KR101252351B1 - 전기효소적 합성 반응을 위한 ｎａｄ(ｐ) 유도체의 전기화학적 환원 방법 - Google Patents

전기효소적 합성 반응을 위한 ｎａｄ(ｐ) 유도체의 전기화학적 환원 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 NAD(P) 유도체를 이용하여 NAD(P) 유도체를 직접 또는 간접 전기화학적 방법으로 환원시키는 방법, 상기 환원된 NAD(P) 유도체를 조효소로 이용하여 NAD(P)H-의존성 효소 반응 산물을 전기효소적으로 합성하는 방법 및 상기 환원된 NAD(P) 유도체의 조효소로서의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 NAD(P) 유도체들은 산화환원효소에 높은 호환성을 보여 주었으며, NAD(P)보다 양성의 산화환원 전위(redox potential)를 가짐으로써 전기화학적 방법을 이용하여 동일한 전압을 걸어 주었을 때 NAD(P)보다 더 많은 양이 환원되었다. 또한 이렇게 환원된 NAD(P) 유도체들은 NAD(P)H에 비해 매우 안정하다는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과들로부터 조효소의 전기화학적인 환원이 필수적인 산업적으로 중요한 NAD(P)H-의존성 효소 반응 산물의 전기효소적 합성 반응에서 NAD(P) 유도체들은 종래의 NAD(P)에 비해 우수한 합성 효율을 얻을 수 있다.

Description

전기효소적 합성 반응을 위한 ＮＡＤ(Ｐ) 유도체의 전기화학적 환원 방법 {METHOD FOR ELECTROCHEMICAL REDUCTION OF NAD(P) ANALOGS FOR ELECTROENZYMATIC SYNTHESIS REACTIONS}
본 발명은 NAD(P) 유도체를 이용하여 NAD(P) 유도체를 직접 및 간접 전기화학적 방법으로 환원시키는 방법, 상기 환원된 NAD(P) 유도체를 조효소로 이용하여 NAD(P)H-의존성 효소 반응 산물을 전기효소적으로 합성하는 방법 및 상기 환원된 NAD(P) 유도체의 조효소로서의 용도에 관한 것이다.
효소는 단백질로 이루어진 순효소(apoenzyme)와 보조인자(cofactor)로 이루어지는데, 그 중 보조인자는 Mg, Zn, Mn, Fe와 같은 금속 이온이거나 NAD, NADP, FAD, CoA와 일부 비타민과의 유기결합체인 조효소(coenzyme)이다. 이 중 조효소들은 기질로부터 이탈된 전자나 원자 등을 일시적으로 수용하여 다른 물질에 전달하는 역할을 한다.
특히, 산화환원효소는 반응의 대응물(counterpart)로서 NAD(H), NADP(H)와 같은 조효소들을 필요로 하는데 이런 산화환원효소 반응을 계속 일으키기 위해서는 조효소들을 원하는 물질을 생산하는 반응 쪽으로 산화 혹은 환원시켜야 한다. 특히 산업적으로 중요한 고부가가치의 물질(키랄 알코올, 키랄 에폭사이드 등)을 생산하는 산화환원효소들은 NAD(P)H-의존성 효소 반응을 하기 때문에 지속적으로 NAD(P)H를 공급해야 한다. 하지만 NAD(P)H는 매우 고가이기 때문에 경제적인 측면에서 많은 연구자들은 효소 반응에 의해 산화된 NAD(P)를 NAD(P)H로 다시 환원시키는 다양한 방법들을 연구하고 있다.
NAD(P)를 환원시키는 방법에는 크게 세 가지 방법이 있는데, 효소적 방법과 광화학적 방법 그리고 전기화학적 방법이다. 효소적 방법은 조효소를 재생시킬 수 있는 효소와 그 기질을 넣어주는 것으로, 이 때문에 원하지 않는 부산물을 생성하는 문제점이 생긴다. 그리고 부산물의 제거가 용이하더라도 공정에 이용할 때 효소를 사용함으로써 공정 비용이 비싸지고, 외부 환경에 의해 효소의 활성이 떨어지면서 공정효율이 낮아지는 문제점을 가지고 있다. 그리고 두 번째 방법인 광화학적 방법은 빛 에너지를 화학 에너지로 전환시키기 위해 광 감응물질 또는 반도체 물질을 이용하는 것인데 이는 반응 메커니즘이 매우 어려워서 실시하는 것에는 어려움이 있다. 마지막으로 전기화학적 방법은 산화된 조효소에 전자를 공급하는 역할로서 전극을 사용한다. 따라서 조효소를 환원시키기 위해서 추가적인 물질을 넣지 않아도 되어 매우 경제적인 방법이라고 할 수 있다.
이런 전기화학적 방법은 또 두 가지 방법으로 나눌 수 있다. 첫 번째 방법은 직접 전기화학적 방법으로 전자전달 매개체(mediator)를 사용하지 않고 전극에서 직접적으로 조효소들을 환원시키는 방법이다. 하지만 직접 전기화학적으로 NAD(P)를 환원시키기 위해서는 높은 전압을 유지시켜야 하며 환원 효율이 낮은 문제점이 있다. 두 번째 방법은 전자전달 매개체를 이용하는 간접 전기화학적 방법이다. 주요한 전자전달 매개체로는 비올로겐(viologen) 계열의 염료와 페로센(ferrocene) 유도체, 퀴논(quinine) 계열의 물질이 있고, 로듐 복합체도 이용되고 있다. 혹은 다이아포레이즈(diaphorase)와 같은 효소를 이용해 NAD(P)를 환원시키는 방법도 있다. 이런 간접 전기화학적 환원 방법은 전압을 낮게 이용할 수 있으나, 여전히 낮은 전환 효율을 나타낸다. 또한 어떤 전자전달 매개체는 독성이 있으며 효소 활성을 저해하는 문제점이 있다.
본 발명은 기존의 NAD(P) 대신에 더 양성의 산화환원 전위(redox potential)를 갖는 NAD(P) 유도체를 이용함으로써 전기화학적 NAD(P) 환원법이 가진 낮은 환원 효율의 문제점을 해결하는 것을 목적으로 한다. 또한 NAD(P)의 환원된 형태인 NAD(P)H는 매우 불안정한 물질이므로, NAD(P)H-의존성 효소 반응 산물을 전기효소적으로 합성함에 있어서 NAD(P) 유도체를 도입함으로써 조효소의 안정성을 향상시키고자 한다.
이에 본 발명은 NAD(P) 유도체인 화학식 I의 화합물을 전기화학적 방법으로 환원시키는 것을 포함하는 NAD(P) 유도체의 환원 방법을 제공한다:
[화학식 I]
Figure 112010073923100-pat00001
이 때, 상기 R 은 CSNH2, COCH3, CHO 또는 COOH 이고, R'는 OH 또는 OPO3H2일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 NAD(P) 유도체인 화학식 I의 화합물을 전기화학적 방법으로 환원시키는 것을 포함하고, 상기 환원된 화학식 I의 화합물을 조효소로 이용하는 것을 특징으로 하는 NAD(P)H-의존성 효소 반응 산물의 전기효소적 합성 방법을 제공한다:
[화학식 I]
Figure 112010073923100-pat00002
이 때, 상기 R 은 CSNH2, COCH3, CHO 또는 COOH 이고, R'는 OH 또는 OPO3H2일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 화학식 I의 화합물을 전기화학적 방법으로 환원시킨 화합물을 조효소로서 포함하는 NAD(P)H-의존성 효소 반응 산물의 전기효소적 합성 반응용 조성물을 제공한다:
[화학식 I]
Figure 112010073923100-pat00003
이 때, 상기 R 은 CSNH2, COCH3, CHO 또는 COOH 이고, R'는 OH 또는 OPO3H2일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 NAD(P) 유도체들은 산화환원효소에 높은 호환성을 보여 주었으며, NAD(P)보다 더 양성의 산화환원 전위(redox potential)를 가짐으로써 전기화학적 방법을 이용하여 동일한 전압을 걸어 주었을 때 NAD(P)보다 더 많은 양이 환원되었다. 또한 이렇게 환원된 NAD(P) 유도체들은 NAD(P)H에 비해 매우 안정하다는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과들로부터 조효소의 전기화학적인 환원이 필수적인 산업적으로 중요한 NAD(P)H-의존성 효소 반응 산물의 전기효소적 합성 반응에서 NAD(P) 유도체들은 종래의 NAD(P)에 비해 우수한 합성 효율을 얻을 수 있다.
도 1 은 본 발명에 따른 NAD(P) 유도체 및 대조군인 NAD(P)의 구조를 보여주는 화학식이다.
도 2 는 GDH에 의해 환원된 NAD 및 NAD 유도체의 전환율을 보여주는 그래프이다.
도 3 은 LDH에 의해 환원된 NAD 및 NAD 유도체의 전환율을 보여주는 그래프이다.
도 4 는 직접 전기화학적 방법에 의해 환원된 NAD 및 NAD 유도체의 전환율을 보여주는 그래프이다.
도 5 는 직접 전기화학적 방법에 의해 환원된 NAD의 안정성 테스트 결과를 보여준다.
도 6 은 직접 전기화학적 방법에 의해 환원된 thio-NAD의 안정성 테스트 결과를 보여준다.
도 7 은 직접 전기화학적 방법에 의해 환원된 APAD의 안정성 테스트 결과를 보여준다.
도 8 은 직접 전기화학적 방법에 의해 환원된 PAAD의 안정성 테스트 결과를 보여준다.
도 9 는 직접 전기화학적 방법에 의해 환원된 NAAD의 안정성 테스트 결과를 보여준다.
도 10 은 간접 전기화학적 방법에 의해 환원된 NAD 및 NAD 유도체의 전환율을 보여주는 그래프이다.
도 11 은 간접 전기화학적 방법에 의해 환원된 NAD의 안정성 테스트 결과를 보여준다.
도 12 는 간접 전기화학적 방법에 의해 환원된 APAD의 안정성 테스트 결과를 보여준다.
도 13 은 NADH-의존성 효소 반응 산물의 전기효소적 합성 반응을 보여주는 모식도이다.
본 발명은 화학식 I의 화합물을 전기화학적 방법으로 환원시키는 것을 포함하는 화학식 I의 화합물의 환원 방법을 제공한다:
[화학식 I]
Figure 112010073923100-pat00004
이 때, 상기 R 은 CSNH2, COCH3, CHO 또는 COOH 이고, R'는 OH 또는 OPO3H2일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 NAD(P)H-의존성 효소 반응 산물을 전기효소적으로 합성하는 데에 필수적인 전기화학적 NAD(P) 환원 반응에 있어서 종래에 잘 알려진 NAD(P) 대신 화학식 I에 개시된 바와 같은 NAD(P) 유도체를 이용하는 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서 사용한 "NAD(P)H-의존성 효소 반응 산물"이란 산화환원효소를 촉매로 이용하고 NAD(P)H를 조효소로 이용한 효소 반응 산물을 의미한다. 상기 NAD(P)H-의존성 효소 반응 산물로는 예를 들어, 키랄 알코올, 키랄 에폭사이드 등이 있을 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용한 "NAD(P)"란 "NAD 또는 NADP"를 의미하며, "NAD(P)H"란 "NADH 또는 NADPH"를 의미한다.
NAD와 NADP는 둘 다 전자(electron)와 양성자(proton)를 전달하는 동일한 조효소 활성을 나타내며, 다만 산화환원효소 기능 및 종류에 따라 NAD가 사용되거나 NADP가 조효소로서 사용된다. 비록 두 조효소가 구조적인 차이점을 보이나 (화학식 I 참조), 본 발명에서 전기화학적 환원 반응이 일어나는 부분은 리보오스(ribose)에 결합된 니코닌아마이드 링(nicotinamide ring) 부분이기 때문에 NAD와 NADP는 공통적인 전기화학적 환원 특성을 보일 수 있다.본 발명의 실시예에 따르면, NAD 유도체로서 티오니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (thionicotinamide adenine dinucleotide, thio-NAD), 3-아세틸피리딘 아데닌 디뉴클레오티드 (3-acetylpyridine adenine dinucleotide, APAD), 3-피리딘알데히드 아데닌 디뉴클레오티드 (3-pyridinealdehyde adenine dinucleotide, PAAD) 그리고 니코틴산 아데닌 디뉴클레오티드 (nicotinic acid adenine dinucleotide, NAAD)를 이용하였으며, NADP 유도체로서 티오니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (Thionicotinamide adenine dinucleotide phosphate, thio-NADP), 3-아세틸피리딘 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (3-acetylpyridine adenine dinucleotide, APADP), 3-피리딘알데히드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (3-Pyridinealdehyde adenine dinucleotide phosphate, PAADP) 그리고 니코틴산 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (Nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate, NAADP)를 이용할 수 있다. 상기 화합물들은 당업계에 공지된 일반적인 화학적 합성 방법에 의하여 합성할 수 있으며, 상업적으로 판매되는 화합물을 구매하여 사용하는 것도 가능하다.
하기 실시예를 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 NAD(P) 유도체들은 NAD(P)를 전기화학적 방법으로 환원시킨 것에 비해 동일한 전압을 걸어 주었을 때 더 많은 양이 환원됨으로써 전기화학적 환원 효율을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라, 환원된 NAD(P) 유도체는 환원된 NAD(P)인 NAD(P)H 보다 안정한 것을 특징으로 한다.
본 발명의 한 구체예에 따르면, 상기 화학식 I의 화합물을 환원시키기 위한 전기화학적 방법은 직접 전기화학적 방법 또는 간접 전기화학적 방법일 수 있다.
간접 전기화학적 방법을 이용하여 화학식 I의 화합물을 환원시키는 경우에 전자전달 매개체로서는, 예를 들면 비올로겐(viologen) 유도체, 페로센(ferrocene) 유도체, 퀴논(quinine) 유도체, 로듐(rhodium) 복합체 또는 다이아포레이즈(diaphorase)와 같은 효소를 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에 따르면 전자전달 매개체로서 로듐 복합체를 사용할 수 있고, 예를 들면 [CpRh(bpy)(H2O)]2+를 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 화학식 I의 화합물을 전기화학적 방법으로 환원시키는 것을 포함하고, 상기 환원된 화학식 I의 화합물을 조효소로 이용하는 것을 특징으로 하는 NAD(P)H-의존성 효소 반응 산물의 전기효소적 합성 방법을 제공한다:
[화학식 I]
Figure 112010073923100-pat00005
이 때, 상기 R 은 CSNH2, COCH3, CHO 또는 COOH 이고, R'는 OH 또는 OPO3H2일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 한 구체예에 따르면, 상기 화학식 I의 화합물을 환원시키기 위한 전기화학적 방법은 직접 전기화학적 방법 또는 간접 전기화학적 방법일 수 있다.
간접 전기화학적 방법을 이용하여 화학식 I의 화합물을 환원시키는 경우에 전자전달 매개체로서는, 예를 들면 비올로겐(viologen) 유도체, 페로센(ferrocene) 유도체, 퀴논(quinine) 유도체, 로듐(rhodium) 복합체 또는 다이아포레이즈(diaphorase)와 같은 효소를 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에 따르면 전자전달 매개체로서 로듐 복합체를 사용할 수 있고, 예를 들면 [CpRh(bpy)(H2O)]2+를 사용할 수 있다.
도 13 에 나타난 바와 같이, 산화환원효소를 촉매로 사용하고 환원된 NAD(P)H를 조효소로 사용하여 NAD(P)H-의존성 효소 반응 산물을 합성하는 반응에 있어서, NAD(P)H-의존성 효소 반응 산물의 합성 효율을 높이기 위하여 산화된 NAD(P)를 전기화학적으로 NAD(P)H로 효율적으로 환원시키는 것이 중요하다.
따라서 본 발명에 따르면 종래에 잘 알려진 NAD(P) 대신 전기화학적 환원 효율이 향상될 뿐만 아니라 안정성이 향상된 NAD(P) 유도체를 전기화학적 방법으로 환원시키고, 이렇게 환원된 NAD(P) 유도체를 조효소로 이용함으로써 NAD(P)H-의존성 효소 반응 산물의 합성 효율을 높일 수 있다.
또한 본 발명은 화학식 I의 화합물을 전기화학적 방법으로 환원시킨 화합물을 조효소로서 포함하는 NAD(P)H-의존성 효소 반응 산물의 전기효소적 합성 반응용 조성물을 제공한다:
[화학식 I]
Figure 112010073923100-pat00006
이 때, 상기 R 은 CSNH2, COCH3, CHO 또는 COOH 이고, R'는 OH 또는 OPO3H2일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
즉, 본 발명에 따른 화학식 I의 화합물을 전기화학적 방법으로 환원시킨 화합물을 NAD(P)H-의존성 효소 반응 산물의 전기효소적 합성 반응에 있어서 조효소로 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: NAD 유도체의 특성
본 발명에서는 대조군인 NAD와 실험군인 NAD 유도체로서 티오니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (thionicotinamide adenine dinucleotide, thio-NAD), 3-아세틸피리딘 아데닌 디뉴클레오티드 (3-acetylpyridine adenine dinucleotide, APAD), 3-피리딘알데히드 아데닌 디뉴클레오티드 (3-pyridinealdehyde adenine dinucleotide, PAAD) 그리고 니코틴산 아데닌 디뉴클레오티드 (nicotinic acid adenine dinucleotide, NAAD)를 이용하였다. 이들의 화학식은 도 1에 나타내었다.
환원된 NAD와 NAD 유도체들은 특정한 UV 흡수파장, 흡광계수, 산화환원 전위(redox potential)을 가진다. 이들을 하기 표 1에 나타내었다.
[표 1]
Figure 112010073923100-pat00007

환원된 형태의 NAD와 NAD 유도체들 각각의 흡수파장은 NAD는 338nm, thio-NAD는 395nm, APAD는 363nm, PAAD는 358nm, NAAD는 330nm 이다. 상기 흡수파장과 흡광계수를 이용하여, 전기화학적으로 생성된 환원된 NAD와 NAD 유도체들의 생성된 농도를 구할 수 있다.
실험예 1: NAD 유도체와 산화환원효소와의 호환성 테스트
NAD를 대신하여 도입한 NAD 유도체들이 산화환원효소에 의해 환원되어 산화환원효소와의 호환성이 있는지를 테스트하였다. 모델 효소로는 글루타민산 탈수소효소 (L-glutamate dehydrogenase from bovine liver, GDH)와 젖산 탈수소효소 (D-lactate dehydrogenase from Lactobacillus leichmanii, LDH)를 사용하였다. 효소의 농도는 0.05 U/ml로 하였고, 용매는 100 mM 인산염 완충용액 (pH 7)으로 하였다. 그리고 반응 시간은 30분으로 하였다. GDH는 기질인 글루타민산 (L-glutamate)을 20 mM 을 넣고 각 특정 흡수파장 영역에서의 kinetics를 측정해 흡광도의 변화를 측정한 후, 반응한 농도를 구하였다. LDH는 10 mM의 젖산 (D-lactate)를 기질로 사용해 각 특정 흡수파장 영역에서의 kinetics를 측정해 흡광도의 변화를 측정한 후, 흡광계수를 이용해 생성된 농도를 구하였다.
도 2 는 GDH에 의해 환원된 NAD 및 NAD 유도체의 농도 변화를 보여주는 그래프이다. PAAD가 가장 많이 효소에 의해 환원되었고, NAD, APAD, thio-NAD순으로 환원되었다. 결론적으로 NAAD를 제외한 NAD 유도체들이 GDH와 호환성이 있는 것을 알 수 있다.
도 3 은 LDH에 의해 환원된 NAD 및 NAD 유도체의 농도 변화를 보여주는 그래프이다. LDH의 경우 APAD가 가장 많이 효소에 의해 환원되었고, NAD, thio-NAD순으로 환원되었다. PAAD와 NAAD는 거의 반응하지 않는 것을 알 수 있다.
실험예 2: NAD 유도체의 직접 전기화학적 환원
NAD 유도체들과 대조군인 NAD를 직접 전기화학적 방법으로 환원시켜 보았다. 전기화학적 환원반응은 3 전극 셀에서 수행하였다. 사용한 기기는 The Series G™ 750 Potentiostat/Galvanostat/ZRA (Gamry, USA)이며, 기준 전극(reference electrode)은 Ag/AgCl (saturated KCl) 전극, 상대 전극(counter electrode)은 백금 선을 이용하였다. 마지막으로 작업 전극(working electrode)은 직경이 2 mm인 디스크 타입의 유리탄소전극(glassy carbon electrode)을 사용하였다. 3 전극 전기화학 셀에서 전압을 -2.0 V (vs. Ag/AgCl)로 하여 전자전달 매개체 없이 직접 전기화학적 방법으로 NAD 및 NAD 유도체들을 환원시켰다. NAD 및 NAD 유도체들은 10 mM의 농도로 100 mM 인산염 완충용액 (pH7)에 용해시켰으며, 산소와의 반응을 없애기 위해 10분간 아르곤을 불어넣어주었다. 반응 부피는 15 ml이며, 반응은 57시간 동안 상온, 상압에서 이루어졌다. 그리고 일정 시간마다 시료를 채취하여 특정 파장에서 각 환원된 형태의 흡광도를 측정하였다.
도 4 는 직접 전기화학적 방법에 의한 NAD 및 NAD 유도체의 환원반응의 결과를 보여준다. 도 4 를 통해 알 수 있는 바와 같이, APAD와 PAAD의 환원형은 대조군인 NAD의 환원형 보다 더 많이 생성되어, NAD 유도체의 도입을 통하여 전기화학적 환원 효율을 향상시킬 수 있음을 알 수 있다.
실험예 3: 직접 전기화학적 방법으로 환원된 NAD 유도체의 안전성 테스트
직접 전기화학적 방법으로 환원된 NAD 유도체들과 대조군인 NAD를 산환환원효소를 이용하여 효소반응을 시켜 보았다. 모델 효소로는 글루타민산 탈수소효소(GDH)와 젖산 탈수소효소(LDH)를 사용하였다. GDH는 NADH를 NAD로 산화시키면서 기질인 알파-케토글루타민산(alpha-ketoglutaric acid)과 황산암모늄(ammonium sulfate)으로부터 L-glutamate를 생성한다. LDH는 NADH를 NAD로 산화시키면서 기질인 나트륨 피루베이트(sodium pyruvate)로부터 키랄 D-lactate를 만든다. 앞서 이야기 했듯이 환원된 NAD와 NAD 유도체들은 특정한 파장 대에서 빛을 흡수하기 때문에 NADH-의존성 반응을 하는 효소인 GDH 및 LDH와 30분간 반응 kinetics를 측정하여 반응 진행을 확인하였다.
모든 기질들은 100 mM 인산염 완충용액 (pH7)에 녹였고 효소의 농도는 0.05 U/ml로 하였다. GDH는 15 mM의 알파케토글루타민산과 50 mM의 황산암모늄을 넣고, LDH는 20 mM의 나트륨 피루베이트를 넣고 반응시켰다. 안정성 확인을 위해 전기화학적으로 반응시킨 날을 0 일째로 하여 상온에서 그냥 나둔다. 그리고 1, 2, 4, 7 일째에 동일한 효소 반응을 시켰다. 모든 kinetics와 흡광도 측정은 UV/vis 분광광도계를 이용하였다.
도 5 는 대조군으로서 직접 전기화학적 방법에 의해 환원된 NAD (NADH)의 안정성 테스트 결과를 보여준다. (A) 는 GDH 효소반응에 참여하는 환원된 NAD (NADH)의 양이 0 일째에는 약 60 %, 1 일째에는 약 20 %에 이르지만 시간이 지날수록 그 양이 급격히 줄어들고 7 일째에는 대부분 반응이 일어나지 않음을 보여준다. (B) 는 LDH 효소반응에 참여하는 환원된 NAD (NADH)의 양이 0, 1 일째에는 약 20 % 정도에 이르지만 시간이 지날수록 그 양이 줄어들고 7 일째에는 대부분 반응이 일어나지 않음을 보여준다. 이를 통하여 대조군인 NAD의 환원형인 NADH의 안정성이 매우 낮은 것을 확인할 수 있다.
도 6 은 직접 전기화학적 방법에 의해 환원된 thio-NAD의 안정성 테스트 결과를 보여준다. 환원된 thio-NAD 는 대조군인 NADH에 비해 GDH 효소반응(A)과 LDH 효소반응(B)에 적은 양이 반응하였으나, 7 일이 지나도 동일한 반응성을 유지하며 매우 안정한 상태를 유지함을 알 수 있다.
도 7 은 직접 전기화학적 방법에 의해 환원된 APAD의 안정성 테스트 결과를 보여준다. GDH 효소반응(A) 및 LDH 효소반응(B)에 참여하는 환원된 APAD의 양이 7 일째에 다소 감소하기는 하였지만 전반적으로 안정적인 반응성을 유지함을 알 수 있다.
도 8 은 직접 전기화학적 방법에 의해 환원된 PAAD의 안정성 테스트 결과를 보여준다. 전기화학적으로 환원시킨 PAAD는 GDH에서 미약하게 반응이 있었고(A), LDH에서는 반응이 없었다(B). 하지만 시간이 지나도 반응성에 거의 변화가 없는 상태로 안정적으로 존재하였다.
도 9 는 직접 전기화학적 방법에 의해 환원된 NAAD의 안정성 테스트 결과를 보여준다. 전기화학적으로 환원시킨 NAAD는 GDH에서 미약하게 반응을 하였고(A), LDH에서도 반응을 하였다(B). 환원된 NAAD의 경우 시간에 따라 다소 불안정한 상태를 보였다.
실험예 4: NAD 유도체의 간접 전기화학적 환원
NAD 유도체들과 대조군인 NAD를 전기화학적 방법으로 환원시켜 보았다. 전기화학적 환원반응은 3 전극 셀에서 수행하였다. 사용한 기기는 The Series G™ 750 Potentiostat/Galvanostat/ZRA (Gamry, USA)이며, 기준 전극(reference electrode)은 Ag/AgCl (saturated KCl) 전극, 상대 전극(counter electrode)은 백금 선을 이용하였다. 마지막으로 작업 전극(working electrode)은 직경이 2 mm인 디스크 타입의 유리탄소전극(glassy carbon electrode)을 사용하였다. 3 전극 전기화학 셀에서 전압을 -0.8 V (vs. Ag/AgCl)로 하여 전기화학적 방법으로 NAD 및 NAD 유도체들을 환원시켰다. NAD 및 NAD 유도체들은 10 mM의 농도로, 전자전달 매개체인 로듐 복합체([CpRh(bpy)(H2O)]2+)는 0.5mM의 농도로 100 mM 인산염 완충용액 (pH7)에 용해시켰으며, 산소와의 반응을 없애기 위해 10분간 아르곤을 불어넣어주었다. 반응 부피는 15 ml이며, 반응은 72시간 동안 상온, 상압에서 이루어졌다. 그리고 일정 시간마다 시료를 채취하여 특정 파장에서 각 환원된 형태의 흡광도를 측정하였다.
도 10 는 간접 전기화학적 방법에 의한 NAD 및 NAD 유도체의 환원반응의 결과를 보여준다. 도 10 를 통해 알 수 있는 바와 같이, APAD, PAAD 및 thio-NAD의 환원형은 대조군인 NAD의 환원형 보다 더 많이 생성되어, NAD 유도체의 도입을 통하여 전기화학적 환원 효율을 향상시킬 수 있음을 알 수 있다.
실험예 5: 간접 전기화학적 방법으로 환원된 NAD 유도체의 안정성 테스트
간접 전기화학적 방법으로 환원된 NAD 유도체인 APAD와 대조군인 NAD를 산환환원효소를 이용하여 효소반응시켜 보았다. 모델 효소로는 글루타민산 탈수소효소(GDH)와 젖산 탈수소효소(LDH)를 사용하였다. GDH는 NADH를 NAD로 산화시키면서 기질인 알파-케토글루타민산(alpha-ketoglutaric acid)과 황산암모늄(ammonium sulfate)으로부터 L-glutamate를 생성한다. LDH는 NADH를 NAD로 산화시키면서 기질인 나트륨 피루베이트(sodium pyruvate)로부터 키랄 D-lactate를 만든다. 앞서 이야기 했듯이 환원된 NAD와 NAD 유도체들은 특정한 파장 대에서 빛을 흡수하기 때문에 NADH-의존성 반응을 하는 효소인 GDH 및 LDH와 30분간 반응 kinetics를 측정하여 반응 진행을 확인하였다.
모든 기질들은 100 mM 인산염 완충용액 (pH 7)에 녹였고 효소의 농도는 0.05 U/ml로 하였다. GDH는 15 mM의 알파케토글루타민산과 50 mM의 황산암모늄을 넣고, LDH는 20 mM의 나트륨 피루베이트를 넣고 반응시켰다. 안정성 확인을 위해 전기화학적으로 반응시킨 날을 0 시간으로 하여 4℃와 37℃에 1, 6, 24 시간동안 보관하고 동일한 효소 반응을 시켰다. 모든 kinetics와 흡광도 측정은 UV/vis 분광광도계를 이용하였다.
도 11 는 대조군으로서 간접 전기화학적 방법에 의해 환원된 NAD의 안정성 테스트 결과를 보여준다. 온도(4℃와 37℃)와 시간에 따라 효소반응을 수행하였다. (A) 는 GDH 효소반응에 참여하는 환원된 NAD의 양이 0 시간에는 반응이 없다가 4℃일 때에는 1, 6, 24시간 동안 동일하게 90% 정도 반응이 지속적으로 나타났다. 반면에 (B)에 나타낸 것처럼 37℃에서 보관한 경우에는 GDH 효소반응에 참여하는 환원된 NAD의 양이 1시간에는 약 80%정도가 있고, 6시간에는 60%정도가 있고, 24시간 째에는 거의 반응성이 없는 것으로 나타났다. (C) 는 4℃에서 보관한 간접 전기화학적으로 환원시킨 NAD를 이용한 LDH 효소반응이며, GDH 효소반응과 비슷한 결과를 얻어내었다. (D) 는 37℃에서 보관한 NAD를 이용한 LDH 효소반응이다. 이를 통하여 대조군인 NAD의 환원형인 NADH의 안정성이 매우 낮은 것을 확인할 수 있다.
도 12 는 간접 전기화학적 방법에 의해 환원된 APAD의 안정성 테스트 결과를 보여준다. 온도(4℃와 37℃)와 시간에 따른 GDH 효소반응(A, B) 및 LDH 효소반응(C, D)을 수행하였다. 효소반응에 참여하는 환원된 APAD는 두 효소반응 모두 70%정도가 되며, 0시간부터 24시간까지 동일한 반응성을 나타내었다. 또한, 4℃와 37℃에서도 계속 70%정도의 반응성을 나타내는 것을 통해 간접 전기화학적으로 환원시킨 APAD가 안정성이 뛰어나다는 것을 알 수 있다.

Claims (6)

  1. 화학식 I의 화합물을 전기화학적 방법으로 환원시키는 것을 포함하는 화학식 I의 화합물의 환원 방법:
    [화학식 I]
    Figure 112010073923100-pat00008

    이 때,
    상기 R 은 CSNH2, COCH3, CHO 또는 COOH 이고,
    R'는 OH 또는 OPO3H2이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 전기화학적 방법은 직접 전기화학적 방법 또는 간접 전기화학적 방법인 화학식 I의 화합물의 환원 방법.
  3. 화학식 I의 화합물을 전기화학적 방법으로 환원시킨 화합물을 조효소로 이용하는 것을 특징으로 하는 NADH-의존성 효소 반응 산물의 전기효소적 합성 방법:
    [화학식 I]
    Figure 112010073923100-pat00009

    이 때, 상기 R 은 CSNH2, COCH3, CHO 또는 COOH 이고,
    R'는 OH 또는 OPO3H2이다.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 전기화학적 방법은 직접 전기화학적 방법 또는 간접 전기화학적 방법인 화학식 I의 화합물의 환원 방법.
  5. 화학식 I의 화합물을 전기화학적 방법으로 환원시킨 화합물을 조효소로서 포함하는 NADH-의존성 효소 반응 산물의 전기효소적 합성 반응용 조성물:
    [화학식 I]
    Figure 112010073923100-pat00010

    이 때, 상기 R 은 CSNH2, COCH3, CHO 또는 COOH 이고,
    R'는 OH 또는 OPO3H2이다.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 전기화학적 방법은 직접 전기화학적 방법 또는 간접 전기화학적 방법인 화학식 I의 화합물의 환원 방법.
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KR20080028507A (ko) * 2005-07-28 2008-03-31 에프. 호프만-라 로슈 아게 안정한 ｎａｄ/ｎａｄｈ 유도체
KR20090023541A (ko) * 2007-09-01 2009-03-05 재단법인서울대학교산학협력재단 조효소의 전기화학적 재생 방법

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