JP2001526547A

JP2001526547A - 改善されたｎａｄ−依存性を有すデヒドロゲナーゼ、その製造方法およびその用途

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Publication number: JP2001526547A
Application number: JP54640799A
Authority: JP
Inventors: フンメル・ヴェルナー; リーベル・ベルティーナ
Original assignee: フォルシュングスツェントルム・ユーリッヒ・ゲゼルシャフト・ミト・ベシュレンクテル・ハフツング
Priority date: 1998-03-19
Filing date: 1999-03-18
Publication date: 2001-12-18
Also published as: WO1999047684A3; US6413750B1; DE19812004A1; EP1002097A2; WO1999047684A2

Abstract

(57)【要約】有利なＮＡＤＨ−依存正デヒドロゲナーゼのＮＡＤＨ−特異性は関連アミノ酸配列の遺伝子工学的に変更して補酵素の結合領域で塩基性を低下させることによって改善することができる。ＮＡＤ⁺≧２０のｋ_cat／Ｋ_M値に相当する調剤目的に役立つＮＡＤＨ−依存性を有するデヒドロゲナーゼは微生物的に得ることができる。この目的のためには、遺伝子コードに遺伝子配列を持つ酵素についてコード化する微生物を使用する。この遺伝子配列は塩基性アミノ酸が少なくとも部分的に補酵素結合部で無帯電のアミノ酸で交換されているアミノ酸配列を持つ酵素についてコード化している。択一的にまたは追加的に塩基性または正に帯電したまたは無帯電のアミノ酸は負に帯電したアミノ酸に交換されてもよい。本発明の方法はＮ−末端に酵素結合場所を持つ短鎖のデヒドロゲナーゼを得るのに特に有利に使用される。実施例によればアルコールデヒドロゲナーゼは、オーバーエクスプレス法で突然変異した遺伝子を含有するE.coil HB 101+(pUBS 520)によって得られる。上記遺伝子はデヒドロゲナーゼについてコード化しておりそして発現プラスミンpKK-117-3HBでクーロン化される。

Description

【発明の詳細な説明】改善されたＮＡＤ−依存性を有すデヒドロゲナーゼ、その製造方法およびその用途本発明は、調剤目的に適するＮＡＤ⁺≧２０のｋ_cat／Ｋ_M値に相当するＮＡＤＨ−依存性を有する短鎖のデヒドロゲナーゼ、特にアルコール−デヒドロゲナーゼを生産するのに特に有利に使用することができる特に有利なＮＡＤＰＨ−依存性のデヒドロゲナーゼのＮＡＤＨ−特異性を改善する方法に関しそしてそうして得られるデヒドロゲナーゼおよびその用途にも関する。デヒドロゲナーゼおよび特にアルコール−デヒドロゲナーゼ（以下、ＡＤＨｎと略す）は、プロキラルなケトンを相応するキラルなアルコールに立体選択的に還元することによってキラルな生成物を生産する価値ある触媒である。本質的に相応する、酵母からの酵素（ＮＡＤ−依存性）、馬の肝臓からの酵素（ＮＡＤ− 依存性）およびテルモアネロビウム・ブロキ（Thermoanaerobium brockii）からの酵素（ＮＡＤＰ−依存性）は市販されており、特別な基質については例えばステロイド−デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ−およびＮＡＤＰ−依存性）も市販されている。部分的に正に制限された基質であるために、近年では、調剤用途に良好に適する別の新規なＡＤＨｎ、例えばRhodococcus erythropolisからの(S)-特異性酵素（ＮＡＤ−依存性）およびLactobacillus属からの(R)-特異性酵素が発見されている。これら両方の種類の酵素は非常に広範囲のケトン類を高いエナンチオ選択性をもって転化する。L.kefir（ドイツ特許第４０１４５７３号明細書）またはL.brevisの酵素は単独で（Ｒ）−アルコールをもたらすので特に興味が持たれる。これらの酵素を使用することでの欠点は勿論、補酵素ＮＡＤＰ⁺あるいはＮＡＤＰＨを必要とすることである。何故ならばこれらの補酵素はＮＡＤ⁺あるいはＮＡＤＨよりも著しく不安定でありそして高価（５〜１０倍）であるからである。それ故に本発明の目的はかゝるＡＤＨｎのＮＡＤ⁺依存性を改善するがデヒドロゲナーゼの相応する改善のためにも全く一般的に使用できる方法に関する。この目的のために開発された、冒頭に記載の種類の本発明の方法は本質的には、補酵素−結合領域の酵素の塩基性を遺伝子工学的手段によりアミノ酸配列を適切に変更することによって低下させることを特徴としている。補酵素−結合領域のデヒドロゲナーゼのアミノ酸残基のこの塩基性の低下は正に帯電したアミノ酸を無帯電のアミノ酸に交換することによって達成することができる。補酵素−結合領域のデヒドロゲナーゼのアミノ酸残基の塩基性を正に帯電したアミノ酸を無帯電のアミノ酸に交換することによって低下させることができる。無帯電であるかまたは正に帯電したアミノ酸を負に帯電したアミノ酸に択一的にまたは追加的に交換することによっても低減することができ、この場合には塩基性を下げるために、勿論、この変化の組合せも使用できる。本発明の別の特徴は特許請求の範囲および以下の説明から明らかである。この方法は、酵素的なレドックス反応において補酵素が協力するために補酵素結合場所での補酵素の受容れが重要であることおよびアミノ酸配列を相応して変更することにより補酵素のために酵素の“結合領域(Andockbereich)”の塩基性を低下させることによってＮＡＤ⁺の受容をＮＡＤＰ⁺に比較しての改善が達成できることから出発している。かゝる変更は遺伝子工学的に行なわれ試され、そして以下の説明から明らかに成る通り、明らかに捕捉可能な改善がこの様に達成される。実例としてLactobacillus brevis(DSM 20054)からのＡＤＨを使用する。その際に補酵素結合場所はＮ−境界に考えられ、Ｎ−末端領域の最初の５０個のアミノ酸の配列は以下の通り書かれている：四つの理想的な下部単位で構成されるこのＡＤＨの下部単位の全配列はB.Rieb el学位論文(デュッセルドルフ大学、１９９７)に開示されており、最終的には突然変異を起こす特有のＤＮＡ−配列が同様にそこに開示されている。このＮ−末端配列の場合には自体公知の遺伝子工学的方法によって塩基性に関係する特定のアミノ酸が交換されそしてＮＡＤ⁺の受容(Akzeptanz)の変化は二つの量、即ち、Ｋ_M−およびｋ_cat−値の測定によって測定される。Ｋ_M−値［ミハエル−メンテン定数(Michaelis-Menten-Konstante)］（モル／Ｌ）を酵素に対する補酵素のアフィニティー(Affinitaet)の目安として考えることができ、出来るだけ小さいＫ_M−値が有利である。ｋ_cat−値（生じた生成物１モル／酵素１モル×秒）は転化率の目安であり、出来るだけ大きい方が良い。両方の量を考慮した組合せ値はｋ_cat／Ｋ_Mの商である。この価は調剤の目的に役立つ酵素を得るためには≧２０であるべきである。以下の例１〜４において塩基性アミノ酸から中性アミノ酸への交換はＲ３８、Ｈ３９、Ｋ４５および／またはＫ４８の所で行なった。突然変異体の特徴は、L. brevisからのＡＤＨの特異性がＮＡＤＰ⁺のＮＡＤ⁺まで変えることを事実上可能とすることを示している。限定された数だけしかアミノ酸交換を実施しないにもかかわらず、ＮＡＤ⁺−依存性を塩基性の低下によって所望の通りに改善することができるという結果が得られる。以下の例において追加的に実施したＡ９Ｇの交換（アラニンをグリシンに交換する、両方とも電荷を有していない）は、塩基性を変更させる理由で行なうのでなく、追加的な安定性の考察を考慮して行なう。本発明に従う交換によって塩基性の低下を達成するＮＡＤ⁺−特異性の変更が後記の実施例のこの“付随する交換”（Ａ９Ｇ）によって著しい影響を受けないことは明らかでありかつ証明し得る。 L.brevisからのＡＤＨのＮ−末端近辺の領域で徹底的にではなく行なわれるアミノ酸交換は別として、かゝる交換自体は残っているアミノ酸鎖（上述の学位論文による）においても実施することができそしてＮＡＤ⁺の特異性に関してプラスの結果が得られる。デヒドロゲナーゼを変化させるための本発明の方法は、勿論、塩基性アミノ酸を無帯電のまたは負に帯電したアミノ酸に意図的に交換できるためにあるいは無帯電のアミノ酸を負に帯電したアミノ酸に交換することができるために、改善すべき酵素の変更するアミノ酸配列の知見あるいは冒頭の規定が推定させる。その時に、ＮＡＤ−特異性の改善のために利用する交換あるいは交換領域は、補酵素結合位置の特別な知見なしに、試行錯誤の原理に従って明らかになる。その際に、遺伝子工学的な作業の重要な部分的段階のための現在市販される装備(Fertlg- Kits)がこれを余りにも多大な費用をかけずに実施できるようにする。塩基性アミノ酸としては特にリシンおよびアルギニンを交換することができ、しかもグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、セリン、チロシンまたはフェニルアラニンの様な無帯電のアミノ酸に交換することができる。負に帯電したアミノ酸の中では特にグルタミン酸およびアスパラギン酸が適する。突然変異した酵素の正の変化の実証は、補酵素ＮＡＤ⁺、ＮＡＤＰ⁺、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨについての速度論的パラメータをケトン−基質のための相応する速度論的パラメータあるいはアルコール（フェニルエタノール）についての酸化反応の際のそれについて測定することによって行なう。更にアセトフェノンの還元の例について、エナンチオ選択性が維持されたままであるかどうかをチェックする。その他には温度最適条件および−安定性、ｐＨ最適条件および−安定性および等電位点を測定しそして未突然変異の野生型酵素についての相応するデータと比較する。野生型酵素は次の性質を示す：Ａ）補酵素ＮＡＤＰ^-、ＮＡＤ⁺、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨについての速度論的データ表１：Lactobacillus brevisからのＡＤＨと反応した際の酸化されそして還元された補酵素についての速度論的データ表１は補酵素ＮＡＤＨがLactobacillus brevisからのＡＤＨの野生型と確認可能な領域で反応しないことを示している。非常に高いＮＡＤ⁺の濃度でのみ弱い活性で受容され、ＮＡＤ⁺についての野生型の選択性（k_cat/K_M）（＝７）がＮＡＤＰ⁺についての値（＝２７０）に比較して約２．５％である。Ｂ）温度最適条件および−安定性野生型ＡＤＨの温度最適条件は５５℃であり、色々な温度での２４時間の培養期間の後に３０℃では未だ１００％の反応性を示し、３７℃では未だ５０％の反応性を示す。Ｃ）ｐＨ最適条件および−安定性アセトフェノンをＮＡＤＰＨで還元するためのｐＨ最適条件は６．５である。最適範囲は非常に幅が狭く、既に６．０または７．０で未だ約６０％の選択率しか測定されない。フェニルエタノールをＮＡＤＰ⁺で酸化するためには最適なのは８．０であり、７〜９の広い最適範囲を有している。野生型酵素はｐＨ７．０〜８．５で貯蔵した際に最も高い安定性を示す。Ｄ）等電位点の測定野生型酵素の等電位点は４．９５である。Ｅ）補酵素の再生下でのバッチ中でのアセトフェノンの還元およびこの反応のエナンチオ選択性の測定野生型酵素を用いてＮＡＤＰＨでアセトフェノンを、補酵素の再生下で還元すると、ガスクロマトグラフィー処理でフェニルエタノールの（Ｒ）−異性体が専ら分離される。以下の実施例で突然変異体の製造および特徴を説明する。その際に遺伝子工学的方法でＮ−末端域のアミノ酸を交換する。実施例１：突然変異体１（Ａ９Ｇ、Ｒ３８Ｌ、Ｋ４５Ｉ）の製造および特徴この突然変異の目的は、野生型に比較して三種類のアミノ酸交換を行なう。即ち３８の位置のアルギニン（Ｒ）をロイシン（Ｌ）に交換し（Ｒ３８Ｌ）、４５の位置のリシン（Ｋ）をイソロイシン（Ｉ）に交換し（Ｋ４５Ｉ）そして９の位置のアラニン（Ａ）をグリシン（Ｇ）に交換する（Ａ９Ｇ）。突然変異体１は野生型に比較して次の通り説明することができる：Ａ９Ｇ，Ｒ３８Ｌ，Ｋ４５Ｉ。Ａ）突然変異誘発法：突然変異体を製造する際の重要な方法段階はＤＮＡを増やすためのＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）である。出発点は、所定のテンプレートによって第一段階で簡単に倍増するＤＮＡ−ポリメラーゼによるＤＮＡ−複製である。この簡単な段階を輪回（サイクル）することによっていずれも新たに製造されそしていずれも古いテンプレートがＤＮＡ−複製を再び進める。これによって指数級数的な規模での増加が実現される（２ⁿ）。ＰＣＲの個々のいずれのサイクルも３段階、即ち二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡの状態にさせる９４〜９６℃での変性段階（Denaturierungsschrft）、今度は一本鎖のＤＮＡにいわゆるプライマーを結合させることができる選択可能な温度でのアニーリング段階、およびポリメラーゼがプライマーに結合しそしてＤＮＡの一本鎖が再び二本鎖を完成する７２℃のポリメラーゼ段階（最適条件に通用する高温性ポリメラーゼ）で構成されている。この場合二本鎖ＤＮＡを目的としているので、プライマーをセンス(sense)−およびアンチセンス(antisense)鎖の両方の鎖のために添加しなければならない。このプライマーはセンス−およびアンチセンスプライマーに応じて挙げられる。アニーリング温度としてはあらゆる融合 −ＰＣＲ−段階で５２℃が使用され、突然変異体１および２を製造する際の別のＰＣＲ−段階では５２℃の温度がそして突然変異体１／１および２／２は５６℃ のそれが使用される。これらの三つの段階は任意に繰り返すことができ、単一のおよび同じ反応容器中で同じ３つの段階をこの順で常に増加する現存のおよび新たに造られるテンプレートで実施される。第二段階に記載のプライマーはポリメラーゼを正しく固着するために必要とされ、ＰＣＲの特異性も確定させる。所定のプライマー配列によって所望のＤＮＡ −セグメントが増幅される。しかしながらプライマーは、目的のＤＮＡ中の多かれ少なかれ補足的配列が存在する場合には目的のＤＮＡにだけ結合し得る。補足的結合性は一方では配列の均一性によっておよびもう一方では第二段階のアニーリング温度によって確定される。この場合アニーリング温度はプライマーの溶融温度に起因する。本発明の場合、ＰＣＲは個々の補助因子突然変異体を生成するために使用される。その際に目的のＤＮＡ−の所での点変異はかゝるプライマーの使用によって導入され、即ちプライマーがＤＮＡ−配列に対して正しい相同性を個々の塩基において示さない。しかしながらプライマーの相同性は点変異にもかかわらず未だ９４％であるので、ＰＣＲを実施することが可能である（平均３３の塩基のプライマーの塩基長さの場合には２つの塩基が交換される）。点変異は二本鎖ＤＮＡの二本の鎖の上で目的の配列に正しく変更するために導入しなければならない。このことは、遺伝子中に点変異を導入するために二つの個々のＰＣＲ−反応が必要であることを意味する。第一の反応では遺伝子の５つの末端（センス−プライマー）から突然変異（アンチセンス−プライマー）までＰＣＲを実施し、第二の反応では突然変異（センス−プライマー）から遺伝子の三つの末端（アンチセンス−プライマー）までＰＣＲを実施する。点変異相互の間隔がプライマーの末端長さ（４０〜６０個の塩基）を超えない沢山の点変異を導入すべき場合には、各点変異のために上述の２つのＰＣＲ反応を別々に実施しなければならない。かゝる点変異をＰＣＲによって導入する場合には、一般に完全な遺伝子は存在しておらず、個々の反応から生じる遺伝子部分セグメント、突然変異までの５つの末端および突然変異から３つの末端までセグメントが存在する。これらは上述の融合−ＰＣＲによって融合して完全な遺伝子としなければならない。融合−ＰＣＲ：このＰＣＲの原理は上述の通りであり、この場合には２つの異なるテンプレートしか添加せず、しかし突然変異域で１００％の相同性を有し、しかも前に使用した突然変異プライマーの長さ（一般に約３０〜４０個の塩基）を有している。この突然変異域はその相同性によってＰＣＲのプライマーとして機能し、即ち個々の鎖中でＤＮＡが変性した後にそれに続くアニリールング段階で両方の出発鎖が再び一緒に結合される。しかし両方の異なる鎖は相同性域において対になる。その時にポリメラーゼは突然変異域によってプライマーとして残りのＤＮＡを再び二本鎖に完結させることができる。この変法だけを可能とするためには、融合 −ＰＣＲの際に最初の５〜１０サイクルで遺伝子特異性プライマーを添加しない。５〜１０サイクルの後に十分に完成した遺伝子−ＤＮＡを利用する。従って、遺伝子の５’および３’プライマーの添加後にこれを次のサイクルで増幅するために使用する。予めに添加した遺伝子セグメントは、それぞれの遺伝子セグメントのために常に１種類のプライマー（センスプライマーだけかまたはアンチセンス−プライマーだけ）が使用されるので増幅することができない。最初のサイクルで完全になった遺伝子だけが両方のプライマーを用いて増幅することができる。この方法で得られる最初の突然変異体は野生型酵素に比較して三種類のアミノ酸交換部を有している。即ち、３８の位置のアルギニン（Ｒ）がロイシン（Ｌ）に交換され（Ｒ３８Ｌ）、４５の位置のリシン（Ｋ）がイソロイシン（Ｉ）に交換され（Ｋ４５Ｉ）および追加的に（本発明の特異性のない）９の位置のアラニンがグリシン（Ｇ）に交換されている（Ａ９Ｇ）。この目的のために以下に詳細に説明する：点変異セグメントを製造するためのテンプレートとして、制限エンドニユークリアーゼEco R1およびヒンド(Hind)-IIIによる制限分析によってＡＤＨ−遺伝子 (recＡＤＨ)を切り取る組替えプラスミド［recADHpkk-177-3H」を使用する。切り取られたセグメントは浄化後にアガロスゲル(Agarosegel)上でＰＣＲ中で使用する。突然変異体１のためのプライマーとして役立つ：Ｒ３８ＬＫ４６Ｉ：acc ggc ctg cac agc gat gtt ggt gaa ata gca gct(36bp)( 5'−プライマーセンス)およびＢＲＡＳ：gcgc aag ctt cta cta ttg agc agt gta gcc acc gtc aac tac aaa t tc aga(3'-プライマーアンチセンス)これは大きなセグメントＢを生じる；ＢＲＣ：gcgc gaa ttc atg tct aac cgt ttg gat ggt(5'-プライマーセンス)およびＲ３８ＬＫ４６Ｉrev：agc tgc tat ttc acc aac atc gct gtg cag gcc ggt(3'- プライマーアンチセンス)これは小さなセグメントを生じる。全てのプライマーは常に５’→３’−読む方向に記載され、プライマーＢＲＳおよびＢＲＡＳはrecＡＤＨ遺伝子の５’あるいは３’末端に相当する。各成分およびそれぞれに使用される．濃度を表２に掲載する。表２：ＰＣＲ混合物(ＮＴＰ＝各０．２ｍＭのｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ；緩衝溶液（原液）＝１００ｍＭのトリス／ＨＣｌｐＨ８．８；１５ｍＭのＭｇＣｌ₂；５００ｍＭのＫＣｌ；１％のTritonＸ−１００（ｖ／ｖ）；Ｔａｑ＝テルムス・アクアティカス(Thermus aquaticus)ポリメラーゼ)。略字の説明はＰＣＲ−混合物と一緒に全ての後記の表に適用される。個々の物質の容量次第で反応混合物に水を補充して１００μＬとする。以下の説明は全てのＰＣＲ混合物について有効である。ＰＣＲ−フラグメントを浄化しそして融合−ＰＣＲ（表３）において重なり在った部分によって結合して、包含された点変異のある完全遺伝子となる。第３表：ＰＣＲ−混合物（略字は表２参照）セグメントの量はセグメントの大きさに依存しており、融合−ＰＣＲのためには同じｐｍｏｌ量の遊離末端セグメントが存在していなければならず、即ち同じ濃度（ｎｇ）では小さいセグメントが大きいセグメントよりも沢山のｐｍｏｌの末端を有している。突然変異体１については１：４．４（小さいセグメント：大きいセグメント）の比であり、即ち小さいセグメントは大きいセグメントの４．４倍少なく使用しなければならない。第３の突然変異Ａ９Ｇの導入：Ａ９Ｇ：ggt aag gta gga atc att aca(５’プライマー)およびＢＲＡＳ：（３’プライマー）大きいフラグメントが生ずる。ＢＲＳ：(５’プライマー)およびＡ９Ｇrev：tgt aat gat tcc tac ctt acc（３’プライマー）、小さいセグメントが生じる（各成分および濃度は表４参照）。第４表：ＰＣＲ−混合物（略字は表２参照）ＰＣＲから生じる増幅したセグメントが再び融合−ＰＣＲによって結合される（表５）。第５表：ＰＣＲ−混合物セグメントは１：４．５（小さいセグメント：大きいセグメント）の比で使用する。このＰＣＲからの生成物は突然変異体１であり、浄化後にクローン化して発現ベクターpkk-177-3HとしそしてE.coil HB 101+(pUBS520)中でオーバーエクスプレスする。突然変異した遺伝子セグメントはもちろんpkk-177-3Hとして他のベクター中にも導入することができる。例えばpBTac(Boehringer社、マンハイム )、pKK-233（Stratagene社）またはpET(Novagen社)。同様にWirtsorganismusとして他のE.coil菌株もHB101+(pUBS520)として、公共の菌株寄託機関またはベクター譲渡会社から入手できるE.coil NM 522、E.coil RRI、E.coil DH5αまたはE .coil TOP 10^-と同様に使用することができる。Ｂ）酵素の製造：細胞増殖：個々の突然変異体を生産するための細胞物質を５Ｌの震盪フラスコ培養器によって常時生産し、突然変異したrec ADHプラスミドのための宿主として常にHB 10 1+菌株を使用する。即ち、培養のためにアンピシリン(Anpicillin)およびネオマイシン(Neomycin)による二倍の選択圧(Selektionsdruck)が必要とされる。次いで液状培地（１％のトリプトン、０．５％の酵母抽出物、１％のＮａＣ１；ｐＨ７．５）中で３７℃で０．５のＯＤ₅₅₀まで培養した後に酵素を１ｍＭのＩＰＴＧの添加によって誘導する。更に４時間増殖させた後に細胞を再生しそして遺伝子発現を細胞溶解後に活性の実証および蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検査する。場合によっては、培養によって得られた細胞を−２０℃で凍結保存してもよい。超音波による細胞溶解：酵素を開放するために標準溶解法を使用することができる。この場合、組替え微生物を脈動する超音波によって溶解する。トリス−緩衝液（０．１Ｍのトリス −ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１ｍＭのＭｇＣｌ₂）中に再懸濁させた細胞を、冷却するために２×２５秒のサイクルで３０秒の間隔を開けて２５％の強度の脈動する Sonifier(製造元:Branson社)で溶解処理に付す。溶解した細胞を遠心分離しそして上澄みをピペットで除く。この上澄みを以下、粗抽出物と称する。以下の特徴を示す様に、この突然変異酵素（突然変異体１）を酵素突然変異体２に比較して正に相対的に安定している。酵素突然変異体１の製造：精製した酵素を製造するために蛋白質精製の標準法を使用する。フェニルセファローセ(Phenylsepharose)６ＦＦ、Ｑ−セファローゼ(Sepharose)ＦＦおよびオクチルセファローゼ(Octylsepharose)ＦＦ(いずれもフライブルグのPharamacia 社の市販品)でのクロマトグラフィーによる３度の浄化段階を使用する。表６は浄化段階の活性および収率を総括掲載している。表６：突然変異体１の製造：Ｃ）速度論的パラメータの測定：速度論的データに関するＡＤＨ−突然変異体１の特徴を以下の表７に総括掲載した値で示す。表７：突然変異体１についての速度論的データ野生型と比較してこの突然変異体１の場合には補酵素ＮＡＤ⁺に対する反応性において著しい改善が既に現れている：即ち、Ｋ_M−値は２．９から１．８ｍＭに顕著に減少しており、同時に２１の活性（ｋ_cat）は約８０に増加した。両方の改善は、この突然変異体ＮＡＤ⁺が既に明らかにより良好に受け入れられることを示している。ＮＡＤ⁺に対する野生型の選択性（ｋ_cat／Ｋ_M）はＮＡＤＰ⁺に比較して約２．５％だけであるのに、突然変異体１の場合の値は約１０％に上昇している。Ｄ）温度最適条件および−安定性温度最適条件は還元反応では補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨにてｐＨ７．０で取り入れる。両方の場合に５５℃である。温度安定性は色々な温度での２５時間の培養の後に残留活性として測定する。この場合には３７℃で残留活性は未だ９５％であり、４２℃で未だ３４％である。Ｅ）ｐＨ最適条件および−安定性ｐＨ最適条件を決めるために以下の緩衝液を使用する：ｐＨ４．６＝酢酸ナトリウム；ｐＨ５．０および５．５＝酢酸ナトリウム；ｐＨ６．０および６．５＝ＫｐｉまたはＭＥＳ；ｐＨ７．０および７．５＝ＫｐｉまたはＴＥＡ；ｐＨ８．０および８．５＝トリス；ｐＨ９．０＝ビシン(Bicine)。全ての緩衝液は１００ｍＭの濃度で使用する。還元反応を測定するために１０ｍＭのアセトフェノンを添加しそして酸化反応のためには２５ｍＭのフェニルエタノールを添加する。ＮＡＤＰ／ＮＡＤの濃度はそれぞれ２ｍＭである。ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨの濃度はそれぞれ０．２５ｍＭである。測定するために、既に基質と正確な濃度で混合されている９７０μｍのそれぞれの緩衝液を所望の補酵素の２０μｍの原液と混合する。反応は１０μｍの酵素を用いて、活性次第で未希釈でまたは希釈して開始し、測定の際の活性は１〜３Ｕ／ｍｌである。還元反応のための突然変異体のｐＨ最適条件はＮＡＤＨを使用した場合もＮＡＤＰＨを用いる場合も５．０〜６．０のの比較的酸性の領域にある。これに比較して、ｐＨ７．５の場合には４％の活性しか測定されない。ＮＡＤおよびＮＡＤＰを用いる酸化反応では７．０のｐＨ値で最大の活性が得られる。ｐＨ安定性は色々なｐＨ値で２５時間の培養後に残留活性として表現され、その際にｐＨ最適条件を測定するためと同じ緩衝液を使用する。４５μｍのそれぞれの緩衝液を５μｍの酵素溶液と混合し、室温で培養する。３０分、６０分、６時間および２５時間後に試料を採取する。突然変異体１の場合にはｐＨ５．０で貯蔵した場合に最高の残留活性（１００％）が得られる。ｐＨ５．５では既に８０％の残留活性となりそしてｐＨ７．０では２５時間後に３４％の残留活性である。Ｆ）等電位点の測定等電位点は等電位焦点合わせ（ＩＥＦ）して測定した後にｐＨ４．２８である。これは突然変異体２に比較して（実施例４参照）正に注目すべき値である。突然変異体２の場合、ＩＰは４．６５であり、両方の突然変異体ともリシンが交換されている。即ち、突然変異体１の場合にはリシン−４５が（イソロイシンに）そして突然変異体２の場合にはリシン−４８が（メチオニンに）交換されている。Ｇ）補酵素再生下およびこの反応のエナンチオ選択性の測定下でのバッチ混合物中のアセトフェノンの還元イソプロパノールを用いての補酵素再生下でアセトフェノンを還元するためのバッチ混合物中でフェニルエタノールに完全に転化し、この目的のために９６０ μｍのトリエタノールアミン緩衝液（１１ｍＭのアセトフェノンでｐＨ７．０とした５０ｍＭ）；１０μｍの塩化マグネシウム（１００ｍＭの原液）；２５μｌのＮＡＤＰ⁺（１０ｍＭの原液）：９．４μｌのイソプロパノール；１Ｕのアルコール−デヒドロゲナーゼを使用する。完全に転化した後に試料中のエナンチオマー純度をガスクロマトグフィーによって測定すると、（Ｒ）−アルコールだけが得られ、（Ｓ）−フェニルエタノールは検出できないことが判る。実施例２：突然変異体１／１（Ａ９Ｇ、Ｒ３８Ｌ、Ｋ４５Ｍ）の製造および特徴この突然変異の目的は、突然変異体１に比較して４５の位置のリシンをイソロイシンの位置（突然変異体１）でメチニンに交換する。突然変異体１中の位置９および３８で行なう残りの交換はそのままであり、その結果突然変異体１／１は野生型に比較して次の通りに記載することができる：Ａ９Ｇ，Ｒ３８Ｌ，Ｋ４５Ｍ。Ａ）突然変異体１／１の製造突然変異体１／１を製造するために原則として実施例１に記載したのと同じ方法を使用する。突然変異体１／１は突然変異体１を更に拡張するものであるので、以下のPCRのためにテンプレートとして突然変異体1を使用する。Ｒ３８ＬＫ４５Ｍ：acc ggc ctg cac agc gat gtt gaa atg gca(5'-プライマー) およびＢＲＡＳ(3'-プライマー)大きなセグメントを生ずる；ＢＲＳ(5'-プライマー)およびＲ３８ＬＫ４５Ｍrev：tgc cat ttc acc aac atc gct gtg cag gcc ggt(3'-プライマー)小さいセグメントを生ずる。表８：ＰＣＲ混合物：セグメントを浄化しそして融合−ＰＣＲを使用する。第９表：ＰＣＲ−混合物セグメントをＰＣＲ中で１：４．４の比で使用する。生成物は、突然変異体１から突然変異Ａ９Ｇが取り入れられているので、突然変異体１／１である。突然変異体１と同様に導入される変異はこの場合も遺伝子の配列順序によって実証される。酵素突然変異体を得るために遺伝子を次いでE.coil HB 101+(pUBS 520)中でオーバーエクスプレスする。Ｂ）酵素の製造：培養および細胞溶解は実施例１に記載した方法と一致する。酵素突然変異体１／１の製造：変異した酵素の製造は実施例１に記載した方法と一致する。表１０に特徴的データを総括掲載する。表１０：突然変異体１／１の製造：Ｃ）酵素突然変異体１／１についての速度論的パラメータの測定：補酵素の速度論的データに関するＡＤＨ−突然変異体１／１の特徴を以下の表１１に総括掲載した値で示す。表１１：突然変異体１／１についての酸化／還元補酵素の速度論的データ速度論的データは補酵素ＮＡＤ⁺をこの突然変異体がＮＡＤＰ⁺と全く同じ様に良好に受け入れることを示している。ＮＡＤ⁺についてのＫ_M−値は著しく低下しており、野生型について２．９の位置で０．５ｍＭである。この突然変異体は補酵素ＮＡＤ⁺に対して既に良好な低いアフィニティーを示す。ｋ_cat−値も僅かに改善され、３３．３sec^-1である。両方の補酵素について選択性（ｋ_cat／Ｋ_M）を比較すると、ＮＡＤ⁺についてもＮＡＤＰ⁺と同じ６６ｍＭ^-1の値を示す。ＮＡＤ⁺がＮＡＤＰ⁺を基準として約２．５％だけ反応する野生型と比較するとＮＡＤ⁺がこの突然変異体のＮＡＤ⁺で１００％反応する。Ｄ）温度最適条件および−安定性酵素突然変異体１／１の温度最適条件はＮＡＤＰＨで測定して少なくとも６５ ℃であり、更に高い温度は測定技術的に条件次第で達成されない。温度最適化を補酵素ＮＡＤＨを用いて測定した場合には、最適な値は４０℃である。恐らくＮＡＤＨは比較的高い温度ではもはや酵素に結合せず、低下した活性が検出される。温度安定性の測定で、２５時間後に２５℃で１００％の残留活性が測定され、３０℃でも未だ５９％のそれが測定される。突然変異体１／１の温度安定性は野生型酵素に比較して著しく悪化している。Ｅ）ｐＨ最適条件および−安定性還元の方向でのｐＨ最適条件（アセトフェノンを用いて測定）はＮＡＤＰＨ並びにＮＡＤＨを用いて測定して約６．０である。酸化については７．０（ＮＡＤＰ⁺）あるいは７．５（ＮＡＤ⁺）が最適である。Ｆ）等電位点の測定突然変異体１／１の等電位点は４．８５である。Ｇ）補酵素再生下およびこの反応のエナンチオ選択性の測定下でのバッチ混合物中のアセトフェノンの還元実施例１に記載した条件でのアセトフェノンの還元ではフェニルエタノールの（Ｒ）−異性体しか得られない。実施例３：突然変異体２（Ａ９Ｇ、Ｒ３８Ｌ、Ｋ４８Ｍ）の製造および特徴この突然変異の目的は、突然変異体１に比較して４８の位置のリシンをメチオニンに交換する（Ｋ４５Ｉ−交換の位置）。突然変異体１中の位置９および３８で行なう残りの交換はそのままであり、その結果突然変異体２は野生型に比較して次の通りに記載することができる：Ａ９Ｇ，Ｒ３８Ｌ，Ｋ４５Ｍ。Ａ）突然変異誘発法突然変異体２を製造するために原則として実施例１に記載したのと同じ方法を使用する。突然変異体２は突然変異体１と無関係に製造されるので、野生型−ＡＤＨ（rec ＡＤＨ）の遺伝子を再びテンプレートとして使用する。Ｒ３８ＬＫ４８Ｍ：acc ggc ctg cac agc gat gtt ggt gaa aaa gca gct atg ag t gtc(5'-プライマー)およびＢＲＡＳ(3'-プライマー)大きなセグメントを生ずる；ＢＲＳ(5'-プライマー)およびＲ３８ＬＫ４８Ｍrev：agc act cat agc tgc ttt ttc acc aac atc gct gtg cag gcc ggt(3'-プライマー)小さなセグメントを生ずる。。表１２：ＰＣＲ−混合物：セグメントを浄化しそして融合−ＰＣＲを使用する。表１３：ＰＣＲ−混合物セグメントを１：４．４の比で使用する。この融合−ＰＣＲの生成物は突然変異Ａ９Ｇを未だ取り入れなければならないので、突然変異体２の中間生成物である。第三の突然変異Ａ９Ｇの導入：Ａ９Ｇ：ggt aag gta gga atc att aca(5'-プライマー)およびＢＲＡＣ(3'-プライマー)大きいセグメントを生ずる。ＢＲＳ：(5'-プライマー)およびＡ９Ｇrev：tgt aat gat tcc tac ctt acc(3' -プライマー)小さいセグメントを生ずる（表１８）。表１４：ＰＣＲ−混合物：セグメントを融合−ＰＣＲ中で１：１４．５の比で使用する（表１９）。第１５表：ＰＣＲ−混合物この融合−ＰＣＲの生成物は突然変異体２であり、これは発現ベクターpkk-17 7-3H中で他の全ての突然変異体と同様にクローン化する。酵素突然変異体を製造するために、遺伝子をE.coil HB 101+(pUBS520)中でオーバーエクスプレスする。Ｂ）酵素の製造：培養および細胞溶解：培養、細胞溶解および酵素精製は実施例１に記載した方法と一致する。表２０は精製の特徴的データを総括掲載する。表１６：酵素突然変異体２の製造：Ｃ）酵素突然変異体２についての速度論的パラメータの測定：補酵素の速度論的データに関するＡＤＨ−突然変異体２の特徴を以下の表２１に総括掲載した値で示す。表１７：突然変異体２についての酸化補酵素の速度論的データこの突然変異体の場合には野生型に比較して両方のパラメータがＮＡＤ⁺に関して有利に変化し、Ｋ_M−値は２．９から０．６２ｍＭに低下し、ｋ_cat値は２１から３３に改善される。従ってｋ_cat／Ｋ_Mは７．３〜５４に改善される。同時にこの突然変異体の場合には中でもＮＡＤＰ⁺に対するアフィニティー（Ｋ_M−値）が改善されているが、ｋ_cat−値が劇的に悪化するので、この突然変異体は補酵素としてのＮＡＤ⁺が有利に使用される。Ｄ）温度最適条件および−安定性温度最適条件は野生型酵素よりも明らかに低く、ＮＡＤＰで測定して５０℃であり、ＮＡＤ⁺では３３〜３７℃である。温度安定性は、２５時間後に２５℃で１００％の残留活性が存在し、３０℃でも未だ４０％のそれがある。Ｅ）ｐＨ最適条件および−安定性アセトフェノンの還元についてのｐＨ最適条件はＮＡＤＰＨを用いて測定して８．０であり、これに対してＮＡＤＨを用いて測定して６．５である。野生型酵素と比較すると、ＮＡＤＨを用いて測定した活性は狭い活性幅であり、ｐＨ７．０では４６％の残留活性しか測定されない。色々なｐＨ値で２５時間後の酵素突然変異体の安定性はｐＨ７．０で最高を示し、ｐＨ６．０ではｐＨ８．０と同じで未だ８４％の残留活性が測定される。Ｆ）等電位点の測定この突然変異体の等電位点はｐＨ４．６５である。Ｇ）補酵素再生下およびこの反応のエナンチオ選択性の測定下でのバッチ混合物中のアセトフェノンの還元実施例１に記載した条件でのアセトフェノンの還元ではフェニルエタノールの（Ｒ）−異性体しか得られない。実施例４：突然変異体２／２（Ａ９Ｇ、Ｒ３８Ｌ、Ｋ４８Ｍ）の製造および特徴この突然変異の目的は、中性アミノ酸に対して３９の位置の塩基性アミノ酸のヒスチジンをロイシンに交換することによって、突然変異体２に比較して追加的に別のアミノ酸交換部を導入している。突然変異体２／２は野生型に比較して次の通りに記載することができる：Ａ９Ｇ，Ｒ３８Ｌ，Ｈ３９Ｌ、Ｋ４８Ｍ。Ａ）突然変異誘発法突然変異体２／２を製造するために原則として実施例１に記載したのと同じ方法を使用する。突然変異体２／２は突然変異体２の二次突然変異体であり、これをＰＣＲのためのテンプレートとして使用する。Ｒ３８ＬＨ３９Ｌ：acc ggc ctg ctc agc gat gtt(5'-プライマー)およびＢＲＡＳ(3'-プライマー)大きなセグメントを生ずる；ＢＲＳ(5'-プライマー)およびＲ３８ＬＨ３９Ｌrev：aac atc gct gag cag gcc ggt(3'-プライマー)小さなセグメントを生ずる。。表１８：ＰＣＲ−混合物：セグメントを精製しそして1:4.4(小:大)の比で融合−ＰＣＲ中で使用する。表１９：ＰＣＲ−混合物この融合−ＰＣＲの生成物は完全突然変異体２／２であり、突然変異Ｋ４８ＭおよびＡ９Ｇは突然変異体２から取り入れられる。酵素突然変異体を製造するために、次いで遺伝子をE.coil HB 101+(pUBS520)中でオーバーエクスプレスする。Ｂ）酵素の製造：培養、細胞溶解および酵素突然変異体２／２の精製：酵素の製造および突然変異酵素の精製は実施例１に記載した方法と一致する。表２４は酵素精製の特徴的データを総括掲載している。表２０：酵素突然変異体2/2の製造：Ｃ）酵素突然変異体２／２についての速度論的パラメータの測定：速度論的データに関するＡＤＨ−突然変異体２／２の特徴を以下の表２５に総括掲載した値で示す。表２１：ＮＡＤ⁺に関しては野生型酵素に比較してＫ_M−値が２．９から０．９６ｍＭに低下する。ＮＡＤＰ⁺に関してはＫ_M−値もｋ_cat値も僅かに悪化している。ＮＡＤＨに比較して突然変異体のアフィニティーが特に良好であり、Ｋ_M−値は０．０７ｍＭである。Ｄ）温度最適条件および−安定性突然変異体２／２の温度最適条件はｐＨ５．０で、ＮＡＤＰＨを使用して測定すると４２℃であり、ＮＡＤＨを使用した場合には５０℃である。この最適条件は比較的広く、ＮＡＤＰＨを使用して測定すると５０℃で未だ９５％の活性が得られ、ＮＡＤＨを使用し６０℃で測定すると未だ７０％の活性が得られる。色々な温度で貯蔵（６時間）した場合の安定性は３０℃で６７％であり、３７℃で７％しかである。Ｅ）ｐＨ最適条件および−安定性アセトフェノンの還元のについてのｐＨ最適条件はＮＡＤＰＨを用いて測定して６．０であり、ＮＡＤＨを用いて測定して５．０である。この突然変異体は正にＮＡＤＨでは本来は酸性域で活性であり、ｐＨ７．０では５．０での活性に比較して６％の活性しか得られない。酸化についても最適条件は僅かに酸性域に移動し、最大の活性はＮＡＤＰ⁺でもＮＡＤ⁺でもｐＨ７．５で見られる。野生型の最適条件のｐＨ８．０では未だ７７％（ＮＡＤＰ⁺）あるいは６１％（ＮＡＤ⁺）の活性が認められる。酵素を色々なｐＨで貯蔵しそして６時間後に残留活性を測定すると、１００％の残留活性はｐＨ７．０で認められ、ｐＨ８．５では５８％しか得られない。Ｆ）等電位点の測定この突然変異体２／２の等電位点はｐＨ４．４７である。Ｇ）補酵素再生下およびこの反応のエナンチオ選択性の測定下でのバッチ混合物中のアセトフェノンの還元実施例１に記載した条件でのアセトフェノンの還元ではフェニルエタノールの（Ｒ）−異性体しか得られない。実施例１〜４から、塩基性アミノ酸残基を無帯電のアミノ酸残基、例えばＲ３８Ｌ、Ｈ３９Ｌ、Ｋ４５Ｉ、Ｋ４５ＭあるいはＫ４８Ｍに色々な組合せで遺伝子工学的に交換することによって、Lactobacillus BrevisからのＮＡＤＰ−優位(b evorzugend)アルコール−デヒドラーゼのＡＤＨ−蛋白質の補酵素関連アミノ酸配列域での塩基性を下げることが酵素のＮＡＤ⁺−特異性の実務上適切な改善をもたらすことが判る。ＮＡＤ⁺−特異性の改善のために補酵素敏感−あるいは補酵素結合領域で塩基性アミノ酸残基を無帯電のアミノ酸残基に交換することは、勿論、公知のまたは調べられるアミノ酸配列および関連するＤＮＡ−配列の他のデヒドラーゲナーゼの場合と同様に可能であり、その際に補酵素感度の変動に―特別な領域が公知でない限り―成果が認められる。例えば広いＮＡＤＰ−優位のデヒドロゲナーゼの場合にはアミノ酸配列が公知でありそしてデーターバンクで調査することができ、その際に先ず第一に既に公知の補酵素−結合モーテイブ(Bindungsmotivs)の近似域で最も簡単に探すことができる。本発明の場合、蛋白質配列データーバンク(“Swiss-Prot”)からL.BrevisＡＤＨの配列を持つ類似性を示す酵素を探した。探究課題としてL.BrevisＡＤＨのアミノ酸−１７〜アミノ酸−５０の配列を提示し、次に探究プログラムを全ての蛋白質について調べ、配列の類似性を示す。このプログラム（参考文献：Altschul ，Stephen F.，Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaffer，Jinghui Zahend Zhang ，Webb MillerおよびDavid J．Lipman(1997)、"Gapped BLAST and PSI-PLAST:a new generation of protein database search programs"，Nucleic Acids Res． 25:3389-3402)は、配列範囲の類似性を説明するために、ギャップも埋めることができる。なお、これは勿論、削除および挿入によって擦れが生ずることを仮定して記載したものである。表２２は、この様に調査した、ＮＡＤＰ−依存性デヒドロゲナーゼについてのコンセンサスの配列に関する類似領域のアミノ酸配列を結果として示している。この場合、“sp-Q93761”はCaenorhabditis elegansからのオキシドレダクターゼ(Oxidoreduktase)を意味し、“sp-P50161”はAspergillus parasticusからのベルシコロリン-レダタターゼ(Versicolorin-Reductase)を意味し、“sp-067610 ”はAquifex aeolicusからのオキシドレダクターゼ(Oxidoreduktase)を意味し、 "sp-Q49721"はMycobacterium lepraeからのオキシドレダクターゼを意味する。表２２：Lactobacillus BrevisからのＡＤＨの推定された補酵素−結合位置に相当する、ＮＡＤＰ−依存性オキシドレダクターゼ中の配列範囲の比較 L.BrevisからのＡＤＨに類似する塩基性アミノ酸残基は、類似の空間的に同等の部分、特に例えばコンセンサス配列域から同様に離れるＬＢ−ＡＤＨの４５および３８の位置に認められる。無帯電残基への本発明に従う交換はこれらの公知の酵素の場合にも改善されたＮＡＤ⁺−受容性をもたらす。塩基性変更の詳述した原理の更なる説明においては、塩基性アミノ酸残基を無帯電アミノ酸残基に交換する場所で塩基性アミノ酸または無帯電アミノ酸から負に帯電したアミノ酸に交換することもＮＡＤ⁺−受容性についてプラスの効果が得られることを確かめる。所望の塩基性の低下は勿論、かゝる交換の混合形によっても達成できる。以下の実施例５は、補酵素過敏域で塩基性アミノ酸を中性アミノ酸に交換するのに加えて、負に帯電したアミノ酸残基を導入することによる利益を実証する。実施例５：突然変異体２／３（Ａ９Ｇ、Ｇ３７Ｄ、Ｒ３８Ｌ、Ｋ４８Ｍ）の製造および特徴この突然変異の目的は、突然変異体２に比較して、領域３７／３８の補酵素のための結合場所に酸性のアミノ酸を導入する。この目的のために、ＮＡＤＰ⁺に比べてＮＡＤ⁺について既に高い優位性を有しておりそして３７の位置でグリシンがアスパラギン酸に交換されている突然変異体２から出発する。突然変異体２Ｇ３７Ｄは野生型に比較して次の通りに記載することができる：Ａ９Ｇ，Ｇ３７Ｄ、Ｒ３８Ｌ，Ｋ４８Ｍ。Ａ）突然変異誘発法突然変異体２／３を製造するために原則として実施例１に記載したのと同じ方法を使用する。突然変異体２／３は突然変異体２の二次突然変異体であり、これをＰＣＲのためのテンプレートとして使用する。Ｒ３７Ｄ３８ＬＫ４８Ｍ：5'acc gac ctg cac agc gat gtt gtt gaa aaa gca gc t atg gtc 3'(5'-プライマー)およびＢＲＡＳ(3'-プライマー)大きなセグメントを生ずる；ＢＲＳ(5'-プライマー)およびＲ３７ＤＲ３８ＬＫ４８Ｍrev：5'gac act cat agc tgc ttt ttc acc aac atc g ct gtg cag gtc ggt 3'(3'-プライマー)小さなセグメントを生ずる。。表２３：ＰＣＲ−混合物（全混合物＝１００μｌ）セグメントを精製しそして1:4.4(小:大)の比で融合−ＰＣＲ中で使用する。表２４：ＰＣＲ−混合物この融合−ＰＣＲの生成物は完全突然変異体２／３であり、突然変異Ｒ３８Ｌ、Ｋ４８ＭおよびＡ９Ｇは突然変異体２から取り入れられる。酵素突然変異体を製造するために、次いで遺伝子をE.coil HB 101+(pUBS520)中でオーバーエクスプレスする。正確な突然変異発生を正のクーロンの配列によって実証する。Ｂ）ＮＡＤ⁺、ＮＡＤＰ⁺、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨを用いての酵素の製造および活性試験：培養、細胞溶解および酵素突然変異体２／３の精製：突然変異の発生によって変化した酵素を含有するE.coil-菌株の増殖を実施例１〜４に記載した様に実施する。細胞の溶解および細胞断セグメントの遠心分離の後に酵素含有上澄み（粗抽出物）を得る。アセトフェノンを還元するための標準酵素試験において、ＮＡＤＰＨを０．０３２Ｕ／ｍｇ（０．３１８Ｕ／ｍｌ；９．７５ｍｇ蛋白質／ｍｌ）およびＮＡＤＨを０．４７Ｕ／ｍｇ（４．６１Ｕ／ｍｌ；９．７５ｍｇ蛋白質ｍｌ）を用いて測定する。フェニルエタノールとの逆反応（アルコールオキシデーション）でＮＡＤ⁺を用いて１．１Ｕ／ｍｇ（１０．８Ｕ／ｍｌ；９．７５ｍｇ蛋白質／ｍｌ）の比活性が測定され、ＮＡＤＰ⁺ではこの酵素製剤は活性を示さない。遺伝子的情報を本発明に従って変更することによって、ＮＡＤ⁺を受容するがＮＡＤＰ⁺をもはや受容しない酵素が得られる。付記：アミノ酸５０までのＮ−末端領域にある野生型およびLactobacillus Brevisからの突然変異ＡＤＨのアミノ酸配列（野生型に対する交換部は下線で明らかにする）：Ａ）野生型酵素：Ｂ）突然変異体１：Ｃ）突然変異体１／１：Ｄ）突然変異体２：Ｅ）突然変異体２／２：Ｆ）突然変異体２／３：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/14 (Ｃ１２Ｎ 9/14 Ｃ１２Ｒ 1:24）Ｃ１２Ｒ 1:24） (Ｃ１２Ｎ 9/14 (Ｃ１２Ｎ 9/14 Ｃ１２Ｒ 1:225）Ｃ１２Ｒ 1:225）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ

Claims

【特許請求の範囲】１）特に有利なＮＡＤＰＨ−依存性デヒドロゲナーゼのＮＡＤＨ−特異性を改善する方法において、補酵素結合領域の酵素の塩基性を遺伝子工学的手段によってアミノ酸配列を適切に変更することによって低下させることを特徴とする、上記方法。２）補酵素結合領域のデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列の塩基性を正に帯電したアミノ酸を無帯電のアミノ酸に交換することによって低下させる請求項１に記載の方法。３）補酵素結合領域のデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列の塩基性を中性のアミノ酸または正に帯電したアミノ酸を負に帯電したアミノ酸に交換することだけでまたは追加的に交換することで低下させる請求項１または２に記載の方法。４）補酵素結合領域に公知のまたは調査できるアミノ酸配列を持つＮＡＤＰＨ優位のデヒドロゲナーゼ生産菌株から出発し、所望の塩基性変更のためにＰＣＲ−技術によって関連のＤＮＡ−配列を相応して変更しそしてこの方法によって変更された所望の遺伝子内部の遺伝情報を適当なベクターでクローン化し、次いでデヒドロゲナーゼ生産微生物中にオバーエクスプレスすることによって、ＮＡＤ⁺≧２０のｋ_cat／Ｋ_M値に相当する調剤目的に役立つＮＡＤＨ−依存性を有するデヒドロゲナーゼを遺伝子工学的方法で製造する請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。５）Ｎ−末端に補酵素結合場所を持つ短鎖のデヒドロゲナーゼを製造する請求項４に記載の方法。６）アルコール−デヒドロゲナーゼ、特に（Ｒ）特異性アルコール−デヒドロゲナーゼを製造する請求項５に記載の方法。７）所望のデヒドロゲナーゼについて符号化して突然変異された、発現プラスミド中で特にｐＫＫ−１１７−３ＨＢ中でクローン化された遺伝子をオーバーエクスプレスして含有するE.coil、特にE.coil 101+(pUBS 520)によってデヒドロゲナーゼを製造する請求項４に記載の方法。８）アルコール−デヒドロゲナーゼがLactobacillen、特にL.brevisまたはL.k efirから出発する請求項７に記載の方法。９） Lactobacillus-菌株、特にL.brevisまたはL.kefirから出発し、Ｎ−末端に補酵素結合場所を持つ短鎖のデヒドロゲナーゼのためにコード化された遺伝子で、補酵素結合場所での所望の塩基性低下に関して相応する遺伝子配列を変更することによって正に帯電したアミノ酸および／または無帯電アミノ酸を負に帯電したアミノ酸に交換することによっておよび／または正に帯電した残基を持つアミノ酸を無帯電の残基を持つアミノ酸に交換することによって得られる、ＮＡＤ⁺≧２０のｋ_cat／Ｋ_M値を有する調剤目的に役立つ（Ｒ）−特異性アルコール−デヒドロゲナーゼ。１０）L.brevisからのアルコールデヒドロゲナーゼの場合に、無変化ではと記載されるＮ−末端の配列領域で少なくとも１つのＧ３７Ｄ−、Ｒ３８Ｌ −、Ｈ３９Ｌ−、Ｋ４５Ｉ−、Ｋ４５Ｍ−および／またはＫ４８Ｍ−交換によって、特に次の一つによって交換された請求項９に記載のアルコール−ヒドロゲナーゼ。１１）相応するケト-化合物の酵素還元によって（Ｒ）−ヒドロキシ−化合物を立体選択的に製造する方法において、酵素として請求項１〜８のいずれか一つに記載に従って得られるデヒドロゲナーゼを使用することを特徴とする、上記方法。１２）Ｒ−ヒドロキシ化合物を酵素酸化することによってラセミ体からＳ−ヒドロキシ化合物を立体選択的に製造する方法において、酵素として請求項１〜８のいずれか一つに記載に従って得られるデヒドロゲナーゼを使用することを特徴とする、上記方法。