MX2008000946A

MX2008000946A - Derivados estables del dinucleotido de nicotinamida adenina/fosfato del dinucleotido de nicotinamida adenina.

Info

Publication number: MX2008000946A
Application number: MX2008000946A
Authority: MX
Inventors: Joachim Hoenes; Dieter Heindl; Carina Horn; Claudia Gaessler-Dietsche
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2005-07-28
Filing date: 2006-07-28
Publication date: 2008-03-27
Also published as: KR20120044372A; JP5129133B2; EP2364989B1; US8809013B2; PT2364988E; WO2007012494B1; KR101035524B1; EP1907408B1; JP5650695B2; PT2364989E; US9399790B2; HK1123308A1; KR101483829B1; EP1907408A1; AU2006274140A1; CA2614792C; CN103122371A; WO2007012494A1; KR20080028507A; CN101233144B

Abstract

La invencion se refiere a derivados del dinucleotido de nicotinamida adenina (NAD/NADH) o derivados del fosfato del dinucleotido de nicotinamida adenina (NADP/NADPH) de la formula (I), a complejos de enzima de los derivados, y al uso de los mismos en los metodos de deteccion bioquimica y a kits reactivos. (ver formula (I)).

Description

DERIVADOS ESTABLES DEL DINUCLEOTIDO DE NICOTINAMIDA ADENINA/ FOSFATO DEL DI UCLEOTIDO DE NICOTINAMIDA ADENINA Campo de la Invención La invención se refiere a derivados del dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD/NADH) y derivados del fosfato del dinucleótido de nicotinamida adenina (NADP/NADPH) , estables, a complejos de enzimas de estos derivados y a sus métodos bioquímicos de detección y kits reactivos. Antecedentes de la Invención Los sistemas de medición para las substancias analíticas bioquímicas son componentes importantes de los métodos analíticos clínicamente relevantes. Esto se refiere principalmente a la medición de los analitos por ejemplo a los metabolitos o substratos que son determinados directa o indirectamente con la ayuda de una enzima. Los analitos son convertidos con la ayuda de un componente de enzima-coenzima y cuantificados consecutivamente. En este proceso, el analito que va a ser determinado es puesto en contacto con una enzima adecuada y una coenzima en donde la enzima es utilizada usualmente en cantidades catalíticas. La coenzima es cambiada, por ejemplo, oxidada o reducida por la reacción enzimática. Este proceso puede ser detectado electroquímicamente o fotométricamente ya sea directamente o por medio de un mediador. Una calibración proporciona una correlación directa entre el valor medido y la concentración Ref .188997 del analito que va a ser determinada. Las coenzimas son moléculas orgánicas que están unidas de manera covalente o no covalente a una enzima y son cambiadas por la conversión del analito. Los ejemplos recombinantes de las coenzimas son el dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD) (por sus siglas en inglés) y el fosfato del dinucleótido de la nicotinamida adenina (?ADP) (por sus siglas en inglés) a partir de los cuales el ?ADH y el ?ADPH respectivamente, son formados por reducción. Los sistemas de medición conocidos del arte previo están caracterizados por una duración limitada en almacenamiento y por requerimientos especiales para el medio ambiente tales como el enfriamiento o el almacenamiento en seco para lograr esta duración en almacenamiento. Por consiguiente, los resultados erróneos provocados por un almacenamiento incorrecto, inadvertido, defectuoso, pueden ocurrir por lo tanto para ciertas formas de aplicación por ejemplo en el caso de pruebas que son llevadas a cabo por los propios usuarios finales tales como la autoverificación de la glucosa. En particular, el agotamiento de los desecantes debido a la abertura del empaque primario durante períodos excesivos puede conducir a errores de medición que en algunos casos puede ser reconocidos difícilmente por el consumidor. Una medida conocida que puede ser utilizada para incrementar la estabilidad de los sistemas bioquímicos de medición es el uso de enzimas estables, por ejemplo el uso de enzimas de organismos termofílicos . También es posible estabilizar las enzimas por la modificación química, por ejemplo por reticulación o por mutagénesis. Además, los estabilizadores de las enzimas tales como la trehalosa, polivinilpirrolidona y la albúmina del suero también pueden ser agregados o las enzimas pueden ser encerradas en las ruedas poliméricas por ejemplo por fotopolimerización. También, se ha intentado mejorar la duración en almacenamiento de los sistemas bioquímicos de medición por el uso de mediadores estables. Por consiguiente, la especificidad de las pruebas es incrementada y las interferencias durante la reacción son eliminadas por el uso de mediadores que tienen el potencial redox más bajo posible. Sin embargo, los potenciales redox de los complejos de enzima/coenzima constituyen un límite inferior para el potencial redox. Si se cae abajo de este límite, esta reacción con los mediadores se hace muy lenta o aún es detenida. Alternativamente, también es posible utilizar sistemas bioquímicos de medición sin mediadores, en los cuales por ejemplo las coenzimas tales como la coenzima NADH son detectadas directamente. Sin embargo, una desventaja de tales sistemas de medición es que las coenzimas tales como NDA y NADP son inestables .

NAD (por sus siglas en inglés) y NADP (por sus siglas en inglés) son moléculas básicas-lábiles, las rutas de degradación de las cuales son descritas en la literatura (N.J. Oppenhei er en The Pyridine Nucleotide Coenzymes Academic Press, New York, London 1982, J. Everese, B. Anderson, K. You, Editores, capítulo 3, páginas 56-65). Esencialmente, la ADP-ribosa es formada durante la degradación de NAD o NADP por la segmentación de los enlaces de glicosilo entre la ribosa y la unidad de piridina. Las formas reducidas de NADH y NADPH, sin embargo, son ácidos lábiles: por ejemplo la epimerización es una ruta de degradación conocida. En ambos casos, la inestabilidad de NAD/NADP y NADH/NADPH se debe a la labilidad del enlace del glicosilo entre la ribosa y la unidad de piridina. Pero aún bajo estas condiciones que no son drásticas tales como en solución acuosa, las coenzimas NAD y NADP están ya hidrolizadas solamente por la humedad del medio ambiente. Esta inestabilidad puede conducir a inexactitudes cuando se miden los analitos. Un número de derivados de NAD/NADP son descritos por ejemplo en B.M. Anderson en the Pyridine Nucleotide Coenzymes, Academic Press New York, London 1982, J. Everese, B. Anderson, K. You, Editores, capítulo 4. Sin embargo, la mayoría de estos derivados no son bien aceptados por las enzimas. El único derivado que hasta ahora ha sido utilizado previamente para las pruebas de diagnóstico es el dinucleótido de 3-acetilpiridina adenina (acetil NAD) el cual fue descrito primero en 1956 (N.O. Kaplan, J. Biol . Chem. (1956) 221, 823) . Esta coenzima tampoco es bien aceptada por las enzimas y exhibe un cambio en el potencial redox. El uso de otros derivados de NAD con un grupo piridina modificado es descrito en WO 01/94370. Sin embargo, las modificaciones del grupo nicotinamida usualmente tienen un efecto directo sobre la reacción catalítica. En la mayoría de los casos este efecto es negativo. En otro concepto de estabilización, la unidad de ribosa fue modificada para que tenga influencia sobre la estabilidad del enlace del glicosilo. Este proceso no interfiere directamente con la reducción catalítica del grupo de nicotinamida. Sin embargo, puede existir un efecto indirecto tan pronto como la enzima se aglutine fuertemente y de manera específica a la unidad de ribosa. Con relación a esto, Kaufmann et al. describe un número de derivados de tiorribosa-NAD en WO 98/33936 y US 5,801,006 y/o WO 01/49247. Sin embargo, una correlación entre la modificación de la unidad de nicotinamida ribosa y la actividad de los derivados en las reacciones enzimáticas no ha sido demostrada previamente. CarbaNAD, un derivado sin un enlace de glicosilo fue descrito por primera vez en 1988 (J.T. Slama, Biochemistry 1989, 27, 183 y Biochemistry 1989, 28, 7866). En este derivado la ribosa está substituida por una unidad de azúcar carbacíclica. Aunque carbaNAD fue descrita como un substrato para las deshidrogenasas, su actividad todavía no ha sido probada en los métodos clínicos de detección bioquímica. Un enfoque semejante fue descrito posteriormente por G.M. Blackburn, Chem. Comm., 1996, 2765 para sintetizar el carbaNAD con un enlace de bisfosfonato de metileno en lugar del pirofosfato natural. El bisfosfonato de metileno muestra una estabilidad más elevada hacia las fosfatasas y fue utilizado como un inhibidor para la ADP ribosil ciclasa. El objetivo no fue para hacerlas más resistentes a la hidrólisis (J.T. Slama, G.M. Blackburn) . Breve Descripción de la Invención Por consiguiente, el objeto de la presente invención es proporcionar sistemas de medición bioanalítica estables especialmente para la determinación de la glucosa, que evitan la sensibilidad a la hidrólisis de ?AD/?ADP y que al mismo tiempo son activas cerno coenzimas en las reacciones enzimáticas. Este objeto es logrado por un elemento de prueba para determinar un analito que comprende: (i) una enzima dependiente de la coenzima o un substrato para tal enzima y (ii) un compuesto de la siguiente fórmula general (I) como la coenzima: O) en la cual : A = adenina o un análogo de la misma; T = en cada caso independientemente denota O, S, U = en cada caso denota independientemente OH, SH, BH3", BCNH2", V = en cada caso denota independientemente OH o un grupo fosfato, W = COOR, C0N(R)2, COR, CSN(R)2 en la cual R en cada caso denota independientemente H o alquilo de C?-C2, Xi, X2 = en cada caso denotan independientemente O, CH2, CHCH3, C(CH3)2, NH, NCH3, Y = NH, S, O, CH2 Z = un residuo que comprende un grupo cíclico con 5 átomos de C que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de O, S y N y opcionalmente uno o más substituyentes, y un residuo CR42 en donde CR42 está unido al grupo cíclico y a X2 en donde R4 = en cada caso independientemente denota H, F, Cl, CH3, siempre que Z y el residuo de piridina no estén enlazados por un enlace glicosídico, o una sal u opcionalmente una forma reducida del mismo. En una modalidad preferida W = CONH2 o COCH3. Los substituyentes preferidos sobre Z son seleccionados del grupo que consiste de OH, F, Cl y alquilo de C1-C2 los cuales están fluorados o clorados opcionalmente y/o 0-C?-C2-alquilo substituido con OH. En una modalidad preferida, un primer residuo V es OH y un segundo residuo V es un grupo fosfato. Opcionalmente, el primer grupo OH y el primer grupo de fosfato pueden formar un anillo junto con los fosfatos de carbono a los cuales los mismos están unidos . En una modalidad preferida, un elemento de prueba es provisto para determinar la glucosa, que comprende una glucosa deshidrogenasa y un compuesto de la fórmula general (I) como se mencionó anteriormente o una sal del mismo. Sorprendentemente, los compuestos de acuerdo con la invención son estables hacia la hidrólisis y son buenos substratos en los métodos de detección enzimática y pueden ser utilizados para diagnósticos bioquímicos. Este descubrimiento es contrario con aquel de la mayoría de los derivados de NAD/NADP previamente conocidos, puesto que estos derivados usualmente son estables solo durante períodos muy breves en los métodos de detección enzimática. La ventaja de los compuestos de acuerdo con la invención, comparado con el arte previo es: - una estabilidad elevada, - una actividad enzimática elevada, - una síntesis simple y económica, - los mismos pueden ser utilizados en todos los métodos de detección bioquímica conocidos previamente. Las desventajas de los métodos de detección bioquímica conocidos previamente pueden ser evitados ampliamente por la provisión de derivados de NAD/NADP estables, utilizando la presente invención preferentemente en combinación con una formulación estabilizadora tal como por ejemplo encerrando las enzimas en redes poliméricas. Sin embargo, no es necesario utilizar aditivos estabilizadores.

Esto es particularmente ventajoso puesto que mientras menor sea el número de substancias reactivas involucradas, mayor será la probabilidad de obtener una formación estable para la determinación del analito. La presente invención proporciona elementos de prueba que comprenden un número de derivados de NAD/NADP estables que tienen una actividad enzimática adecuada para su uso como una coenzima sobre el elemento de prueba. Los derivados de NAD/NADP estables, pueden ser producidos en los procesos de síntesis conocidos generalmente. Para esto, el grupo amino de un aminoalcohol cíclico es convertido en un derivado de piridinio por la química de Zincke. El grupo OH primario es fosforilado subsiguientemente y acoplado a un derivado de AMP activado para formar un derivado de NAD. Alternativamente, el grupo OH primario puede también ser fosforilado primero y luego el grupo amino puede ser convertido en una piridina por medio de la reacción de Zincke. Otra ruta sintética es activar el alcohol primario para formar un tosilato o yoduro y subsiguientemente alquilar el ADP. Las modalidades preferidas del elemento de prueba de acuerdo con la invención comprenden por ejemplo los compuestos que tienen la siguiente fórmula general (I'): (!') en la cual : A = adenina o un análogo de la misma; T = en cada caso independientemente denota O, S, U = en cada caso denota independientemente OH, SH, BH3~, BCNH2", V = en cada caso denota independientemente OH o un grupo fosfato, W = COOR, CON(R)2, COR, CSN(R)2 en la cual en cada caso R denota independientemente H o alquilo de C?-C2, Xi, X2 = en cada caso denotan independientemente 0, CH2, CHCH3, C(CH3)2, NH, NCH3 , Y = NH, S, O, CH2, Z = un anillo de cinco elementos, carbocíclico o heterocíclico, saturado o insaturado, en particular un compuesto de la fórmula general (II) , en la cual un enlace sencillo o un doble enlace puede estar presente entre R5 ' y R5", R4 = en cada caso denota independientemente H, F, Cl , CH3, R5 = CR42, si un enlace sencillo está presente entre R5 ' y R5", entonces R5' = 0, S, NH, NC?-C2-alquil?, CR42, CHOH, CH0CH3, R5" = CR42, CHOH, CH0CH3 , si un doble enlace está presente entre R5 ' y R5", entonces R5 ' = R5" = CR4, R6 , Rß ' = en cada caso denotan independientemente CH, CCH3 o una sal u opcionalmente una forma reducida de la misma. Los compuestos de la siguiente fórmula general (I" son otra materia objeto de la invención: (i") en la cual A = adenina o un análogo de la misma; T = en cada caso independientemente denota 0, S, U = en cada caso denota independientemente OH, SH, BH3", BCNH2", V = en cada caso denota independientemente OH o un grupo fosfato, W = COOR, CON(R)2, COR, CSN(R)2 en la cual en cada caso R denota independientemente H o alquilo de C1-C2, Xi, X2 = en cada caso denotan independientemente 0, CH2, CHCH3, C(CH3)2, NH, NCH3 , Y = NH, S, 0, CH2, Z = un anillo de cinco elementos, carbocíclico o heterocíclico, saturado o insaturado, en particular un compuesto de la fórmula general (II) , (") en la cual un enlace sencillo o un doble enlace puede estar presente entre R5 ' y R5", R4 = en cada caso denota independientemente H, F, Cl, CH3, R5 = CR42, si un enlace sencillo está presente entre R5 ' y R5", entonces R5' = 0, S, NH, NC?-C2-alquil?, CR42, CHOH, CH0CH3 , R5" = CR42, CHOH, CH0CH3, si un doble enlace está presente entre R5' y R5", entonces R5' = R5" = CR4, R6, R6' = en cada caso denota independientemente CH, CCH3 siempre que si R5 = CH2, T = O, U = en cada caso denota OH, V = OH, W = CONH2, X = 0 e Y = 0 entonces R5' y R5" no son simultáneamente CHOH, o una sal u opcionalmente una forma reducida del mismo. En una modalidad preferida, los compuestos de acuerdo con la invención contienen análogos de adenina tales como adenina Cs-substituida y N6-substituida, variantes deaza tales como la 7-deaza, variantes de aza tales como 8-aza o combinaciones tales como 7 -deaza u 8 -aza o análogos carbocíclicos tales como formicina en donde las variantes de 7 -deaza pueden ser substituidas en la posición 7 con halógeno, alquinilo de Ci-Cß, alquenilo de C?-C6 o alquilo de C?-C6. En una modalidad preferida adicional , los compuestos contienen análogos de adenosina que contienen por ej emplo 2-metoxidesoxirribosa, 2 ' -f luorodesoxi-ribosa , hexitol , altritol o análogos policíclicos tales como azúcares bicíclicos , de LNA y tricíclicos en lugar de la ribosa . En particular, los oxígenos del (di) fosfato también pueden ser substituidos isoelectrónicamente tal como por ejemplo 0" por S" y/o por BH3", 0 por NH, NCH3 y/o por CH2 y =0 por =S. En una modalidad preferida al menos un residuo U del compuesto de acuerdo con la invención es diferente de OH y es preferido particularmente al menos un residuo U = BH3" . Las modalidades preferidas especialmente son los derivados de borano carbaNAD, c-pentil NAD, pirrolil NAD, furanil NAD, carbaNAD ciclofosfato , carbaNADP, pirrolidinil NAD así como los elementos de prueba que los contienen : borano carbaNAD ciclopentil NAD pirrolil NAD furanil NAD glicofosfato de carbaNAD pirrolidinil NAD Las detecciones bioquímicas de los analitos, por ejemplo, los parámetros en los fluidos corporales tales como la sangre, el suero, el plasma o la orina o en las muestras del agua de desecho o los alimentos, son de importancia particular en los diagnósticos. En estas pruebas, el analito que va a ser determinado es puesto en contacto con una enzima adecuada y una coenzima. Por consiguiente, otra materia objeto de la presente invención es un complejo de enzima-coenzima que consiste en un compuesto de acuerdo con la invención en combinación con una enzima adecuada. Cualesquiera substancias químicas o biológicas que pueden ser detectadas por una reacción redox pueden ser determinadas como analitos, por ejemplo substancias que son substratos de una enzima dependiente de una coenzima o las propias enzimas dependientes de la coenzima. Los ejemplos preferidos de los analitos son la glucosa, ácido láctico, ácido málico, glicerol, alcohol, colesterol, triglicéridos, ácido ascórbico, cisteína, glutationa, péptidos, urea, amonio, salicilato, piruvato, 5 ' -nucleotidasa, creatina cinasa (CK) (por sus siglas en inglés) , lactato deshidrogenasa (LDH) (por sus siglas en inglés) , dióxido de carbono, etc. Para la detección de los substratos de la enzima, el elemento de prueba preferentemente contiene una enzima que es adecuada para detectar el substrato, además de la coenzima. Las enzimas adecuadas son por ejemplo las deshidrogenasas seleccionadas de la glucosa deshidrogenasa (E.C.1.1.1.47) , lactato deshidrogenasa (E.C.1.1.1.27.1.1.1.28) , malato deshidrogenasa (E.C.1.1.1.37) glicerol deshidrogenasa (E.C.1.1.1.6), alcohol deshidrogenasa (E.C.1.1.1.1), alfa-hidroxibutirato deshidrogenasa, sorbitol deshidrogenasa o aminoácido deshidrogenasa por ejemplo L-aminoácido deshidrogenasa (E.C.1.4.1.5). Las enzimas adecuadas adicionales son oxidasas tales como la glucosa oxidasa (E.C.1.1.3.4) o la colesterol oxidasa (E.C. 1.1.3.6) o las aminotransferasas tales como aspartato o alanina aminotransferasa, 5 ' -nucleotidasa o creatina cinasa. Para la detección de las enzimas, el elemento de prueba preferentemente contiene un substrato de enzima adecuado para detectar la enzima, además de la coenzima. Otra materia objeto de la presente invención es el uso de un compuesto de acuerdo con la invención o de un complejo de enzima-coenzima de acuerdo con la invención para detectar un analito en una muestra por una reacción enzimática. Con relación a esto, la detección de la glucosa con la ayuda de la glucosa deshidrogenasa (GlucDH) es preferida particularmente. El cambio en la coenzima, es decir, en el compuesto de acuerdo con la invención por la reacción con el analito (si el analito es un substrato de enzima) o por una reacción catalizada por el analito (si el analito es una enzima) puede ser detectado en un principio de cualquier manera deseada. Básicamente, todos los métodos para detectar reacciones enzimáticas que son conocidas en el arte pueden ser utilizados. Sin embargo, el cambio en la coenzima es detectado preferentemente por métodos ópticos . Los métodos de detección óptica incluyen por ejemplo la medición de la absorción, fluorescencia, dicroidismo circular (CD) , dispersión rotatoria óptica (ORD), refractometría, etc. El cambio en la coenzima es detectado particularmente de manera preferible por la medición de la fluorescencia. La medición de la fluorescencia es altamente sensible y es posible la detección aún de concentraciones bajas del analito en sistemas miniaturizados. Un líquido de prueba puede ser utilizado para detectar un analito en el cual el reactivo está presente por ejemplo en la forma de una solución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso o está presente como un polvo o liofilizado. Sin embargo, también es posible utilizar una prueba en seco, en tal caso el reactivo es aplicado a un portador, una tira de prueba. El portador puede ser por ejemplo una tira de prueba que comprende un material absorbente y/o capaz de aumentar de volumen, que es humedecido por la muestra líquida que va a ser examinada. Una matriz del gel en la cual un complejo de enzima-coenzima es incorporado, también puede ser utilizada, sin embargo, como un reactivo de detección (cotéjese DE 102 218 45 Al) . En este caso, la enzima puede ser ya sea polimerizada en la matriz junto con el compuesto de acuerdo con la invención o, después de la polimerización, la matriz se puede poner en contacto con una solución de la coenzima en la presencia de la enzima para formar el complejo de la enzima-coenzima correspondiente. Otra materia objeto de la presente invención se refiere a un kit reactivo y a su uso para detectar los analitos. El kit reactivo puede contener un compuesto de acuerdo con la invención, una enzima adecuada y un amortiguador adecuado de la reacción. Las enzimas adecuadas ya han sido descritas. El kit reactivo de acuerdo con la invención puede ser utilizado en una amplia variedad de formas y puede ser utilizado para los analitos determinados tales como la glucosa, ácido láctico, ácido málico, glicerol, alcohol, colesterol, triglicéridos, ácido ascórbico, cisteína, glutationa, péptidos, urea, amonio, salicilato, piruvato, 5 ' -nucleotidasa, CK, LDH y dióxido de carbono, etc. Un kit reactivo es preferido, el cual contiene un compuesto de acuerdo con la invención y la glucosa deshidrogenasa (E.C.1.1.1.47) para detectar la glucosa en la sangre. El kit reactivo de acuerdo con la invención puede ser utilizado para detectar un analito en una prueba líquida o en seco. Otra materia objeto de la presente invención se refiere a una tira de prueba para la detección fluorométrica o fotométrica de un analito. Tal tira de prueba contiene un compuesto como se estableció anteriormente como una coenzima y una enzima adecuada o un substrato de enzima inmovilizada sobre un material absorbente y/o que puede aumentar de volumen. Los materiales adecuados pueden ser seleccionados por ejemplo de la celulosa, los plásticos, etc. Otra materia objeto de la presente invención comprende un método para detectar un analito que comprende las etapas de : (a) poner en contacto una muestra con un elemento de prueba o un kit reactivo de acuerdo con la invención que comprende una coenzima, y (b) detectar el analito con base por ejemplo en el cambio en la coenzima. Otra ventaja de la invención es que la emisión de la fluorescencia de las coenzimas exhibe un desplazamiento batocrómico y por consiguiente existe una interferencia baja con la emisión de fluorescencia de otros materiales del elemento de prueba y/o de la muestra. Todas las modalidades preferidas de una materia objeto de la presente invención que son mostradas, también están propuestas para aplicarse a otras materias objetos de la invención tales como por ejemplo las modalidades preferidas de los compuestos de acuerdo con la invención. La invención va a ser discernida con mayor detalle por las siguientes figuras y ejemplos. Breve Descripción de las Figuras La figura 1 es un diagrama del proceso para la sintetización de carbaNAD (cNAD) . La figura 2 es una gráfica de los resultados de someter a tensión el NAD a 8 SC y 37 aC. La figura 3 es una gráfica de los resultados de someter a tensión el carbaNAD a 8 fiC y 37 2C. La figura 4 es un diagrama del proceso para sintetizar el borano NAD por la alquilación de ADP, en donde en el caso de Y = BH3 , solamente el beta fosfato de ADP fue alquilado. La figura 5 es un diagrama del proceso para sintetizar la pirrolidinilo NAD (pNAD) . Los números de los compuestos y los rendimientos de las etapas de reacción respectivas son establecidos a continuación de las fórmulas estructurales. La figura 6A y la figura 6B son los espectros de absorción de NAD y pNAD (figura 6A) y de NADH y/o pNADH (figura 6B) . La figura 7 muestra los espectros de fluorescencia de NADH y pNADH como un complejo de GlucDH (espectros de emisión) . La figura 8 muestra los espectros de fluorescencia de NADH y pNADH como un complejo de GlucDH (espectros de excitación) . La figura 9 muestra la comparación de la estabilidad de NAD y pNAD. La figura 10A, la figura 10B y la figura 10C muestran los espectros de absorción de NAD y cNAD (figura 10A) y de NADH y/o cNADH (figuras 10B y 10C) . La figura 11 muestra los espectros de fluorescencia de NADH y cNADH como un complejo de GlucDH. Descripción Detallada de la Invención Ejemplos Preparación experimental de los derivados de NAD/NADH estables La preparación de los derivados de NAD/NADH estables, es mostrada con base en carbaNAD (compuesto 9, figura 1) , y pirrolidina NAD (compuesto 18, figura 5) como ejemplos. Los derivados adicionales pueden ser preparados utilizando los procesos apropiados de síntesis. Los aminoalcoholes correspondientes utilizados como reactivos de partida ya son conocidos en la literatura: 2-amino-l, 4-anhidro-2 , 3-didesoxi-L-treo-pentitol : Huryn, Donna M. ; Sluboski, Barbara C; Tam, Steve Y.; Todaro, Louis J.; Weigele, Manfred Tetrahedron Letters (1989), 30(46), 6259-62. 3-amino-, (IR, 3S) -ciclopentanometanol , Beres, J. ; Sagi, G.; Tomoskozi, I.; Gruber, L.; Gulacsi, E.; Otvos, L.; Tetrahedron Letters (1988), 29(22), 2681-4. (A) Preparación de carbaNAD I . IR- (- ) -exo-c?s-5, 6-di idroxi-2-azabiciclo [2.2.1]heptan-3-ona (1) Una solución de 16.4 g (147 mmol) de la lR-(-)-2-azabiciclo[2.2. l]hpet-5-en-3-ona en 400 ml de acetona es agregada a una solución de 22.5 g (167 mmol) del N-metil-morfolina-N-óxido en 80 ml de agua desionizada en un matraz de fondo redondo de 1 1. Se agregan 15 ml (1.2 mmol) de una solución al 2.5 % de tetraóxido de osmio en terc-butanol dentro del transcurso de 15 minutos mientras que se enfría sobre hielo. La mezcla es agitada subsiguientemente toda la noche a temperatura ambiente. El solvente es removido por destilación en un evaporador rotatorio. El mismo se agita con 100 ml y nuevamente se retira por destilación en un evaporador rotatorio. Después de esto, el mismo es disuelto en 600 ml de agua desionizada y se agregan 35 g de carbón activado. La mezcla es agitada vigorosamente durante 1 h y luego filtrada sobre un filtro de lecho profundo Seitz K 250. El agua es removida del filtrado por destilación en un evaporador rotatorio. El producto es utilizado sin purificación adicional . TLC (gel de sílice 60 F-254 de Merck) : acetato de etilo/metanol/ácido acético glacial 7:2:1 Rf 0.75 (material de partida), 0.53 (1). Teñido con TDM/relevado en una cámara de cloro. * reactivo de TDM: solución 1: 10 g de N,N,N',N' -tetrametil-4, 4 ' -diamino-difenil metano en 40 ml de ácido acético glacial y 200 ml de agua desionizada. Solución 2: 20 g de potasio en 400 ml de agua desionizada. Solución 3: disuelva 0.3 g de ninhidrina en 10 ml de ácido acético glacial y agregue 90 ml de agua desionizada. Reactivo terminado: una mezcla de las soluciones 1 y 2 y adición de 6 ml de la solución 3. II. IR- (-) -exo-cis-5,6-dimetilmetilendioxi-2-azabiciclo- [2.2.1]heptan-3-ona (2) El producto 1 sin refinar es hervido bajo reflujo durante 1 h en 200 ml de etanol absoluto. Después de agregar 400 ml (3.26 mol) de dimetoxipropano y 250 mg (2.2 mmol) del clorhidrato de piridina, la mezcla es hervida bajo reflujo durante 15 minutos adicionales. Después de agregar 10 ml de la solución de carbonato ácido de sodio, saturada, la solución es evaporada a sequedad bajo vacío en un evaporador rotatorio. 500 ml de cloroformo, 150 ml de la solución de cloruro de sodio, saturada y 75 ml de la solución de carbonato ácido de sodio, saturada, son agregados al residuo y se transfieren hacia un embudo de separación. Después de la extracción por agitación, se deja que repose toda la noche tiempo durante el cual se lleva a cabo la separación de fases . La fase orgánica es separada y la fase acuosa es extraída durante dos veces adicionales con 200 ml de cloroformo en cada caso. Las fases orgánicas combinadas son secadas sobre sulfato de magnesio. Después de remover el desecante por filtración, el solvente es removido por destilación bajo presión reducida sobre un evaporador rotatorio. El producto sin refinar (24.9 g = 92 %) es utilizado sin purificación adicional. TLC (gel de sílice 60 F-254 de Merck) : acetato de etilo/metanol/acido acético glacial 7:2:1 Rf 0.84. Teñido con TDM/relevado en una cámara de cloro. III. lR-(-)-4-N-terc-butiloxicarbonil-exo-cis-5,6-dimetilmetileno-dioxi-2, 2-azabiciclo [2.2. l]heptan-3-ona (3) 41.5 g (190 mmol) del dicarbonato de di-terc-butilo y 0.83 g (6.8 mmol) de la 4-dimetil-aminopiridina son agregados bajo argón a una solución de 24.9 g (135.7 mmol) del producto 2 sin refinar en 450 ml de cloroformo absoluto. La mezcla es hervida bajo reflujo mientras que se agita hasta que cesa la evolución del gas. La mezcla es filtrada sobre una columna que es llenada con 40 g de gel de sílice 60 y equilibrada con cloroformo. La misma es lavada con 100 ml de cloroformo. El solvente es removido del filtrado por destilación bajo presión reducida sobre un evaporador rotatorio. El producto sin refinar es secado durante 60 minutos a 10 mbar y 40 aC. El mismo es utilizado sin purificación adicional. TLC (gel de sílice 60 F-254 de Merck) : acetato de etilo/hexano 3:2 Rf 0.85. Teñido con TDM/relevado en una cámara de cloro. IV. (- ) - (IR, 2R, 3S, 4R) -4- (N- erc-butiloxicarbonil)amino-2, 3-dimetil-metilendioxi-1- (hidroximetil)ciclopentano (4) El producto 3 sin refinar se disuelve a temperatura ambiente en 400 ml de tetrahidrofurano mientras que se agita y se agregan 80 ml de agua desionizada. Después de enfriamiento a 4 SC, se agregan 5.3 g de borohidruro de sodio todo en una sola porción y se agita toda la noche tiempo durante el cual se permite que la mezcla se caliente lentamente hasta la temperatura ambiente. Se agregan 100 ml de etanol y se agitan durante 6 h a temperatura ambiente. Los solventes son removidos por destilación bajo presión reducida sobre un evaporador rotatorio. Se agregan 300 ml de la solución de cloruro de sodio, saturada y 650 ml de acetato de etilo y se transfieren a un embudo de separación. La fase orgánica es separada y la fase acuosa es lavada nuevamente con 350 ml de acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas son secadas sobre sulfato de magnesio. Después de remover el desecante por filtración, el solvente es removido por destilación bajo presión reducida sobre un evaporador rotatorio. El producto sin refinar (42.2 g) es purificado por medio de cromatografía en columna y gel de sílice 60 (columna h = 93 cm, d = 10 cm) eluyente THF/hexano 1:3, luego THF/hexano 2:3), velocidad de flujo 3 1/h. Se colectan fracciones de 40 ml . Las fracciones son verificadas por TLC (gel de sílice 60 F-254 de Merck: acetato de etilo/hexano 3:2 Rf 0.45. Teñido con TDM/relevado en una cámara de cloro). El solvente es removido de las fracciones combinadas del producto por destilación al vacío sobre un evaporador rotatorio, rendimiento: 24.9 g. V. (- ) - (IR 2R, 3S,4R) -4-amino-2, 3-dihidroxi-1- (hidroximetil) -ciclopentano (5) 8 ml de agua desionizada y luego 80 ml de ácido trifluoroacético son agregados a 11.09 (38.6 mmol) de 4. La solución se agita vigorosamente durante 6 h a temperatura ambiente, tiempo durante el cual se forma una solución de color amarillo tenue, clara. Se agregan 200 ml de agua desionizada, y la misma se evapora bajo vacío sobre un evaporador rotatorio. Se vuelven a agregar 200 ml de agua desionizada y la misma es evaporada nuevamente bajo vacío en un evaporador rotatorio. El producto sin refinar es disuelto en 100 ml de agua desionizada en un baño ultrasónico y se filtra. El filtrado es aplicado a una columna de intercambio iónico Dowex 1X8 (malla 100-200, forma de OH) (15 X 4.9 cm) y se eluye con agua, tiempo durante el cual el producto se eluye después de aproximadamente 150 ml en un volumen de 300 ml (pH 10.4). Las fracciones son verificadas por TLC (gel de sílice 60 F-254 de Merck: butanol/acido acético glacial/agua 5:2:3 Rf 0.42, teñido con TDM/relevado en una cámara de cloro) . El solvente es removido de las fracciones de los productos combinados por destilación al vacío sobre un evaporador rotatorio, rendimiento: 5.2 g de un aceite incoloro. VI. Sal de Zincke de la nicotinamida (6) 58.6 g del dinitroclorobenceno son fundidos bajo nitrógeno y luego se agregan 29.32 g de nicotinamida al material fundido. El material fundido es calentado durante 2.5 h a 110 eC. se agregan 500 ml de una mezcla de etanol/agua 3:2 (v/v) por medio de un enfriador de reflujo y se hierven bajo reflujo hasta que una solución es formada. Después de agitación toda la noche a temperatura ambiente, se agregan 150 ml de etanol/agua al 50 % y 100 ml de agua, se transfieren a un embudo de separación y se lavan tres veces con 500 ml de cloroformo cada vez. Se agregan 300 ml y 50 g de carbón activo a la fase acuosa separada la cual es agitada durante 1 h a temperatura ambiente y luego se filtra sobre un filtro de lecho profundo Seitz K 700. El filtrado es concentrado a vacío hasta aproximadamente 100 ml sobre un evaporador rotatorio, tiempo durante el cual la temperatura del baño no debe exceder 20 2C. El mismo se diluye con 300 ml de agua y se agregan 70 g de tetrafluoroborato de sodio a temperatura ambiente mientras que se agita. El precipitado es recristalizado a partir de metanol/agua. El material cristalizado es removido por filtración, lavado con una cantidad pequeña de acetona y luego con éter dietílico y secado durante 24 h al alto vacío a 40 SC (rendimiento de 21.1 g, 23 %) . Las fracciones son verificadas por TLC (gel de sílice 60 F-254 de Merck: butanol/ácido acético glacial/agua 5:2:3 Rf = 0.56) . VII . (-) - (IR, 2R, 3S, 4R) -4- (3-carboxamidopiridin-l-il) -2, 3-dihidroxi-1- (hidroximetil)ciclopentano (6) = ononucleósido de carba nicotinamida = carbaNMN Una solución de 4.5 g (31 mmol) de ciclopentilamina 5 en 110 ml de metanol absoluto es agregada por goteo dentro del transcurso de 90 minutos a una solución de 15.3 g (40.7 mmol) de la sal de Zincke 6 en 110 ml de metanol absoluto mientras que se agita a temperatura ambiente. Se agrega 1 ml de diisopropiletilamina y la misma se agita entonces durante dos días a temperatura ambiente. Se agregan 500 ml de agua, se transfieren a un embudo de separación y se lavan dos veces con 200 ml de cloruro de metileno cada vez. El agua es removida de la fase acuosa separada por destilación bajo un vacío sobre un evaporador rotatorio. El residuo es recibido en 100 ml de agua y se purifica por cromatografía en columna sobre Sephadex C25 (forma de Na+) : columna de 70 x 7.5 cm de elusión del amortiguador A (agua desionizada) hasta el amortiguador B NaCl 0.35 M en agua, velocidad de flujo de 200 ml/h. Se colectan fracciones de 15 ml y se verifican por TLC (gel de sílice 60 F-254 de Merck: acetato de butanol/ácido acético glacial/agua 5:2:3 Rf 0.22). El solvente es removido de las fracciones combinadas del producto por destilación en un vacío sobre un evaporador rotatorio. El residuo que contiene la sal es retirado por hervido con 500 ml de etanol caliente. El mismo es filtrado en caliente y se deja reposar durante 12 h a temperatura ambiente. El precipitado es removido por filtración y el solvente es removido del filtrado por destilación bajo un vacío sobre un evaporador rotatorio. Rendimiento 7 g. VIII. (-)-(lR,2R,3S,4R)-4-(3-carboxamidopiridin-l-il)-2,3-dihidroxi-1-fosfatoilmetil)ciclopentano (6) = carba NMN-monofosfato Una mezcla de 20 ml de cloruro de fosforoxi y 50 ml de fosfato de trimetilo es agregada a 0 2C a una suspensión de 7 g (27.7 mmol) de carbaNMN en 80 ml de fosfato de trimetilo anhidro. La misma se agita durante 2 h a 0 2C y luego durante 2 h a temperatura ambiente. Se agregan 300 ml de agua mientras que se enfría sobre hielo y la mezcla es evaporada hasta 10 ml bajo un vacío sobre un evaporador rotatorio. El mismo se recibe en 100 ml de agua, se filtra y se purifica por medio de cromatografía en columna sobre Sephadex C25 (forma Net3H+) : columna de 66 x 9 cm, elución del amortiguador A (agua desionizada) hasta el amortiguador B) acetato de amonio 0.60 M, velocidad de flujo de 200 ml/h. Se colectan fracciones de 15 ml y se verifican por TLC (placas de gel de sílice 60 F-254 Merck: acido isobutírico/amoníaco/agua 66:1:33 Rf 0.25). El solvente es removido de las fracciones combinadas del producto por destilación al vacío sobre un evaporador rotatorio. El residuo es disuelto en 100 ml de agua y liofilizado. Este procedimiento es repetido tres veces. Rendimiento de 4.0 g. IX. carbaNAD (9) Una solución de 1.25 g (30 mmol) de morfolidato de AMP en 40 ml de DMF absoluto es agregada por goteo dentro del transcurso de 1 h a temperatura ambiente a una mezcla de una solución de 3.31 g (10 mmol) del monofosfato de carbaNMN en 40 ml de DMF absoluto y 78 ml (39 mmol) de tetrazol al 3.5 % en acetonitrilo absoluto. La mezcla es agitada durante 2 días a temperatura ambiente. El pH es ajustado a 6.5 utilizando una solución de KHC03 al 10 %, acuosa, mientras que se enfría sobre hielo seco/acetona. La misma es diluida con 500 ml de agua y se concentra cuidadosamente a sequedad al vacío sobre un evaporador rotatorio. El residuo es disuelto en 150 ml de agua desionizada y se purifica por cromatografía en columna sobre Sephadex QAE 25 (forma NEt3H+) : columna 65 x 4.5 cm, elución del amortiguador A (agua desionizada) hasta el amortiguador B) carbonato de trietilamonio 1 M, velocidad de flujo de 200 ml/h: se colectan fracciones de 15 ml y se verifican por TLC (placas de gel de sílice 60 F-254 de Merck: ácido isobutírico/amoníaco/agua 66:1:33, Rf 0.47). El solvente es removido por destilación de las fracciones combinadas del producto por destilación al vacío sobre un evaporador rotatorio. El residuo es disuelto en 100 ml de agua y liofilizado. Este procedimiento es repetido tres veces. Rendimiento 1.1 g. Examen de la estabilidad de carbaNAD Una solución 10 mM de carbNAD y/o NAD es sometida a tensión a pH 8 en un amortiguador de fosfato de potasio 0.1 M. El contenido es determinado por medio de cromatografía de CLAR después de 0.25, 75 y 175 H. Amortiguador A: KHP04 100 mM + sulfato ácido de tetrabutilamonio 100 mM, pH 6.9 Amortiguador B: Amortiguador A + acetonitrilo 1:1 Velocidad de flujo 1.0 ml/min, detección: 254 nm Columna L 125 de RP18 de 4.6 mm de diámetro Gradiente: en 40 minutos hasta 35 % del amortiguador B, mantenido durante 2 minutos y luego se cambia a 0 % del amortiguador A dentro del transcurso de 3 minutos . Los porcentajes del área de CLAR después de que son sometidos a tensión durante varios intervalos de tiempo, son mostrados en las figuras 2 y 3. La incidencia de productos de descomposición (nicotinamida, ADP-ribosa, AMP, ADP y los productos de descomposición desconocidos para NAD y los productos de descomposición desconocidos de Yl e Y2 para cNAD) muestran que el cNAD es muy estable comparado con el NAD. B) Preparación del pirro idinil-NAD I. Síntesis de pNAD de la Ia. etapa (compuesto 10) (10) El trans-N-t-BOC-O-mesil-4-hidroxil-L-prolinol (35.4 g, 120 mmol) se disuelve en 500 ml de DMF y la azida de sodio (15.6 g, 240 mmol) disuelta en 75 ml de agua fue agregada durante 5 h a 70 fiC. La misma fue agitada subsiguientemente de manera adicional toda la noche a temperatura ambiente, la mezcla se vierte en una solución de cloruro de sodio saturada en una cantidad de 1000 ml y se extrae con acetato de etilo.

El acetato de etilo se seca con Na2S04 y subsiguientemente se evapora . Se formaron 32.8 g (> 100 %) del residuo (valor teórico: 29 g) . El producto sin refinar se procesó directamente de manera adicional después de TLC y verificación por EM. Una cromatografía de capa delgada sobre una placa KG 60 F-254 (solvente móvil: acetato de etilo/rociado con ninhidrina) fue llevada a cabo para la verificación: trans-N-t-BOC-O-mesil-4-hidroxi-L-prolinol Rf: 0.49 producto Rf: 0.78 MS ESI ES+ 242 La identidad del producto también fue confirmada por análisis de NMR.

* El trans-N-t-BOC-O-mesil-4-hidroxil-L-prolinol está disponible comercialmente de Sanochemia Pharazeutika AG, Cat. No. P. 719. II. Síntesis de pNAD de la 2a. etapa (compuesto 11) (10) (11) El compuesto 10 (120 mmol) se mezcla en 500 ml de metanol con 2.0 g de Pd-carbón (10 %) y se hidrogena durante 12 h a 30 mbar. En este proceso, el matraz de reacción se inunda varias veces con H2, el catalizador fue removido por filtración con succión y el mismo fue concentrado. Se formó un aceite incoloro (el aceite debe ser procesado inmediatamente de manera adicional debido a su alta sensibilidad al aire) . MS ESI ES+ 217 presente TLC (isohexano/acetato de etilo 1/1/KG 254 F/ninhidrina) : el producto permanece al principio. La identidad del producto también fue confirmada por el análisis de RMN. III. Síntesis de pNAD de la 3a. etapa (compuesto 12) (11) (12) 120 mmol del compuesto 11 (PM: 216.28) se mezclan en 500 ml de dioxano que contiene NaHC03 (11.0 g, 130 mmol) y cloruro de Fmoc (33.8 g, 130 mmol) y se agita toda la noche a temperatura ambiente. Las sales resultantes fueron removidas por filtración, la solución se evapora y el residuo fue purificado sobre una columna de gel de sílice (isohexano e isohexano/EE 8/2 - 1/1). La fracción principal produjo 39.0 g = 74.1 % * (valor teórico = 52.6 g) . TLC KG 60 F254 solvente móvil de isohexano/acetato de etilo 2:1): Rf 0.13 MS ESI ES+ 439/+339 La identidad del producto también fue confirmada por el análisis de RMN. * El rendimiento se refiere al producto de la primera etapa. IV. Síntesis de pNAD de la 4a. etapa (compuesto 13) (12) (13) El compuesto 12 de la etapa 3 (7.08 g, 16.1 mmol) se disuelve en 80 ml de fosfato de trimetilo y subsiguientemente se enfría a 0 aC en un baño de hielo. El POCl3 mezclado con fosfato de trimetilo (13 ml de POCl3 destilado recientemente en 13 ml de fosfato de trimetilo) fue agregado a un embudo de goteo y agregado en porciones dentro del transcurso de 20 minutos bajo argón. La temperatura se incrementó en una reacción exotérmica hasta 5 SC. Subsiguientemente se agregan 2.6 ml de piridina y se agita durante unos 40 minutos adicionales a 0 2C y bajo argón. La solución de la reacción fue agregada cuidadosamente por goteo a 800 ml de una solución de carbonato ácido de trietilamonio 1 M enfriada con hielo (pH = 8) . Después que se complementa la adición, la misma se agita durante 1 h adicional. La solución ligeramente turbia fue agregada subsiguientemente (de manera rápida) por goteo a una solución de NaCl saturada en una cantidad de 1 1. La misma fue agitada de manera adicional toda la noche para mejorar la cristalización. EL precipitado fue removido por filtración. El residuo fue desalado sobre una columna Diaion. Para este propósito, se agregan 500 g de Diaion al isopropanol/agua 1/1 y se deja que se impregne toda la noche. El Diaion fue llenado en la columna y enjuagado con agua. Una suspensión del residuo fue formada en 100 ml de agua de pH 3.5 (ácido acético) que fueron aplicados subsiguientemente a una columna y enjuagados con agua (pH 3.5) hasta que estuvo libre de cloruro de sodio. La substancia fue eluida entonces de la columna con 25 % de isopropanol (pH 3.5) . La solución fue evaporada al alto vacío a temperatura ambiente.

Residuo = 2.6 g, = 31.3 % TLC RP8 F254/MeOH/agua 9/1 MS ESI ES - 517.13 La identidad del producto también fue confirmada por análisis de NRM. V. Síntesis de pNAD de la 5a. etapa (compuesto 14) (13) (14) Una mezcla del compuesto 13 de la etapa 4 (4.10 g, 7.9 mmol) en 250 ml de metanol y 83 ml de amoníaco al 25 % se agita toda la noche a temperatura ambiente y se evapora al vacío a temperatura ambiente. El residuo fue recibido en 200 ml de agua y se agita tres veces con 100 ml de acetato de etilo. Los componentes insolubles fueron removidos por filtración; la fase acuosa clara fue separada y evaporada nuevamente a temperatura ambiente. Residuo = 2.56 g = 100 % MS ESI ES - 295 Para remover los cationes de NH3, el residuo fue disuelto en 2 x en la base de Hünig y se evaporó nuevamente cada vez al alto vacío. VI. Síntesis de pNAD de la 6a. etapa (compuesto 15) (14) (15) La sal de Zincke (2.66 g, 8.99 mmol) fue disuelta parcialmente en 50 ml de metanol y el compuesto 14 de la etapa 5 (2.56 g, 8.31 mmol) disuelto en 50 ml de metanol fue agregada por goteo mientras que se está agitando. La mezcla se volvió de color rojo y se disolvió lentamente. La misma fue agitada adicionalmente toda la noche a temperatura ambiente y el filtrado fue removido por filtración. El filtrado se evapora al vacío, se recibe en 100 ml de agua y se extrae tres veces con acetato de etilo. La fase de acetato de etilo contiene el subproducto de dinitroanilina, la fase acuosa contiene el producto y la sal de Zincke, el restante. La fase acuosa se evapora al vacío a temperatura ambiente y se agregan 10 ml de agua al residuo que fue obtenido, el cual fue agitado durante 10 minutos sobre un agitador magnético y los componentes insolubles fueron removidos por filtración. El producto permaneció disuelto. Esta solución fue aplicada a una columna Diaion HP20 (1000 ml) que ha sido enjuagada con agua y se enjuaga dos veces con 1000 ml de agua. La misma fue enjuagada subsiguientemente con agua/ isopropanol al 5 % y las fracciones positivas (detectadas por TLC RP8 MeOH/W 9/1) fueron evaporadas a temperatura ambiente. El residuo fue triturado con isopropanol y se filtraron con succión con la ayuda de éter etílico. Residuo = 1.60 g = 47.9 % TLC RP8 254 MeOH/W 9/1 MS ES - 400.1/ES + 402.0 también exhibe el doble de la masa. La identidad del producto también fue confirmada por análisis de RMN. Vlla. Síntesis de la etapa 7a de pNAD (compuesto 16) OVSrO (16) Una mezcla de ácido AMP (ácido libre de monofosfato de adenosina) (10 g, 27.5 mmol) en 60 ml de metanol (secado con sodio) y 5.3 ml (60 mmol) de morfolina (destilada recientemente) se agita hasta que una solución clara fue formada. Subsiguientemente, se agregan 17 g (82.5 mmol) de N,N' -diciclohexil carbodiimida (DCC) y se agita toda la noche a temperatura ambiente al mismo tiempo que se excluye la humedad. El precipitado (DCH) que fue formado, fue filtrado con succión y el filtrado de evaporó rotatoriamente a 30 aC. Subsiguientemente el mismo se agitó con 150 ml de H2O/150 ml de éter dietílico y nuevamente se filtra. Después de la separación de las fases, la fase acuosa se extrae nuevamente dos veces con 75 ml de éter dietílico cada vez. La fase acuosa se evaporó rotatoriamente de manera consecutiva a temperatura ambiente. El residuo se disuelve unas dos veces adicionales en piridina y otra vez se evaporaron rotatoriamente nuevamente al alto vacío. Vil. Síntesis de pNAD de la 7a. etapa (compuesto 17) (15) (16) (17) Uña mezcla del morfolidato de AMP (csrrpuesto 16 de la etapa 7a) (2.53 g, 3.61 mmol), el compuesto 15 de la etapa 6 (1.60 g, 3.98 mmol), la solución de -yfr?Cl2 en formamida 0.2 M* (27.1 ml, 5.42 mmol) y MgS04 anhidro (0.87 g, 7.95 m ol) se agita toda la noche a teitperatura ambiente y después de este intervalo de tiempo fue convertido ampliamente como se determinó por TLC (RP8 MeOH/W 9/1) . La mezcla de reacción se precipita con acetonitrilo y se filtra por succión. Residuo = 5.3 g (rendimiento teórico 2.64 g) ** MS ESI ES - 729.3 = producto, ES - 415 = catión de morfolidato de AMP, ES - 400.2 /ES + residuos de 402.1 del compuesto 15 (etapa 6) TLC RP 8 F254 Rf 0.085 * Para preparar esta solución se disuelven 2516 mg de MnCl2 anhidro en 100 ml de formamida al 99.99 % mientras que se agita y subsiguientemente se agregan tamices moleculares de 4A. ** El residuo fue procesado adicionalmente como un producto sin refinar. VIII. Síntesis de pNAD de la 8a. etapa (compuesto 18) pirrolidinilo-NAD) (17) (18) Se agregan 5.0 ml de ácido trifluoroacético (TFA) a 500 mg del compuesto 17 de la etapa 7 (producto sin refinar, que contiene aproximadamente 50 % de las sales) y se agita durante 1 h a temperatura ambiente y subsiguientemente se concentra por evaporación. Se formaron 500 ml del aceite incoloro como el residuo. MS ESI ES - 729.24 (adición de NH3 necesario) 2 porciones de 200 mg y 300 mg fueron purificadas cada una en 2 etapas de separación: Primera etapa de separación: Columna Fractogel EMD S03-S: D (interno) = 14 mm L (empacado) = 85 mm I . Acondicionamiento (velocidad de flujo 5 ml/min) a) 100 ml H20 b) 200 ml H2S040.25 M c) 100 ml H20 d) 200 ml de solución una de amoníaco 1 M e) 100 ml de H20 II. Separación: a) aplicar 200 ml de la substancia disueltos en 5 ml de H20 b) eluir con un gradiente de H20 - 0.2 M NH4HC03 en solución. (solvente móvil A = 250 ml de H20 contenido en un matraz Erlenmeyer y agitados sobre un agitador magnético, bombeado sobre la columna a una tasa de 5 ml/min del solvente B móvil = solución de NHHC03 0.2 M bombeada a 2.5 ml/min hasta A) . III. Fraccionamiento: a) fracciones cada una de 3 ml b) impurezas del primer pico c) 2 /o. pico dentro de aproximadamente 70 ml del eluido preliminar = substancia VI. Reacondicionamiento: a) 100 ml de una solución de amonio 1 M b) 100 ml de H20 2a. etapa de separación: Diaion HP20, columna D (interna) = 30 mm L (empacado) 130 mm eluido con 100 ml de H20 y 100 ml de H20/5 % de isopropanol . La substancia ya eluida en la fase acuosa; solamente las impurezas están presentes en la fracción de isopropanol . 3 fracciones fueron obtenidas con la CLAR analítica: Fl = 13.5 mg F2 = 5.5 mg F3 = 11.5 mg Total = 30.5 mg = 12.2 % La identidad del pirrolidinilo NAD (compuesto 18) fue confirmada por análisis de RMN. Ensayo de glucosa deshidrogenasa para pNAD Para examinar el papel de pNAD como un cofactor de la glucosa deshidrogenasa (GlucDH) , un ensayo de la actividad de la glucosaDH en el amortiguador de Tris 0.1 M/NaCl 0.2 M (pH 8.5) fue llevada a cabo. La concentración de la glucosa fue de 80 M. Las concentraciones de pNAD y de NAD de 0.05-0.5 mM fueron utilizadas. A esta solución, se agregan 10 mg/ml (pNAD) o 0.002 mg/ml (NAD) [83 ó 0.017 µM respectivamente] de GlucDH. El ensayo fue llevado a cabo a temperatura ambiente y la reacción enzimática fue verificada por el registro de los espectros de absorción a intervalos de tiempos regulares. Los valores mostrados en la tabla 1 se refieren a una medición de la absorción después de 4 minutos . Tabla 1 Espectro de absorción para pNAD y pNADH Los espectros de absorción de NAD y pNAD y/o NADH y pNADH son mostrados en las figuras 6A y 6B. NADH y pNAD exhiben una absorción máxima a 260 nm. El pNADH, es decir, pNAD después del ensayo de la actividad de GlucDH exhibió un cambio al color rojo de la absorción máxima en aproximadamente 10 nm (figura 6B) comparado con NADH. Los espectros de fluorescencia de NADH y pNADH como los complejos de GlucDH son mostrados adicionalmente en las figuras 7 y 8. Los espectros fueron registrados en cada caso después del ensayo de actividad de GlucDH. La figura 7 muestra los espectros de emisión de los complejos de NADH/pNADH-GlucDH a longitudes de onda de excitación de 340 y 370 nm. Los espectros de emisión de NADH y pNADH a las longitudes de onda de excitación de 370 nm son semejantes. La figura 8 muestra un espectro de excitación para un complejo de NADH/pNADH-GlucDH a una longitud de onda de emisión de 460 nm. El pNADH exhibe un espectro de excitación más amplio que NADH. Los espectros también fueron registrados después de los ensayos de actividad de GlucDH. Investigación sobre la estabilidad de pNAD Para examinar la estabilidad de pNAD comparado con NAD, las mismas cantidades de NAD y de pNAD fueron tomadas cada una en KP0 0.15 M, amortiguador de NaCl 1 M (pH 7.0) y se incubó a 50 2C. La descomposición de NAD y/o pNAD fue verificada por CLAR. La figura 9 muestra las áreas porcentuales de las cantidades de (p)NAD comparadas con las cantidades de (p)NAD en el tiempo cero. La figura muestra que pNAD es muy estable comparado con NAD.

C) Preparación de ciclofosfato de carbaNAD (19) 79 mg (0.1 mmol) de la 05 ' - (hidroxi-morfolino-fosforil) -02', 03 ' -hidroxi-fosforil-adenosina, el dihidrato de la sal de ciclohexilamina del ácido N-ciclohexil-morfolin-4-carbonimídico (secado por coevaporación con piridina (Morphat et al., J. Am. Chem. Soc. 83; 1961; 663-675), 44 mg (0.105 mmol) de monofosfato de carbaNMN y subsiguientemente 25 mg del sulfato de magnesio seco fueron agregados a 0.74 ml de una solución de cloruro de manganeso 0.2 en formamida pura. La mezcla fue agitada bajo argón durante tres días en un matraz de reacción cerrado y se agregó subsiguientemente a 10 ml de acetonitrilo mientras que se agita. El precipitado fue removido por filtración, purificado por cromatografía de RP sobre una columna RP 18 Hypersil ODS, 250 x 21.2 mM, de 5 µm utilizando un gradiente de 0 % de B hasta 100 % de B durante 60 minutos: eluyente A: acetato de trietilamonio 0.1 M, eluyente B: mezcla 1:4 de acetato de trietilamonio 0.1 M y acetonitrilo, tasa de flujo: 10 ml/min. La elución fue verificada por detección a 260 nm. La fracción principal fue colectada y liofilizada 5 veces para remover el acetato de trietilamonio. La sal de trietilamonio fue convertida en el ácido libre con Dowex 50 WX2 y subsiguientemente en la sal de litio. Rendimiento: 10 mg. D) Preparación de carbaNADP (20) Se agregan tres veces cuatro unidades de ribonucleasa T2 dentro del transcurso de 6 h a 37 2C a una solución de 2.2 mg de la sal de carbaNAD ciclofosfato de litio (19) en 1 ml del amortiguador de Bis-tris-propano (0.02 M, pH 7.5) . La mezcla fue mantenida toda la noche a 37 9C. La enzima fue desnaturalizada por calentamiento a 65 SC durante 20 minutos. Después de filtración, se llevó a cabo una purificación por cromatografía de RP sobre una columna RP 18 Hypersil ODS, 250 x 21.2 mm, de 5 µm utilizando un gradiente de 0 % de B hasta 100 % de B durante 60 minutos: eluyente A: acetato de trietilamonio 0.1 M; eluyente B: mezcla 1:4 de 0.1 ml acetato de trietilamonio y acetonitrilo; velocidad de flujo: 10 ml/min. La elución fue verificada por detección a 260 nm. La fracción principal fue colectada y liofilizada 5 veces para remover el acetato de trietil-amonio. Espectro de masa (Sistema 6327 de MALDI Applied Biosystems Voyager: calculado 742.45, encontrado: 743.17). E) Ensayo de la actividad de la glucosa deshidrogenasa para cNAD Un ensayo de la actividad de la glucosa deshidrogenasa para cNAD comparado con NAD fue llevado a cabo como se describió bajo B) , para pNAD. Para este propósito, las concentraciones de la glucosa deshidrogenasa de 0.1 (cNAD) y 0.002 mg/ml (NAD) [0.83 y 0.017 µM) respectivamente] fueron utilizados. Las cantidades utilizadas y los resultados son mostrados en la tabla 2. Tabla 2 F) Espectros de absorción de cNAD y de cNADH Las figuras 10A, 10B y 10C muestran los espectros de absorción de NAD y de cNAD. NAD así como cNAD tienen una absorción máxima a 260 nm. La figura 10B muestra los espectros de absorción de NADH y cNADH en donde los espectros fueron registrados en cada caso después de un ensayo de la actividad de la glucosa deshidrogenasa. La absorción máxima de cNADH exhibe un cambio al color rojo de 20 nm. Los espectros de absorción adicionales para NADH y cNADH son mostrados en la figura 10C en la cual diferentes condiciones para el ensayo de la actividad de la glucosa deshidrogenasa asociada fueron seleccionadas como se estableció en las leyendas . La figura 11 muestra adicionalmente los espectros de fluorescencia de NADH y cNADH como los complejos de GlucDH. Los espectros fueron registrados a una longitud de onda de excitación de 370 nm después de un ensayo de la actividad de la glucosa deshidrogenasa. NADH así como cNADH exhiben un incremento de la señal de fluorescencia cuando se tratan con GlucDH. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

Reivindicaciones Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Elemento de prueba para determinar un analito, caracterizado porque comprende: (i) una enzima dependiente de una coenzima o un substrato para tal enzima y (ii) un compuesto de la siguiente fórmula general (I) como la coenzima : (l) en la cual : A = adenina o un análogo de la misma; T = en cada caso independientemente denota O, S, U = en cada caso denota independientemente OH, SH, BH3~,
BCNH2~, V = en cada caso denota independientemente OH o un grupo fosfato, W = COOR, CON(R)2, COR, CSN(R)2 en la cual R en cada caso denota independientemente H o alquilo de C?-C2, Xi, X2 = en cada caso denotan independientemente 0, CH2, CHCH3, C(CH3)2, NH, NCH3 , Y = NH, S, 0, CH2, Z = un residuo que comprende un grupo cíclico con 5 átomos de C que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de 0, S y N y opcionalmente uno o más substituyentes, y un residuo CR42 en donde CR42 está unido al grupo cíclico y a X2, en donde R4 = en cada caso independientemente denota H, F, Cl, CH3, siempre que Z y el residuo de piridina no estén enlazados por un enlace glicosídico, o una sal u opcionalmente una forma reducida del mismo. 2. El elemento de prueba de conformidad con la reivindicación 1 para determinar la glucosa, caracterizado porque comprende una glucosa deshidrogenasa y un compuesto de conformidad con la fórmula general (I) o una sal del mismo como una coenzima. 3. El elemento de prueba de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque los substituyentes sobre Z son seleccionados del grupo que comprende F, Cl y alquilo de C?-C2 que está opcionalmente fluorado o clorado y/o O-alquilo de C?-C2, substituido con OH. 4. El elemento de prueba de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque comprende un compuesto de la siguiente fórmula (I') como la coenzima:
(O en la cual : A = adenina o un análogo de la misma; T = en cada caso independientemente denota O, S, U = en cada caso denota independientemente OH, SH, BH3", BCNH2~, V = en cada caso denota independientemente OH o un grupo fosfato, W = COOR, CON(R)2, COR, CSN(R)2 en la cual en cada caso R denota independientemente H o alguilo de C?-C2, Xi, X2 = en cada caso denotan independientemente O, CH2, CHCH3, C(CH3)2, NH, NCH3 , Y = NH, S, O, CH2, Z = un anillo de cinco elementos, carbocíclico o heterocíclico, saturado o insaturado de la fórmula general (II)
(II) en la cual un enlace sencillo o un doble enlace pueden estar presentes entre R5 ' y R5", en la cual R4 = en cada caso denota independientemente H, F, Cl, CH3,
R5 = CR42, si un enlace sencillo está presente entre R5' y R5", entonces
R5' = O, S, NH, NC?-C2-alquilo, CR42, CHOH, CHOCH3 , R5" = CR42, CHOH, CHOCH3, si un doble enlace está presente entre R5' y R5", entonces R5 ' = R5" = CR4 , R6, R6' = en cada caso denotan independientemente CH, CCH3 o una sal u opcionalmente una forma reducida de la misma. 5. El elemento de prueba de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado, porque W = CONH2 o COCH3. 6. El elemento de prueba de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque está en la forma de una tira de prueba. 7. El elemento de prueba de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la enzima es una deshidrogenasa seleccionada de la glucosa deshidrogenasa (E.C.1.1.1.47), lactato deshidrogenasa (E. C.l.1.1.27.1.1.1.28 ) , malato deshidrogenasa (E.C.1.1.1.37) glicerol deshidrogenasa (E.C.1.1.1.6) , alcohol deshidrogenasa (E.C.1.1.1.1), alfa-hidroxibutirato deshidrogenasa, sorbitol deshidrogenasa o aminoácido deshidrogenasa por ejemplo L-aminoácido deshidrogenasa (E.C.1.4.1.5) . 8. El elemento de prueba de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 7 para detectar la glucosa, caracterizado porque la enzima es la glucosa deshidrogenasa. 9. El compuesto de la fórmula general (I"):
(I") caracterizado porque: A = adenina o un análogo de la misma; T = en cada caso independientemente denota O, S, U = en cada caso denota independientemente OH, SH, BH3", BCNH2-, V = en cada caso denota independientemente OH o un grupo fosfato, W = COOR, CON(R)2, COR, CSN(R)2 en la cual R en cada caso denota independientemente H o alquilo de C?-C2, Xi, X2 = en cada caso denotan independientemente 0, o NH,
Y = NH, S, 0, CH2, Z = un anillo de cinco elementos, carbocíclico o heterocíclico, saturado o insaturado de la fórmula general (II), (") en la cual un enlace sencillo o un doble enlace pueden estar presentes entre R5 ' y R5", R4 = en cada caso denota independientemente H, F, Cl, CH3,
R5 = CR42, si un enlace sencillo está presente entre R5 ' y R5", entonces
R5' = 0, S, NH, NC?-C2-alquil?, CR42, CHOH, CH0CH3 , R5" = CR42, CHOH, CH0CH3, si un doble enlace está presente entre R5' y R5", entonces R5 ' = R5" = CR4, R6, R6 ' = en cada caso denota independientemente CH, CCH3 siempre que si R5 = CH2, T = O, U = en cada caso denota OH, V = OH, W = CONH2. Xi, X2 = O e Y = 0 entonces R5' y R5"4 no son simultáneamente CHOH, o una sal u opcionalmente una forma reducida del mismo. 10. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque al menos un residuo U es diferente de OH.
11. Un compuesto de conformidad con las reivindicaciones 9 ó 10, caracterizado porque al menos un residuo U = BH3X
12. El compuesto de conformidad con una de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque W = CONH2 o COCH3.
13. El compuesto de conformidad con una de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizado porque un primer residuo V es un grupo OH, un segundo residuo V es un grupo de fosfato y en el cual el grupo OH y el grupo fosfato pueden formar opcionalmente un ciclo con los átomos de carbono a los cuales los mismos están unidos.
14. El compuesto de conformidad con una de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizado porque R5 ' = CR42 o CHOH.
15. El compuesto de conformidad con una de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizado porque R5 ' es O .
16. El compuesto de conformidad con una de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizado porque R5 ' = NH o NC?-C2-alquilo.
17. Un complejo de enzima-coenzima, caracterizado porque consiste de un compuesto de conformidad con una de las reivindicaciones 9 a 16 en combinación con una enzima adecuada .
18. El complejo de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la enzima es una deshidrogenasa seleccionada de la glucosa deshidrogenasa (E.C.1.1.1.47) , lactato deshidrogenasa (E. C.l.1.1.27.1.1.1.28) , malato deshidrogenasa (E.C.1.1.1.37) glicerol deshidrogenasa (E.C.1.1.1.6), alcohol deshidrogenasa (E.C.1.1.1.1) , alfa-hidroxibutirato deshidrogenasa, sorbitol deshidrogenasa o aminoácido deshidrogenasa por ejemplo L-aminoácido deshidrogenasa (E.C.1.4.1.5) .
19. El uso de un compuesto de conformidad con una de las reivindicaciones 9 a 16 o un complejo de conformidad con las reivindicaciones 17 ó 18 para detectar un analito en una muestra por una reacción enzimática.
20. Un kit reactivo, caracterizado porque contiene un compuesto de conformidad con una de las reivindicaciones 9 a 16 y opcionalmente una enzima o un complejo de enzima-coenzima adecuado, de conformidad con las reivindicaciones 17 ó 19 así como un amortiguador de la reacción adecuado.
21. Un kit reactivo de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la enzima es una deshidrogenasa seleccionada de la glucosa deshidrogenasa (E.C.1.1.1.47) , lactato deshidrogenasa (E. C.l.1.1.27.1.1.1.28 ) , malato deshidrogenasa (E.C .1.1.1.37) glicerol deshidrogenasa (E.C.1.1.1.6), alcohol deshidrogenasa (E.C.1.1.1.1), alfa-hidroxibutirato deshidrogenasa, sorbitol deshidrogenasa o aminoácido deshidrogenasa por ejemplo L-aminoácido deshidrogenasa (E.C.1.4.1.5) .
22. El uso del elemento de prueba de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 8 o del kit reactivo de conformidad con las reivindicaciones 20 ó 21 para determinar los analitos seleccionados de la glucosa, ácido láctico, ácido málico, glicerol, alcohol, colesterol, triglicéridos, ácido ascórbico, cisteína, glutationa, péptidos, urea, amonio, salicilato, piruvato, 5 ' -nucleotidasa, creatina cinasa (CK) , lactato deshidrogenasa (LDH) y dióxido de carbono .
23. Un método para detectar un analito, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) poner en contacto una muestra con un elemento de prueba de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 8 o un kit reactivo de conformidad con las reivindicaciones 20 ó 21, que comprende una coenzima y (b) detectar el analito.
24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el analito es detectado fotométricamente o fluorométricamente.