドキサールを有
するシチジン3′−ホスホジエステルである。 生成物の1つとしてピリドキサールをもたらす
RNアーゼのための可能な基質(S1C1)は次のよ
うに加水分解される化合物()である。
【化】
化合物はCpベンジルについて発表されてい
る方法〔Bernard及びWitzel(1961)〕と同様にし
て合成することができる。上記の反応によつて生
成した水和物(ヒドレート)として示されている
ピリドキサールは、ピリドキサールキナーゼ
(EC2.7.1.35)により触媒される反応において、
必要なピリドキサールホスフエートに転換され
る。 他の可能な基質には次の化合物()〜()
が含まれる。
る方法〔Bernard及びWitzel(1961)〕と同様にし
て合成することができる。上記の反応によつて生
成した水和物(ヒドレート)として示されている
ピリドキサールは、ピリドキサールキナーゼ
(EC2.7.1.35)により触媒される反応において、
必要なピリドキサールホスフエートに転換され
る。 他の可能な基質には次の化合物()〜()
が含まれる。
【式】
【式】
【式】
上記の式中Cpはシチジン3′−ホスホリル−で
あり、そしてRはH−又は−O−P(OH)2のい
ずれかである。 化合物()はRNアーゼSによる加水分解の
後ピリドキソールを生成し、この物質は、キナー
ゼで触媒される反応の前に追加の段階として測定
系中でピリドキソールオキシダーゼ(EC1.4.3.5)
を用いてピリドキサールに転換される。化合物
()の燐酸化形である化合物()をRNアー
ゼSの基質として使用する場合、オキシダーゼの
作用によりピリドキサールホスフエートが直接生
成するであろう。化合物()(シチジン3′−ホ
スホリル基がピリドキサールのフエノール性酸素
においてホスホジエステル連結されている)は、
RNアーゼで触媒される加水分解のもとで直接ピ
リドキサールホスフエートを生成するであろう。
しかしながら、除去基の酸素原子上の大きな置換
基は酵素的特異性の点から許容されないことが知
られるから、この基質は好ましくない。 化合物()及び()は、ホルムアミド/
水、又は他の非プロトン性溶剤/水混合物中で縮
合反応を触媒するためにRNアーゼを使用するこ
とにより酵素的に製造することができる
〔Findley、Mathias及びRabin(1962)〕。化合物
()及び()と同様に、化合物()を合成
するために、適切に保護された反応体と共にホス
ホトリエステル法を用いる化学合成法を使用する
ことができる。 アポ酵素であるアポグルタミン酸−アスパラギ
ン酸トランスフエラーゼ(Apo1)の調製法はす
でに記載されており〔Martinez−Carrion
(1970)、Arrio−Dupont M.(1972)〕、そして次
の段階、すなわちまずピリドキサールホスフエー
トを親和性の低いピリドキサミンホスフエートで
置換し、そして次にゲルクロマトグラフイーによ
り後者を除去することにより最もうまく行われ
る。補酵素は長基間安定である。良好なシグナル
対ノイズ比のためにはピリドキサールホスフエー
トのすべてを除去することが必要であるが、これ
はケト酸で処理しそして次にNaBH4で処理する
阻害段階により保証される。この段階はアポ酵素
標品中のすべての残留酵素活性を不活性化する。 ピリドキサールホスフエートとアポ酵素とから
のホロトランスアミナーゼの基構成はM.Arrio−
Dupont(1972)により報告に記載されている。典
型的には、0.1μM又はこれより高い濃度のアポト
ランスフエラーゼを使用する。この濃度は、この
系において生成するある低濃度のピリドキサール
ホスフエートを実質上化学量論的にホロトランス
アミナーゼを転換するのを保証するのに十分であ
る。 2重補酵素カツプリングを用いる2重増幅系 理論的には、必要なだけの感度を有する測定系
を構成するために「カスケード」を形成すること
ができることが明らかである。 次に、潜在的に非常に鋭敏な系を記載する。こ
の2重増幅は次のようにして生ずる。第1触媒が
補酵素(最終的にはFADとなる)を開放し、こ
れがアポオキシダーゼと一緒になつて第2補酵素
ピリドキサールホスフエートを生成せしめ、今度
はこれが第2アポ酵素を活性化する。
あり、そしてRはH−又は−O−P(OH)2のい
ずれかである。 化合物()はRNアーゼSによる加水分解の
後ピリドキソールを生成し、この物質は、キナー
ゼで触媒される反応の前に追加の段階として測定
系中でピリドキソールオキシダーゼ(EC1.4.3.5)
を用いてピリドキサールに転換される。化合物
()の燐酸化形である化合物()をRNアー
ゼSの基質として使用する場合、オキシダーゼの
作用によりピリドキサールホスフエートが直接生
成するであろう。化合物()(シチジン3′−ホ
スホリル基がピリドキサールのフエノール性酸素
においてホスホジエステル連結されている)は、
RNアーゼで触媒される加水分解のもとで直接ピ
リドキサールホスフエートを生成するであろう。
しかしながら、除去基の酸素原子上の大きな置換
基は酵素的特異性の点から許容されないことが知
られるから、この基質は好ましくない。 化合物()及び()は、ホルムアミド/
水、又は他の非プロトン性溶剤/水混合物中で縮
合反応を触媒するためにRNアーゼを使用するこ
とにより酵素的に製造することができる
〔Findley、Mathias及びRabin(1962)〕。化合物
()及び()と同様に、化合物()を合成
するために、適切に保護された反応体と共にホス
ホトリエステル法を用いる化学合成法を使用する
ことができる。 アポ酵素であるアポグルタミン酸−アスパラギ
ン酸トランスフエラーゼ(Apo1)の調製法はす
でに記載されており〔Martinez−Carrion
(1970)、Arrio−Dupont M.(1972)〕、そして次
の段階、すなわちまずピリドキサールホスフエー
トを親和性の低いピリドキサミンホスフエートで
置換し、そして次にゲルクロマトグラフイーによ
り後者を除去することにより最もうまく行われ
る。補酵素は長基間安定である。良好なシグナル
対ノイズ比のためにはピリドキサールホスフエー
トのすべてを除去することが必要であるが、これ
はケト酸で処理しそして次にNaBH4で処理する
阻害段階により保証される。この段階はアポ酵素
標品中のすべての残留酵素活性を不活性化する。 ピリドキサールホスフエートとアポ酵素とから
のホロトランスアミナーゼの基構成はM.Arrio−
Dupont(1972)により報告に記載されている。典
型的には、0.1μM又はこれより高い濃度のアポト
ランスフエラーゼを使用する。この濃度は、この
系において生成するある低濃度のピリドキサール
ホスフエートを実質上化学量論的にホロトランス
アミナーゼを転換するのを保証するのに十分であ
る。 2重補酵素カツプリングを用いる2重増幅系 理論的には、必要なだけの感度を有する測定系
を構成するために「カスケード」を形成すること
ができることが明らかである。 次に、潜在的に非常に鋭敏な系を記載する。こ
の2重増幅は次のようにして生ずる。第1触媒が
補酵素(最終的にはFADとなる)を開放し、こ
れがアポオキシダーゼと一緒になつて第2補酵素
ピリドキサールホスフエートを生成せしめ、今度
はこれが第2アポ酵素を活性化する。
【化】
プローブ−酵素切断
前記のように、この発明の1つの観点は第1酵
素反応を行うのに先立つて、検出系から第1酵素
(反応方式1におけるE0)を取り出す可能性に存
在する。このことは、第1反応、感度増強及び検
出をポリヌクレオチド分析対象及びオリゴヌクレ
オチドプローブを含有しない溶液中で行うことが
できるという利点を有する。プローブ−酵素断片
の結合のこの切断は、大酵素断片との接合によつ
て酵素を完成する前に行うことができ、あるいは
接合の後であつて基質を添加する前に行うことが
できる。例えば、分析対象がポリヌクレオチドで
あり、プローブが該分析対象とハイブリダイズし
得るオリゴヌクレオチドであり、そして小酵素断
片がジスルフイド結合を介して該オリゴヌクレオ
チド連結しているS−ペプチドである場合、この
結合は常用の環元剤、例えばジチオスレイトール
又はβ−メルカプトエタノールを用いて切断しS
−ペプチドを再度遊離せしめることができる。す
なわち、Spep−プローブをサンプルに添加し、
そして未結合Spep−プローブを洗浄により除去
する。次にS−ペプチドをプローブから切断し、
そして過剰のS−蛋白質と反応せしめることによ
り酵素接合体を形成することができる。あるい
は、S−蛋白質をSpep−プローブに添加し、次
にプローブから接合体を切断することができる。
特定の例として次のものを挙げることができる。
(i)分析対象を支持体、例えば重合性又は吸着性固
体に固定化し;(ii)固定化された分析対象を溶液中
で過剰のSpep−プローブと反応せしめ;(iii)結合
した分析対象−Spep−プローブ複合体を伴う前
記支持体を溶液から取り出し、そして洗浄して未
結合Spep−プローブを除去し;(iv)該支持体を切
断剤の溶液に浸漬し、この切断剤が支持体から
Spepを切断してこれを溶液中に移行させ、;(v)S
−蛋白質を溶液に加えて酵素接合体を生成せし
め、そして酵素反応を行つて検出可能な結果を発
生せしめる。段階(v)においては、S−蛋白質と共
にすべての他の試薬を一度に溶液に添加して測定
反応を完了することができよう。上記に代る方法
として、S−ペプチドをまず支持体上に固定化
し、次の切断段階により分析対象及びプローブを
除去し、支持体上のS−ペプチドとS−蛋白質と
を接合せしめる。この方法においては、第1酵素
反応、及びおそらくそれに続く反応を支持体上で
行うことができ、この方法は反応の検出可能な結
果を同定するために一層容易でありそして一層鋭
敏であろう。 第1酵素によつて触媒される反応に先立つてプ
ローブから第1酵素を分離することは、プローブ
及び分析対象が酵素の活性を妨害しない点におい
て有利である。同様に、小酵素断片(Spep)を
大断片(Spr)との接合の前にプローブから切断
することにより、プローブ又は分析対象が接合を
妨害するのが防止される。 補欠分子族生成物質 合成補欠分子族生成物質の概念は、上記の特定
の例における場合より一層一般的に適用すること
ができる。例えば、GB2019408に記載されてい
るように、例えばビオチン−アビジン連結によつ
てプローブに間接的に連結された第1酵素として
リボヌクレアーゼ(RNアーゼ)を使用すること
ができる。次にこのRNアーゼが前記の新規な合
成補欠分子族生成物質R−X基質に作用して補酵
素前駆体をもたらし、そして第2酵素反応を介し
て最終的に検出可能な結果を導くことができる。 さらに、補欠分子族生成物質反応のための第1
酵素がRNアーゼである必要はない。第2反応の
ための適当な補酵素又は補欠分子族を用いて出発
する場合、第1反応として合成出発物質(新規な
補欠分子族生成物質)の酵素触媒的切断を含む反
応方式を確立することができる。例えば、補欠分
子族生成物質がアシル化された補酵素であり、そ
して第1酵素が該補酵素からアシル基を切断する
エステラーゼであつてもよい。もしエステラーゼ
が不活性なペプチド断片と蛋白質断片とに切断さ
れ得るものであれば、RNアーゼSpep/Sprにつ
いて前記したのと同様にしてそれを使用すること
ができる。エステラーゼがこのように切断され得
ないのであれば、これを全体として、例えば直接
に、又はビオチン/アビジンにより、しかし好ま
しくはRNアーゼSpep/Sprにより、プローブに
連結することができる。この最後の方法において
は、Spepが前記のようにしてプローブに連結さ
れ、そしてSprが酵素に連結される。蛋白質を連
結するための一般的方法当業界においてよく知ら
れており、これを用いてSpr断片と酵素とを連結
することができる。S−蛋白質が他の蛋白質の担
体として機能するこの方法は次のように表示する
ことができる。
素反応を行うのに先立つて、検出系から第1酵素
(反応方式1におけるE0)を取り出す可能性に存
在する。このことは、第1反応、感度増強及び検
出をポリヌクレオチド分析対象及びオリゴヌクレ
オチドプローブを含有しない溶液中で行うことが
できるという利点を有する。プローブ−酵素断片
の結合のこの切断は、大酵素断片との接合によつ
て酵素を完成する前に行うことができ、あるいは
接合の後であつて基質を添加する前に行うことが
できる。例えば、分析対象がポリヌクレオチドで
あり、プローブが該分析対象とハイブリダイズし
得るオリゴヌクレオチドであり、そして小酵素断
片がジスルフイド結合を介して該オリゴヌクレオ
チド連結しているS−ペプチドである場合、この
結合は常用の環元剤、例えばジチオスレイトール
又はβ−メルカプトエタノールを用いて切断しS
−ペプチドを再度遊離せしめることができる。す
なわち、Spep−プローブをサンプルに添加し、
そして未結合Spep−プローブを洗浄により除去
する。次にS−ペプチドをプローブから切断し、
そして過剰のS−蛋白質と反応せしめることによ
り酵素接合体を形成することができる。あるい
は、S−蛋白質をSpep−プローブに添加し、次
にプローブから接合体を切断することができる。
特定の例として次のものを挙げることができる。
(i)分析対象を支持体、例えば重合性又は吸着性固
体に固定化し;(ii)固定化された分析対象を溶液中
で過剰のSpep−プローブと反応せしめ;(iii)結合
した分析対象−Spep−プローブ複合体を伴う前
記支持体を溶液から取り出し、そして洗浄して未
結合Spep−プローブを除去し;(iv)該支持体を切
断剤の溶液に浸漬し、この切断剤が支持体から
Spepを切断してこれを溶液中に移行させ、;(v)S
−蛋白質を溶液に加えて酵素接合体を生成せし
め、そして酵素反応を行つて検出可能な結果を発
生せしめる。段階(v)においては、S−蛋白質と共
にすべての他の試薬を一度に溶液に添加して測定
反応を完了することができよう。上記に代る方法
として、S−ペプチドをまず支持体上に固定化
し、次の切断段階により分析対象及びプローブを
除去し、支持体上のS−ペプチドとS−蛋白質と
を接合せしめる。この方法においては、第1酵素
反応、及びおそらくそれに続く反応を支持体上で
行うことができ、この方法は反応の検出可能な結
果を同定するために一層容易でありそして一層鋭
敏であろう。 第1酵素によつて触媒される反応に先立つてプ
ローブから第1酵素を分離することは、プローブ
及び分析対象が酵素の活性を妨害しない点におい
て有利である。同様に、小酵素断片(Spep)を
大断片(Spr)との接合の前にプローブから切断
することにより、プローブ又は分析対象が接合を
妨害するのが防止される。 補欠分子族生成物質 合成補欠分子族生成物質の概念は、上記の特定
の例における場合より一層一般的に適用すること
ができる。例えば、GB2019408に記載されてい
るように、例えばビオチン−アビジン連結によつ
てプローブに間接的に連結された第1酵素として
リボヌクレアーゼ(RNアーゼ)を使用すること
ができる。次にこのRNアーゼが前記の新規な合
成補欠分子族生成物質R−X基質に作用して補酵
素前駆体をもたらし、そして第2酵素反応を介し
て最終的に検出可能な結果を導くことができる。 さらに、補欠分子族生成物質反応のための第1
酵素がRNアーゼである必要はない。第2反応の
ための適当な補酵素又は補欠分子族を用いて出発
する場合、第1反応として合成出発物質(新規な
補欠分子族生成物質)の酵素触媒的切断を含む反
応方式を確立することができる。例えば、補欠分
子族生成物質がアシル化された補酵素であり、そ
して第1酵素が該補酵素からアシル基を切断する
エステラーゼであつてもよい。もしエステラーゼ
が不活性なペプチド断片と蛋白質断片とに切断さ
れ得るものであれば、RNアーゼSpep/Sprにつ
いて前記したのと同様にしてそれを使用すること
ができる。エステラーゼがこのように切断され得
ないのであれば、これを全体として、例えば直接
に、又はビオチン/アビジンにより、しかし好ま
しくはRNアーゼSpep/Sprにより、プローブに
連結することができる。この最後の方法において
は、Spepが前記のようにしてプローブに連結さ
れ、そしてSprが酵素に連結される。蛋白質を連
結するための一般的方法当業界においてよく知ら
れており、これを用いてSpr断片と酵素とを連結
することができる。S−蛋白質が他の蛋白質の担
体として機能するこの方法は次のように表示する
ことができる。
【化】
上記の式中、Spr−Exは共有結合した酵素分子
を含むS−蛋白質であり、他の記号は前記の通り
である。 次の記載はピリドキサールホスフエート及びフ
ラビン補酵素を使用する方法についてであるが、
他の検出系を構成するために任意の適切な補因子
を使用することができよう。 カツプリング補酵素としてピリドキサールを用い
る系 この方法を用いる場合、最終検出系は前記のも
のと同じであろう。S−蛋白質に付加される第1
触媒は加水分解酵素、例えばプロテアーゼ、ペプ
チダーゼ、アミダーゼ又はエステラーゼ等の広範
囲から選択される任意のものであつてよく、そし
て特にスロンビン又は血液凝固系の他の特異的プ
ロテアーゼの1つであつてよい。第1触媒(Ex)
としてスロンビンを用いる場合、合成補欠分子族
生成物質すなわち補酵素生成物質S1C1は次の式
()〜()で示されるような物質であつてよ
い。
を含むS−蛋白質であり、他の記号は前記の通り
である。 次の記載はピリドキサールホスフエート及びフ
ラビン補酵素を使用する方法についてであるが、
他の検出系を構成するために任意の適切な補因子
を使用することができよう。 カツプリング補酵素としてピリドキサールを用い
る系 この方法を用いる場合、最終検出系は前記のも
のと同じであろう。S−蛋白質に付加される第1
触媒は加水分解酵素、例えばプロテアーゼ、ペプ
チダーゼ、アミダーゼ又はエステラーゼ等の広範
囲から選択される任意のものであつてよく、そし
て特にスロンビン又は血液凝固系の他の特異的プ
ロテアーゼの1つであつてよい。第1触媒(Ex)
としてスロンビンを用いる場合、合成補欠分子族
生成物質すなわち補酵素生成物質S1C1は次の式
()〜()で示されるような物質であつてよ
い。
【式】
【式】
【式】
上記の式において、R2はH−又は−PO(OH)2
であり、そしてR1はこれらの化合物がスロンビ
ン作用の良好な基質であるようにスロンビンの既
知の特異性に基いて設計されたアシル基である
〔Magnusson(1971)、及びその中の参照文献〕。
式()の化合物の加水分解はピリドキサミン
(ホスフエート)をもたらし、そして式()及
び()の両化合物はピリドキサール又はピリド
キサールホスフエートを放出する。式()及び
()の化合物中のアルデヒド(ヒドレート)基
が−CH2OHにより置き換えられ、そしてピリド
キソールオキシダーゼを介してカツプリングが行
われれば、阻害的でなくそして酸化されにくいこ
とが明らかであろう。 化合物()〜()は、Harrison及び
Harrison(1971)により記載されたような簡単な
方法により、RCOOH及びピリドキサール誘導体
から合成することができる。適当なRCOOHの調
製はLiem及びScherage(1974)に記載されてい
るようにして行うことができる。 コリンエステラーゼのための補酵素発生基質、
並びに化合物(XI)及び(XII)の構造:
であり、そしてR1はこれらの化合物がスロンビ
ン作用の良好な基質であるようにスロンビンの既
知の特異性に基いて設計されたアシル基である
〔Magnusson(1971)、及びその中の参照文献〕。
式()の化合物の加水分解はピリドキサミン
(ホスフエート)をもたらし、そして式()及
び()の両化合物はピリドキサール又はピリド
キサールホスフエートを放出する。式()及び
()の化合物中のアルデヒド(ヒドレート)基
が−CH2OHにより置き換えられ、そしてピリド
キソールオキシダーゼを介してカツプリングが行
われれば、阻害的でなくそして酸化されにくいこ
とが明らかであろう。 化合物()〜()は、Harrison及び
Harrison(1971)により記載されたような簡単な
方法により、RCOOH及びピリドキサール誘導体
から合成することができる。適当なRCOOHの調
製はLiem及びScherage(1974)に記載されてい
るようにして行うことができる。 コリンエステラーゼのための補酵素発生基質、
並びに化合物(XI)及び(XII)の構造:
【化】
【化】
【式】
基質(XI)及び(XII)は、ピリドキサール中の
適当な基を保護した後、エステル化のための常法
を用いることにより合成することができる
〔Harrison及びHarrison(1971)〕。ピリドキサー
ルのアルデヒド基(上にヒドレートとして示して
ある)とコリンエステラーゼの活性部位中の基と
の反応を防止するため、ピリドキソールを除去基
として使用し、そしてピリドキソールオキシダー
ゼ及びキナーゼを上記の修飾酵素として使用する
ことができる。 カツプリング補酵素としてフラビン誘導体を用い
る系 この系は、前記のフラビンカツプリング測定の
ための最終検出系及び前項に記載した第1触媒を
使用するであろう。使用される基質(S1C1)の
タイプはスロンビン作用のために構造()を
有し、そしてコリンエステラーゼが第1酵素であ
る場合には構造()を有するであろう。
適当な基を保護した後、エステル化のための常法
を用いることにより合成することができる
〔Harrison及びHarrison(1971)〕。ピリドキサー
ルのアルデヒド基(上にヒドレートとして示して
ある)とコリンエステラーゼの活性部位中の基と
の反応を防止するため、ピリドキソールを除去基
として使用し、そしてピリドキソールオキシダー
ゼ及びキナーゼを上記の修飾酵素として使用する
ことができる。 カツプリング補酵素としてフラビン誘導体を用い
る系 この系は、前記のフラビンカツプリング測定の
ための最終検出系及び前項に記載した第1触媒を
使用するであろう。使用される基質(S1C1)の
タイプはスロンビン作用のために構造()を
有し、そしてコリンエステラーゼが第1酵素であ
る場合には構造()を有するであろう。
【式】
式():R1=ペプチド断片
式():R1=CH3
エステル()及び()の化学合成は
Harrison及びHarrison(1971)に記載された方法
の1つによつて行われ、例えばカルボン酸
R1COOHによるフラビンのカルボジイミド介在
エステル化、及びHPLCによる基質の精製により
行われる。 参照文献 Arrio−Dupont,M.(1972)ヨーロピアン・ジ
ヤーナル・オブ・バイオケミストリー
(European J.Biochem.)30,307。 Barnard,E.A.及びWitzel,H.(1962)バイオ
ケミカル・アンド・バイオフイジカル・リサーチ
コミユニケーシヨンス(Biochem.Biophys.Res.
Commun.)7,289。 Brown,D.M.及びTodd,A.R.(1953)ジヤー
ナル・オブ・ケミカル・ソシエテイー(J.Chem.
Soc.)2040。 Chavers,L.G.及びScheraga,H.A.(1980)バ
イオケミストリー(Biochemistry)19,996。 Cheng,S.−Y.,Clenn,T.M.及びPastan,I.
(1983)ニユークレイツク・アシズ・リサーチ
(Nucl.Acids Res.)11,659。 Choong,Y.S.,Shepherd,M,G.及び
Sullivan,P.A.(1975)バイオケミカル・ジヤー
ナル(Biochem.J.)145,37。 Doscher,M.S.(1969)メソズ・イン・エンチ
モロジー(Methods in Enzymology)11,640。
Findlay等1962他の記載を参照のこと。 Froede,H.C.及びWilson,I.B.(1971)ザ・エ
ンチム(The Enzymes)、第3版、Boyer編、
V87。 フジカワ、K.及びDavie,E.W.(1976)メソ
ズ・イン・エンチモロジー(Methods in
Enzymol.)XLV、89。 Gait,M.J.,Matthes,H.W.D.,Singh,M.,
Sproat,B.及びTitmas,R.C.EMBCコース・マ
ニユアル(EMBO Course Manual)(1982)
Verlag Chemie発行。 Chisla,S.,オガタ、H.Massey,V.,
Schonbrunn,A.,Abeles,R.H.及びWalsh,C.
T.(1976)バイオケミストリー(Biochemistry)
15,1791。 Gibson,K.D.,Neuberger,A.及びScott,J.
J.(1955)ビオケミカル・ジヤーナル(Biochem.
J.)61,618。 Harrison,I.T.及びHarrison,S.H.(1971)コ
ンペンジユム・オブ・オーガニツク・シンセシ
ス・メソズ(Compendium of Organic
Synthetic Methods)pp.280−286,204−207及
び213−218。 イタクラ、K.,カタギリ、N.,Narang,S.
A.,Bahl,C.P.,Marians,K.J.及びWu,R.
(1975)ジヤーナル・オブ・ヒオロジカル・ケミ
ストリー(J.Biol.Chem.)250,4952。 イタクラ、K.,カタギリ、N.,Bahl,C.P.,
Wightman,R.H.及びNarang,S.A.(1975)ジヤ
ーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソシエテ
イー(J.Am.Chem.Soc.)97,7327。 Jesty,J.及びNemerson,Y.(1976)メソズ・
イン・エンチモロジー(Methods、in
Enzymol.)XLV,95。 Kas,J.及びCerna Jitka(1980)メソズ・イ
ン・エンチモロジー(Methods in Enzymol.)
66,344。 Liem,R.K.H.及びScheraga,H.A.(1974)ア
ーチブス・ビオケミストリー・カンドビオフイジ
ツクス(Archives Biochem.Biophys.)160,
333。 Magnusson,S.(1971)ジ・エンチム(The
Enzymes)Boyer,P.D.編p.278。 Marfrey,P.S.,Nowak,H.Uziel,M.及び
Yphantis,D.A.(1965)ジヤーナル・オブ・ビオ
ロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.)240,
3264及び3270。 Martinez−Carrion,M.,Timeier,D.C.及び
Peterson,D.(1970)バイオケミストリー
(Biochemistry)9,2574。 Massey,V.及びCurti,B.(1966)ジヤーナ
ル・オブ・ビオロジカル・ケミストリー(J.Biol.
Chem.)241,3417。 Mayhew,S.G.及びWassink,J.H.(1980)メ
ソズ・イン・エンチモロジー(Methods in
Enzymol.)66,217。 Mayhew,S.G.及びWassink,J.H.(1980)メ
ソズ・イン・エンチモロジー(Methods in
Enzymol.)66,323。 McCormick,D.B.(1962)ジヤーナル・オ
ブ・ビオロジカル・ケミストリー(J.Biol.
Chem.)237,959。 Merrill,A.H.及びMcCormick,D.B.(1978)
アナリテイカル・ビオケミストリー(Anal.
Biochem.)89,87。 Merrill,A.H.及びMcCormick,D.B.(1980)
メソズ・イン・エンチモロジー(Methods in
Enzymol.)66,287。 ナカノ、M.,ウシジマ、Y.,サガ、M.,ツツ
ミ、Y.&アサミ、H.(1968)ビオチミカ・ビオフ
エジカ・アクタ(Biochim.Biophys.Acta)167,
9。 Rej.R.(1982)アナリテイカル・ビオケミスト
リー(Anal.Biochem.)119,205。 Richards,F.M.及びVithayathil,P.J.(1959a)
ジヤーナル・オブ・ビオロジカル・ケミストリー
(J.Biol.Chem.)234,1459。 Richards,F.M.及びVithayathil,P.J.(1959b)
ブルツクハーゲン・シンポジウム・イン・バイオ
ロジー(Brookhaven Symp.in Biol.)13,115。 Roychoudhury,R.,Jay,E.及びWu,R.
(1976)ニユークレイツク・アシズ・リサーチ
(Nucl.Acids Res.)3,863。 Schoellman,G.及びShaw,E.(1962)バイオ
ケミカル・アンド・バイオフイジカル・リサー
チ・コミユニケーシヨン(Biochem.Biophys.
Res.Commun.)7,36。 Schrecker,A.W.及びScott,J.J.(1955)バイ
オケミカル・ジヤーナル(Biochem.J.)61,
618。 Schuman,M.及びMassey,V.(1971)ビオチ
ミカ・ビオフエジカ・アクタ(Biochim.
Biophys.Acta)227,500。 Shin,M.(1971)メソズ・イン・エンチモロジ
ー(Methods in Enzymol.)23A,440。 Stawinkski,J.,ホズミ、Y.,Narang,S.
A.,Bahl,C.P.及びWu,R.(1977)ニユークレ
イツク・アシズ・リサーチ(Nucleic、Acids
Res.)4,353。 Swell,L,.Law,M.D.,Field,H.及び
Treadwell,C.R.(1960)ビオチミカ・ビオフエ
ジカ・アクタ(Biochim.Biophys.Acta)235。 タカハシ、T.,イリエ、M.及びウキタ,T.
(1969)ジヤーナル・オブ・バイオケミストリー
(J.Biochem.)(東京)65,55。 Todrick,A.(1954)ブリテイツシユ・ジヤー
ナル・オブ・フアーマコロジー(Brit.J.Pharma
−col.)9,76。 ツゲ、H.及びナカニシ、Y.(1980)メソズ・イ
ン・エンチモロジー(Methods in Enzymol.)
66,344。 ウダカ、S.,Koukol,J.&Vennesland,B.
(1959)ジヤーナル・オブ・バクテリオロジー
(J.Bacteriol.)78,714。 Ward,D.C.,Waldrop,A.A.,Langer,P.
A.,(1982)EP63879。 Wightman,R.H.及びNarang,S.A.(1975)ニ
ユークレイツク・アシズ・リサーチ(Nucleic
Acids Res.)4,353。 Eckstein,F.,Saenger,W.及びSuck,D.
(1972)バイオケミカル・アンド・バイオフイジ
カル・リサーチ・コミユニケーシヨンズ
(Biochem.Biophys.Res.Comm.)46,No.2,964
−971。 Still,W.C.,Kahn,M及びMitra,A.(1978)
ジヤーナル・オブ・オーガニツク・ケミストリー
(J.Org.Chem.)43,No.14,2923−2925。 Usher,D.A.Erenrich,E.S.及びEckstein,F.
(1972)プロシーデイクグス・オブ・ザ・ナシヨ
ナルアカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・
ユナイテツド・ステイツ・オブ・アメリカ
(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.)69,No.1,115−
118。
Harrison及びHarrison(1971)に記載された方法
の1つによつて行われ、例えばカルボン酸
R1COOHによるフラビンのカルボジイミド介在
エステル化、及びHPLCによる基質の精製により
行われる。 参照文献 Arrio−Dupont,M.(1972)ヨーロピアン・ジ
ヤーナル・オブ・バイオケミストリー
(European J.Biochem.)30,307。 Barnard,E.A.及びWitzel,H.(1962)バイオ
ケミカル・アンド・バイオフイジカル・リサーチ
コミユニケーシヨンス(Biochem.Biophys.Res.
Commun.)7,289。 Brown,D.M.及びTodd,A.R.(1953)ジヤー
ナル・オブ・ケミカル・ソシエテイー(J.Chem.
Soc.)2040。 Chavers,L.G.及びScheraga,H.A.(1980)バ
イオケミストリー(Biochemistry)19,996。 Cheng,S.−Y.,Clenn,T.M.及びPastan,I.
(1983)ニユークレイツク・アシズ・リサーチ
(Nucl.Acids Res.)11,659。 Choong,Y.S.,Shepherd,M,G.及び
Sullivan,P.A.(1975)バイオケミカル・ジヤー
ナル(Biochem.J.)145,37。 Doscher,M.S.(1969)メソズ・イン・エンチ
モロジー(Methods in Enzymology)11,640。
Findlay等1962他の記載を参照のこと。 Froede,H.C.及びWilson,I.B.(1971)ザ・エ
ンチム(The Enzymes)、第3版、Boyer編、
V87。 フジカワ、K.及びDavie,E.W.(1976)メソ
ズ・イン・エンチモロジー(Methods in
Enzymol.)XLV、89。 Gait,M.J.,Matthes,H.W.D.,Singh,M.,
Sproat,B.及びTitmas,R.C.EMBCコース・マ
ニユアル(EMBO Course Manual)(1982)
Verlag Chemie発行。 Chisla,S.,オガタ、H.Massey,V.,
Schonbrunn,A.,Abeles,R.H.及びWalsh,C.
T.(1976)バイオケミストリー(Biochemistry)
15,1791。 Gibson,K.D.,Neuberger,A.及びScott,J.
J.(1955)ビオケミカル・ジヤーナル(Biochem.
J.)61,618。 Harrison,I.T.及びHarrison,S.H.(1971)コ
ンペンジユム・オブ・オーガニツク・シンセシ
ス・メソズ(Compendium of Organic
Synthetic Methods)pp.280−286,204−207及
び213−218。 イタクラ、K.,カタギリ、N.,Narang,S.
A.,Bahl,C.P.,Marians,K.J.及びWu,R.
(1975)ジヤーナル・オブ・ヒオロジカル・ケミ
ストリー(J.Biol.Chem.)250,4952。 イタクラ、K.,カタギリ、N.,Bahl,C.P.,
Wightman,R.H.及びNarang,S.A.(1975)ジヤ
ーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソシエテ
イー(J.Am.Chem.Soc.)97,7327。 Jesty,J.及びNemerson,Y.(1976)メソズ・
イン・エンチモロジー(Methods、in
Enzymol.)XLV,95。 Kas,J.及びCerna Jitka(1980)メソズ・イ
ン・エンチモロジー(Methods in Enzymol.)
66,344。 Liem,R.K.H.及びScheraga,H.A.(1974)ア
ーチブス・ビオケミストリー・カンドビオフイジ
ツクス(Archives Biochem.Biophys.)160,
333。 Magnusson,S.(1971)ジ・エンチム(The
Enzymes)Boyer,P.D.編p.278。 Marfrey,P.S.,Nowak,H.Uziel,M.及び
Yphantis,D.A.(1965)ジヤーナル・オブ・ビオ
ロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.)240,
3264及び3270。 Martinez−Carrion,M.,Timeier,D.C.及び
Peterson,D.(1970)バイオケミストリー
(Biochemistry)9,2574。 Massey,V.及びCurti,B.(1966)ジヤーナ
ル・オブ・ビオロジカル・ケミストリー(J.Biol.
Chem.)241,3417。 Mayhew,S.G.及びWassink,J.H.(1980)メ
ソズ・イン・エンチモロジー(Methods in
Enzymol.)66,217。 Mayhew,S.G.及びWassink,J.H.(1980)メ
ソズ・イン・エンチモロジー(Methods in
Enzymol.)66,323。 McCormick,D.B.(1962)ジヤーナル・オ
ブ・ビオロジカル・ケミストリー(J.Biol.
Chem.)237,959。 Merrill,A.H.及びMcCormick,D.B.(1978)
アナリテイカル・ビオケミストリー(Anal.
Biochem.)89,87。 Merrill,A.H.及びMcCormick,D.B.(1980)
メソズ・イン・エンチモロジー(Methods in
Enzymol.)66,287。 ナカノ、M.,ウシジマ、Y.,サガ、M.,ツツ
ミ、Y.&アサミ、H.(1968)ビオチミカ・ビオフ
エジカ・アクタ(Biochim.Biophys.Acta)167,
9。 Rej.R.(1982)アナリテイカル・ビオケミスト
リー(Anal.Biochem.)119,205。 Richards,F.M.及びVithayathil,P.J.(1959a)
ジヤーナル・オブ・ビオロジカル・ケミストリー
(J.Biol.Chem.)234,1459。 Richards,F.M.及びVithayathil,P.J.(1959b)
ブルツクハーゲン・シンポジウム・イン・バイオ
ロジー(Brookhaven Symp.in Biol.)13,115。 Roychoudhury,R.,Jay,E.及びWu,R.
(1976)ニユークレイツク・アシズ・リサーチ
(Nucl.Acids Res.)3,863。 Schoellman,G.及びShaw,E.(1962)バイオ
ケミカル・アンド・バイオフイジカル・リサー
チ・コミユニケーシヨン(Biochem.Biophys.
Res.Commun.)7,36。 Schrecker,A.W.及びScott,J.J.(1955)バイ
オケミカル・ジヤーナル(Biochem.J.)61,
618。 Schuman,M.及びMassey,V.(1971)ビオチ
ミカ・ビオフエジカ・アクタ(Biochim.
Biophys.Acta)227,500。 Shin,M.(1971)メソズ・イン・エンチモロジ
ー(Methods in Enzymol.)23A,440。 Stawinkski,J.,ホズミ、Y.,Narang,S.
A.,Bahl,C.P.及びWu,R.(1977)ニユークレ
イツク・アシズ・リサーチ(Nucleic、Acids
Res.)4,353。 Swell,L,.Law,M.D.,Field,H.及び
Treadwell,C.R.(1960)ビオチミカ・ビオフエ
ジカ・アクタ(Biochim.Biophys.Acta)235。 タカハシ、T.,イリエ、M.及びウキタ,T.
(1969)ジヤーナル・オブ・バイオケミストリー
(J.Biochem.)(東京)65,55。 Todrick,A.(1954)ブリテイツシユ・ジヤー
ナル・オブ・フアーマコロジー(Brit.J.Pharma
−col.)9,76。 ツゲ、H.及びナカニシ、Y.(1980)メソズ・イ
ン・エンチモロジー(Methods in Enzymol.)
66,344。 ウダカ、S.,Koukol,J.&Vennesland,B.
(1959)ジヤーナル・オブ・バクテリオロジー
(J.Bacteriol.)78,714。 Ward,D.C.,Waldrop,A.A.,Langer,P.
A.,(1982)EP63879。 Wightman,R.H.及びNarang,S.A.(1975)ニ
ユークレイツク・アシズ・リサーチ(Nucleic
Acids Res.)4,353。 Eckstein,F.,Saenger,W.及びSuck,D.
(1972)バイオケミカル・アンド・バイオフイジ
カル・リサーチ・コミユニケーシヨンズ
(Biochem.Biophys.Res.Comm.)46,No.2,964
−971。 Still,W.C.,Kahn,M及びMitra,A.(1978)
ジヤーナル・オブ・オーガニツク・ケミストリー
(J.Org.Chem.)43,No.14,2923−2925。 Usher,D.A.Erenrich,E.S.及びEckstein,F.
(1972)プロシーデイクグス・オブ・ザ・ナシヨ
ナルアカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・
ユナイテツド・ステイツ・オブ・アメリカ
(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.)69,No.1,115−
118。
第1図はCpリボフラビン調製の反応経過を示
すクロマトグラムであつて284nm及び360nmの紫
外線のもとで観察したものであり;第2図は上記
反応混合物の中圧クロマトグラフイーにおける溶
出の様子を270nmの吸収により観察したものであ
り、H2O(40);ピリジン(10):酢酸(1)中
1.05Kg/cm2の窒素圧により行つたものであり;第
3図は上記フラツシユクロマトグラフイーからの
溶出精製物の薄層クロマトグラムであり;そし
て、第4図はRNアーゼ1mg/mlと共にインキユ
ベートした後のカラム画分Aの薄層クロマトグラ
ムである。
すクロマトグラムであつて284nm及び360nmの紫
外線のもとで観察したものであり;第2図は上記
反応混合物の中圧クロマトグラフイーにおける溶
出の様子を270nmの吸収により観察したものであ
り、H2O(40);ピリジン(10):酢酸(1)中
1.05Kg/cm2の窒素圧により行つたものであり;第
3図は上記フラツシユクロマトグラフイーからの
溶出精製物の薄層クロマトグラムであり;そし
て、第4図はRNアーゼ1mg/mlと共にインキユ
ベートした後のカラム画分Aの薄層クロマトグラ
ムである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 検出されるべき分析対象の存在に関連する濃
度で存在する第1酵素が第1酵素反応を触媒する
エンザイムリンクドアツセイ法において、前記第
1酵素のための基質が合成非天然化合物であつて
この化合物は該第1酵素によつて開裂されて直接
的に又は1もしくは複数の追加の反応により他の
酵素の触媒活性のために必須の成分を生成し、該
成分によつて該他の酵素が活性化されて分析対象
の存在に関連する前記検出可能な結果を導く第2
酵素反応を触媒することを特徴とする方法。 2 前記第1酵素のための基質が合成非天然補欠
分子族生成化合物であり、そして前記他の酵素の
触媒活性のために必須の成分が補欠分子族又は補
酵素である、請求項1に記載のエンザイムリンク
ドアツセイ方法。 3 前記他の酵素の触媒活性のために必須の成分
がリボフラビン含有補欠分子族である、請求項2
に記載のエンザイムリンクドアツセイ方法。 4 前記第1酵素がホスホジエステラーゼであ
り、そして前記合成非天然化合物が式R−Xのピ
リミジンリボヌクレオシド3′−ホスホジエステル
化合物を含んで成り、ここでRはピリミジンリボ
ヌクレオシド3′−ホスフエートであり、そしてX
は3′−ホスフエート基を介してRに連結している
脱離基であつて、Xは前記他の酵素の触媒活性の
ために必須な成分であるか又は1もしくは複数の
他の反応により該他の酵素の触媒活性のために必
須な成分に転換される、請求項1に記載のエンザ
イムリンクドアツセイ方法。 5 前記脱離基生成物がリボフラビン、チアミ
ン、ピロキシダール、ピリドキシン及びピリドキ
シンホスフエートから選択される、請求項4に記
載のエンザイムリンクドアツセイ方法。 6 その濃度が検出されるべき分析対象の存在に
関連する第1酵素が検出可能な生成物を導く第1
酵素反応を触媒するエンザイムリンクドアツセイ
法において、前記第1酵素のための基質が合成非
天然化合物であつてこの化合物は該第1酵素によ
つて開裂されて直接的に又は1もしくは複数の追
加の反応により他の酵素の触媒活性のために必須
の成分を生成し、該成分によつて該他の酵素が活
性化されて分析対象の存在に関連する前記の検出
可能な結果を導く第2酵素反応を触媒することを
特徴とする方法において使用するためのキツト又
は組合せであつて、 (i) 前記第1酵素のための基質、 (ii) 前記第1酵素反応により直接に又は他の方法
で活性化されるべき、第2酵素反応のための成
分、及び (iii) 検出可能な結果を生成するための、前記第2
酵素反応により活性化され得るシグナル生成
系、 を含んで成るキツト又は組合せ。 7 前記第1酵素のための基質が合成非天然補欠
分子生成化合物であり、そして前記他の酵素の触
媒活性のために必須の成分が補欠分子族又は補酵
素である、請求項6に記載のキツト又は組合せ。 8 前記他の酵素の触媒活性のために必須の成分
がリボフラビン含有補欠分子族である、請求項7
に記載のキツト又は組合せ。 9 前記第1酵素がホスホジエステラーゼであ
り、そして前記合成非天然化合物が式R−Xのピ
リミジンリボヌクレオシド3′−ホスホジエステル
化合物を含んで成り、ここでRはピリミジンリボ
ヌクレオシド3′−ホスフエートであり、そしてX
は3′−ホスフエート基を介してRに連結している
脱離基であつて、Xは前記他の酵素の触媒活性の
ために必須な成分であるか又は1もしくは複数の
他の反応により該他の酵素の触媒活性のために必
須な成分に転換される、請求項6に記載のキツト
又は組合せ。 10 前記脱離基生成物がリボフラビン、チアミ
ン、ピロキシダール、ピリドキシン及びピリドキ
シンホスフエートから選択される、請求項9に記
載のキツト又は組合せ。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB848407736A GB8407736D0 (en) | 1984-03-26 | 1984-03-26 | Detecting specific polynucleotide sequences |
GB8407736 | 1984-03-26 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS611398A JPS611398A (ja) | 1986-01-07 |
JPH0586199B2 true JPH0586199B2 (ja) | 1993-12-10 |
Family
ID=10558660
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60059688A Granted JPS611398A (ja) | 1984-03-26 | 1985-03-26 | 酵素的分析方法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US4745054A (ja) |
EP (2) | EP0156641B1 (ja) |
JP (1) | JPS611398A (ja) |
AT (1) | ATE108454T1 (ja) |
CA (1) | CA1258673A (ja) |
DE (2) | DE3587883T2 (ja) |
GB (3) | GB8407736D0 (ja) |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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US5190864A (en) * | 1986-04-15 | 1993-03-02 | Northeastern University | Enzyme amplification by using free enzyme to release enzyme from an immobilized enzyme material |
US4937188A (en) * | 1986-04-15 | 1990-06-26 | Northeastern University | Enzyme activity amplification method for increasing assay sensitivity |
US4835099A (en) * | 1986-11-20 | 1989-05-30 | Becton, Dickinson And Company | Signal enhancement in immunoassay by modulation of enzymatic catalysis |
GB8628108D0 (en) * | 1986-11-25 | 1986-12-31 | London Biotechnology Ltd | Riboflavin-linked assay |
US5196306A (en) * | 1989-03-29 | 1993-03-23 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for the detection or quantitation of an analyte using an analyte dependent enzyme activation system |
ATE193019T1 (de) * | 1989-10-13 | 2000-06-15 | Zeneca Ltd | Sonden |
DE69024364T2 (de) * | 1989-10-17 | 1996-07-11 | British Tech Group | Verstärkter chemilumineszenzassay |
GB8927365D0 (en) * | 1989-12-04 | 1990-01-31 | Ici Plc | Reagent |
EP0597951B1 (en) * | 1991-07-26 | 1999-03-31 | Dade Chemistry Systems Inc. | An assay with signal detection in the presence of a suspended solid support |
US5279937A (en) * | 1992-04-30 | 1994-01-18 | Detechnology Canada | Use of macroglobulins to improve the signal-to-background ratio in affinity binding assays |
US5985548A (en) * | 1993-02-04 | 1999-11-16 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Amplification of assay reporters by nucleic acid replication |
EP0716713A1 (en) * | 1993-08-18 | 1996-06-19 | Id Biomedical Corporation | Compositions and methods for detecting target nucleic acid sequences utilizing adjacent sequence-enzyme molecules |
US5817455A (en) * | 1994-03-01 | 1998-10-06 | Novagen, Inc. | Method for in vitro inactivation of RNase S |
US5874216A (en) | 1996-02-23 | 1999-02-23 | Ensys Environmental Products, Inc. | Indirect label assay device for detecting small molecules and method of use thereof |
GB2347213B (en) * | 1999-02-20 | 2001-06-27 | Stuart Harbron | Method for determining nuclease activity |
US6322980B1 (en) * | 1999-04-30 | 2001-11-27 | Aclara Biosciences, Inc. | Single nucleotide detection using degradation of a fluorescent sequence |
US6514700B1 (en) * | 1999-04-30 | 2003-02-04 | Aclara Biosciences, Inc. | Nucleic acid detection using degradation of a tagged sequence |
US7537938B2 (en) * | 2000-04-28 | 2009-05-26 | Monogram Biosciences, Inc. | Biomarker detection in circulating cells |
US7771929B2 (en) * | 2000-04-28 | 2010-08-10 | Monogram Biosciences, Inc. | Tag library compounds, compositions, kits and methods of use |
US20030207300A1 (en) * | 2000-04-28 | 2003-11-06 | Matray Tracy J. | Multiplex analytical platform using molecular tags |
US7160735B2 (en) * | 2000-04-28 | 2007-01-09 | Monogram Biosciences, Inc. | Tagged microparticle compositions and methods |
WO2002094998A2 (en) | 2001-05-21 | 2002-11-28 | Aclara Biosciences, Inc. | Analyzing phosphorylated proteins |
PL373962A1 (en) * | 2001-05-21 | 2005-09-19 | Aclara Biosciences, Inc. | Methods and compositions for analyzing proteins |
WO2002097112A2 (en) * | 2001-05-26 | 2002-12-05 | Aclara Biosciences, Inc. | Catalytic amplification of multiplexed assay signals |
FR2827304B1 (fr) | 2001-07-16 | 2004-05-21 | Commissariat Energie Atomique | Procede et support d'analyse biologique utilisant des oligonucleotides comportant un marqueur activable enzymatiquement |
US7045311B2 (en) * | 2001-10-25 | 2006-05-16 | Monogram Biosciences, Inc. | Whole cell assay systems for cell surface proteases |
CN1166422C (zh) * | 2001-11-05 | 2004-09-15 | 北京源德生物医学工程股份有限公司 | 用于体外高能聚焦超声波治疗机的坐位架 |
US20050053939A1 (en) * | 2001-11-09 | 2005-03-10 | Ahmed Chenna | Methods and compositions for enhancing detection in determinations employing cleavable electrophoretic tag reagents |
US20040229294A1 (en) * | 2002-05-21 | 2004-11-18 | Po-Ying Chan-Hui | ErbB surface receptor complexes as biomarkers |
US7402397B2 (en) * | 2002-05-21 | 2008-07-22 | Monogram Biosciences, Inc. | Detecting and profiling molecular complexes |
US20040229299A1 (en) * | 2002-05-21 | 2004-11-18 | Badal M. Youssouf | Intracellular complexes as biomarkers |
US20040175765A1 (en) * | 2002-07-05 | 2004-09-09 | Sharat Singh | Cell-screening assay and composition |
US20050003369A1 (en) * | 2002-10-10 | 2005-01-06 | Affymetrix, Inc. | Method for depleting specific nucleic acids from a mixture |
EP1680666A4 (en) * | 2003-10-27 | 2008-03-26 | Monogram Biosciences Inc | ANTI-THERAPEUTIC HUMAN ANTIBODY DETECTION |
US7790364B2 (en) * | 2006-01-27 | 2010-09-07 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Compositions and methods for high throughput screening of pharmacological chaperones |
JP2022108322A (ja) | 2021-01-13 | 2022-07-26 | 株式会社日立ハイテク | 分離カラム接続装置及び分離装置 |
WO2023091588A1 (en) * | 2021-11-17 | 2023-05-25 | Nerd Bio Llc | Systems and methods for real-time cellular drug-target engagement |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS59140900A (ja) * | 1983-01-28 | 1984-08-13 | Toyo Jozo Co Ltd | 新規な酵素的高感度測定法 |
JPS59213399A (ja) * | 1983-05-18 | 1984-12-03 | Toyo Jozo Co Ltd | Nh↓3またはatpの測定法 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3852157A (en) * | 1971-05-14 | 1974-12-03 | Syva Corp | Compounds for enzyme amplification assay |
IL39323A (en) * | 1971-05-14 | 1975-08-31 | Syva Co | Highly sensitive assay method employing an enzyme for amplification |
WO1981000725A1 (en) * | 1979-09-14 | 1981-03-19 | Charles Hospital Dev | Method of determining a substrate in a sample |
GB2059421A (en) * | 1979-10-03 | 1981-04-23 | Self C H | Assay method and reagents therefor |
US4259232A (en) * | 1979-10-23 | 1981-03-31 | Miles Laboratories, Inc. | Flavin adenine dinucleotide-labeled protein and polypeptide conjugates |
US4378428A (en) * | 1981-03-30 | 1983-03-29 | Baker Instruments Corporation | Method for carrying out non-isotopic immunoassays, labeled analytes and kits for use in such assays |
US4463090A (en) * | 1981-09-30 | 1984-07-31 | Harris Curtis C | Cascade amplification enzyme immunoassay |
DK147184A (da) * | 1983-04-18 | 1984-10-19 | Du Pont | Fremgangsmaade og reagens til kvantitativ immunokemisk analyse |
GB8407736D0 (en) * | 1984-03-26 | 1984-05-02 | Univ London | Detecting specific polynucleotide sequences |
-
1984
- 1984-03-26 GB GB848407736A patent/GB8407736D0/en active Pending
-
1985
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-
1988
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS59140900A (ja) * | 1983-01-28 | 1984-08-13 | Toyo Jozo Co Ltd | 新規な酵素的高感度測定法 |
JPS59213399A (ja) * | 1983-05-18 | 1984-12-03 | Toyo Jozo Co Ltd | Nh↓3またはatpの測定法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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