CN109836377B - 一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸类似物及其合成方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)类似物及其合成方法与应用。NAD+类似物的结构通式为
其中，以羧基为1位碳，类似物2位碳原子手性中心的立体构型为S，取代基R为C1‑C5的烷基或C1‑C5中的H被‑OH、‑COOH、‑CONH2、‑SCH3、
中的一种取代的烷基，取代位置为烷基的末端或次末端碳原子上；NAD+类似物是利用1‑(2’,4’‑二硝基苯基)‑3‑氨甲酰基吡啶和L‑α‑氨基酸为原料，在碱催化下合成的；NAD+类似物可以作为NAD(P)依赖型氧化还原酶的辅酶。本发明方法具有以下优点：合成NAD+类似物的反应条件温和，原料简单易得，反应产物完全保留原料L‑α‑氨基酸的立体结构，不发生消旋。本发明得到的NAD+类似物可用于生物催化、生物分析化学、代谢工程和合成生物学研究中。
Description
技术领域
本发明涉及一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)类似物及其合成与应用，属于烟酰胺类辅酶类似物的合成及应用领域。
背景技术
氧化还原酶需要氧化还原辅因子提供接受或提供电子以及氢质子，氧化还原辅因子主要包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(辅酶I，NAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(辅酶II，NADP)黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、黄素单核苷酸(FMN)等。而80％的氧化还原酶都需要NAD(H)作为辅因子，10％的氧化还原酶需要NADP(H)作为辅因子。烟酰胺类辅因子价格非常昂贵，限制了氧化还原酶在工业中的应用。为了降低工业成本，需要用廉价易得的NAD(P)的类似物替代天然辅因子(Chinese Journal of Bioprocess Engineering,2004,3,1-8)。所以利用烟酰胺辅因子类似物(mNADs)作为酶的辅因子的研究受到了广泛的关注(ACSCatalysis,2014,4,788-797)。
烟酰胺辅因子类似物的结构改变主要有两个方面：一是改变天然辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的腺嘌呤二核苷酸(AD)部分，将烟酰胺1位N的取代基改变为结构简单的基团，比如烷基或芳基，称为合成mNADs；二是保留二核苷酸结构改变吡啶环上3位氨甲酰基为其他酰基基团或改变腺嘌呤基团为其他基团，称为保守mNADs。结构简单的合成mNADs是通过卤代烷烃或卤代芳烃烃将烟酰胺或其类似物在1位N上进行烷基化，得到N取代烟酰胺或其类似物卤化盐(mNAD+s)，然后在碱性条件下用连二亚硫酸钠还原为mNADHs(Helvetica Chimica Acta,1937,20,418-423)。保守mNADs，可以利用NAD酶(NADase)催化3-酰基取代的吡啶类似物和天然辅因子(NAD(P))之间的反应，得到只有吡啶环上3位发生改变的保守mNADs(Analytical Biochemistry,1991,195,57-62)。也可以用化学合成焦磷酸酯的方法，利用PPh3/(PyS)2在N-甲基咪唑存在情况下活化烟酰胺单核苷酸(NMN)，使其可以与另外一分子腺嘌呤基团经过修饰或改变的单核苷酸快速反应生成焦磷酸酯形式的保守mNADs(Chinese Journal of Organic Chemistry,2014,34,54-64)。
结构简单的合成mNADs和结构保守的mNADs都已成功应用于氧化还原酶催化的酶促反应中。Knox研究了硫辛酰胺脱氢酶可利用1-甲基-1,4(2H)-烟酰胺为辅因子催化还原苯甲醌，首次证明简单烟酰胺辅因子类似物可以作为活性辅因子类似物，用于烟酰胺辅因子依赖型的氧化还原酶中(Biochemical Pharmacology,1995,49,1641-1647)。Ryan将细胞色素P450 BM-3氧化酶进行突变，并将两种合成烟酰胺类似物1-苯甲基-1,4(2H)-烟酰胺和1-(4’-甲氧基苄基)-1,4(2H)-烟酰胺作为突变体与野生型的辅因子催化。发现P450 BM-3在1064位的Trp突变为Ser的突变体和966位Arg突变为His的突变体利用利用辅因子类似物的催化效率与野生型利用天然NAD+的效率基本一致(ChemBioChem,2008,9,2579–2582)。Paul将一系列mNADHs替代烯酮还原酶ERs中天然辅因子NAD(P)H，发现辅因子类似物可以替代天然NAD(P)H，保持催化反应的催化效率和立体选择性(Organic Letters,2013,15,180-183)。Anderson将3位丁酰基、硫代氨甲酰基或其他基团取代的吡啶化合物与天然NAD+通过NAD酶作用得到的保守mNAD+s，并将所得产物作为单独的辅因子应用到马肝醇脱氢酶中，结果发现吡啶环上3位丁酰基取代的半合成mNAD+s作为马肝醇脱氢酶的辅因子时，酶催化氧化乙醇到乙醛的效率是利用天然NAD+时的8倍，而3位硫代氨甲酰基取代的类似物是其3.5倍(Journal of Biological Chemistry,1959,234,1219-1225)。本组将烟酰胺辅因子的腺嘌呤部分改变为氟胞嘧啶得到烟酰胺氟胞嘧啶二核苷酸(NFCD+)，并将其用于苹果酸酶(ME)和D-乳酸脱氢酶(DLDH)的突变体中，发现两种酶的突变体对NFCD+的亲和力及催化活性比对天然NAD+的更大，而野生型对NFCD+的亲和力远小于NAD+(Journal of the AmericanChemical Society,2011,133,20857-20862)。
已报道的NAD+类似物能够用作氧化还原酶的辅酶，但不能被酶特异性的识别，需要对酶进行突变后，才能特异性识别，提高酶反应速率。所以设计不同结构廉价易得的NAD+类似物，再对酶进行定向进化，使酶能有效识别NAD+类似物，降低生产成本。
发明内容
本发明的目的为提供一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)类似物及其合成方法和应用，使其能有效的被氧化还原酶识别，作为氧化还原酶的辅酶，催化氧化还原反应。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)类似物，
具有如下结构通式：
其中，以羧基为1位碳，类似物2位碳原子手性中心的立体构型为S，取代基R为C1-C5的烷基或C1-C5中的H被-OH、-COOH、-CONH2、-SCH3、
中的一种取代的烷基，取代位置为末端或次末端碳原子上。NAD+类似物包括但不仅限于以下化合物：
本发明中NAD+类似物的合成方法是利用1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐和L-α-氨基酸为原料，在碱催化下合成的。
其中，所述的L-α-氨基酸包括但不仅限于L-缬氨酸(Val)、L-亮氨酸(Leu)、L-异亮氨酸(Ile)、L-丝氨酸(Ser)、L-苏氨酸(Thr)、L-甲硫氨酸(Met)、L-天冬酰胺(Asn)、L-谷氨酰胺(Gln)、L-谷氨酸(Glu)、L-赖氨酸(Lys)、L-精氨酸(Arg)、L-组氨酸(His)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-酪氨酸(Tyr))和L-色氨酸(Trp)，结构式分别如下：
其中，所述的碱为乙酸钠、甲酸钠、三乙胺、三丙胺或三丁胺中的一种或两种以上；1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐、L-α-氨基酸和碱三者的摩尔当量比为1：1～1.1:1～2；合成NAD+类似物的温度为20～40℃；溶剂为甲醇、水或甲醇与水(体积比1:1)的混合物。
所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)类似物作为NAD(P)依赖型氧化还原酶的辅酶，用于催化氧化还原反应，构建辅酶再生循环，生产目的产物。
本发明所使用的苹果酸酶来自大肠杆菌K12(UniProt code P26616)。本发明所用到的突变脱氢酶是利用
单位点突变试剂盒在大肠杆菌K12苹果酸酶上引入氨基酸突变得到突变型苹果酸酶(L301R)。本发明所使用的苹果酸酶都是按文献(ProteinExpression and Purification,2007,53,97-103)方法表达纯化。
本发明所使用的D-乳酸脱氢酶来自Lactobacillus helveticus(Uniprot codeP30901)。本发明所用到的突变乳酸脱氢酶是利用
单位点突变试剂盒在乳酸脱氢酶上引入氨基酸突变得到突变型乳酸脱氢酶(V152R)。本发明所用的乳酸脱氢酶都是按文献(Protein Expression and Purification,2007,53,97-103)方法表达纯化的。
本发明所使用的亚磷酸脱氢酶来自Ralstonia sp.strain 4506(Uniprot codeG4XDR8)。本发明所使用的突变亚磷酸脱氢酶是利用
单位点突变试剂盒在亚磷酸脱氢酶上引入氨基酸突变得到突变型亚磷酸脱氢酶(I151R)。本发明所用的亚磷酸脱氢酶都是按文献(Protein Expression and Purification,2007,53,97-103)方法表达纯化。
本发明所使用的甲酸脱氢酶来自Pseudomonas sp.101(Uniprot code P33160)。本发明所使用的突变甲酸脱氢酶是利用
单位点突变试剂盒在甲酸脱氢酶上引入氨基酸突变得到突变型甲酸脱氢酶(L287R)。本发明所用的甲酸脱氢酶都是按文献(Protein Expression and Purification,2007,53,97-103)方法表达纯化。
本发明所使用的甲醛脱氢酶来自Pseudomonas putida(Uniprot code P46154)。本发明所使用的突变甲醛脱氢酶是利用
单位点突变试剂盒在甲醛脱氢酶上引入氨基酸突变得到突变型甲醛脱氢酶(E265R)。本发明所用甲醛脱氢酶都是按文献(Protein Expression and Purification,2007,53,97-103)方法表达纯化。
本发明所使用的甲醇脱氢酶来自Bacillus stearothermophilus(Uniprot codeP42327)。本发明所使用的突变甲醇脱氢酶是利用
单位点突变试剂盒在甲醇脱氢酶上引入氨基酸突变得到突变型甲醇脱氢酶(D136R)。本发明所用的甲醇脱氢酶都是按文献(Protein Expression and Purification,2007,53,97-103)方法表达纯化。
本发明所使用的1,3-丙二醇脱氢酶来自Klebsiella pneumoniae(Uniprot codeQ7WRJ3)。本发明所使用的突变1,3-丙二醇脱氢酶是利用
单位点突变试剂盒在1,3-丙二醇脱氢酶上引入氨基酸突变得到突变型1,3-丙二醇脱氢酶(M184R)。本发明所用的1,3-丙二醇脱氢酶都是按文献(Protein Expression and Purification,2007,53,97-103)方法表达纯化。
本发明所使用乙醇脱氢酶，来自Sacharomyces cereviae(CAS No.9031-72-5)，购买于Sigma Aldrich。
本发明中NAD+类似物的编号为Xyz-NAD，其中Xyz为氨基酸的三字母简写；本发明中NAD+类似物还原产物的编号为Xyz-NADH，其中Xyz为氨基酸的三字母简写。
与现有技术相比，本发明具有的优点：
本发明合成的NAD类似物，结构简单且稳定，合成路线简单且成本低，能够被多种依赖于烟酰胺辅因子氧化还原酶突变体识别，进一步对氧化还原酶进行突变，提高酶对类似物的活性，具有工业应用的潜在价值，有望降低生产成本。
具体实施方式
以下实施例有助于了解本专利，但不局限于本发明的内容。
2,4-二硝基氯苯工业上是以氯苯为原料经间歇式硝化中的两步法制备而得，可直接购买商品化试剂。
实施例1
1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐是按文献(The Journal ofOrganic Chemistry,2012,77,7319-7329)方法合成的，步骤如下：将烟酰胺(0.244g，2mmol)和2,4-二硝基氯苯(1.215g，6mmol)加到25mL圆底烧瓶中，加热到90℃，反应2h，待反应冷却至室温，加入甲醇溶解，加入乙醚重结晶，重复3次，真空干燥得到棕色泡沫状固体1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐。1H NMR(400MHz,D2O)δ9.60(s,1H),9.34(d,J＝2.4Hz,1H),9.28(d,J＝6.4Hz,1H),9.21(d,J＝8.4Hz,1H),8.88(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),8.43(dd,J＝8.4,6.4Hz,1H),8.20(d,J＝8.8Hz,1H).13C NMR(101MHz,D2O)δ164.97,149.80,147.51,147.31,145.64,142.74,138.33,134.16,131.13,130.75,128.59,122.76.
实施例2
向含有L-酪氨酸(Tyr，189.6mg，1.03mmol)的2mL水溶液中，滴加含有1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol)的2mL甲醇溶液，滴加完毕后，向反应中加入乙酸钠(82.0mg 1mmol)，反应液颜色由橙色变为紫色，20℃下搅拌24h后，TLC检测，原料1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐不再减少，未完全反应，过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，棕色泡沫状固体Tyr-NAD。1H NMR(400MHz,MeOD)δ9.29(s,1H),8.92(d,J＝6.0Hz,1H),8.83(d,J＝8.0Hz,1H),8.01(dd,J＝8.0,6.0Hz,1H),6.87(d,J＝8.4Hz,2H),6.56(d,J＝8.4Hz,2H),5.50(dd,J＝11.6,4.4Hz,1H),3.75(dd,J＝15.0,4.4Hz,1H),3.39(dd,J＝15.0,11.6Hz,1H).
实施例3
向含有L-酪氨酸(Tyr，189.6mg，1.03mmol)的2mL水溶液中，滴加含有1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol)的2mL水溶液，滴加完毕后，向反应中加入甲酸钠(136.0mg，2mmol)，反应液颜色由橙色变为紫色，30℃下搅拌24h后，TLC检测，原料1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐不再减少，未完全反应，过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，棕色泡沫状固体Tyr-NAD。1H NMR(400MHz,MeOD)δ9.29(s,1H),8.92(d,J＝6.0Hz,1H),8.83(d,J＝8.0Hz,1H),8.01(dd,J＝8.0,6.0Hz,1H),6.87(d,J＝8.4Hz,2H),6.56((d,J＝8.4Hz,2H),5.50(dd,J＝11.6,4.4Hz,1H),3.75(dd,J＝15.0,4.4Hz,1H),3.39(dd,J＝15.0,11.6Hz,1H).
实施例4
向含有L-酪氨酸(Tyr，189.6mg，1.03mmol)的2mL甲醇溶液中，滴加含有1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol)的2mL甲醇溶液，滴加完毕后，加入三乙胺1mmol，40℃下搅拌24h后，TLC检测，原料L-酪氨酸反应完全。过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，棕色泡沫状固体Tyr-NAD。1H NMR(400MHz,MeOD)δ9.29(s,1H),8.92(d,J＝6.0Hz,1H),8.83(d,J＝8.0Hz,1H),8.01(dd,J＝8.0,6.0Hz,1H),6.87(d,J＝8.4Hz,2H),6.56((d,J＝8.4Hz,2H),5.50(dd,J＝11.6,4.4Hz,1H),3.75(dd,J＝15.0,4.4Hz,1H),3.39(dd,J＝15.0,11.6Hz,1H).HRMS:calculated forC15H15N2O4 +287.1026,found 287.1022.比旋度是利用旋光度测定仪在波长589nm、温度20℃、浓度2.0mg/mL的水溶液中测得。比旋度-24.50。最大吸收波长λmax和摩尔吸光系数ε是利用紫外可见分光光度计扫描一定浓度(20g/mL)NAD+类似物在200-700nm范围内的吸收谱测得。最大吸收波长λmax为269nm；摩尔吸光系数ε为5.18mM-1·cm-1。旋光性NAD+类似物的阴极还原电位Epc是利用CHI600C电化学工作站，以Ag/AgCl为参比电极、Pt丝对电极为辅助电极、玻碳电极为工作电极，扫描速度100mV/s，扫描范围-0.4V～-1.4V，氮气保护下，旋光性NAD+类似物浓度为0.5mM，电解液为0.2M KCl水溶液中测得。阴极还原电位Epc(vs Ag/AgCl)为-1.245V。
实施例5
向含有L-亮氨酸(Leu，131.2mg，1mmol)的2mL甲醇溶液中，滴加含有1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol)的2mL甲醇溶液，滴加完毕后，加入三丙胺1mmol，分别在反应0h、4h、9h分三次加入，室温下搅拌24h后，TLC检测，原料1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐反应完全。过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，淡黄色粉沫状固体Leu-NAD(201mg,73.8％)。1HNMR(400MHz,MeOD)δ9.48(s,1H),9.19(d,J＝6.0Hz,1H),8.96(d,J＝8.0Hz,1H),8.18(dd,J＝8.0,6.4Hz,1H),5.35(dd,J＝10.0,5.6Hz,1H),2.37–2.19(m,2H),1.40-1.33(m,1H),1.00(d,J＝6.8Hz,3H),0.93(d,J＝6.4Hz,3H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ170.65,163.93,146.40,144.33,143.89,133.95,127.35,75.23,41.44,24.91,21.76,20.23.HRMS:calculated for C12H17N2O3 +237.1234,found 237.1239.比旋度+90.49；最大吸收波长λmax为267nm；摩尔吸光系数ε为5.18mM-1·cm-1；阴极还原电位Epc(vs Ag/AgCl)为-1.215V。比旋度、最大吸收波长、摩尔吸光系数以及阴极还原电位测定方法同实施例4。
实施例6
向含有L-甲硫氨酸(Met，164.1mg，1.1mmol)的2mL甲醇溶液中，滴加含有1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol)的2mL甲醇溶液，滴加完毕后，加入三丁胺1mmol，分别在反应0h、4h、9h分三次加入，室温下搅拌24h后，TLC检测，原料1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐反应完全。过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，棕色泡沫状固体Met-NAD(244mg,95.6％)。1H NMR(400MHz,MeOD)δ9.45(s,1H),9.16(d,J＝6.4Hz,1H),8.97(d,J＝8.0Hz,1H),8.18(dd,J＝8.0,6.4Hz,1H),5.47(dd,J＝9.6,4.8Hz,1H),2.85–2.71(m,1H),2.64–2.49(m,2H),2.43–2.33(m,1H),2.03(s,3H).13C NMR(101MHz,D2O)δ171.78,165.81,146.68,144.63,144.30,133.70,128.07,74.77,30.90,29.24,13.69.HRMS:calculated for C11H15N2O3S+255.0798,found 255.0800.比旋度+76.49；最大吸收波长λmax为267nm；摩尔吸光系数ε为5.12mM-1·cm-1；阴极还原电位Epc(vs Ag/AgCl)为-1.185V。比旋度、最大吸收波长、摩尔吸光系数以及阴极还原电位测定方法同实施例4。
实施例7
向含有L-谷氨酰胺(Gln，160.8mg，1.1mmol)的2mL甲醇溶液中，滴加含有1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol)的2mL甲醇溶液，滴加完毕后，加入三乙胺1mmol，分别在反应0h、4h、9h分三次加入，室温下搅拌48h后，TLC检测，原料1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐反应完全Gln-NAD(253mg,88.2％)。过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，棕色泡沫状固体。1H NMR(400MHz,MeOD)δ9.21(s,1H),8.89(d,J＝5.6Hz,1H),8.71(d,J＝8.0Hz,1H),7.98–7.89(m,1H),5.13(dd,J＝9.2,5.0Hz,1H),2.55(td,J＝12.7,6.6Hz,1H),2.29(td,J＝15.8,7.0Hz,1H),2.07(t,J＝6.8Hz,2H).13C NMR(101MHz,D2O)δ176.77,171.38,165.78,146.66,144.76,144.31,133.65,128.07,75.81,31.49,28.36.HRMS:calculated for C11H15N2O3S+ 255.0798,found255.0800.比旋度+79.49；最大吸收波长λmax为268nm；摩尔吸光系数ε为4.75mM-1·cm-1；阴极还原电位Epc(vs Ag/AgCl)为-1.185V。比旋度、最大吸收波长、摩尔吸光系数以及阴极还原电位测定方法同实施例4。
实施例8
向含有L-谷氨酸(Glu，161.8mg，1.1mmol)的2mL甲醇溶液中，滴加含有1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol)的2mL甲醇溶液，滴加完毕后，加入三乙胺1mmol，分别在反应0h、4h、9h分三次加入，室温下搅拌48h后，TLC检测，原料1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐反应完全。过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，棕色泡沫状固体Glu-NAD(154mg,53.5％)。1H NMR(400MHz,MeOD)δ9.25(s,1H),8.95(d,J＝6.0Hz,1H),8.78(d,J＝8.4Hz,1H),8.13–7.98(m,1H),5.17(dd,J＝9.2,6.0Hz,1H),2.62(dq,J＝13.4,7.4Hz,1H),2.41–2.14(m,3H).13C NMR(101MHz,D2O)δ177.52,171.61,165.84,146.63,144.71,144.24,133.66,128.06,75.85,31.58,28.28.HRMS:calculated for C11H14N3O4 +252.0979,found 252.0976.比旋度+65.00；最大吸收波长λmax为267nm；摩尔吸光系数ε为5.17mM-1·cm-1；阴极还原电位Epc(vs Ag/AgCl)为-1.225V。比旋度、最大吸收波长、摩尔吸光系数以及阴极还原电位测定方法同实施例4。
实施例9
向含有L-赖氨酸(Lys，164.1mg，1.1mmol)的2mL甲醇溶液中，滴加含有1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol)的2mL甲醇溶液，滴加完毕后，加入三乙胺1mmol，分别在反应0h、4h、9h分三次加入，室温下搅拌24h后，TLC检测，原料1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐反应完全。过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，棕色泡沫状固体Lys-NAD(104mg,48.5％)。1H NMR(400MHz,D2O)δ9.27(s,2H),9.03(d,J＝6.0Hz,1H),8.98(d,J＝6.0Hz,1H),8.92(d,J＝8.0Hz,1H),8.87(d,J＝8.0Hz,1H),8.27–8.09(m,2H),5.28(dd,J＝9.2,5.6Hz,1H),4.65(t,J＝7.4Hz,2H),2.43-2.57(m,1H),2.41–2.23(m,1H),2.16–2.05(m,2H),1.47(dd,J＝10.0,5.2Hz,1H),1.28(dd,J＝10.4,6.2Hz,1H).13C NMR(101MHz,D2O)δ165.81,146.31,144.50,144.27,143.96,133.95,133.72,128.39,128.07,76.14,61.71,31.70,29.79,22.18.HRMS:calculated for C18H22N4O4 2+358.1630,found 179.0815.比旋度+51.00；最大吸收波长λmax为265nm；摩尔吸光系数ε为8.52mM-1·cm-1；阴极还原电位Epc(vs Ag/AgCl)为-1.095V。比旋度、最大吸收波长、摩尔吸光系数以及阴极还原电位测定方法同实施例4。
实施例10
向含有L-组氨酸(His，170.8mg，1.1mmol)的2mL甲醇溶液中，滴加含有1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol)的2mL甲醇溶液，滴加完毕后，加入三乙胺1mmol，分别在反应0h、4h、9h分三次加入，室温下搅拌24h后，TLC检测，原料1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐反应完全。过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，棕色泡沫状固体His-NAD(168mg,56.4％)。1H NMR(400MHz,D2O)δ9.10(s,1H),8.86(d,J＝6.2Hz,1H),8.82(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),8.07(dd,J＝8.0,6.2Hz,1H),7.53(d,J＝0.9Hz,1H),6.80(s,1H),5.58(dd,J＝10.6,4.7Hz,1H),3.69(dd,J＝15.6,4.7Hz,1H),3.53(dd,J＝15.6,10.6Hz,1H).13C NMR(101MHz,D2O)δ171.00,165.58,146.60,144.31,144.22,136.32,133.17,132.41,127.68,116.40,76.20,30.95.HRMS:calculated for C12H13N4O3 +261.0982,found 261.0984.比旋度+19.00；最大吸收波长λmax为267nm；摩尔吸光系数ε为4.50mM-1·cm-1；阴极还原电位Epc(vs Ag/AgCl)为-1.205V。比旋度、最大吸收波长、摩尔吸光系数以及阴极还原电位测定方法同实施例4。
实施例11
向含有L-苯丙氨酸(Phe，181.7mg，1.1mmol)的2mL甲醇溶液中，滴加含有1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol)的2mL甲醇溶液，滴加完毕后，加入三乙胺1mmol，分别在反应0h、4h、9h分三次加入，室温下搅拌24h后，TLC检测，原料1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐反应完全。过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，棕色泡沫状固体Phe-NAD(110.2mg,36.0％)。1H NMR(400MHz,MeOD)δ9.34(s,1H),8.98(d,J＝6.0Hz,1H),8.82(d,J＝8.0Hz,1H),8.00(dd,J＝8.0,6.4Hz,1H),7.29(d,J＝4.4Hz,1H),7.20–7.04(m,5H),5.60(dd,J＝11.6,4.4Hz,1H),3.88(dd,J＝14.8,4.4Hz,1H),3.50(dd,J＝15.2,11.6Hz,1H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ169.48,163.68,146.64,144.59,143.78,135.80,133.50,129.11,128.66,128.57,128.41,127.07,126.98,77.86,39.10.HRMS:calculated for C15H15N2O3+271.1077,found271.1074.比旋度-5.50；最大吸收波长λmax为268nm；摩尔吸光系数ε为4.86mM-1·cm-1；阴极还原电位Epc(vs Ag/AgCl)为-1.195V。比旋度、最大吸收波长、摩尔吸光系数以及阴极还原电位测定方法同实施例4。
实施例12
向含有L-缬氨酸(Val，128.8mg，1.1mmol)的2mL甲醇溶液中，滴加含有1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol)的2mL甲醇溶液，滴加完毕后，加入三乙胺1mmol，分别在反应0h、4h、9h分三次加入，室温下搅拌24h后，TLC检测，原料1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐反应完全。过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，得产物Val-NAD(255mg,98.5％)。1H NMR(400MHz,D2O)δ9.36(s,1H),9.14(d,J＝6.4Hz,1H),8.94(d,J＝8.0Hz,1H),8.22(dd,J＝8.0,6.4Hz,1H),4.90(d,J＝9.3Hz,1H),2.66(m,1H),1.12(d,J＝6.7Hz,3H),0.84(d,J＝6.7Hz,3H).13C NMR(101MHz,D2O)δ171.59,165.88,146.42,144.45,143.99,133.52,127.92,82.81,31.74,18.64,17.62.HRMS:calculated for C11H15N2O3 +223.1077,found223.1079.比旋度+121.99；最大吸收波长λmax为267nm；摩尔吸光系数ε为5.48mM-1·cm-1；阴极还原电位Epc(vsAg/AgCl)为-1.210V。比旋度、最大吸收波长、摩尔吸光系数以及阴极还原电位测定方法同实施例4。
实施例13
向含有L-异亮氨酸(Ile，144.3mg，1.1mmol)的2mL甲醇溶液中，滴加含有1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol)的2mL甲醇溶液，滴加完毕后，加入三乙胺1mmol，分别在反应0h、4h、9h分三次加入，室温下搅拌24h后，TLC检测，原料1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐反应完全。过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，得产物Ile-NAD(96mg,35.2％)。1H NMR(400MHz,D2O)δ9.37(s,1H),9.15(d,J＝6.0Hz,1H),8.93(d,J＝8.0Hz,1H),8.21(dd,J＝8.0,6.4Hz,1H),4.97(d,J＝9.2Hz,1H),2.48-240.(m,1H),1.28-1.17(m,2H),1.09(d,J＝6.7Hz,3H),0.83(t,J＝7.4Hz,3H).13C NMR(101MHz,D2O)δ171.56,165.79,146.46,144.41,144.03,133.49,127.93,81.74,37.66,24.49,14.91,9.94.HRMS:calculated for C12H17N2O3 +237.1234,found237.1235.比旋度+102.49；最大吸收波长λmax为268nm；摩尔吸光系数ε为5.14mM-1·cm-1；阴极还原电位Epc(vs Ag/AgCl)为-1.205V。比旋度、最大吸收波长、摩尔吸光系数以及阴极还原电位测定方法同实施例4。
实施例14
向含有L-丝氨酸(Ser，115.6mg，1.1mmol)的2mL甲醇溶液中，滴加含有1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol)的2mL甲醇溶液，滴加完毕后，加入三乙胺1mmol，分别在反应0h、4h、9h分三次加入，室温下搅拌24h后，TLC检测，原料1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐反应完全。过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，未得产物Ser-NAD，核磁共振分析沉淀，确定沉淀为产物Ser-NAD(148mg,60.2％)。1H NMR(400MHz,D2O)δ9.37(s,1H),9.11(d,J＝6.4Hz,1H),8.96(d,J＝8.0Hz,1H),8.23(dd,J＝8.0,6.4Hz,1H),5.52(dd,J＝7.2,3.6Hz,1H),4.43(dd,J＝13.0,7.2Hz,1H),4.34(dd,J＝13.0,3.6Hz,1H).13C NMR(101MHz,D2O)δ169.51,165.93,147.05,144.65,144.55,133.44,127.80,77.27,61.74.HRMS:calculated for C9H11N2O4 +211.0713,found211.0714.比旋度+101.49；最大吸收波长λmax为268nm；摩尔吸光系数ε为5.13mM-1·cm-1；阴极还原电位Epc(vs Ag/AgCl)为-1.205V。比旋度、最大吸收波长、摩尔吸光系数以及阴极还原电位测定方法同实施例4。
实施例15
向含有L-苏氨酸(Thr，131.0mg，1.1mmol)的2mL甲醇溶液中，滴加含有1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol)的2mL甲醇溶液，滴加完毕后，加入三乙胺1mmol，分别在反应0h、4h、9h分三次加入，室温下搅拌24h后，TLC检测，原料1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐反应完全。过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，得产物Thr-NAD(177mg,68.1％)。1H NMR(400MHz,D2O)δ9.38(s,1H),9.13(d,J＝6.4Hz,1H),8.97(d,J＝8.0Hz,1H),8.22(dd,J＝8.0,6.4Hz,1H),5.27(d,J＝4.6Hz,1H),4.84(dd,J＝6.4,4.6Hz,1H),1.16(d,J＝6.4Hz,3H).13C NMR(101MHz,D2O)δ169.85,165.88,147.60,145.10,144.56,133.13,127.54,80.62,67.20,18.94.HRMS:calculated for C10H13N2O4 +225.0870,found225.0876.比旋度+133.99；最大吸收波长λmax为268nm；摩尔吸光系数ε为5.70mM-1·cm-1；阴极还原电位Epc(vs Ag/AgCl)为-1.205V。比旋度、最大吸收波长、摩尔吸光系数以及阴极还原电位测定方法同实施例4。
实施例16
向含有L-天冬酰胺(Asn，145.3mg，1.1mmol)的2mL甲醇溶液中，滴加含有1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol)的2mL甲醇溶液，滴加完毕后，加入三乙胺1mmol，分别在反应0h、4h、9h分三次加入，室温下搅拌24h后，TLC检测，原料1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐反应完全。过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，得产物Asn-NAD(54mg,19.7％)。1H NMR(400MHz,D2O)δ9.38(s,1H),9.10(d,J＝6.4Hz,1H),94(d,J＝8.0Hz,1H),8.22(dd,J＝8.0,6.4Hz,1H),5.75(dd,J＝10.4,4.0Hz,1H),3.54(dd,J＝17.0,4.0Hz,1H),3.37(dd,J＝17.0,10.4Hz,1H).13CNMR(101MHz,D2O)δ173.17,170.67,165.80,146.92,144.68,144.57,133.58,127.93,72.36,37.62.HRMS:calculated for C10H12N3O4 +238.0822,found238.0826.比旋度+84.99；最大吸收波长λmax为268nm；摩尔吸光系数ε为4.82mM-1·cm-1；阴极还原电位Epc(vs Ag/AgCl)为-1.175V。比旋度、最大吸收波长、摩尔吸光系数以及阴极还原电位测定方法同实施例4。
实施例17
向含有L-色氨酸(Trp，224.6mg，1.1mmol)的2mL甲醇溶液中，滴加含有1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol)的2mL甲醇溶液，滴加完毕后，加入三乙胺1mmol，分别在反应0h、4h、9h分三次加入，室温下搅拌24h后，TLC检测，原料1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐反应完全。过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，得产物Trp-NAD(165mg,47.8％)。1H NMR(400MHz,D2O)δ8.66(s,1H),8.45(d,J＝6.4Hz,1H),8.28(d,J＝8.0Hz,1H),7.57(dd,J＝8.0,6.24Hz,1H),7.25(d,J＝8.0Hz,2H),7.19(d,J＝8.0Hz,2H),7.04(t,J＝7.8Hz,2H),6.92(t,J＝7.8Hz,2H),6.86(s,1H),5.44(dd,J＝10.0,4.6Hz,1H),3.71(dd,J＝15.5,4.6Hz,1H),3.51(dd,J＝15.5,10.0Hz,1H).13C NMR(101MHz,D2O)δ171.20,164.92,146.11,143.79,143.35,135.82,132.14,126.98,126.11,124.52,122.16,119.53,117.52,111.87,107.65,76.51,29.13.HRMS:calculated for C17H16N3O3 +310.1186,found310.1192.比旋度-59.00；最大吸收波长λmax为269nm；摩尔吸光系数ε为8.02mM-1·cm-1；阴极还原电位Epc(vs Ag/AgCl)为-1.225V。比旋度、最大吸收波长、摩尔吸光系数以及阴极还原电位测定方法同实施例4。
实施例18
向含有L-精氨酸(Arg，191.6mg，1.1mmol)的2mL甲醇溶液中，滴加含有1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐(324.7mg，1mmol)的2mL甲醇溶液，滴加完毕后，加入三乙胺1mmol，分别在反应0h、4h、9h分三次加入，室温下搅拌24h后，TLC检测，原料1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐反应完全。过滤除去反应液中的不溶物，滤液减压浓缩除溶剂，硅胶柱层析纯化，得产物Arg-NAD(285mg,90.5％)。1H NMR(400MHz,D2O)δ9.34(s,1H),9.10(d,J＝5.6Hz,1H),8.96(d,J＝7.8Hz,1H),8.30–8.23(m,1H),5.50(dd,J＝8.8,5.0Hz,1H),3.60(dd,J＝14.0,4.8Hz,1H),3.30-3.15(m,1H),2.60-2.50(m,1H),2.41-2.27(m,1H),1.83–1.65(m,1H),1.48-1.35(m,1H).13C NMR(101MHz,D2O)δ165.69,165.56,156.64,146.58,145.06,144.30,133.81,128.39,74.65,40.16,29.29,24.74.HRMS:calculated for C12H19N5O3 2+281.1477,found140.5738.比旋度+41.50；最大吸收波长λmax为268nm；摩尔吸光系数ε为3.79mM-1·cm-1；阴极还原电位Epc(vs Ag/AgCl)为-1.175V。比旋度、最大吸收波长、摩尔吸光系数以及阴极还原电位测定方法同实施例4。
实施例19
类似物稳定性实验。在50mM pH8、9、10、11的碳酸氢钠缓冲液(氘水)中，加入NAD或NAD类似物，至各化合物终浓度为10mM，在37℃下保温1.0h。核磁共振分析，测定NAD或NAD类似物降解情况。此外，按文献(Enzyme and Microbial Technology,2014,58–59,75-79)方法，测定NAD及NAD类似物在E.coli BW25113全细胞溶液以及细胞裂解液上清中37℃下保温1.0h，HPLC测定NAD或NAD类似物降解情况。结果如表1所示可见，不论在不同pH缓冲液中还是在全细胞溶液或细胞裂解液上清中，NAD类似物都具有更好的稳定性。
表1.NAD及其类似物降解率
实施例20
分别称取15种旋光性NAD+类似物10.0mg溶于5mL水中，分别加入5倍摩尔当量的连二亚硫酸钠和5倍当量的碳酸钠，40℃反应30min后稀释100倍，紫外可见分光光度计200-700全波长扫描检测还原型旋光性NADH类似物的最大吸收波长λmax和摩尔吸光系数ε，结果如表2所示。
表2.旋光性NADH类似物的λmax和ε
实施例21
苹果酸酶活性测定：将野生型苹果酸酶和突变型苹果酸酶(L301R)配制成1mg/mL的溶液。配制0.19mL反应体系(50mM pH 7.5HEPES，5mM L-苹果酸，5mM MnCl2，2mM的NAD+或旋光性NAD+类似物)，酶活性分析时快速加入10L酶液，混匀后置于紫外分光光度计中，在25℃条件下连续检测340nm(NAD+为辅因子时)或357nm(旋光性NAD+类似物为辅因子时)吸光值。酶活力单位定义为25℃条件下每分钟生成1mol还原型NADH或还原型旋光性NADH所需的酶量。测得结果如表3所示。
表3.苹果酸酶活性
实施例22
乳酸脱氢酶活性测定：将野生型乳酸脱氢酶和突变型乳酸脱氢酶(V152R)配制成1mg/mL的溶液。配制0.19mL反应体系(50mM pH7.5HEPES，5mM D-乳酸钠，2mM的NAD+或旋光性NAD+类似物)，酶活性分析时快速加入10L酶液，混匀后置于紫外分光光度计中，在25℃条件下连续检测340nm(NAD+为辅因子时)或357nm(旋光性NAD+类似物为辅因子时)吸光值。酶活力单位定义为25℃条件下每分钟生成1mol还原型NADH或还原型旋光性NADH所需的酶量。测得结果如表4所示。
表4.乳酸脱氢酶活性
实施例23
亚磷酸脱氢酶活性测定：将野生型亚磷酸脱氢酶和突变型亚磷酸脱氢酶(I151R)配制成5mg/mL的溶液。配制0.19mL反应体系(50mM pH7.5HEPES，5mM亚磷酸钠，2mM的NAD+或旋光性NAD+类似物)，酶活性分析时快速加入10L酶液，混匀后置于紫外分光光度计中，在25℃条件下连续检测340nm(NAD+为辅因子时)或357nm(旋光性NAD+类似物为辅因子时)吸光值。酶活力单位定义为25℃条件下每分钟生成1mol还原型NADH或还原型旋光性NADH所需的酶量。测得结果如表5所示。
表5.亚磷酸脱氢酶活性
实施例24
甲酸脱氢酶活性测定：将野生型甲酸脱氢酶和突变型甲酸脱氢酶(L287R)配制成5mg/mL的溶液。配制0.19mL反应体系(50mM pH7.5HEPES，5mM甲酸钠，2mM的NAD+或旋光性NAD+类似物)，酶活性分析时快速加入10L酶液，混匀后置于紫外分光光度计中，在25℃条件下连续检测340nm(NAD+为辅因子时)或357nm(旋光性NAD+类似物为辅因子时)吸光值。酶活力单位定义为25℃条件下每分钟生成1mol还原型NADH或还原型旋光性NADH所需的酶量。测得结果如表6所示。
表6.甲酸脱氢酶活性
实施例25
甲醛脱氢酶活性测定：将野生型甲醛脱氢酶和突变型甲醛脱氢酶(E265R)配制成5mg/mL的溶液。配制0.19mL反应体系(50mM pH7.5HEPES，5mM甲醛，2mM的NAD+或旋光性NAD+类似物)，酶活性分析时快速加入10L酶液，混匀后置于紫外分光光度计中，在25℃条件下连续检测340nm(NAD+为辅因子时)或357nm(旋光性NAD+类似物为辅因子时)吸光值。酶活力单位定义为25℃条件下每分钟生成1mol还原型NADH或还原型旋光性NADH所需的酶量。测得结果如表7所示。
表7.甲醛脱氢酶活性
实施例26
甲醇脱氢酶活性测定：将野生型甲醇脱氢酶和突变型甲醇脱氢酶(D136R)配制成5mg/mL的溶液。配制0.19mL反应体系(50mM pH7.5HEPES，5mM甲醇，2mM的NAD+或旋光性NAD+类似物)，酶活性分析时快速加入10L酶液，混匀后置于紫外分光光度计中，在25℃条件下连续检测340nm(NAD+为辅因子时)或357nm(旋光性NAD+类似物为辅因子时)吸光值。酶活力单位定义为25℃条件下每分钟生成1mol还原型NADH或还原型旋光性NADH所需的酶量。测得结果如表8所示。
表8.甲醇脱氢酶活性
实施例27
1,3-丙二醇脱氢酶活性测定：将野生型1,3-丙二醇脱氢酶和突变型1,3-丙二醇脱氢酶(M184R)配制成5mg/mL的溶液。配制0.19mL反应体系(50mM pH 7.5HEPES，5mM1,3-丙二醇，2mM的NAD+或旋光性NAD+类似物)，酶活性分析时快速加入10L酶液，混匀后置于紫外分光光度计中，在25℃条件下连续检测340nm(NAD+为辅因子时)或357nm(旋光性NAD+类似物为辅因子时)吸光值。酶活力单位定义为25℃条件下每分钟生成1mol还原型NADH或还原型旋光性NADH所需的酶量。测得结果如表9所示。
表9. 1,3-丙二醇脱氢酶活性
实施例28
乙醇脱氢酶活性测定：将乙醇脱氢酶配制成1mg/mL的溶液。配制0.19mL反应体系(50mM pH8.8磷酸钠缓冲液，5mM乙醇，2mM的NAD+或旋光性NAD+类似物)，酶活性分析时快速加入10L酶液，混匀后置于紫外分光光度计中，在25℃条件下连续检测340nm(NAD+为辅因子时)或357nm(旋光性NAD+类似物为辅因子时)吸光值。酶活力单位定义为25℃条件下每分钟生成1mol还原型NADH或还原型旋光性NADH所需的酶量。测得结果如表10所示。
表10.乙醇脱氢酶活性
实施例29
突变型亚磷酸脱氢酶(I151R)作为再生酶，利用亚磷酸为辅底物，构建再生NADH或还原型NAD类似物的循环体系，突变型乳酸脱氢酶(V152R)作为产物酶，用于生成D-乳酸。10mL反应体系：50mM pH7.5HEPES，20mM丙酮酸，2mM NAD类似物，50mM亚磷酸，50U/mL突变型亚磷酸脱氢酶，20U/mL突变型乳酸脱氢酶，30℃下反应，离子色谱监测反应1h、6h、12h、24h、36h时反应中D-乳酸的生产情况。对照实验利用野生型亚磷酸脱氢酶、野生型乳酸脱氢酶和NAD。结果如表11所示。
表11.酶偶联反应D-乳酸的产率
本发明合成的NAD类似物，结构简单且稳定，合成路线简单且成本低，能够被多种依赖于烟酰胺辅因子氧化还原酶突变体识别，进一步对氧化还原酶进行突变，提高酶对类似物的活性，具有工业应用的潜在价值，有望降低生产成本。
Claims (6)
1.一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+类似物，其特征在于：NAD+类似物的结构通式如下：
其中，以羧基为1位碳，类似物2位碳原子手性中心的立体构型为S，取代基R为C1-C5的烷基或C1-C5中的H被-OH、-COOH、-CONH2、-SCH3、
中的一种取代的烷基，取代位置为烷基的末端或次末端碳原子上。
2.根据权利要求1所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+类似物，其特征在于：类似物选自以下化合物：
3.一种权利要求1所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+类似物的合成方法，其特征在于：NAD+类似物是以1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐和L-α-氨基酸为原料，碱催化下合成的；
所述合成NAD+类似物的原料L-α-氨基酸选自以下结构：
4.根据权利要求3所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+类似物的合成方法，其特征在于：所述的碱为乙酸钠、甲酸钠、三乙胺、三丙胺或三丁胺中的一种或两种以上；1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲酰基吡啶氯化盐、L-α-氨基酸和碱的摩尔当量比为1：1～1.1:1～2；温度条件为20～40℃；合成NAD+类似物的溶剂为甲醇、水或甲醇与水的混合物，所述甲醇与水的体积比为1:1。
5.一种权利要求1所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+类似物的应用，其特征在于：作为NAD(P)依赖型氧化还原酶的辅酶，用于催化氧化还原反应，构建辅酶再生循环，生产目的产物。
6.根据权利要求5所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+类似物的应用，其特征在于：所述的氧化还原酶为苹果酸酶、亚磷酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、甲醛脱氢酶、甲醇脱氢酶、1,3-丙二醇脱氢酶或乙醇脱氢酶中的一种或几种。
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