KR101039753B1 - 금속 나노입자를 이용한 옥시도리덕타제 보조인자의전기화학적 재생방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 금속 나노입자를 이용한 옥시도리덕타제 보조인자의 전기화학적 재생방법에 관한 것으로, 3-전극 시스템을 구비한 반응기 내에서 산화형의 옥시도리덕타제 보조인자를 메틸비올로겐, 루테늄 II 복합체 및 로듐 III 복합체로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 1종 이상의 1차 산화환원 매개체; 및 2차 산화환원 매개체인 금속 나노입자 존재 하에 전기화학적으로 환원형의 옥시도리덕타제 보조인자로 변환시켜 재생하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 금속 나노입자는 상기 재생방법에 있어서, 2차 산화환원 매개체이자 촉매로 작용하여 옥시도리덕타제 보조인자의 재생 속도를 상승시키는 효과를 나타내는 바, 옥시도리덕타제 효소를 이용하는 다양한 생촉매반응의 효율을 높이는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

옥시도리덕타제, 보조인자, 조효소, 금속나노입자, (헥사메틸벤젠-2,2′-비피리딘클로로)루테늄(II), 펜타메틸사이클로펜타디에닐-2,2'-비피리딘클로로)로듐(III), 전기화학적 방법, 생촉매반응

Description

금속 나노입자를 이용한 옥시도리덕타제 보조인자의 전기화학적 재생방법{The method for regeneration of oxidoreductase cofactor using metal nanoparticle}

본 발명은 금속 나노입자를 이용한 옥시도리덕타제 보조인자의 전기화학적 재생방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 3-전극 시스템을 구비한 반응기 내에서 산화형의 옥시도리덕타제 보조인자를 메틸비올로겐, 루테늄 II 복합체 및 로듐 III 복합체로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 1종 이상의 1차 산화환원 매개체와 2차 산화환원 매개체인 금속 나노입자 존재 하에 전기화학적으로 환원형의 옥시도리덕타제 보조인자로 변환시켜 재생하는 방법에 관한 것이다.

효소는 단백질로 이루어진 주효소(apoenzyme)와 조효소(coenzyme)로 이루어지며, 상기 조효소는 금속이온 여부에 따라 보조인자(cofactor) 또는 보결족(prosthetic group)으로 구분된다. 우리가 통상적으로 말하는 조효소는 엄밀하게는 보조인자(cofactor)를 말하는 것으로서, 상기 보조인자는 기질로부터 이탈된 원 자나 원자단을 일시적으로 수용하여 다른 물질에 전달하는 역할을 하며 대표적으로 니코틴아미드 보조인자인 NAD, NADP와 플라빈 보조인자인 FAD, FMN 등이 있다.

상기 니코틴아미드 보조인자와 플라빈 보조인자 또는 그들의 산화된 형태는 많은 종류의 옥시도리덕타제가 수행하는 산화환원 생촉매반응에 있어서 필수적인 보조인자로 이용된다(E. Siu et al., Biotechnol. Prog . 23, 293, 2007; W. A. van der Donk and H. Zhao, Curr . Opin . Biotechnol . 14, 421, 2003). 상기 생촉매반응은 실험실 내 유기합성 및 다양한 공업 분야에서 있어서 점점 더 중요해지고 있다. 생촉매 반응의 효율을 높이기 위해서는, 효소의 지속적 반응 수행을 위한 보조인자가 지속적으로 재생되어야 할 필요가 있지만, 다양한 방식으로 널리 이용되고 있는 가수분해 효소와는 달리, 산화환원 효소의 사용에 있어서 만족할만한 보조인자 재생방법이 확립되지 않아 그다지 널리 상용화되고 있지 않은 현실이다.

이에 전기화학적 재생(electrochemical regeneration)은 기존의 제2효소/기질 재생방법을 대체할 수 있는 하나의 매력적인 방법으로 여겨져 왔다 (F. Hollmann and A. Schmid, Biocatal . Biotransform . 22, 63, 2004). 하지만 전기화학적 재생방법에서도 NAD(P)⁺의 NAD(P)H로의 환원이 열역학적으로 선호되는 전압조건에서도 전극과 NAD(P)⁺사이의 느린 전자전달 속도로 인하여 재생 효율이 떨어지는 단점이 있었다.

이를 해결하기 위하여 균등질의 산화환원 매개체(mediator)를 사용하여 전극과 NAD(P)⁺사이에 전자를 전달하는 방법이 개발된 바 있다(H. Jaegfeldt et al., Anal. Chem . 53, 1979, 1981; J. Wang and J. Liu Anal . Chim . Acta, 284, 385, 1993; J. Wang et al., Anal . Chim . Acta, 360, 171, 1998).

구체적으로, 메틸비올로겐(methyl viologen)이 NAD(P)H에 대한 전자전달 매개체로써 Flavoenzyme(Ferredoxin reductase(FDR) 혹은 Lipoamide Dehydrogenase(LipDH))과 함께 간접적인 전기화학적 재생에 사용된 바 있으며(Dicosimo et al. J Org Chem (1981) 46 : 4622-4623), 루테늄(II) 복합체인 (헥사메틸벤젠-2,2′-비피리딘클로로)루테늄(II)을 케톤류의 알콜로의 환원에 전자전달을 위한 매개체로 사용된 바 있고(Ogo S, Abura T, Watanabe Y(2002) Organometallics 21:2964-2969; Yaw Kai Yan et al. J Biol Inorg Chem (2006) 11: 483-488), 로듐 (III) 복합체인 (펜타메틸사이클로펜타디에닐-2,2'-비피리딘클로로)로듐(III):[Cp*Rh(bpy)H₂O]²⁺(이하 M_ox)를 NAD(P)⁺에의 전자전달을 위한 매개체로 사용한 바 있으며(R. Ruppert, S. Herrmann, E. Steckhan, Tetrahedron Lett. 1987, 28, 6583; F. Hollmann, A. Schmid, E. Steckhan, Angew . Chem. 2001, 113, 190; Angew . Chem . Int . Ed. 2001, 40, 169; K. Vuorilehto, S. Lutz, C. Wandrey, Bioelectrochemistry 2004, 65, 1.), 상기 로듐 III 복합체를 FADH₂의 재생에 사용한 바 있다(F. Hollmann et al. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 19- 20(2003) 167-176)

상기 전자전달 매개체 중에서 로듐 III 복합체 M_ox는 전기화학/화학적 과정을 거쳐 활성 환원체인 M_red2 로 변환되어 NADH의 재생에 관여한다. M_ox는 두 개의 전자를 받아들여 전기화학적인 변화로 M_red1의 상태가 된다(E-step). 이어서 상기 M_red1은 총 전자의 양은 변하지 않고 용액 상에서 하나의 양성자를 취함으로써 화학적인 과정을 통해 M_red2로 변환된다(C-step). 상기 활성 환원체인 M_red2는 전자 두 개와 양성자 하나를 NAD(P)⁺에 제공하여 NAD(P)H로 변환시키고, 이때 자신은 초기상태인 M_ox로 돌아가게 된다(도 1 참조).

하지만, 상기 로듐 III 복합체 M 사용시 NADH 생산이 약간 증가하기는 하지만, 그다지 만족할 만한 수준의 재생속도를 얻지는 못하였다.

상기 메커니즘에서 M_red1에서 M_red2으로의 화학적인 단계(C-step)가 전체 반응시간에 있어서 반응속도 결정단계(rate determining step, rds)로 알려져 있다(F. Hollmann et al., Angew . Chem . Int . Ed . 113, 190 2001; F. Hollmann et al., Angew . Chem . Int . Ed . 40, 169 2001). 따라서, 보다 효율적인 NADH의 재생을 위해서는 상기 화학적 단계에서의 양성자 흡수 동역학을 증가시킬 필요가 있다.

이에 본 발명자는 금속 나노입자에 주목하게 되었다.

백금은 전해질 내의 양성자를 수소로 환원시키는 수소발생반응(hydrogen evolution reaction, HER)에서, 그리고 연료전지에서 수소를 양성자로 산화시키는 데 광범위하게 사용되어왔다(N. Nanbu et al., J. Electroanal . Chem ., 485, 128, 2000; A. Henglein et al., J. Phys Chem . C, 111, 606, 1981). 백금은 양성자가 백금 원소의 표면에 흡착되는 성질 때문에 촉매로서의 특성이 다른 물질들보다 뛰어난 장점이 있다. 상기 양성자가 흡착된 백금(이하, 백금나노입자-흡착수소 복합체; Pt-H_ads)은 H⁺/H₂ 반응을 동역학적으로 더 쉽게 만들어, 결과적으로 반응에 필요한 과전압을 감소시킨다.

한편, 백금 이외의 금속-H_ads 들은, 유기분자들에 대해 환원제로 기능할 수 있는 것으로 알려져 있는데, 특히 나노입자상에서의 경우 그 효과가 현저하다. 종래, 루시제닌 양이온을 단일양이온 라디칼로 환원시키데 있어서 백금나노입자-흡착수소 복합체(nPt-H_ads)를 사용한 바 있으며(J. Z. Guo et al., J. Phys . Chem . C, 111, 606, 2007). 또한, 다른 금속 나노입자로서, 은나노입자-흡착수소 복합체(nAg-H_ads)를 CH₂Cl₂를 CH₃Cl로, Ti⁺를, Ti⁰로 환원시키는데 사용하거나, 팔라듐나노입자-흡착수소 복합체(nPd-H_ads)를 Pt^{4 +}를 Pt^{2 +}나 Pt⁰로 환원시키는데 사용한 바 있 다(A. Henglein, J. Phys . Chem ., 83, 2858, 1979; Y. Wang and N. Toshima, J. Phys . Chem. B, 101, 5301, 1997). 따라서, 금, 은, 철, 니켈, 구리, 이리듐, 루테늄, 코발트, 크롬, 팔라듐 등의 금속들은 백금과 유사한 기능을 할 수 있을 것으로 기대된다.

하지만, 지금까지 상기 금속 나노입자를 옥시도리덕타제 보조인자의 재생에 사용한 적은 전혀 없었으며, 종래 알려진 매개체와 혼합하여 사용하는 경우의 효과 역시 전혀 보고된 바 없다.

이에 본 발명자는 종래 전기화학적으로 옥시도리덕타제 보조인자를 재생하는 방법이 효율이 낮음을 감안하여 이를 개선코자 각고의 노력을 거듭한 결과, 메틸비올로겐, 루테늄 II 복합체 및 로듐 III 복합체로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 1종 이상의 1차 산화환원 매개체 외에 금속 나노입자를 추가하는 경우, 상기 금속 나노입자가 촉매 겸 2차 매개체로 작용하여 보조인자 생성 속도를 향상시키는 작용을 한다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 종래 옥시도리덕타제 보조인자의 재생방법을 개선하기 위한 것으로 보다 효율이 높은 옥시도리덕타제 보조인자의 전기화학적 재생방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 3-전극 시스템을 구비한 반응기 내에서 산화형의 옥시도리덕타제 보조인자를 메틸비올로겐, 루테늄 II 복합체 및 로듐 III 복합체로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 1종 이상의 1차 산화환원 매개체뿐만 아니라 금속 나노입자 존재 하에 전기화학적으로 환원형의 옥시도리덕타제 보조인자로 변환시켜 재생하는 방법을 제공한다.

본 발명은 금속 나노입자를 이용한 옥시도리덕타제 보조인자의 전기화학적 재생방법에 관한 것으로, 상기 금속 나노입자가 옥시도리덕타제 보조인자의 전기화학적 재생에 있어서, 2차 매개체이자 촉매로 작용하여 옥시도리덕타제 보조인자의 재생 속도를 상승시키는 효과를 나타내는 바, 옥시도리덕타제 효소를 이용하는 다양한 생촉매반응의 효율을 높이는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 4단계를 포함하여 이루어지는 옥시도리덕타제(oxidoreductase) 보조인자(cofactor)의 전기화학적 재생방법을 제공한다.

<단계 1> : 옥시도리덕타제 반응기에 산화형의 옥시도리덕타제 보조인자; 메틸비올로겐, 루테늄 II 복합체 및 로듐 III 복합체로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 1종 이상의 1차 산화환원 매개체; 및 2차 산화환원 매개체인 금속 나노입자를 첨가하는 단계

<단계 2> : 상기 단계 1의 반응기에 전압을 인가한 후 교반하여 환원형의 옥시도리덕타제 보조인자를 생성시키는 단계.

본 발명의 방법 중 단계 1은 옥시도리덕타제 반응기에 산화형의 옥시도리덕타제 및 산화환원 매개체를 첨가하는 단계이다.

본 발명의 전기화학적 재생방법은 옥시도리덕타제 반응기(bioreactor)에서 수행될 수 있다. 상기 반응기는 작업전극(working electrode), 기준전극(reference electrode) 및 보조전극(counter electrode)으로 이루어지는 3전극 시스템(3-electrodes system)을 구비하는 것이 바람직하다.

상기 작업전극(working electrode)은 전기화학반응(Redox)이 일어나는 전극으로서, 당업자의 관점에서 백금전극(PTE), 금전극(AUE), 유리탄소전극(GCE), 은전 극(AGE), 탄소 페이스트전극(CPE), 니켈전극(NIE) 또는 팔라듐전극(PDE) 등을 이용할 수 있으나, 바람직하게는 유리탄소전극, 금전극 또는 백금전극일 수 있다.

상기 기준전극(reference electrode)은 화학전지의 기전력(起電力) 또는 전극전위를 측정할 때 사용하는 단극전위(單極電位)가 일정하여 기준이 될 수 있는 전극을 의미하는 것으로서, 이 전극과 다른 전극으로 전지를 만들어 그 기전력을 측정하면, 기준전극의 전위는 이미 알고 있으므로 측정하는 다른 전극의 전위를 알 수 있다. 당업자의 관점에서 기준전극으로 은/염화은전극, 칼로멜전극 , 수은/황산수은(I)전극 또는 수은/산화수은전극 등을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 은/염화은전극일 수 있다.

상기 보조전극(counter or auxiliary electrode)은 작업전극의 반응을 방해하는 요건을 제거하기 위하여 사용되는 전극으로서, 당업자의 관점에서 백금전극 또는 탄소전극을 이용할 수 있으나, 바람직하게는 백금전극일 수 있다.

본 발명의 전기화학적 환원의 대상이 되는 산화형의 옥시도리덕타제 보조인자는 니코틴아미드 보조인자인 NAD⁺(nicotinamide adenine dinucleotide), NADP⁺(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) 또는 플라빈 보조인자인 FAD⁺(flavin adenine dinucleotide), FMN⁺(flavin mononucleotide)일 수 있으며, 바람직하게는 NAD⁺일 수 있다.

본 발명의 단계 1의 1차 산화환원 매개체는 메틸비올로겐, 루테늄 II 복합체 및 로듐 III 복합체는 산화형의 옥시도리덕타제 보조인자에 전자 전달(electron transfer)을 위한 1차 매개체의 용도로 사용된다.

상기 산화환원 매개체 중 메틸비올로겐(methyl viologen)이 NAD(P)H에 대한 전자전달 매개체로써 Flavoenzyme(Ferredoxin reductase (FDR) 혹은 Lipoamide Dehydrogenase(LipDH))과 함께 간접적인 전기화학적 재생에 사용된 바 있으며(Dicosimo et al. J Org Chem (1981) 46 : 4622-4623), 루테늄(II) 복합체인 (헥사메틸벤젠-2,2′-비피리딘클로로)루테늄(II)을 케톤류의 알콜로의 환원에 전자전달을 위한 매개체로 사용된 바 있고(Ogo S, Abura T, Watanabe Y(2002) Organometallics 21:2964-2969; Yaw Kai Yan et al. J Biol Inorg Chem (2006) 11: 483-488), 로듐 (III) 복합체인 (펜타메틸사이클로펜타디에닐-2,2'-비피리딘클로로)로듐(III):[Cp*Rh(bpy)H₂O]²⁺(이하 M_ox)를 NAD(P)⁺에의 전자전달을 위한 매개체(R. Ruppert, S. Herrmann, E. Steckhan, Tetrahedron Lett. 1987, 28, 6583; F. Hollmann, A. Schmid, E. Steckhan, Angew . Chem. 2001, 113, 190; Angew . Chem . Int . Ed . 2001, 40, 169; K. Vuorilehto, S. Lutz, C. Wandrey, Bioelectrochemistry 2004, 65, 1.) 및 FAD+에의 전자전달을 위한 매개체(F. Hollmann et al. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 19-20(2003) 167-176)로 사용된 바 있다. 따라서, 상기 1차 산화환원 매개체는 전자와 양성자를 전 달함으로써 옥시도리덕타제 보조인자의 재생 동역학(kinetics)을 개량하는데 사용된다.

상기 루테늄 II 복합체는 바람직하게는 (헥사메틸벤젠-2,2′-비피리딘클로로)루테늄(II)일 수 있고, 상기 로듐 III 복합체는 (펜타메틸사이클로펜타디에닐-2,2'-비피리딘클로로)로듐(III)을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에 추가되는 금속나노입자는 상기 1차 산화환원 매개체와 옥시도리덕타제 보조인자가 존재하는 단일 매개체 시스템에 도입시 1) 양성자 전달을 위한 균질 촉매로서의 기능과 2) 전극으로부터 전하를 얻어 상기 1차 산화환원 매개체에 전달하기 위한 부가매개체로서의 기능, 즉, 촉매이자 2차 매개체로서의 역할을 한다.

당업자의 관점에서 상기 금속나노입자는 환원제 역할을 할 수 있는 금속이면 어느 것이나 가능하나, 바람직하게는 금, 은, 백금, 철, 니켈, 구리, 이리듐, 루테듐, 코발트, 크롬, 팔라듐으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다(Yan, Li., React. Kinet. Catal. Lett. Vol. 88, No. 1, 105-110(2006); Guo Hua LAI, Chinese Chemical Lettes Vol. 15, No.12, pp 1494-1496(2004); Arnim Henglein, Chem. rev. 1989, 89, 1861-1873; Christine M. Anal bioanal Chem (2006) 384:601-619). 더욱 바람직하게는 백금 나노입자(nPt)를 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용된 가장 바람직한 금속 나노입자인 백금 나노입자(nPt)는 당업자의 관점에서 통상적으로 알려진 방법으로 제조할 수 있으나, 바람직하게는 사염화백금칼륨염의 시트레이트 환원에 의해 제조할 수 있다(D. N. Furlong, A. Launikonis, W. H. F. Sasse, Chem . Soc . Faraday Trans, 1 1984, 80, 571; I. Okura in Encyclopedia of Nanoscience and Nanotechnology, Vol. 8 (Ed.:H. S. Nalwa), American Scientific Publishers, 2004, P.41).

상기 백금 나노입자의 첨가량은 크게 제한되지는 않으나, 바람직하게는 전해질에 1 pM 이상의 농도로 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법 중 단계 2는 단계 1의 반응기에 전압을 인가한 후 교반하여 환원형의 옥시도리덕타제 보조인자를 생성시키는 단계이다.

상기 단계 2의 전압은 -0.7 내지 -0.9 V인 것이 바람직하다. 상기 전압 범위보다 낮은 경우 촉매기능이 나타나지 않을 수 있으며, 너무 높은 전압에서는 수소발생과 같이 원하지 않는 반응이 일어날 수 있다.

상기 단계 2의 전압의 인가에 의하여 금속 나노입자가 전극으로부터 전자를 받아들여 금속 나노입자-흡착수소 복합체(metal-H_ads)를 형성하고(단계 a); 상기 단계 a의 금속 나노입자-흡착수소 복합체가 1차 산화환원 매개체에 전자를 전달하는 단계(단계 b); 상기 단계 a의 금속나노입자-흡착수소 복합체가 상기 1차 산화환원 매개체에 양성자를 전달하는 단계(단계 c); 전자와 양성자를 받은 1차 산화환원 매개체가 산화형 옥시도리덕타제 보조인자에게 전자와 양성자를 전달하여 환원형 옥 시도리덕타제 보조인자를 형성하게 된다(단계 d). 즉 본 발명에서 사용한 금속 나노입자는 1차 산화환원 매개체의 존재 하에 2차 매개체이자 촉매로 작용하여 양성자와 전자의 전달에 관여하게 된다.

구체적으로, 본 발명에서는 1차 산화환원 매개체로 로듐 복합체(III)를 사용하였으며, 이 경우, 도 2에 나타낸 바와 같이, 전압의 인가에 의하여 금속 나노입자가 전극으로부터 전자를 받아들여 금속 나노입자-흡착수소 복합체(metal-H_ads)를 형성하고(단계 a); 상기 단계 a의 금속 나노입자-흡착수소 복합체가 M_ox에 전자를 전달하여 M_red1을 형성하며(단계 b); 상기 단계 a의 금속나노입자-흡착수소 복합체가 단계 b의 M_red1에 양성자를 전달하여 M_red2를 형성하고(단계 c); 상기 단계 c의 M_red2가 산화형 옥시도리덕타제 보조인자에게 전자와 양성자를 전달하여 환원형 옥시도리덕타제 보조인자를 형성하게 된다(단계 d).

한편, 본 발명의 제조방법 중 단계 2의 교반은 최소 200 rpm 이상으로 수행하는 것이 바람직하다. 200 rpm 이하에서는 전자 및 양성자가 원활히 이동되기에 충분한 교반이 진행되지 않아 옥시도리덕타제 보조인자의 재생이 더디게 일어날 수 있는 단점이 있기 때문이다.

본 발명의 효과를 확인하기 위하여, 백금 나노입자의 비존재 또는 존재시 NAD⁺에서 NADH로의 변환 속도(conversion rate)를 살펴본 결과, 백금 나노입자의 비존재시와 존재시의 속도차는 3.82 nmols^-1cm^-2로서 백금 나노입자가 존재시 NADH 생성속도가 25배 증가됨을 확인할 수 있었다(도 4c 참조). 또한, 백금 나노입자의 양이 증가할수록 NADH의 생성양이 많아지며, 교반시 NADH 생성량이 증가함을 확인할 수 있었다(도 5 참조)

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 재생된 옥시도리덕타제 보조인자를, 옥시도리덕타제 보조인자-의존 산화화원 촉매반응에서의 보조인자로 사용하는 산화환원 촉매반응 속도 향상방법을 제공한다.

이에, 본 발명의 방법에 의하여 재생된 NADH의 기능을 확인하기 위하여 α-케토글루탐산의 글루탐산으로의 전환율을 살펴본 결과, 본 발명의 재생된 NADH에 의하여 글루탐산이 생성됨을 확인할 수 있었고, 또한, 생성되는 글루탐산의 양이 첨가한 백금 나노입자의 농도에 비례함을 알 수 있었다(도 8 참조).

이로부터, 본 발명에서 사용한 금속 나노입자는 1차 산화환원 매개체의 존재 하에 2차 매개체이자 촉매로 작용하여 양성자와 전자의 전달에 관여함으로써, 옥시도리덕타제 보조인자의 재생속도를 상승시키는데 기여하는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 방법은 옥시도리덕타제 효소를 이용하는 다양한 산화환원 촉매반응의 효율을 높일 수 있으며, 특히 높은 pH 환경과 같이 열악한 환경 하에서도 효율적일 것으로 판단된다. 또한, 본 발명의 방법은 옥시도리덕타제 보조인자의 재생뿐만 아니라 다른 물질의 화학반응에서도 확대적용 할 수 있을 것으로 추측된다.

이하, 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 로듐 III 복합체 M 및 백금 나노입자( nPt )의 제조

NAD⁺와 전극간의 전자를 전달하기 위한 유기금속 매개체로 로듐 III 복합체인 (펜타메틸사이클로펜타디에닐-2,2'-비피리딘클로로)로듐(III) (이하 M이라 함; M=[Cp^*Rh(bpy)Cl]⁺; Cp^*=C⁵Me⁵, bpy=2,2'-비피리딘)을 사용하였다. 상기 로듐 III 복합체 M은 Kelle와 Gratzel의 방법(F. Hollmann, B. Witholt, A. Schmid, J. Mol . Catal. B 2002, 19-20, 167)으로 합성하였다.

한편, 백금나노입자(nPt)는 사염화백금칼륨염(potassium tetracholroplatinate)의 시트레이트 환원에 의하여 제조하였다(D. N. Furlong, A. Launikonis, W. H. F. Sasse, Chem . Soc . Faraday Trans, 1 1984, 80, 571; I. Okura in Encyclopedia of Nanoscience and Nanotechnology, Vol. 8 (Ed.:H. S. Nalwa), American Scientific Publishers, 2004, P.41). 즉, 소디움 시트레이트 수용액(30 mL, 680 mM)을 K₂PtCl₄(120 mL, 11.5 mM) 및 폴리비닐피롤리돈(3 g, 분자량 10k)의 끓는 수용성 혼합물에 4시간동안 첨가하여 제조하였다.

실시예 2: 로듐 III 복합체 및 백금 나노입자(nPt)를 이용한 전기화학적 방법에 의한 NADH의 재생

전기화학적 방법에 의하여 NADH를 재생하기 위하여 3개의 전극을 갖는 단일구획 셀(single-compartment cell)을 제작하였다. 작업전극(working electrode; 0.03 cm²)으로 유리 탄소(GC) 디스크를, 보조전극(counter electrode)으로 백금 와이어를, 기준전극(reference electrode; 0.197 V vs 표준수소전극)으로 potentiostat/galvanostat(EG & G, Model 273A)에 연결된 은/염화은(Ag/AgCl) 전극을 사용하였다.

NADH 생성의 1차 산화환원 매개체(mediator)인 로듐 III 복합체 M은 0.5 mM의 농도로 사용하였고, 2차 매개체이자 촉매로 사용하는 백금 나노입자(nPt)는 0.3, 0.6 또는 1.2 mM의 농도로 각각 사용하였으며, NAD⁺는 0.5 mM 또는 1 mM의 농도로 사용하였다.

전해질로는 인산염버퍼(100 mM, pH 7.0)를 사용하였고, 상기 버퍼에 M, nPt 및 NAD⁺를 첨가하고 -0.8 V 하에 340 rpm으로 교반하여 용해시켰다.

실험예 1: 로듐 III 복합체 M의 순환 전압-전류도

로듐 III 복합체 M의 NADH 재생에 있어서의 동역학(kinetics)을 알아보기 위하여, 상기 복합체 M을 0.5 mM의 농도로 인산염버퍼(100 mM, pH 8.2)에 용해시킨 후 다양한 검사 속도(scan rate)에서 순환 전압-전류도(cyclic voltammogram)를 측정하였다.

측정결과는 도 3a와 도 3b에 나타내었다.

도 3a에서 알 수 있는 바와 같이, 애노딕 피크의 세기는 검사 속도에 비례하여 증가하는 반면, 100 mV/s 이하의 느린 검사 속도에서는 선명하게 나타나지 않았다. 느린 애노딕 편향 전압에서는, M_red1이 전극에 전자를 제공할 수 있는 기회를 갖지 못하기 때문에 화학적인 단계(C step)가 전기화학적인 단계(E step)보다 빠르게 진행된다. 하지만 빠른 검사 속도(500 mV/s 이상의 속도)에서는, 화학적인 단계가 진행되기 이전에 M_red1이 전기화학적으로 산화되어 M_ox가 된다. 이는 M_red1과 전극 사이의 전자전달 속도가 검사 속도에 의해 화학적 반응의 속도보다 빠른 속도로 조절되었기 때문이다.

도 3b는 도 3a에서 얻은 캐소딕 및 애노딕 피크 전류의 검사 속도 의존성(dependency)을 나타낸 것이다. 애노딕 피크에서의 전류값 i _p 는 500 mV/s 이상의 검사 속도에서만 전형적인 패러데이 과정(i_p ∝ [검사 속도]^0.5) 의 검사 속도 의존성을 보이는데, 이는 M_red1가 전기화학적인 단계에 의해 완전히 M_ox으로 변환되었음을 의미한다. 500 mV/s 이하의 검사 속도에서 피크 전류값들은 세 개의 최고 검사 속도에서의 전류값들에 맞추어 외삽된 선으로부터 벗어나있는데, 이는 느린 검사 속도에서는 M_red1이 화학적인 단계에 의해 부분적으로 M_red2으로 변환되었기 때문이다. 따라서, NADH 생성에 활성을 갖는 M_red2의 효율적인 형성을 위해서는, 화학적 단계에서의 양성자 흡수 동역학(kinetics)을 증강시킬 필요가 있다.

실험예 2: 로듐 III 복합체 M 외에 NAD ⁺ 와 백금 나노입자 존재시의 순환 전압-전류도

1차 산화환원 매개체인 로듐 III 복합체 M 외에 NAD⁺와 백금 나노입자(nPt) 존재시의 동역학(kinetics)을 알아보기 위하여, 복합체 M만 존재시, 복합체 M 외에 NAD⁺ 존재시 및 이들 각각에 백금 나노입자를 첨가한 경우의 순환 전압-전류도(cyclic voltammogram)를 측정하였다. 백금 나노입자(nPt)는 0.6 mM로, 복합체 M은 0.5 mM로, 그리고 NAD⁺는 0.5 mM로 인산염버퍼(100 mM, pH 7.0)에 용해하였고, 검사속도는 100 mVs^-1에서 측정하였다.

상기 측정결과는 도 4a 및 도 4b에 나타내었다.

도 4a에서 알 수 있는 바와 같이, M의 캐소딕 피크 전류(E_pc)에서의 환원전압(reduction potential)은 NAD⁺의 유무와는 상관없이 약 -0.7V에서 측정되었다.

반면, 이에 백금 나노입자(nPt)가 추가한 경우, 순환 전압-전류도가 전체적으로 바뀌었다(도 4b 참조). 도 4b에 나타나는 캐소딕과 애노딕 피크는 주로 백금 나노입자상에 대한 양성자의 흡착과 탈착에 의해 나타난다. 캐소딕 피크에서의 환 원 전위(E_pc)는 -0.85 V ~ -0.9 V에서 나타나고, 애노딕 피크에서의 산화 전위는 -0.52 V에서 나타났다.

도 4c에는 NADH 생성을 위해 사용된 작업 전위인 -0.8 V에서의 백금 나노입자의 비존재 또는 존재시 NAD⁺에서 NADH로의 변환 속도(conversion rate)를 나타내었다. 상기 속도(Δi/nFA; n=전자수, F=패러데이 상수, A=전극 면적)는 도 4a의 -0.8 V에서의 캐소딕 전류값 차이로부터 계산하였다.

도 4c에서 알 수 있는 바와 같이, 백금 나노입자의 비존재시와 존재시의 속도차는 3.82 nmols^-1cm^-2로서 백금 나노입자가 존재시 NADH 생성속도가 25배 증가됨을 확인할 수 있었다.

도 4d는 NADH 생성을 위해 사용된 작업 전위인 -0.8 V에서의 NAD⁺ 비존재 또는 존재시 백금 나노입자(nPt)에서 백금 나노입자-흡착 수소 원자 복합체(nPt-H_ads)로의 변환 속도를 나타내었다. 상기 속도(Δi/nFA; n=전자수, F=패러데이 상수, A=전극 면적)는 도 4b의 -0.8 V에서의 캐소딕 전류값 차이로부터 계산하였다.

도 4d에서 알 수 있는 바와 같이, NAD⁺의 비존재시와 존재시의 속도차는 7.64 nmols^-1cm^-2로서 NAD⁺가 존재시 nPt-H_ads의 생성속도가 25% 향상됨을 확인할 수 있었다.

실험예 3: 백금 나노입자( nPt )의 농도 및 교반에 따른 NADH 재생 속도 측정

백금 나노입자의 농도와 교반 속도가 NADH 재생 속도에 미치는 영향을 확인하기 위하여 백금 나노입자를 0 mM, 0.3 mM, 0.6 mM 및 1.2 mM로 나누어 첨가하고, 340 rpm으로 교반하면서 유리 탄소(GC) 전극으로 -0.8 V의 전압을 인가하여 시간에 따라 생성된 NADH의 농도를 분광학적으로 측정하였다. 교반에 따른 효과를 알아보기 위하여, 백금 나노입자를 첨가하지 않고, 교반하지 않은 상태에서 동일한 전압을 인가하여 생성된 NADH의 농도를 측정하여 비교하였다. NADH 농도는 NAD+의 첨가 전후의 흡광도(340 nm)차로 계산하였다.

측정결과는 도 5에 나타내었다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 백금 나노입자의 양이 증가할수록 NADH의 생성속도가 빨라지며, 그에 따라 생성되는 NADH의 양도 많음을 알 수 있었다. 특히 1.2 mM의 백금 나노입자 첨가시 5시간의 전기화학반응 후에 생성된 NADH의 양은 백금 나노입자가 없을 때보다 5배 많았다. 또한, 340 rpm으로 교반한 경우, 교반하지 않을 때보다 NADH의 생성속도 및 생성량이 많음을 알 수 있었다.

실험예 4: 백금 나노입자의 부존재시 전극의 종류를 달리한 NADH 생성량 측정

백금 나노입자가 NADH 재생에 기여한다는 것을 확인하기 위해 백금을 포함한 다양한 벌크상의 판상 전극을 작업전극으로 이용해 백금 나노입자가 없는 상태에서 복합체 M만을 사용하여 2시간동안 NADH 재생실험을 한 후, 생성된 NADH의 농도를 측정하였다. 복합체 M은 0.5 mM의 농도로, NAD+는 1 mM의 농도로 인산염버퍼(100 mM, pH 7.0)에 녹여 사용하였다. 측정결과는 도 6a에 나타내었다. 도 6a에서 보는 바와 같이, 백금 나노입자가 없는 상태에서는 벌크 전극의 종류에 따라 약간의 차이를 보이기는 하지만, 상대적으로 매우 적은 양의 NADH가 형성되었음을 알 수 있었다. 상기 결과를 실험예 3의 도 5와 비교하여 보더라도, 도 5에서 GC 전극 상에서 1.2 mM의 백금 나노입자를 사용한 실험에서 얻은 2시간째에서의 NADH 농도는 0.2 mM인데 반하여, 도 6a의 GC 전극에서의 결과는 약 0.22로 백금 나노입자의 존재만으로도 약 10배의 차이가 난다는 것을 확인할 수 있다. 이는 백금 나노입자가 NADH 생성에 있어, 매우 중요한 역할을 함을 의미하는 것이다.

한편, 백금 나노입자가 없을 때, 백금 판상 전극은 GC나 금 판상 전극에 비해 NADH 재생에 있어 덜 효율적이었다. 하지만 백금 나노입자가 존재할 때, 백금 판상전극에서도 NADH 재생 속도가 증가하였다(도 6b 참조). 따라서, 양성자를 전달하는 촉매적인 기능과 전자를 전달하는 환원적인 기능은 백금 전극이 아니라 백금 나노입자로부터 기인하는 것임을 확인할 수 있었다. 백금 나노입자를 흡착시킨 GC 전극과 백금 나노입자를 흡착시키지 않은 GC 전극을 사용한 경우 NADH의 양이 차이가 없었기 때문에, 생성된 NADH의 양이 전극 표면으로 백금 나노입자가 흡착되어 표면적이 증가하였기 때문에 야기된 결과라고 판단하기는 힘든 것으로 보인다.

실험예 5: 백금 나노입자의 촉매기능 메커니즘 확인

백금 나노입자의 촉매기능 메커니즘을 확인하기 위해 NAD⁺ 없이 로듐 III 복합체 M(0.5 mM)만을 첨가한 용액, 백금 나노입자(0.6 mM)만을 첨가한 용액 및 복합체 M과 백금 나노입자만을 첨가한 용액 각각에 -0.8 V의 전압을 인가하고 340 rpm에서 1시간 동안 교반하여 미리 환원시켰다. 그리고 나서, NAD⁺를 혼합하여 NADH 생성 농도를 측정하였다. 측정결과는 도 7에 나타내었다. 만약 용액상의 0.5 mM의 M_ox가 완전히 환원되어 M_red2의 상태로 존재한다면, 0.5 mM의 NADH가 NAD⁺의 혼합을 통해 형성될 것이다. 하지만, 1시간 동안 전압을 인가해 사전에 환원시킨 복합체 M의 용액을 통해 형성된 NADH의 농도는 0.01 mM 이하로 매우 적게 측정되었다. 생성되는 양이 적기는 하지만, 백금 나노입자의 용액 또한 직접적으로 NAD⁺를 NADH로 환원시켰다. 복합체 M과 백금 나노입자만을 각각 사용하였을 때 형성된 NADH의 양은 큰 차이가 없었다. 하지만 백금 나노입자와 복합체 M의 혼합물에서는 시너지효과가 관찰되었다. 생성된 NADH의 양은 0.125 mM로서, 복합체 M이나 백금 나노입자의 단일 조성에 비해서 약 20배 정도 증가되었는데, 이는 백금 나노입자가 M_red2의 형성을 증대시켰음을 의미한다.

결론적으로, 백금 나노입자는 균일상의 촉매이자 NADH 재생에 있어서 1차 매개체 복합체 M의 존재하에 2차 매개체로서 작용하며, 양성자와 전자를 복합체 M에 전해줌으로써 NADH 생성 속도를 증가시켰다. 따라서, 백금 나노입자는 양성자와 전 자전달의 촉매기능을 통해, 높은 pH와 같은 양성자 부족 환경하에서도 다른 화학물질의 환원반응에도 활용될 수 있을 것이다.

실험예 6: 본 발명에 따라 재생된 NADH 를 이용한 생촉매 반응 효율성 검증

본 발명의 효율성을 검토하기 위하여, 본 발명의 전기화학적 재생방법에 의해 재생된 NADH를 알파-케토글루탐산의 글루탐산 탈수소효소(Glutamate Dehydrogenase)에 의한 L-글루탐산으로의 생촉매반응에 적용하였다.

상기 생촉매반응을 위하여, 반응기에 0.1M의 인산완충용액(pH 7.0)을 넣고, 0.1 mM의 NAD+, 0.5 mM의 복합체 M, 1 mM의 알파-케토글루탐산, 15 mM의 (NH₄)₂SO₄, 20U의 글루탐산 탈수소효소를 넣은 다음, 백금 나노입자를 각각 0 mM, 0.05 mM, 0.15 mM 및 0.3 mM로 농도를 달리하여 첨가하였다. -0.8V의 전압을 인가하고, 340 rpm으로 교반시켜 5시간 동안 반응을 진행한 후 전환율(%)을 측정하였다. 측정결과는 도 8에 나타내었다.

백금 나노입자를 넣지 않고 실험한 경우 4% 만이 전환되는데 반하여, 0.05 mM을 첨가하면 17%, 0.15 mM을 첨가하면 36%, 0.3 mM을 첨가하면 50%로 전환율이 백금 나노입자 첨가량에 따라 상승함을 알 수 있었다. 이는 백금 나노입자에 의해 NADH 재생속도가 빨라지며, 이에 따라 NADH를 보조인자로 이용하는 생촉매반응 속도 역시 빨라지는 것으로서, 본 발명 적용시 NADH가 보조인자로 관여하는 다양한 생촉매반응의 효율을 상승시킬 수 있을 것으로 판단된다.

도 1은 로듐 III 복합체 M의 전기화학적 변환을 나타낸 것이다.

도 2는 백금 나노입자를 활용한 전기화학적 보조인자 재생의 모식도를 나타낸 것이다.

도 3은 pH 8.2에서 얻은 복합체 M의 순환 전압-전류도와 그 피크 점의 경향을 분석한 것이다.

도 4는 복합체 M과 백금 나노입자를 이용한 순환 전압-전류도를 나타낸 것이다.

도 5는 백금 나노입자의 농도를 변수로 실험한 전기화학적 NADH 재생의 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 다양한 전극에서 실험한 NADH 재생의 결과를 나타낸 것이다.

도 7은 복합체 M과 백금 나노입자 각각에 의해 재생된 NADH의 양과 두 성분이 공존할 때 재생된 NADH의 양을 나타낸 것이다.

도 8은 백금 나노입자의 농도에 따른 NADH 보조인자에 의한 알파-케토글루탐산의 L-글루탐산 전환율을 나타낸 것이다.

Claims (8)

1. 옥시도리덕타제 반응기에 산화형의 옥시도리덕타제 보조인자; 메틸비올로겐, 루테늄 II 복합체 및 로듐 III 복합체로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 1종 이상의 1차 산화환원 매개체; 및 금, 은, 백금, 철, 니켈, 구리, 이리듐, 루테늄, 코발트, 크롬 및 팔라듐으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 2차 산화환원 매개체인 금속 나노입자를 첨가하는 단계(단계 1); 및

   상기 단계 1의 반응기에 전압을 인가한 후 교반하여 환원형의 옥시도리덕타제 보조인자를 생성시키는 단계(단계 2)

   를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 옥시도리덕타제 보조인자의 전기화학적 재생방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 단계 1의 산화형의 옥시도리덕타제 보조인자는 NAD⁺, NADP⁺, FAD⁺ 및 FMN⁺으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 옥시도리덕타제 보조인자의 전기화학적 재생방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 단계 1의 루테늄 II 복합체는 (헥사메틸벤젠-2,2′-비피리딘클로로)루테늄(II)인 것을 특징으로 하는 옥시도리덕타제 보조인자의 전기화 학적 재생방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 단계 1의 로듐 III 복합체는 (펜타메틸사이클로펜타디에닐-2,2'-비피리딘클로로)로듐(III)인 것을 특징으로 하는 옥시도리덕타제 보조인자의 전기화학적 재생방법.
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, 상기 단계 1의 금속나노입자를 1 pM 이상의 농도로 첨가하는 것을 특징으로 하는 옥시도리덕타제 보조인자의 전기화학적 재생방법.
7. 제1항에 있어서, 단계 2는 전압의 인가에 의하여 금속 나노입자가 전극으로 부터 전자를 받아들여 금속 나노입자-흡착수소 복합체(metal-H_ads)를 형성하는 단계(단계 a); 상기 단계 a의 금속 나노입자-흡착수소 복합체가 1차 산화환원 매개체에 전자를 전달하는 단계(단계 b); 상기 단계 a의 금속 나노입자-흡착수소 복합체가 상기 1차 산화환원 매개체에 양성자를 전달하는 단계(단계 c); 전자와 양성자를 받은 1차 산화환원 매개체가 산화형 옥시도리덕타제 보조인자에게 전자와 양성자를 전달하여 환원형 옥시도리덕타제 보조인자를 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 옥시도리덕타제 보조인자의 전기화학적 재생방법.
8. 제1항에 의해 재생된 옥시도리덕타제 보조인자를, 옥시도리덕타제 보조인자-의존 산화화원 촉매반응에서의 보조인자로 사용하는 것을 특징으로 하는 산화환원 촉매반응 속도 향상방법.

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