JP5129133B2 - 安定なｎａｄ／ｎａｄｈ誘導体 - Google Patents

Description

本発明は、安定なニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ／ＮＡＤＨ）誘導体およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ）誘導体、これら誘導体の酵素複合体およびそれらの生化学検出法での使用、さらにはそれらの試薬キットに関する。

生化学分析のための測定システムは、臨床関連の分析法における重要な要素である。ここでは、例えば代謝産物または基質など、酵素を用いて直接的または間接的に測定される被分析物の測定が主体である。この場合、被分析物は酵素／補酵素の複合体を用いて変換され、ついで定量測定される。この過程において、測定対象である被分析物を然るべき酵素および補酵素に接触させる。その場合、酵素は通常触媒としての量で使用される。補酵素は酵素反応によって、例えば酸化または還元などの変化をする。この過程は直接、またはメディエータを用いて電子化学的、または光学的測定により検出することができる。較正操作により、測定値と測定対象である被分析物の濃度との直接的関係が提供される。

補酵素は、酵素と共有結合または非共有結合している有機分子であり、被分析物の変換によって変化する。補酵素の重要例はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）であり、還元によってこれらよりそれぞれＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨが生成される。

先行技術から公知の測定システムは、制限のある保管期限およびこの貯蔵期限を達成するために冷却または乾燥保存など環境条件への特殊な要求を特徴としている。したがって、例えばグルコース自己測定などエンドユーザ自身が行う測定において、特定の適用形態が採られた場合では、気づかないまま不適切な誤った保存がなされたために結果に誤りが生ずるという事態が起こり得る。特に、一次包装が長時間開放されて乾燥剤が消費し尽くされると、システムによってはユーザにはほとんど気づかれない誤測定が生じることがある。

生化学測定システムの安定性を向上させるために採られる公知の対策には、安定な酵素、例えば好熱性生物からの酵素の使用がある。そのほか、化学的修飾、例えば架橋結合によって、または突然変異生成によって酵素を安定化させる可能性もある。さらに、例えばトレハロース、ポリビニルピロリドンおよび血清アルブミンなどの酵素安定化剤を添加することもできる。または、例えば光重合により酵素をポリマー網状組織内に閉じ込めることも可能である。

また、安定なメディエータの使用によって生化学測定システムの貯蔵期限を改善する試みもなされている。つまり、できる限り酸化還元電位の低いメディエータを使用して測定の特異性を高め、反応中の障害を排除する。ところが、酵素／補酵素複合体の酸化還元電位は、酸化還元電位の下限を成している。これを下回ると、メディエータとの反応が緩慢になるか、または完全停止状態になる。

上記に代わり、メディエータなしの生化学測定システムを使用することも可能である。その場合では、例えば補酵素ＮＡＤＨといった補酵素が、直接的に検出される。しかし、そのような測定システムは、ＮＡＤおよびＮＡＤＰなどの補酵素が不安定であるという欠点がある。

ＮＡＤおよびＮＡＤＰは塩基に不安定な分子であり、その分解過程は文献に記述されている（N. J. Oppenheimer著 The Pyridine Nucleotide Coenzyms、Academic Press／ニューヨーク、ロンドン、１９８２年刊、J. Everese、B. Anderson、K. You編、第３章、５６〜６５頁）。ＮＡＤまたはＮＡＤＰの分解過程では、基本的に、リボースとピリジンユニット間のグリコシル結合の開裂によってＡＤＰリボースが生成される。還元型のＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨは逆に酸に不安定である。例えばエピマー化は周知の分解過程である。両例におけるＮＡＤ／ＮＡＤＰおよびＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨの不安定性の根源は、リボースとピリジンユニット間のグリコシル結合における不安定性にある。補酵素ＮＡＤおよびＮＡＤＰは、水溶液中のような過激でない条件下でも、周囲の湿気だけで単独で加水分解を起こす。この不安定性が、被分析物の測定で不正確な結果を生ずる原因になることがある。

一連のＮＡＤ／ＮＡＤＰ誘導体については、例えばB. M. Anderson著Pyridine Nucleotide Coenzymes、Academic Press／ニューヨーク、ロンドン、１９８２年刊、J. Everese、B. Anderson、K. You編、第４章に記述されている。しかし、これら誘導体のほとんどは酵素に充分には受容されない。したがって、これまで診断テストに使用されてきた唯一の誘導体は、１９５６年に初めて発表された（N. O. Kaplan、J. Biol. Chem.（１９５６年）第２２１巻、８２３頁）３−アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド（Ａｃｅｔｙｌ ＮＡＤ）である。この補酵素も酵素による受容性は低く、酸化還元電位の変化を示す。

国際公開第０１／９４３７０号パンフレットには、修飾したピリジン基を有する他のＮＡＤ誘導体の使用が記載されている。しかし、ニコチンアミド基の修飾は、一般には触媒反応に直接的な影響を及ぼす。ほとんどの場合、その影響は不利に作用する。

他の安定化構想では、グリコシル結合の安定性に影響を与えるために、リボースユニットが修飾された。この操作は、ニコチンアミド基の触媒反応に対し直接的には干渉しない。しかし、酵素がリボースユニットに対して強力で特殊な結合をすると、直ちに間接的な影響が生じ得る。これに関しては、Kaufmannらが、国際公開第９８／３３９３６号パンフレットおよび米国特許第５，８０１，００６号明細書または国際公開第０１／４９２４７号パンフレットにおいて、一連のチオリボースＮＡＤ誘導体を開示している。しかし、ニコチンアミドリボースユニットの修飾と酵素反応における誘導体の活性の間の関係については示されていない。

グリコシル結合を持たない誘導体であるカルバＮＡＤについては、１９８８年に初めて記述された（J. T. Slama、Biochemistry、１９８９年、第２７巻、１８３頁およびBiochemistry、１９８９年、第２８巻、７６８８頁）。この誘導体では、リボースはカルバ環状糖ユニットで置換される。カルバＮＡＤは脱水素酵素の基質として記載されているが、その活性は臨床生化学検出法においてこれまで証明されたことがない。

後に、G. M. BlackburnがChem. Comm.（１９９６年）、２７６５頁に、天然ピロフォスフェートの代わりに、メチレンビスフォスフォネート結合を有するカルバＮＡＤを合成する同様の試みについて記述している。メチレンビスフォスフォネートはフォスファターゼに対しより高い安定性を示し、ＡＤＰリボシルシクラーゼの阻害剤として使用された。その目的は、加水分解に対して安定性を向上させることではなかった（J. T. Slama、G. M. Blackburn）。

以上より、本発明の目的は、ＮＡＤ／ＮＡＤＰの加水分解感受性を回避し、同時に酵素反応において補酵素として作用する、特にグルコース測定のための安定なバイオ分析測定システムを提供することにある。

この目的は、被分析物測定のための試験エレメントであって、
（ｉ）補酵素依存性酵素またはその種の酵素の基質および
（ii）補酵素として下記一般式（Ｉ）で表される化合物であって、

Ａはアデニンまたはその類似体、
Ｔはそれぞれ独立してＯ、Ｓ、
Ｕはそれぞれ独立してＯＨ、ＳＨ、ＢＨ₃ ^-、ＢＣＮＨ₂ ^-、
Ｖはそれぞれ独立してＯＨまたはフォスフェート基、
ＷはＣＯＯＲ、ＣＯＮ（Ｒ）₂、ＣＯＲ、ＣＳＮ（Ｒ）₂であって、Ｒはそれぞれ独立してＨまたはＣ₁〜Ｃ₂アルキル、
Ｘ₁、Ｘ₂はそれぞれ独立してＯ、ＣＨ₂、ＣＨＣＨ₃、Ｃ（ＣＨ₃）₂、ＮＨ、ＮＣＨ₃、
ＹはＮＨ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ₂、
Ｚおよびピリジン残基がグリコシド結合によらずに結合しているという条件で、
Ｚは必要に応じてＯ、ＳおよびＮから選択されたヘテロ原子と必要に応じて１個以上の置換基を含む５Ｃ原子を有する環状基を含む残基、および、Ｒ４はそれぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＣＨ₃であり、ＣＲ４₂が前記環状基およびＸ₂に結合しているＣＲ４₂残基
である化合物もしくはその塩または必要な場合にはその還元型
を含む試験エレメントによって達成される。

好ましい実施形態の１つでは、ＷはＣＯＮＨ₂またはＣＨＣＨ₃である。

Ｚにおける好ましい置換基は、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｃ ₁〜Ｃ₂アルキルおよびＯ−Ｃ ₁ 〜Ｃ ₂ アルキルからなる群から選択され、前記Ｃ ₁ 〜Ｃ ₂ アルキルが必要に応じてフッ素化または塩素化および／またはＯＨ置換され得る。

好ましい実施形態の１つでは、第１残基のＶはＯＨであり、第２残基のＶはフォスフェート基である。この１つのＯＨ基と１つのフォスフェート基は、これらが結合している炭素原子と共に環を形成することができる。

好ましい実施形態の１つでは、グルコース脱水素酵素および上記の一般式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩を含む、グルコース測定のための試験エレメントが提供される。

驚くべきことに、本発明に基づく化合物は加水分解に対して安定であり、酵素検出法において優れた基質であり、生化学的診断に使用することができる。この発見は、従来から公知のＮＡＤ／ＮＡＤＰ誘導体の大部分とは対照的である。これら誘導体は、酵素による検出法では通常きわめて短い期間しか安定ではないからである。

本発明に基づく化合物の長所は、先行技術と比較すれば、高い安定性、高い酵素活性、簡易でコスト的に有利な合成、従来から公知のすべての生化学検出法への適用可能性である。

本発明、好ましくは、例えばポリマー網状構造への酵素の封入による安定化処方との組み合わせを用いて、安定なＮＡＤ／ＮＡＤＰ誘導体を提供することにより、従来から公知の生化学検出法の欠点を大部分回避することができる。しかも、安定化のための添加剤を使用する必要もない。関与反応物質の数が少なければ少ないほど、被分析物測定のための安定処方を得る機会もそれだけ大きくなるので、この点は特に有利である。

本発明によれば、試験エレメント上に、補酵素としての使用に十分な酵素活性を有する多くの安定なＮＡＤ／ＮＡＤＰ誘導体を含む試験エレメントが提供される。

安定なＮＡＤ／ＮＡＤＰ誘導体は、一般的に知られた合成法で製造することができる。その場合、環状アミノアルコールのアミノ基を、チンク（Zincke）化学過程を経てピリジニウム誘導体に変換する。ついで、第１級ＯＨ基をリン酸化し、活性化されたＡＭＰ誘導体と結合させてＮＡＤ誘導体とする。これに代え、第１級ＯＨ基を最初にリン酸化して、ついでアミノ基をチンク（Zincke）反応によりピリジンに変換させることもできる。

他の合成経路としては、第１級アルコールを活性化してトシレートまたはヨウ化物を形成し、ついでＡＤＰをアルキル化する。

本発明に基づく試験エレメントの好ましい実施形態は、
下記一般式（Ｉ’）で表される化合物であって、

Ａはアデニンまたはその類似体、
Ｔはそれぞれ独立してＯ、Ｓ、
Ｕはそれぞれ独立してＯＨ、ＳＨ、ＢＨ₃ ^-、ＢＣＮＨ₂ ^-、
Ｖはそれぞれ独立してＯＨまたはフォスフェート基、
ＷはＣＯＯＲ、ＣＯＮ（Ｒ）₂、ＣＯＲ、ＣＳＮ（Ｒ）₂であって、Ｒはそれぞれ独立してＨまたはＣ₁〜Ｃ₂アルキル、
Ｘ₁、Ｘ₂はそれぞれ独立してＯ、ＣＨ₂、ＣＨＣＨ₃、Ｃ（ＣＨ₃）₂、ＮＨ、ＮＣＨ₃、
ＹはＮＨ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ₂、
Ｚは飽和もしくは不飽和の炭素環またはヘテロ環の五員環、特に、一般式（ＩＩ）の化合物であって、

Ｒ５’とＲ５”の間に一重または二重結合が存在し、
Ｒ４はそれぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＣＨ₃、
Ｒ５はＣＲ４₂、
Ｒ５’とＲ５”の間に一重結合が存在する場合には、
Ｒ５’はＯ、Ｓ、ＮＨ、ＮＣ₁〜Ｃ₂アルキル、ＣＲ４₂、ＣＨＯＨ、ＣＨＯＣＨ₃、
Ｒ５”はＣＲ４₂、ＣＨＯＨ、ＣＨＯＣＨ₃、
Ｒ５’とＲ５”の間に二重結合が存在する場合には、
Ｒ５’およびＲ５”はＣＲ４、
Ｒ６、Ｒ６’はそれぞれ独立してＣＨ、ＣＣＨ₃
である化合物もしくはその塩または必要な場合にはその還元型
を含む。

本発明の別の対象として、下記一般式（Ｉ”）で表される化合物がある。

ここで、
Ａはアデニンまたはその類似体、
Ｔはそれぞれ独立してＯ、Ｓ、
Ｕはそれぞれ独立してＯＨ、ＳＨ、ＢＨ₃ ^-、ＢＣＮＨ₂ ^-、
Ｖはそれぞれ独立してＯＨまたはフォスフェート基、
ＷはＣＯＯＲ、ＣＯＮ（Ｒ）₂、ＣＯＲ、ＣＳＮ（Ｒ）₂であって、Ｒはそれぞれ独立してＨまたはＣ₁〜Ｃ₂アルキル、
Ｘ₁、Ｘ₂はそれぞれ独立してＯ、ＣＨ₂、ＣＨＣＨ₃、Ｃ（ＣＨ₃）₂、ＮＨ、ＮＣＨ₃、
ＹはＮＨ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ₂、
Ｚは飽和もしくは不飽和の炭素環またはヘテロ環の五員環、特に、一般式（ＩＩ）の化合物であって、

Ｒ５’とＲ５”の間に一重または二重結合が存在し、
Ｒ４はそれぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＣＨ₃、
Ｒ５はＣＲ４₂、
Ｒ５’とＲ５”の間に一重結合が存在する場合には、
Ｒ５’はＯ、Ｓ、ＮＨ、ＮＣ₁〜Ｃ₂アルキル、ＣＲ４₂、ＣＨＯＨ、ＣＨＯＣＨ₃、
Ｒ５”はＣＲ４₂、ＣＨＯＨ、ＣＨＯＣＨ₃、
Ｒ５’とＲ５”の間に二重結合が存在する場合には、
Ｒ５’およびＲ５”はＣＲ４、
Ｒ６、Ｒ６’はそれぞれ独立してＣＨ、ＣＣＨ₃、
ただし、Ｒ５がＣＨ₂、ＴがＯ、ＵがそれぞれＯＨ、ＶがＯＨ、ＷがＣＯＮＨ₂、ＸがＯおよびＹがＯのとき、Ｒ５’とＲ５”は同時にＣＨＯＨではないことを条件
とする化合物もしくはその塩または必要な場合にはその還元型。

好ましい実施形態の１つでは、本発明に基づく化合物は、例えばＣ₈−置換型およびＮ₆−置換型アデニンなどのアデニン類似体、７−デアザなどのデアザ変異体、８−アザなどのアザ変異体または７−デアザもしくは８−アザなどの組み合わせ、またはフォルミシンなど炭素環類似体を含んでいる。ここで、７−デアザ変異体は第７位でハロゲン、Ｃ₁〜Ｃ₆−アルキニル、−アルケニルまたは−アルキルにより置換されている場合がある。

また別の好ましい実施形態の１つでは、当該化合物は、リボースの代わりに、例えば２−メトキシデオキシリボース、２’−フルオロデオキシリボース、ヘキシトール、アルトリトール、またはビシクロ糖、ＬＮＡ糖およびトリシクロ糖などの多環類似体を含むアデノシン類似体を含む。

特にまた、（ジ）フォスフェート酸素は等電子数的に置換することもできる。例えばＯ^-をＳ^-またはＢＨ₃ ^-によって、ＯをＮＨ、ＮＣＨ₃またはＣＨ₂によって、および＝Ｏを＝Ｓによって置換することができる。

好ましい実施形態の１つでは、本発明に基づく化合物の残基Ｕのうち少なくとも１つはＯＨとは異なり、特に好ましくは、残基Ｕのうち少なくとも１つはＢＨ₃ ^-である。

特に好ましい実施形態では、誘導体がボラノカルバＮＡＤ、ｃ−ペンチルＮＡＤ、ピロリルＮＡＤ、フラニルＮＡＤ、カルバＮＡＤシクロフォスフェート、カルバＮＡＤＰ、ピロリジニルＮＤであり、また試験エレメントが上記同一成分を含んでいる。

これらを下記に示す。

例えば血液、血清、血漿または尿などの体液中または廃水試料中もしくは食品中の被分析物のパラメータの生化学的検出は、診断術において非常に重要な役割を果たしている。その場合では、測定対象の被分析物を然るべき酵素および補酵素に接触させる。

したがって、本発明のまた別な対象として、然るべき酵素と本発明に基づく化合物との組み合わせからなる酵素／補酵素複合体がある。

レドックス反応によって検出できる生物学的または化学的物質であればいずれも、例えば補酵素依存的酵素の基質または補酵素依存的酵素自体を被分析物として測定することができる。被分析物の好ましい例としては、グルコース、乳酸、りんご酸、グリセロール、アルコール、コレステロール、トリグリセリド、アスコルビン酸、システイン、グルタチオン、ペプチド、尿素、アンモニウム、サリチル酸塩、ピルビン酸塩、５’−ヌクレオチダーゼ、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、乳酸塩脱水素酵素（ＬＤＨ）、二酸化炭素などがある。

酵素基質の検出では、試験エレメントは補酵素のほかに、基質の検出に適した酵素を含んでいるのが好ましい。適した酵素としては、例えばグルコース脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．４７）、乳酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．２７、 １．１．１．２８）、りんご酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３７）、グリセロール脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．６）、アルコール脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．１）、アルファ−ヒドロキシブチレート脱水素酵素、ソルビトール脱水素酵素またはアミノ酸脱水素酵素、例えばＬ−アミノ酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．４．１．５）から選択された脱水素酵素がある。その他適した酵素として、例えばグルコースオキシダーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．３．４）、コレステロールオキシダーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．３．６）などのオキシダーゼ、または、例えばアスパラギン酸塩またはアラニンアミノトランスフェラーゼなどのアミノトランスフェラーゼ、５’−ヌクレオチダーゼまたはクレアチンキナーゼがある。

酵素の検出には、試験エレメントは補酵素のほかに、酵素の検出に適した酵素基質を含んでいるのが好ましい。

試料中の被分析物を酵素反応により検出するために、本発明に基づく化合物または本発明に基づく酵素／補酵素複合体を使用することも本発明のまた別の対象である。これに関しては、グルコース脱水素酵素（ＧｌｕｃＤＨ）によるグルコースの検出が特に好ましい。

補酵素すなわち本発明に基づく化合物が、被分析物と反応することによる変化（被分析物が酵素基質の場合）または被分析物の触媒反応による変化（被分析物が酵素の場合）は、原則として任意の方法で検出することができる。それには、原則として、先行技術から公知のあらゆる酵素反応検出法が使用できる。しかし、補酵素の変化は光学的方法による検出が好ましい。光学的検出法には、例えば吸光、蛍光、円偏光二色性（ＣＤ）、旋光分散（ＯＲＤ）の測定、屈折測定などが含まれる。補酵素の変化は蛍光測定によって検出するのが特に好ましい。蛍光測定は高感度であり、小型システム内での低濃度の被分析物の検出でさえ可能である。

被分析物の検出には液式試験を使用することができる。その場合、試薬は、例えば水性または非水性の溶液または懸濁液の状態か、または粉末または凍結乾燥物の形態をとる。しかしまた、乾式試験を使用することもできる。その場合、試薬は、担体である試験ストリップの上に載せる。担体には、例えば、検査試料液によって湿潤する吸収性または／および膨潤性の素材を含む試験ストリップとすることができる。

しかし、酵素／補酵素複合体の組み込まれたゲルマトリックスを検出試薬として使用することもできる（独国特許出願公開第１０２２１８４５号明細書参照）。

この場合、酵素は、本発明に基づく化合物と共にマトリックス内に組み入れて重合化することができる。または、マトリックスを酵素の存在下で重合した後、対応する酵素／補酵素複合体が生成されるように、補酵素溶液と接触させることができる。

本発明のまた別な対象は、試薬キットおよび被分析物検出を目的としたそれの使用に関する。試薬キットは、本発明に基づく化合物、然るべき酵素および然るべき反応緩衝剤を含むことができる。適した酵素は既述のとおりである。本発明に基づく試薬キットは多方面に適用することができ、例えばグルコース、乳酸、りんご酸、グリセロール、アルコール、コレステロール、トリグリセリド、アスコルビン酸、システイン、グルタチオン、ペプチド、尿素、アンモニウム、サリチル酸塩、ピルビン酸塩、５’−ヌクレオチダーゼ、ＣＫ、ＬＤＨ、二酸化炭素などの被分析物の測定に使用することができる。血中グルコースの検出には、本発明に基づく化合物およびグルコース脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．４７）を含む試薬キットが好ましい。

本発明に基づく試薬キットは、乾式試験テストまたは液式試験での被分析物の検出に使用することができる。

本発明のまた別な対象は、被分析物の蛍光測定または光学測定による検出のための試験ストリップに関する。そのような試験ストリップは、補酵素として前記のような化合物および適当な酵素または酵素基質を含んでいて、これらは吸収性または／および膨潤性の素材上に固定されている。これに適した素材は、例えばセルロース、プラスチックなどから選択することができる。

以上のほか、下記の過程、すなわち、
（ａ）補酵素を含む本発明の試験エレメントまたは試薬キットと試料の接触
（ｂ）例えば補酵素の変化に基づく被分析物の検出
の過程を含む、被分析物検出のための方法も本発明の対象である。

本発明のさらなる優位性は、補酵素の蛍光発光が深色移動を示し、そのため試験エレメントのその他素材または／および試料の蛍光発光とはわずかな干渉しか起こさないという点にある。

本発明の対象である上記好ましい実施形態は、いずれも、例えば本発明に基づく化合物の好ましい実施形態など本発明のその他の対象にも適用することが意図されている。

以下では、下記の図面および実施例に基づき本発明をより詳しく説明する。

安定なＮＡＤ／ＮＡＤＨ誘導体の試験的製造
安定なＮＡＤ／ＮＡＤＨ誘導体の製造について、例としてカルバＮＡＤ（化合物９、図１）とピロリドンＮＡＤ（化合物１８、図５）に基づいて説明する。その他の誘導体はしかるべき合成方法によって製造することができる。出発試薬として使用される、しかるべきアミノアルコールは、以下のとおり文献から公知である。

２−アミノ−１，４−アンヒドロ−２，３−ジデオキシ−Ｌ−スレオ−ペンチトール：
Huryn, Donna M. ; Sluboski, Barbara C. ; Tam, Steve Y. ; Todaro, Louis J. ; Weigele, Manfred.、Tetrahedron Letters（１９８９年）、第３０巻（第４６号）、６２５９〜６２頁。

３−アミノ−、（１Ｒ，３Ｓ）−シクロペンタンメタノール：
Beres, J. ; Sagi, G. ; Tomoskozi, I. ; Gruber, L. ; Gulacsi, E. ; Otvos, L.、Tetrahedron Letters（１９８８年）、第２９巻（第２２号）、２６８１〜４頁。

Ａ）カルバＮＡＤの製造
Ｉ．１Ｒ−（−）−エキソ−シス−５，６−ジヒドロキシ−２−アザビシクロ［２．２．１］へプタン−３−オン（１）
８０ｍｌの脱イオン水に２２．５ｇ（１６７ｍｍｏｌ）のＮ−メチルモルフォリン−Ｎ−オキシドを溶かした溶液を１ｌ入り丸底フラスコに入れ、そこへ４００ｍｌのアセトンに１６．４ｇ（１４７ｍｍｏｌ）の１Ｒ−（−）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンを溶かした溶液を加える。さらに、tert−ブタノールに溶かした２．５％オスミウムテトラオキシド溶液の１５ｍｌ（１．２ｍｍｏｌ）を、氷冷下１５分以内で添加する。ついでこの混合物を室温で一晩撹拌する。

溶媒はロータリーエバボレーターで蒸留分離させる。１００ｍｌを撹拌して、再びロータリーエバボレーターで蒸留分離させる。ついで６００ｍｌの脱イオン水に溶かし、３５ｇの活性炭を加える。混合物を１時間激しく撹拌し、ついでＳｅｉｔｚ Ｔｉｅｆｅｎｆｉｌｔｅｒ Ｋ２５０に通して深層濾過する。ロータリーエバボレーターにより濾液から水を蒸留分離する。生成物はさらに精製することなく使用される。

ＤＣ（Ｍｅｒｃｋ Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ Ｆ−２５４）：
酢酸エチル／メタノール／氷酢酸 ７：２：１、 Ｒ_f０．７５（出発物質）、０．５３（１）、ＴＤＭによる着色／塩素チェンバでの顕色

^*ＴＤＭ試薬：
溶液１：４０ｍｌの氷酢酸と２００ｍｌの脱イオン水の混合液に１０ｇのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−４，４’−ジアミノジフェニルメタンを溶かした溶液。
溶液２：４００ｍｌの脱イオン水に２０ｇの塩化カリウムを溶かした溶液。
溶液３：１０ｍｌの氷酢酸に０．３ｇのニンヒドリンを溶かし、９０ｍｌの脱イオン水を添加した溶液。
調製試薬：溶液１と２の混合液に６ｍｌの溶液３を加えた溶液。

II．１Ｒ−（−）−エキソ−シス−５，６−ジメチルメチレンジオキシ−２−アザビシクロ［２．２．１］へプタン−３−オン（２）
粗生成物１を２００ｍｌの無水エタノール中で環流下１時間沸騰させる。４００ｍｌ（３．２６ｍｏｌ）ジメトキシプロパンおよび２５０ｍｇ（２．２ｍｍｏｌ）ピリジン塩酸塩の添加後、混合物を環流下でさらに１５分間沸騰させる。１０ｍｌの炭酸水素ナトリウム飽和溶液の添加後、当該溶液をロータリーエバボレーターにおいて減圧濃縮乾固する。残渣に５００ｍｌのクロロフォルム、１５０ｍｌの食塩飽和溶液および７５ｍｌの炭酸水素ナトリウム飽和溶液を加え、分液ロートに移し入れる。振盪抽出後一晩放置しておけば、相分離が起きる。

有機相を分離除去し、水相はさらに２回それぞれ２００ｍｌのクロロフォルムで抽出する。合わせた有機相は硫酸マグネシウム上で乾燥させる。乾燥剤の濾別後、ロータリーエバボレーターにおいて溶媒を減圧下で蒸留分離する。粗生成物（２４．９ｇ＝９２％）はさらに精製することなく使用される。

ＤＣ（Ｍｅｒｃｋ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ Ｆ−２５４）：
酢酸エチル／メタノール／氷酢酸 ７：２：１
Ｒ_f０．８４、ＴＤＭによる着色／塩素チェンバでの顕色

III．１Ｒ−（−）−４−Ｎ−tert−ブチルオキシカルボニル−エキソ−シス−５，６−ジメチルメチレンジオキシ−２−アザビシクロ［２．２．１］へプタン−３−オン（３）
４５０ｍｌの無水クロロフォルムに２４，９ｇ（１３５．７ｍｍｏｌ）の粗生成物２を溶かした溶液に、アルゴン雰囲気下で４１．５ｇ（１９０ｍｍｏｌ）のジ−tert−ブチルジカーボネートと０．８３ｇ（６．８ｍｍｏｌ）の４−ジメチルアミノピリジンを添加する。この混合物を、気体の発生が停止するまで、環流撹拌下で沸騰させる。この混合物を、４０ｇのＳｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０が充填され、クロロフォルムで平衡化されたカラムを通して濾過する。つぎに、１００ｍｌのクロロフォルムで洗浄する。ロータリーエバボレーターにより、濾液から溶媒を減圧下で蒸留分離する。粗生成物を１０ｍｂａｒ、４０℃の条件で６０分間乾燥させる。粗生成物はさらに精製することなく使用される。

ＤＣ（Ｍｅｒｃｋ Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ Ｆ−２５４）：
酢酸エチル／ヘキサン３：２、 Ｒ_f＝０．８５、ＴＤＭによる着色／塩素チェンバでの顕色

IV．（−）−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）−４−（Ｎ−tert−ブチルオキシカルボニル）アミノ−２，３−ジメチル−メチレンジオキシ−１−（ヒドロキシメチル）シクロペンタン（４）
粗生成物３を４００ｍｌのテトラヒドロフランに室温で撹拌しながら溶解し、８０ｍｌの脱イオン水を添加する。４℃に冷却後、５．３ｇの水素化ホウ素ナトリウムを一度に添加し、一晩撹拌する。その間、その混合物を室温までゆっくりと加温する。１００ｍｌのエタノールを加え、室温で６時間撹拌する。ロータリーエバボレーターで溶媒を減圧下蒸留分離する。３００ｍｌの塩化ナトリウム飽和溶液と６５０ｍｌの酢酸エチルを添加し、分液ロートに移し入れる。有機相を分離し、水相を再び３５０ｍｌの酢酸エチルで洗浄する。合わせた有機相は硫酸マグネシウム上で乾燥させる。乾燥剤の濾別後、ロータリーエバボレーターで溶媒を減圧下蒸留分離する。粗生成物（４２．２ｇ）をＳｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０（カラムの高さ９３ｃｍ、直径１０ｃｍ）を充填したカラムクロマトグラフィーにより精製する（溶離剤ＴＨＦ／ヘキサン 当初１：３、ついで２：３、流速３ｌ／時間）。４０ｍｌの画分を収集する。該画分はＤＣ（Ｍｅｒｃｋ Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０ Ｆ−２５４：酢酸エチル／ヘキサン ３：２、Ｒ_f＝０．４５、ＴＤＭによる着色／塩素チェンバでの顕色）により測定する。ロータリーエバボレーターにより、合わせた生成物画分から溶媒を真空下で蒸留分離させる。収量：２４．９ｇ。

Ｖ．（−）−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）−４−アミノ−２，３−ジヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）シクロペンタン（５）
１１．０９ｇ（３８．６ｍｍｏｌ）の生成物４に、８ｍｌの脱イオン水、ついで８０ｍｌのトリフルオロ酢酸を添加する。室温で６時間激しく撹拌すると、薄黄色の透明溶液が生成する。２００ｍｌの脱イオン水を追加し、ロータリーエバボレーターで真空下蒸発させる。さらに２００ｍｌの脱イオン水を加えて再度ロータリーエバボレーターで真空下蒸発させる。粗生成物を超音波槽で１００ｍｌの脱イオン水に溶かし、濾過する。濾液をＤｏｗｅｘ １Ｘ８（１００〜２００メッシュ、ＯＨ型）イオン交換カラム（１５×４．９ｃｍ）に添加し、水で溶出する。生成物の溶出は、容量約１５０ｍｌを越えた時点から容量３００ｍｌまで行われる（ｐＨ１０．４）。画分をＤＣ（Ｍｅｒｃｋ Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０ Ｆ−２５４：ブタノール／氷酢酸／水 ５：２：３、Ｒ_f０．４２、ＴＤＭによる着色／塩素チェンバでの顕色）により測定する。ロータリーエバボレーターにより、合わせた生成物画分から溶媒を真空下で蒸留分離させる。収量：５．２ｇ、無色オイル。

VI．ニコチンアミドのＺｉｎｃｋｅ塩（６）
窒素雰囲気下で５８．６ｇのジニトロクロロベンゼンを融解させ、ついでこの融解物に２９．３２ｇのニコチンアミドを添加する。これを１１０℃で２．５時間加熱する。３：２（ｖ／ｖ）のエタノール／水混合物５００ｍｌを、環流冷却器を通して添加し、溶液となるまで環流下で沸騰させる。室温で一晩撹拌した後、１５０ｍｌの５０％エタノール／水および１００ｍｌの水を添加し、分液ロートに移し入れて、それぞれ５００ｍｌのクロロフォルムで３回洗浄する。分離した水相に３００ｍｌおよび５０ｇの活性炭を加え、室温で１時間撹拌した後、Ｓｅｉｔｚ Ｔｉｅｆｅｎｆｉｌｔｅｒ Ｋ ７００深層フィルターに通して濾過する。濾液をロータリーエバボレーターにより真空下で約１００ｍｌに濃縮するが、その間浴温は２０℃を越えてはならない。つぎに、３００ｍｌの水で希釈して、撹拌下室温で７０ｇのテトラフルオルホウ酸ナトリウムを添加する。沈殿物をメタノール／水で再結晶化させる。この結晶体を濾別し、少量のアセトンついでジエチルエーテルで洗浄して高真空下４０℃で２４時間乾燥させる（収量２１．１ｇ、２３％）。画分をＤＣ（Ｍｅｒｃｋ Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０ Ｆ−２５４：ブタノール／氷酢酸／水 ５：２：３、Ｒ_f＝０．５６）により測定する。

VII．（−）−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）−４−（３−カルボキシアミドピリジン−１−イル）−２，３−ジヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）シクロペンタン（６）＝カルバニコチンアミドモノヌクレオシド＝カルバＮＭＮ
１１０ｍｌの無水メタノールに４．５ｇ（３１ｍｍｏｌ）のシクロペンチルアミン５を溶かした溶液を、１１０ｍｌの無水メタノールに１５．３ｇ（４０．７ｍｍｏｌ）のＺｉｎｃｋｅ塩６を溶かした溶液に、撹拌下室温で９０分以内に滴下する。１ｍｌのジイソプロピルエチルアミンを添加し、その後室温で２日間撹拌する。５００ｍｌの水を添加し、分液ロートに移し入れて、それぞれ２００ｍｌの塩化メチレンで２回洗浄する。ロータリーエバボレーターにより、分離した水相から水を真空下で蒸留分離させる。残渣は１００ｍｌの水に入れて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ２５（Ｎａ⁺型）によるカラムクロマトグラフィーで精製する：カラム７０×７．５ｃｍ、緩衝液Ａ（脱イオン水）から緩衝液Ｂ（０．３５Ｍ ＮａＣｌ水溶液）への変更下での溶出、流速２００ｍｌ／時間。１５ｍｌの画分を収集し、ＤＣ（Ｍｅｒｃｋ Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ Ｆ−２５４：ブタノール／氷酢酸／水 ５：２：３、Ｒ_f０．２２）により測定する。

ロータリーエバボレーターにより、合わせた生成物画分から溶媒を真空下で蒸留分離する。塩含有残渣は５００ｍｌの加熱エタノールにより煮沸除去する。加熱状態で濾過し、室温で１２時間放置する。沈殿物を濾別し、ロータリーエバボレーターにより濾液から溶媒を真空下で蒸留分離する。収量７ｇ。

VIII．（−）−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）−４−（３−カルボキシアミドピリジン−１−イル）−２，３−ジヒドロキシ−１−フォスファトイルメチル）シクロペンタン（６）＝カルバＮＭＮ−モノフォスフェート
８０ｍｌの無水トリメチルリン酸エステルへ７ｇ（２７．７ｍｍｏｌ）のカルバＮＭＮを加えた懸濁液に、２０ｍｌのオキシ塩化リンと５０ｍｌのトリメチルリン酸エステルの混合物を０℃で添加する。これを０℃で２時間、ついで室温で２時間撹拌する。氷冷下で３００ｍｌの水を添加した後、この混合物をロータリーエバボレーターにより真空下で１０ｍｌに濃縮する。これを１００ｍｌの水に入れ、濾過後Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ２５（ＮＥｔ₃Ｈ⁺型）によるカラムクロマトグラフィーで精製する：カラム６６×９ｃｍ、緩衝液Ａ（脱イオン水）から緩衝液Ｂ（０．６０Ｍ酢酸アンモニウム）への変更下での溶離、流速２００ｍｌ／時間。１５ｍｌの画分を収集し、ＤＣ（Ｍｅｒｃｋ Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ Ｆ−２５４ ｐｌａｔｅｓ：イソ酪酸／アンモニア／水 ６６：１：３３、Ｒ_f０．２５）により測定する。ロータリーエバボレーターにより、合わせた生成物画分から溶媒を真空下で蒸留分離する。残渣を１００ｍｌの水に溶かし、凍結乾燥する。この操作を３回繰り返す。収量：４．０ｇ。

IX．カルバＮＡＤ（９）
４０ｍｌの無水ＤＭＦに３．３１ｇ（１０ｍｍｏｌ）のカルバＮＭＮモノフォスフェートを溶かした溶液と無水アセトニトリルに７８ｍｌ（３９ｍｍｏｌ）の３．５％テトラゾールを溶かした溶液の混合液に、４０ｍｌの無水ＤＭＦに１．２５ｇ（３０ｍｍｏｌ）のＡＭＰモルフォリデートを溶かした溶液を室温にて１時間以内に滴下する。この混合物を室温で２日間撹拌する。

ドライアイス／アセトンによる冷却下で、１０％ＫＨＣＯ₃水溶液によりｐＨを６．５に調整する。５００ｍｌの水で希釈後、ロータリーエバボレーターにより真空下乾固するまで注意深く濃縮する。残渣を１５０ｍｌの脱イオン水に溶かし、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＱＡＥ２５（ＮＥｔ₃Ｈ⁺型）によるカラムクロマトグラフィーで精製する：カラム６５×４．５ｃｍ、緩衝液Ａ（脱イオン水）から緩衝液Ｂ（１Ｍ炭酸トリエチルアンモニウム）への変更下での溶離、流速２００ｍｌ／時間。１５ｍｌの画分を収集し、ＤＣ（Ｍｅｒｃｋ Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ Ｆ−２５４ ｐｌａｔｅｓ ： イソ酪酸／アンモニア／水 ６６：１：３３、Ｒ_f０．４７）により測定する。

ロータリーエバボレーターにより、合わせた生成物画分から溶媒を真空下で蒸留分離する。残渣を１００ｍｌの水に溶かし、凍結乾燥する。この操作を３回繰り返す。収量：１．１ｇ。

カルバＮＡＤの安定性試験
カルバＮＡＤまたはＮＡＤの１０ｍＭ溶液を、ｐＨ８の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液に加えて負荷をかける。０．２５、７５および１７５時間後にＨＰＬＣクロマトグラフィーにより含有量を測定する。

緩衝液Ａ：１００ｍＭ ＫＨＰＯ₄＋１０ｍＭ硫酸水素テトラブチルアンモニウム、ｐＨ６．９
緩衝液Ｂ：緩衝液Ａ＋アセトニトリル １：１
流速 １．０ｍｌ／分、検出：２５４ｎｍ
ＲＰ１８カラム：長さ１２５ｍｍ、直径４．６ｍｍ
グラジエント：４０分で３５％緩衝液Ｂに調整、２分間維持、ついで３分内で０％緩衝液Ａに設定。

図２および３には、ＨＰＬＣ分析による負荷後の面積％が時間別に描かれている。

分解生成物（ニコチンアミド、ＡＤＰリボース、ＡＭＰ、ＡＤＰおよびＮＡＤの未知分解生成物、さらにはｃＮＡＤの未知分解生成物Ｙ１、Ｙ２）の発生状況から、ｃＮＡＤはＮＡＤに比べて非常に安定であることが明らかである。

Ｂ）ピロリジニル−ＮＡＤの製造
Ｉ．ｐＮＡＤ合成の第１過程（化合物１０）

５００ｍｌのＤＭＦに溶かしたトランス−Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｏ−メシル−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリノール（３５．４ｇ、１２０ｍｍｏｌ）溶液を準備し、７５ｍｌの水に溶かしたアジ化ナトリウム（１５．６ｇ、２４０ｍｍｏｌ）をそこへ添加して５時間で７０℃に昇温した。ついで、室温で一晩撹拌し、この混合物を１０００ｍｌの飽和食塩溶液に注入して酢酸エチルで抽出した。酢酸エチルはＮａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、ついで蒸発させた。

残渣量は３２．８ｇ（＞１００％）であった（理論値：２９ｇ）。

粗生成物はＤＣおよびＭＳ測定後、さらに処理した。測定には、ＫＧ６０ Ｆ２５４プレートによる薄層クロマトグラフィーを行った（移動相：酢酸エチル／ニンヒドリンのスプレー）。

トランス−Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｏ−メシル−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリノール Ｒ_f：０．４９
生成物Ｒ_f：０．７８
ＭＳ ＥＳＩ ＥＳ＋２４２

さらに、生成物の同一性をＮＭＲ分析により確認した。
^*トランス−Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｏ−メシル−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリノールは、Ｓａｎｏｃｈｅｍｉａ Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｋａ（株）からカタログ番号Ｐ−７１９として販売されている。

II．ｐＮＡＤ合成の第２過程（化合物１１）

化合物１０（１２０ｍｍｏｌ）を、２．０ｇのパラジウム炭素（１０％）を含む５００ｍｌのメタノールに混入し、３０ｍｂａｒで１２時間水素添加した。この過程において、反応用フラスコはＨ₂を数回流し、触媒は吸引濾過により除去し、メタノール溶液を濃縮した。

無色のオイルが得られた（このオイルは高い空気感受性を示すので、直ちに処理すべきである）。

ＭＳ ＥＳＩ ＥＳ＋２１７の存在。

ＤＣ（イソへキサン／酢酸エチル １／１／ ＫＧ２５４ Ｆ／ニンヒドリン）：生成物は出発点に残る。

さらに、生成物の同一性をＮＭＲ測定により確認した。

III．ｐＮＡＤ合成の第３過程（化合物１２）

１２０ｍｍｏｌの化合物１１（分子量：２１６．２８）を、ＮａＨＣＯ₃（１１．０ｇ、１３０ｍｍｏｌ）および塩化Ｆｍｏｃ（３３．８ｇ、１３０ｍｍｏｌ）を含む５００ｍｌのジオキサンに混入し、室温で一晩撹拌した。得られた塩を濾別し、溶液を蒸発させて残渣をシリカゲル・カラム（イソへキサンおよびイソへキサン／ＥＥ ８／２〜１／１）に通して精製した。

主画分の量は３９．０ｇ＝７４．１％^*であった（理論値＝５２．６ｇ）。
ＤＣ（ＫＧ６０ Ｆ２５４ 移動相 イソへキサン／酢酸エステル ２：１）：Ｒ_F０．１３
ＭＳ ＥＳＩ ＥＳ ＋４３９／＋３３９

さらに、生成物の同一性をＮＭＲ測定により確認した。
^*収率は第１過程の溶離物を基準とする。

IV．ｐＮＡＤ合成の第４過程（化合物１３）

第３過程からの化合物１２（７．０８ｇ、１６．１ｍｍｏｌ）を８０ｍｌのトリメチルフォスフェートに溶かし、ついで氷浴で０℃に冷却した。ＰＯＣｌ₃をトリメチルフォスフェートと混合（１３ｍｌの新たに蒸留したＰＯＣｌ₃を１３ｍｌのトリメチルフォスフェートに混合）して滴下ロートに入れ、アルゴン雰囲気のもと２０分以内で分割添加した。発熱反応により温度は５℃にまで上昇した。ついで２．６ｍｌのピリジンを添加し、０℃およびアルゴン雰囲気の条件下で４０分間追加撹拌した。

この反応溶液を、氷冷された８００ｍｌの１Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム溶液（ｐＨ＝８）に慎重に滴下した。完全に添加し終えた後に、さらに１時間撹拌した。わずかに混濁したこの溶液を、ついで１ｌのＮａＣｌ飽和溶液に（迅速に）滴下した。晶出効果を上げるために一晩追加撹拌した後、沈殿物を濾別した。残渣をＤｉａｉｏｎカラムに通して脱塩した。このためには、５００ｇのＤｉａｉｏｎをイソプロパノール／水 １／１に添加して一晩膨潤させた。その後、Ｄｉａｉｏｎをカラムに充填し、水で洗浄した。前記残渣のスラリーはｐＨ３．５（酢酸）の１００ｍｌの水中で生成するが、ついでこれをカラムに添加し、食塩がなくなるまで水（ｐＨ３．５）で洗浄した。その後、２５％のイソプロパノール（ｐＨ３．５）によりカラムから物質を溶出させた。この溶液を高真空、室温のもとで蒸発させた。
残渣＝２．６ｇ＝３１．３％
ＤＣ ＲＰ８ Ｆ２５４／ＭｅＯＨ／水 ９／１
ＭＳ ＥＳＩ ＥＳ−５１７．１３

さらに、生成物の同一性をＮＭＲ測定により確認した。

Ｖ．ｐＮＡＤ合成の第５過程（化合物１４）

２５０ｍｌのメタノールに投入した第４過程からの化合物１３（４．１０ｇ、７．９ｍｍｏｌ）と８３ｍｌの２５％アンモニアとの混合物を室温で一晩撹拌し、室温および真空下の条件で蒸発させた。残渣は２００ｍｌの水に入れ、次に１００ｍｌ酢酸エチルの添加、撹拌の操作を３回繰り返した。不溶分を濾別して透明水相を分離させ、それを室温で再び蒸発させた。
残渣＝２．５６ｇ＝１００％
ＭＳ ＥＳＩ ＥＳ−２９５
ＮＨ₃カチオンを除去するため、残渣を２回ヒューニッヒ塩基中で溶解させ、各回それぞれ高真空下で再度蒸発させた。

VI．ｐＮＡＤ合成の第６過程（化合物１５）

Ｚｉｎｋｅ塩（２．６６ｇ、８．９９ｍｍｏｌ）を５０ｍｌメタノールに部分的に溶かした溶液に、５０ｍｌのメタノールに溶かした第５過程からの化合物１４（２．５６ｇ、８．３１ｍｍｏｌ）を撹拌下で滴下した。この混合物は赤く着色し、漸次溶解した。室温で一晩追加撹拌し、生じた沈殿物を濾別した。濾液を真空中で蒸発させた後１００ｍｌの水に入れ、酢酸エチルによる抽出を３回行った。

酢酸エチル相は副産物ジニトロアニリンを、水相は生成物および残留Ｚｉｎｃｋｅ塩を含んでいる。水相は真空中、室温で蒸発させ、得られた残渣に１０ｍｌの水を加え、マグネチックスターラーで１０分間撹拌し、不溶分を濾別した。生成物は溶解したままであった。この溶液を、水で洗浄したＤｉａｉｏｎ ＨＰ２０カラム（１０００ｍｌ）に添加し、１０００ｍｌの水で２回洗浄した。ついで、水／５％イソプロパノールで洗浄し、ポジティブ画分（ＤＣ ＲＰ８ ＭｅＯＨ／水 ９／１により検出）を室温で蒸発処理した。残渣をイソプロパノールと共に粉砕し、ジエチルエーテルを加えて吸引濾過した。
残渣＝１．６０ｇ＝４７．９％
ＤＣ ＲＰ８ ２５４ ＭｅＯＨ／水 ９／１
ＭＳ ＥＳ−４００．１／ＥＳ＋４０２．０ ２倍の質量を示す場合もある。
さらに、生成物の同一性をＮＭＲ測定により確認した。

VIIａ．ｐＮＡＤ合成の第７ａ過程（化合物１６）

６０ｍｌのメタノール（ナトリウムにより乾燥）に加えたＡＭＰ酸（アデノシンモノフォスフェート遊離酸）（１０ｇ、２７．５ｍｍｏｌ）と５．３ｍｌ（６０ｍｍｏｌ）のモルフォリン（新たに蒸留）との混合物を、透明溶液の状態になるまで撹拌した。ついで、１７ｇ（８２．５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を添加し、湿気の遮断下室温で一晩撹拌した。生じた沈殿物（ＤＣＨ）を吸引濾過し、濾液を３０℃で回転蒸発させた。ついで、１５０ｍｌＨ₂Ｏ／１５０ｍｌジエチルエーテルを加えて撹拌し、再び濾過した。相の分離後、水相をさらに２回それぞれ７５ｍｌのジエチルエーテルにより抽出した。ついで、水相を室温で回転蒸発させた。残渣をさらに２回ピリジンに溶かし、それぞれ高真空下で再度回転蒸発させた。

VII．ｐＮＡＤ合成の第７過程（化合物１７）

ＡＭＰ−モルフォリデート（第７ａ過程からの化合物１６）（２．５３ｇ、３．６１ｍｍｏｌ）、第６過程からの化合物１５（１．６０ｇ、３．９８ｍｍｏｌ）、フォルムアミドに溶かしたＭｎＣｌ₂溶液０．２Ｍ^*（２７．１ｍｌ、５．４２ｍｍｏｌ）および無水ＭｇＳＯ₄（０．８７ｇ、７．９５ｍｍｏｌ）からなる混合物を室温で一晩撹拌した。この時間の経過後では、ＤＣ測定（ＲＰ８ ＭｅＯＨ／水 ９／１）によれば、大部分が変換されていた。反応混合物をアセトニトリルで沈殿させ、吸引濾過した。
残渣＝５．３ｇ（理論値２．６４ｇ）^**
ＭＳ、ＥＳＩ ＥＳ−７２９．３は生成物、ＥＳ−４１５はＡＭＰモルフォリデートのカチオン、ＥＳ−４００．２／ＥＳ＋４０２．１は化合物１５（第６過程）の残基
ＤＣ ＲＰ８ Ｆ２５４ Ｒ_f０．０８５
^*この溶液は、２５１６ｍｇの無水ＭｎＣｌ₂を１００ｍｌの９９．９９％フォルムアミド中で撹拌下溶解させて調製し、ついで４Ａモレキュラーシーブを添加した。
^**残渣は粗生成物としてさらに処理した。

VIII．ｐＮＡＤ合成の第８過程（化合物１８、ピロリジニル−ＮＡＤ）

５００ｍｇの第７過程からの化合物１７（粗生成物、約５０％の塩含有）を５．０ｍｌのトリフルオル酢酸（ＴＦＡ）と混合し、室温で１時間撹拌し、ついで蒸発により濃縮した。残渣として５００ｍｇの無色オイルが生じた。
ＭＳ ＥＳＩ ＥＳ−７２９．２４（ＮＨ₃の添加が必要）
精製は、２００ｍｇと３００ｍｇに２分割の上、それぞれ下記の２分離過程を通して行った。

第１分離過程
フラクトゲルＥＭＤ ＳＯ₃−ｓカラム：直径（内径）１４ｍｍ、長さ（外装）８５ｍｍ
Ｉ．条件
（流速５ｍｌ／分） ａ） １００ｍｌ Ｈ₂Ｏ
ｂ） ２００ｍｌ ０．２５Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄
ｃ） １００ｍｌ Ｈ₂Ｏ
ｄ） ２００ｍｌ １Ｍアンモニア溶液
ｅ） １００ｍｌ Ｈ₂Ｏ

II．分離：ａ）２００ｍｇの物質を５ｍｌのＨ₂Ｏに溶かして添加する。
ｂ）Ｈ₂Ｏ→０．２Ｍ ＮＨ₄ＨＣＯ₃溶液のグラジエントにより溶出させる。（移動溶媒Ａは、２５０ｍｌのＨ₂Ｏをエルレンマイヤーフラスコに用意し、マグネチックスターラーで撹拌し、５ｍｌ／分の速度でカラムにポンピング供与する。移動溶媒Ｂは０．２Ｍ ＮＨ₄ＨＣＯ₃溶液で、２．５ｍｌ／分の速度でＡに対してポンピング供与する）。

III．分画：ａ）それぞれ３ｍｌずつ分画。
ｂ）不純物の第１ピーク。
ｃ）約７０ｍｌの予備溶出後の第２ピークは物質。

IV．再コンディショニング：ａ）１００ｍｌの１Ｍアンモニア溶液
ｂ）１００ｍｌのＨ₂Ｏ

２．分離過程
Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ２０、カラム直径（内径）３０ｍｍ、長さ（外装）１３０ｍｍ、１００ｍｌの水および１００ｍｌの水／５％イソプロパノールにより溶離させる。

水相と共に既に物質が現われる。イソプロパノール画分には不純物のみ存在する。
分析ＨＰＬＣにより３画分が得られた：Ｆ１＝１３．５ｍｇ
Ｆ２＝５．５ｍｇ
Ｆ３＝１１．５ｍｇ
総計＝３０．５ｍｇ＝１２．２％
ピロリジニルＮＡＤ（化合物１８）の同一性はＮＭＲ測定によって確認された。

グルコース脱水素酵素によるｐＮＡＤの分析
グルコース脱水素酵素（ＧｌｕｃＤＨ）のコファクターとしてのｐＮＡＤの役割を調べるため、０．１Ｍトリス／０．２Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．５）緩衝液中でＧｌｕｃＤＨ活性の分析を行った。グルコースの濃度は８０ｍＭであった。ｐＮＡＤおよびＮＡＤ濃度は０．０５〜０．５ｍＭを使用した。これに対し、１０ｍｇ／ｍｌ（ｐＮＡＤ）または０．００２ｍｇ／ｍｌ（ＮＡＤ）［それぞれ８３または０．０１７μＭ］のＧｌｕｃＤＨを添加した。分析は室温で行い、酵素反応は規則的な時間間隔で吸収スペクトルを記録することにより測定した。表１に示した値は、４分後の吸収測定を対象としたものである。

ｐＮＡＤおよびｐＮＡＤＨの吸収スペクトル
図６Ａおよび６ＢにはＮＡＤ、ｐＮＡＤおよびＮＡＤＨ、ｐＮＡＤＨの吸収スペクトルが示されている。ＮＡＤおよびｐＮＡＤは２６０ｎｍで吸収極大を示す。ＰＮＡＤＨ、すなわちＧｌｕｃＤＨ活性分析後のｐＮＡＤは、ＮＡＤＨに比べて吸収極大が約１０ｎｍ赤方偏移している（図６Ｂ）。

さらに、図７および８には、ＧｌｕｃＤＨ複合体としてのＮＡＤＨおよびｐＮＡＤＨの蛍光スペクトルが示されている。各スペクトルはそれぞれ、ＧｌｕｃＤＨ活性分析後に記録した。図７は、励起波長３４０ｎｍまたは３７０ｎｍにおけるＮＡＤＨまたはｐＮＡＤＨとＧｌｕｃＤＨとの複合体の発光スペクトルを示している。励起波長３７０ｎｍにおけるＮＡＤＨおよびｐＮＡＤＨの発光スペクトルは類似している。図８は、発光波長４６０ｎｍにおけるＮＡＤＨまたはｐＮＡＤＨとＧｌｕｃＤＨとの複合体についての励起スペクトルを示している。それによると、ｐＮＡＤＨはＮＡＤＨより幅広い励起スペクトルを示す。これらのスペクトルも同様に、ＧｌｕｃＤＨ活性分析後に記録した。

ｐＮＡＤの安定性試験
ＮＡＤとの比較でｐＮＡＤの安定性を調べるため、同量のＮＡＤとｐＮＡＤをそれぞれ、０．１５Ｍ ＫＰＯ₄、１Ｍ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中に取り、５０℃でインキュベートした。ＮＡＤおよびｐＮＡＤの分解はＨＰＬＣにより追跡した。図９には、ゼロ時間における（ｐ）ＮＡＤ量を基準として比較した（ｐ）ＮＡＤ量の面積率が％表示されている。図から明らかなように、ｐＮＡＤはＮＡＤに比較して非常に安定である。

Ｃ）カルバＮＡＤシクロフォスフェート（１９）の製造

無水フォルムアミドに溶かした０．７４ｍｌの０．２塩化マンガン溶液に、７９ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）のＯ５’−（ヒドロキシ−モルフォリノ−フォスフォリル）−Ｏ₂’，Ｏ₃’−ヒドロキシ−フォスフォリル−アデノシン，Ｎ−シクロヘキシル−モルフォリン−４−カーボンイミド酸シクロヘキシルアミン塩二水化物（ピリジンとの共蒸発により乾燥（Mophatら、J. Am. Chem. Soc. 第８３巻、１９６１年、６６３〜６７５頁））、４４ｍｇ（０．１０５ｍｍｏｌ）カルバＮＭＮモノフォスフェートを、ついで２５ｍｇの乾燥硫酸マグネシウムを添加した。この混合物を閉鎖型反応器によりアルゴン雰囲気下で３日間撹拌し、ついで１０ｍｌのアセトニトリルに撹拌下で添加した。沈殿物を濾過により除去し、ＲＰ１８ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＯＤＳカラム（２５０×２１．２ｍｍ、５μｍ）でのＲＰクロマトグラフィーにより、０％Ｂから１００％Ｂのグラジエントを用いながら、６０分間にわたって精製した：溶出液Ａ：０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム、溶出液Ｂ：０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム／アセトニトリルの１：４混合液、流速：１０ｍｌ／分。溶出状態は２６０ｎｍでの検出によって監視した。酢酸トリエチルアンモニウムを除去するため、主画分を集めて５回凍結乾燥を行った。トリエチレンアンモニウム塩はＤｏｗｅｘ５０ ＷＸ２により遊離酸に、ついでリチウム塩に変換された。収量：１０ｍｇ。

Ｄ）カルバＮＡＤＰ（２０）の製造

１ｍｌのビス−トリス−プロパン緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ７．５）に２．２ｍｇのカルバＮＡＤシクロフォスフェートリチウム塩を溶かした溶液に、４ユニットのリボヌクレアーゼＴ２を３７℃で３回６時間以内に添加した。この混合物を一晩３７℃に維持した。この酵素を６５℃で２０分間加熱することにより変性させた。濾過後、ＲＰ１８ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＯＤＳカラム（２５０×２１．２ｍｍ、５μｍ）でのＲＰクロマトグラフィーにより、０％Ｂから１００％Ｂのグラジエントを用いながら６０分間にわたって精製した：溶出液Ａ：０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム、溶出液Ｂ：０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム／アセトニトリルの１：４混合液、流速：１０ｍｌ／分。溶出状態は２６０ｎｍでの検出によって監視した。酢酸トリエチルアンモニウムを除去するため、主画分を集めて５回凍結乾燥を行った。

質量スペクトル（ＭＡＬＤＩ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ ６３２７：計算値７４２．４５、実測値７４３．１７）

Ｅ）グルコース脱水素酵素によるｃＮＡＤの活性分析
項目Ｂ）でｐＮＡＤについて記載したとおり、ｃＮＡＤに対するグルコース脱水素酵素活性分析をＮＡＤとの比較で行った。このために、グルコース脱水素酵素の使用濃度は０．１ｍｇ／ｍｌ（ｃＮＡＤの場合）または０．００２ｍｇ／ｍｌ（ＮＡＤの場合）［それぞれ０．８３または０．０１７μＭ］とした。使用量および結果は表２に示した。

Ｆ）ｃＮＡＤおよびｃＮＡＤＨの吸収スペクトル
図１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃは、ＮＡＤとｃＮＡＤの吸収スペクトルを示している。ＮＡＤもｃＮＡＤも２６０ｎｍに吸収極大を有している。図１０ＢはＮＡＤＨおよびｃＮＡＤＨの吸収スペクトルを示している。そのスペクトルは、それぞれグルコース脱水素酵素活性分析後に記録したものである。ｃＮＡＤＨの吸収極大は２０ｎｍの赤方偏移を示している。図１０ＣにはＮＡＤＨおよびｃＮＡＤＨの吸収スペクトルがさらに示されているが、注釈部分に記載されているように、それぞれのグルコース脱水素酵素活性分析では異なった条件が選択されている。

さらに、図１１にはＧｌｕｃＤＨとの複合体としてのＮＡＤＨおよびｃＮＡＤＨの蛍光スペクトルが示されている。当該スペクトルは、グルコース脱水素酵素活性分析後に、励起波長３７０ｎｍで記録されている。ＮＡＤＨもｃＮＡＤＨも、ＧｌｕｃＤＨによる処理により蛍光信号が増大することを示している。

カルバＮＡＤ（ｃＮＡＤ）合成過程の図式である。 ８℃および３７℃でのＮＡＤに対する負荷試験結果の図である。 ８℃および３７℃でのカルバＮＡＤに対する負荷試験結果の図である。 ＡＤＰのアルキル化によるボラノＮＡＤ合成方法の図式である。ただし、ＹがＢＨ₃の場合は、ＡＤＰのベータフォスフェートのみがアルキル化される。 ピロリジニルＮＡＤ（ｐＮＡＤ）合成方法の図式である。構造式のほか、化合物番号および各反応過程での収率が記載されている。 ＮＡＤ、ｐＮＡＤの吸収スペクトルの図である。 ＮＡＤＨ、ｐＮＡＤＨの吸収スペクトルの図である。 ＧｌｕｃＤＨ複合体としてのＮＡＤＨおよびｐＮＡＤＨの蛍光スペクトル（発光スペクトル）の図である。 ＧｌｕｃＤＨ複合体としてのＮＡＤＨおよびｐＮＡＤＨの蛍光スペクトル（励起スペクトル）の図である。 ＮＡＤとｐＮＡＤの安定性の比較図である。 ＮＡＤとｃＮＡＤの吸収スペクトルの図である。 ＮＡＤＨとｃＮＡＤＨの吸収スペクトルの図である。 ＮＡＤＨとｃＮＡＤＨの吸収スペクトルの図である。 ＧｌｕｃＤＨ複合体としてのＮＡＤＨとｃＮＡＤＨの蛍光スペクトルの図である。

Claims (15)

1. 被分析物測定のための試験用デバイスであって、
   （ｉ）補酵素依存性酵素またはその種の酵素の基質および
   （ii）補酵素として下記一般式（Ｉ）で表される化合物であって、
   

   

   Ａはアデニン、または７−デアザアデニン、８−アザアデニンおよび７−デアザ−８−アザアデニンであって、７−デアザアデニンおよび７−デアザ−８−アザアデニンは、任意には、第７位でハロゲン、Ｃ₁〜Ｃ₆−アルキニル、Ｃ₁〜Ｃ₆−アルケニルまたはＣ₁〜Ｃ₆−アルキルにより置換されていてもよい、
   Ｔはそれぞれ独立してＯ、Ｓ、
   Ｕはそれぞれ独立してＯＨ、ＳＨ、
   Ｖはそれぞれ独立してＯＨまたはフォスフェート基、
   ＷはＣＯＯＲ、ＣＯＮ（Ｒ）₂、ＣＯＲ、ＣＳＮ（Ｒ）₂であって、Ｒはそれぞれ独立してＨまたはＣ₁〜Ｃ₂アルキル、
   Ｘ₁はＯ、
   Ｘ₂はＯ、
   ＹはＯ、
   Ｚは下記一般式（II）で表される飽和の炭素環またはヘテロ環の五員環であって、
   

   

   上記式（II）のＣ（Ｒ４） ₂が上記式（Ｉ）のＸ₂に結合し、
   上記式（II）のＲ６’が上記式（Ｉ）のピリジン環の窒素原子に結合し、
   Ｒ５’とＲ５”との間が一重結合であり、
   Ｒ４はそれぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＣＨ₃、
   Ｒ５はＣ（Ｒ４） ₂、
   Ｒ５’はＮＨ、ＮＣ₁〜Ｃ₂アルキル、Ｃ（Ｒ４） ₂、ＣＨＯＨ、ＣＨＯＣＨ₃、
   Ｒ５”はＣ（Ｒ４） ₂、ＣＨＯＨ、ＣＨＯＣＨ₃、
   Ｒ６、Ｒ６’はそれぞれ独立してＣＨ、ＣＣＨ₃
   である化合物もしくはその塩または必要な場合にはその還元型化合物
   を含み、前記補酵素依存性酵素がグルコース脱水素酵素であるグルコース測定のための試験用デバイス。
2. 請求項１記載の試験用デバイスであって、ＷはＣＯＮＨ₂またはＣＯＣＨ₃である試験用デバイス。
3. 試験ストリップの形態である請求項１または２記載の試験用デバイス。
4. 一般式（Ｉ”）で表わされる化合物であって、
   

   

   Ａはアデニン、または７−デアザアデニン、８−アザアデニンおよび７−デアザ−８−アザアデニンであって、７−デアザアデニンおよび７−デアザ−８−アザアデニンは、任意には、第７位でハロゲン、Ｃ₁〜Ｃ₆−アルキニル、Ｃ₁〜Ｃ₆−アルケニルまたはＣ₁〜Ｃ₆−アルキルにより置換されていてもよい、
   Ｔはそれぞれ独立してＯ、Ｓ、
   Ｕはそれぞれ独立してＯＨ、ＳＨ、
   Ｖはそれぞれ独立してＯＨまたはフォスフェート基、
   ＷはＣＯＯＲ、ＣＯＮ（Ｒ）₂、ＣＯＲ、ＣＳＮ（Ｒ）₂であって、Ｒはそれぞれ独立してＨまたはＣ₁〜Ｃ₂アルキル、
   Ｘ₁はＯ、
   Ｘ₂はＯ、
   ＹはＯ、
   Ｚは一般式（II）で表される飽和の炭素環またはヘテロ環の五員環であって、
   

   

   上記式（II）のＣ（Ｒ４） ₂ が上記式（Ｉ”）のＸ ₂ に結合し、
   上記式（II）のＲ６’が上記式（Ｉ”）のピリジン環の窒素原子に結合し、
   Ｒ５’とＲ５”との間が一重結合であり、
   Ｒ４はそれぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＣＨ₃、
   Ｒ５はＣ（Ｒ４） ₂、
   Ｒ５’はＮＨ、ＮＣ₁〜Ｃ₂アルキル、Ｃ（Ｒ４） ₂、ＣＨＯＨ、ＣＨＯＣＨ₃、
   Ｒ５”はＣ（Ｒ４） ₂、ＣＨＯＨ、ＣＨＯＣＨ₃、
   Ｒ６、Ｒ６’はそれぞれ独立してＣＨ、ＣＣＨ₃、
   ただし、Ｒ５がＣＨ₂、ＴがＯ、ＵがそれぞれＯＨ、ＶがＯＨ、ＷがＣＯＮＨ₂、Ｘ₁、Ｘ₂がＯおよびＹがＯのとき、Ｒ５’とＲ５”は同時にＣＨＯＨではないことを条件
   とする化合物もしくはその塩または必要な場合にはその還元型化合物。
5. 請求項４記載の化合物であって、ＷがＣＯＮＨ₂またはＣＯＣＨ₃である化合物。
6. 請求項４または５記載の化合物であって、第１残基のＶはＯＨ基であり、第２残基のＶはフォスフェート基であって、必要な場合には前記ＯＨ基およびフォスフェート基はこれらが結合する炭素原子と環を形成する化合物。
7. 請求項４〜６のいずれか１項に記載の化合物であって、Ｒ５’がＣ（Ｒ４） ₂もしくはＣＨＯＨまたはＲ５’がＮＨもしくはＮＣ₁〜Ｃ₂アルキルである化合物。
8. 然るべき酵素と請求項４〜７のいずれか１項に記載の化合物との組み合わせからなる酵素／補酵素複合体であって、前記酵素が、グルコース脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．４７）、乳酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．２７、 １．１．１．２８）、りんご酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３７）、グリセロール脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．６）、アルコール脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．１）、アルファ−ヒドロキシブチレート脱水素酵素、ソルビトール脱水素酵素またはＬ−アミノ酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．４．１．５）から選択されたアミノ酸脱水素酵素から選択された脱水素酵素であることを特徴とする複合体。
9. 酵素反応による試料中の被分析物の検出のための請求項４〜７のいずれか１項に記載の化合物または請求項８記載の複合体の使用。
10. 請求項４〜７のいずれか１項に記載の化合物および必要な場合には、然るべき酵素または請求項８記載の酵素／補酵素複合体、さらには然るべき反応緩衝液を含む試薬キットであって、前記酵素が、グルコース脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．４７）、乳酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．２７、 １．１．１．２８）、りんご酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３７）、グリセロール脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．６）、アルコール脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．１）、アルファ−ヒドロキシブチレート脱水素酵素、ソルビトール脱水素酵素またはＬ−アミノ酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．４．１．５）から選択されたアミノ酸脱水素酵素から選択された脱水素酵素であることを特徴とする試薬キット。
11. グルコース測定のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の試験用デバイスの使用。
12. グルコース、乳酸、りんご酸、グリセロール、アルコール、コレステロール、トリグリセリド、アスコルビン酸、システイン、グルタチオン、ペプチド、尿素、アンモニウム、サリチル酸塩、ピルビン酸塩、５’−ヌクレオチダーゼ、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）および二酸化炭素から選択された被分析物の測定のための、請求項１０記載の試薬キットの使用。
13. （ａ）試料と請求項１〜３のいずれか１項に記載の補酵素含有試験用デバイスとの接触、
    （ｂ）グルコースの検出
    の過程を含む、グルコース検出のための方法。
14. （ａ）試料と請求項１０記載の補酵素含有試薬キットとの接触、
    （ｂ）被分析物の検出
    の過程を含む、被分析物検出のための方法。
15. 前記被分析物の検出が分光測定または蛍光測定により行われることを特徴とする請求項１１３または１４記載の方法。

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