WO1999047684A2 - Dehydrogenasen mit verbesserter nad-abhängigkeit, deren herstellung und verwendung - Google Patents

Dehydrogenasen mit verbesserter nad-abhängigkeit, deren herstellung und verwendung Download PDF

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WO1999047684A2
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Werner Hummel
Bettina Riebel
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Forschungszentrum Jülich GmbH
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group

Definitions

  • the invention relates to a method for improving the NADH specificity of preferably NADPH-dependent dehydrogenases, which in particular for the production of dehydrogenase - especially short-chain dehydrogenases and preferably alcohol dehydrogenases - with NADH dependency suitable for preparative purposes in accordance with a kcat / KM -Value for NAD + > 20 is useful and then includes available dehydrogenases and their use.
  • Dehydrogenases and especially alcohol dehydrogenases are valuable catalysts for the production of chiral products by stereoselective reduction of prochiral ketones to the corresponding chiral alcohols.
  • Appropriate enzymes from yeast (depending on NAD), horse liver (depending on NAD) and Thermoanaerobium brockii (depending on NADP) are commercially available, and for special substrates also steroid dehydrogenases (depending on NAD and NADP).
  • the aim of the invention is therefore a method for improving the NAD + dependency of such ADHn, which can also be used quite generally for the corresponding improvement of dehydrogenases.
  • the method of the type mentioned at the outset, which was developed for this purpose is essentially characterized in that the basicity of the enzyme in the coenzyme docking area is reduced by appropriate modification of the amino acid sequence using genetic engineering means. This reduction in the basicity of the amino acid residues of the dehydrogenase in the coenzyme docking area can be achieved in particular by exchanging positively charged amino acid (s) for uncharged amino acid (s).
  • the basicity of the amino acids of the dehydrogenase in the coenzyme docking area can also be reduced by exchanging neutral or positively charged amino acid (s) for negatively charged amino acid (s), it being possible, of course, to provide combinations of these requirements to reduce the basicity.
  • the ADH from Lactobacillus brevis (DSM 20 054), in which a coenzyme binding site in the N-terminus is suspected and whose sequence of the first 50 amino acids in the N-terminal area is assumed to serve as an implementation example: SNRLDGKVA-I ⁇ o-ITGGTLGIGL 20 -AIATK- FVEEG 3 oAKVMITGRHS 40 -DVGEKAAKSV 5 o
  • the complete sequence of a subunit of this ADH which consists of four identical subunits, is published in the dissertation B. Riebel (1997, University of Düsseldorf), as is the associated DNA sequence, via which the mutation ultimately takes place.
  • the method according to the invention for modifying dehydrogenases naturally requires knowledge or preliminary determination of the amino acid sequence to be modified of the enzyme to be improved, in order for a targeted exchange of basic amino acids by uncharged or also negatively charged amino acids or an exchange of uncharged amino acids by negative to be able to make charged amino acids.
  • the exchange or exchange area useful for improving the NAD specificity then results - even without prior knowledge of the coenzyme binding site - according to the trial-and-error principle, the ready-made kits currently commercially available for the essential sub-steps of genetic engineering work to make this feasible without too much effort.
  • lysine and arginine can be exchanged as basic amino acids, preferably against uncharged ones such as, for example, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, serine, tyrosine or phenylalanine.
  • uncharged ones such as, for example, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, serine, tyrosine or phenylalanine.
  • glutamic acid and aspartic acid are particularly suitable.
  • the positive change in the mutated enzymes was demonstrated by determining the kinetic parameters for the coenzymes NAD + , NADP + , NADH and NADPH via the corresponding kinetic parameters for the ketone substrate (acetophenone) or in the oxidation reaction for the alcohol (phenylethanol ). Furthermore, using the example of the reduction of acetophenone, it was checked whether the enantioselectivity was retained. Otherwise, temperature optima and stability, pH optima and stability and the isoelectric point were determined and compared with the corresponding data for the non-mutated wild-type enzyme.
  • the wild-type enzyme shows the following properties:
  • Table 1 Kinetic data for the oxidized and reduced coenzymes when reacting with the ADH from Lactobacillus brevis.
  • the temperature optimum of the wild-type ADH is 55 ° C, after 24 hours of incubation at different temperatures it shows 100% residual activity at 30 ° C and 50% at 37 ° C.
  • the pH optimum for the reduction of acetophenone with NADPH is 6.5.
  • the optimal range is very narrow, even at pH 6.0 or 7.0 there is only about 60% residual activity.
  • the optimum for the oxidation of phenylethanol with NADP + is 8.0 with a wider optimum range of 7-9.
  • the wild-type enzyme shows the highest stability when stored at pH 7.0 to 8.5. D) Determination of the isoelectric point
  • the isoelectric point of the wild-type enzyme is 4.95.
  • mutant 1 (A9G, R38L, K45I):
  • arginine (R) in position 38 should be replaced by leucine (L) (R38L), lysine (K) in position 45 by isoleucine (I) (K45I) and alanine (A) at position 9 against glycine (G) (A9G).
  • Mutant 1 can therefore be described in comparison to the wild type as follows: A9G, R38L, K45I.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Each individual cycle of a PCR consists of 3 steps, a denaturation step at 94-96 ° C, where the double-stranded DNA is put into the single-stranded state, an annealing step at a selectable temperature, where so-called primers can bind to the now single-stranded DNA, and a polymerase step at 72 ° C (the common temperature optimum of thermophilic polymerases), where these polymerases bind to the primers and complete the single strand of the DNA again into a double strand. Since this is double-stranded DNA, primers for both strands, the sense and the antisense strand, must be added. These primers are called sense and antisense primers.
  • the annealing temperature used in all fusion PCR steps is 52 ° C, in the other PCR steps in the production of mutants 1 and 2 a temperature of 52 ° C and the mutants 1/1 and 2/2 a of 56 ° C .
  • the primers mentioned in step 2 are necessary for the correct preparation of the polymerase and also determine the specificity of the PCR.
  • the desired DNA sections are amplified by the predetermined primer sequence.
  • primers can only bind to the target DNA if they find a more or less complementary sequence in the target DNA.
  • the complementary binding capacity is determined on the one hand by the sequence homology and on the other hand by the annealing temperature of the second step, the annealing temperature resulting from the melting temperature of the primer.
  • the PCR was used to generate the individual cofactor mutants.
  • the point mutations on the target DNA were introduced by using such primers, ie the primers did not show the correct homology to the DNA sequence in individual bases. However, since the homology of the primers was still 94% despite point mutations, it was possible to carry out the PCR (with a base length of the primers of an average of 33 bases, 2 bases were exchanged).
  • the point mutations must be inserted on both strands of the double-stranded DNA for a correct change of the target sequence. This means that two single PCR reactions are required to introduce a point mutation in the gene. In one reaction a PCR is carried out from the 5 'end of the gene (sense primer) to the mutation (anti-sense primer), in the second reaction the mutation (sense primer) to the 3 end of the gene ( anti sense primer) performed a PCR.
  • This PCR corresponds to that described above, only in this case 2 different templates are added, but which have 100% homology in the mutation area, namely for the length of the mutation primer previously used (generally approx. 30-40 bases) .
  • This mutation region functions as a primer of PCR due to its homology, ie after denaturing the DNA into the single strands, the two starting strands can be found again in the subsequent annealing step, but the two different strands can also pair in the homology region.
  • the polymerase can then complete the remaining DNA from the mutation region as the primer to a double strand. In order to allow only this variant as a possibility, no gene-specific primers are added to the fusion PCR in the first 5-10 cycles.
  • the first mutant generated by this method contains three amino acid changes compared to the wild-type enzyme: arginine (R) in position 38 was replaced by leucine (L) (R38L), lysine (K) in position 45 by isoleucine (I) ( K45I) and (not specific to the invention) additionally alanine (A) in position 9 against glycine (G) (A9G).
  • R arginine
  • L leucine
  • K45I isoleucine
  • A9G alanine in position 9 against glycine
  • Recombinant plasmid [recADHpkk-177-3H] was used as the template for the production of the point mutation fragments, from which the ADH gene (recADH) was excised by restriction analysis using restriction endonucleases Eco Rl and Hind III. The cut-out fragment was used in the PCR after purification on an agarose gel. The following were used as primers for mutant 1:
  • R38LK46I acc ggc ctg cac agc gat gtt ggt gaa ata gca gct (36 bp) (5 ' primer sense) and
  • BRAS gcgc aag ctt cta cta ttg agc agt gta gcc acc gtc aac tac aaa ttc aga (3 ' primer antisense), which give the large fragment B; as well as BRS: gcgc gaa ttc atg tct aac cgt ttg gat ggt (5 'primer sense) and R38LK46Irev: agc tgc tat ttc acc aac atc gct gtg cag gcc ggt (3 ' primer antisense), which result in the small fragment A.
  • reaction mixture is supplemented with water to 100 ⁇ l, which applies to all PCR mixtures below.
  • PCR fragments were purified and combined by the overlapping part in the fusion PCR (Table 3) to the complete gene with the point mutations contained.
  • the amount of fragments depends on the size of the fragments; the same pmol amounts must be present at the free ends of the fragments for the fusion PCR, ie with the same concentration in ng, smaller fragments have a higher number of pmol ends than larger fragments.
  • the ratio is 1: 4.4 (small to large fragment), ie 4.4 times less of the small than the large must be used.
  • A9G ggt aag gta gga atc att aca (5 trimer) and BRAS: (3 'primer), which give the large fragment.
  • BRS (5 'primer) and A9Grev: tgt aat gat tcc tac ctt acc (3' primer), which give the small fragment (components and concentrations see table 4).
  • the amplified fragments resulting from the PCR are reassembled via fusion PCR (Table 5).
  • the fragments were used in a ratio of 1: 14.5 (small to large).
  • the product from this PCR represents mutant 1, after purification it was cloned into the expression vector pkk-177-3H and overexpressed in E.coli HB101 + (pUBS520).
  • the mutated gene piece can of course also be inserted into vectors other than pkk-177-3H, for example pBTac (from Boehringer Mannheim), pKK-233 (from Stratagene) or pET (from Novagen).
  • E. coli strains other than HB101 + ( ⁇ UBS520), such as E. coli NM 522, E. coli RRl, E. coli DH5 ⁇ or E. coli TOP 10 " from public strain collections or vector-distributing companies can also be used as the host organism are available.
  • Cell mass for the processing of the individual mutants was always produced by 5 L shake flask fermentation, and the HB101 + strain was always used as the host for the mutated recADH plasmids, ie double selection pressure by ampicillin and neomycin is required for the cultivation.
  • the enzyme was then induced by adding 1 mM LPTG.
  • the cells were harvested and the gene expression after cell disruption was checked by activity detection and SDS-PAGE of the proteins.
  • the cells obtained by fermentation can also be stored frozen at -20 ° C.
  • Standard digestion methods can be used to release the enzyme.
  • the recombinant organisms were disrupted by pulsed ultrasound.
  • the cells resuspended in Tris buffer (0.1 M Tris-HCl, pH 7.5; 1 mM MgCl 2 ) were subjected to digestion with 2 x 25 sec cycles with a 30 sec interval for cooling using the pulsed sonifier (from Branson) Subjected to 25% intensity.
  • the disrupted cells were centrifuged and the supernatant pipetted off, which is referred to below as the crude extract.
  • this mutant enzyme (mutant 1) is relatively stable, especially in comparison to enzyme mutant 2.
  • this mutant 1 Compared to the wild type, this mutant 1 has already shown a clear improvement in the reactivity to the coenzyme NAD + : The K M value has decreased significantly from 2.9 to 1.8 mM, while the activity (at) increased from 21 to almost 80. Taken together, both improvements show that this mutant already accepts NAD + much better. While the selectivity (kcat M) of the wild type for NAD + compared to NADP + is only approx. 2.5%, this value has increased to approx. 10% for mutant 1.
  • the optimum temperature was recorded for reduction reactions at pH 7.0 with the two coenzymes NADH and NADPH. In both cases it is 55 ° C.
  • the temperature stability was determined as residual activity after 25 h of incubation at various Temperatures determined. At 37 ° C 95% residual activity was obtained, at 42 ° C 34%.
  • the pH optimum of the mutant for the reduction reactions is in the relatively acidic range between 5.0 and 6.0 both when using NADH and with NADPH. In comparison, only 4% activity was measured at pH 7.5. For the oxidation reactions with NAD and NADP, maximum activity is obtained at a pH of 7.0.
  • the pH stability is expressed as residual activity after 25 hours of incubation at different pH values, using the same buffers as used to determine the optimum pH. 45 ⁇ l of the respective buffer were mixed with 5 ⁇ l of the enzyme solution and incubated at room temperature. Samples were taken after 30 min, 60 min, 6 h and 25 h.
  • the isoelectric point after determination with isoelectric focusing (LEF) is at pH 4.28. This is remarkable in comparison to mutant 2 (see example 4).
  • the LP is 4.65, although one lysine was exchanged in both mutants: in mutant 1 the lysine-45 (in isoleucine) and in mutant 2 the lysine-48 (in methionine).
  • mutant 1/1 (A9G, R38L, K45M):
  • mutant 1 The aim of this mutation was to replace the lysine at position 45 in methionine in place of isoleucine (mutant 1) compared to mutant 1.
  • the other exchanges in positions 9 and 38 made in mutant 1 have been retained, so that mutant 1/1 can be described in comparison to the wild type as follows: A9G, R38L, K45M.
  • mutant 1/1 is an extension of mutant 1, mutant 1 is therefore used as a template for the subsequent PCR.
  • R38LK45M acc ggc ctg cac agc gat gtt gaa atg gca (5 primers) and BRAS (3 primers), which give the large fragment.
  • the fragments were purified and used in the fusion PCR.
  • the fragments were used in the ratio 1: 4.4 in the PCR.
  • the product represents mutant 1/1, since mutation A9 mutation A9G was adopted.
  • mutant 1 As with mutant 1, the mutations introduced were confirmed by sequencing the gene. The gene was then overexpressed in E. coli HB101 + (pUBS520) to obtain the enzyme mutant.
  • Table 11 Kinetic data for the oxidized and reduced coenzymes for the enzyme mutant 1/1.
  • the temperature optimum for the enzyme mutant 1/1 measured with NADPH is at least 65 ° C, higher temperatures were not reached due to measurement technology. If the optimum temperature is determined with the coenzyme NADH, an optimal value is found at 40 ° C. Presumably, NADH is no longer bound to the enzyme so well at higher temperatures, so that only reduced activity is then detectable.
  • the measurement of the temperature stability shows that after 25 hours only 100% residual activity is detectable only at 25 ° C, and only 59% at 30 ° C. The temperature stability of mutant 1/1 has therefore deteriorated significantly compared to the wild-type enzyme.
  • the pH optimum for the direction of reduction is approximately 6.0 with both NADPH and NADH.
  • the optimum for oxidation is 7.0 (NADP + ) or 7.5 (NAD + ).
  • the isoelectric point of the enzyme mutant 1/1 is 4.85.
  • mutant 2 (A9G, R38L, K48M):
  • mutant 2 was replaced the lysine in position 48 with methionine compared to mutant 1 - instead of the K45I exchange.
  • the other exchanges in positions 9 and 38 made in mutant 1 have been retained, so that mutant 2 can be described in comparison to the wild type as follows: A9G, R38L, K48M.
  • mutant 2 was produced independently of mutant 1, the wild-type ADH (recADH) gene was used again as a template.
  • R38LK48M acc ggc ctg cac agc gat gtt ggt gaa aaa gca gct atg agt gtc (5 'primer) and
  • BRAS (3 'primers) that give the large fragment
  • R38LK48Mrev gac act cat agc tgc ttt ttc acc aac atc gct gtg cag gcc ggt (3 'primers), which give the small fragment.
  • the fragments were purified and used in the fusion PCR.
  • A9G ggt aag gta gga atc att aca (5 'primer) and BRAS: (3' primer), which is the big one
  • BRS (5 ' primer) and A9Grev: tgt aat gat tcc tac ctt acc (3' primer) which is the small one
  • the fragments were used in the ratio 1: 14.5 in the fusion PCR (Table 19).
  • mutant 2 The product of this fusion PCR is mutant 2, which, like all other mutants, was cloned into the expression vector pkk-177-3H. The gene was then overexpressed in E. coli HB101 + (pUBS520) to obtain the enzyme mutant.
  • Table 17 Kinetic data for the oxidized coenzymes for enzyme mutant 2.
  • the temperature optimum is significantly lower than that of the wild-type enzyme, measured with NADP at 50 ° C, with NAD + at 33-37 ° C.
  • the temperature stability shows that after 25 h only 100% residual activity is still present at 25 ° C, and only 40% at 30 ° C.
  • the optimum pH for the reduction of acetophenone was 8.0 with NADPH, but 6.5 with NADH. This optimum at 6.5 corresponds to the wild-type enzyme, measured with NADPH. Comparable to the wild-type enzyme, the activity measured with NADH also shows only a narrow activity range; at pH 7.0 there is only 46% residual activity. The stability of the mutant enzyme at various pH values after 25 h shows a maximum at pH 7.0, at pH 6.0 and 8.0, 84% residual activity was still measured.
  • the isoelectric point of the mutant enzyme is pH 4.65.
  • Mutant 2/2 can therefore be described in relation to the wild type as follows: A9G, R38L, H39L, K48M.
  • mutant 2/2 is a subsequent mutant of mutant 2, this was used as a template for the PCR.
  • BRAS (3 primers) that make up the large fragment
  • BRS (5 primers) and R38LH39Lrev: aac atc gct gag cag gcc ggt (3 primers), which give the small fragment.
  • the fragments were purified and used in the fusion PCR in a ratio of 1: 4.4 (small to large).
  • the K M value decreased from 2.9 to 0.96 mM compared to the wild-type enzyme.
  • K M - as well as at-value deteriorated slightly The particularly good affinity of the mutant for NADH is striking, the K value is 0.07 mM.
  • the optimum temperature of mutant 2/2, measured at pH 5.0, is 42 ° C, measured with NADPH and at 50oC when using NADH. These optima are relatively broad, measured with NADPH still gives 95% activity when measured at 50 ° C, measured with NADH at 60 ° C still 70%.
  • the stability during storage (6h) at different temperatures is 67% for 30 ° C and only 7% for 37 ° C.
  • the pH optimum for the reduction of actophenone with NADPH is 6.0, when using NADH it is 5.0. With NADH in particular, this mutant is actually only active in the acidic range; at pH 7.0, only 6% activity is obtained compared to the value at 5.0. The optimum for oxidation is also significantly slightly shifted to the acidic range; maximum activity can be found with both NADP + and NAD + at pH 7.5. At pH 8.0, the optimum of the wild type, only 77% (NADP + ) or 61% (NAD 4 ) activity can be found. If the enzyme is stored at different pH values and the residual activity measured after 6 h, 100% residual activity is still found at pH 7.0. At pH 8.5, only 58% is obtained.
  • the isoelectric point of the enzyme mutant 2/2 is 4.47.
  • Examples 1 to 4 show that the reduction in basicity in the coenzyme-relevant amino acid sequence region of the ADH protein of the NADP-preferred alcohol dehydrogenase from Lactobacillus brevis can be achieved by genetic engineering Replacement of basic by uncharged amino acid residues such as R38L, H39L, K45I, K45M or K48M in different combinations leads to a practice-relevant improvement in the NAD + specificity of the enzyme.
  • amino acid sequences are known and can be researched in databases, it being easiest to start by searching in the similarity range of an already known coenzyme binding motif.
  • a protein sequence database (“Swiss-Prot”) was used to search for enzymes which showed similarities to the sequence of the L. brevis ADH.
  • the search motif was the sequence from amino acid 17 to amino acid 50 of the L. brevis - Entered ADH, the search program then finds all proteins that have sequence similarities.
  • the program (reference: Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) can also insert gaps to clarify the similarity of sequence regions, assuming that deletions and insertions can naturally lead to such shifts.
  • Table 22 shows amino acid sequences in the similarity range based on consensus sequences for NADP-dependent dehydrogenases.
  • Sp-Q93761 means an oxidoreductase from Caenorhabditis elegans, "sp-P50161” a versicolorin reductase from Aspergillus parasiticus, "sp-O67610” an oxidoreductase from Aquifex aeolicus, “sp-P42317” an oxidoreductase from Bacillus subtilis and "sp-Q49721” an oxidoreductase from Mycobacterium leprae.
  • Table 22 Comparison of sequence regions in NADP-dependent oxidoreductases which correspond to the presumed coenzyme binding site of the ADH from Lactobacillus brevis (LB ADH).
  • Example 5 demonstrates the benefits of introducing a negatively charged amino acid residue in this way, in addition to replacing basic amino acids with neutral ones in the coenzyme-sensitive range.
  • mutant 2 was started, which already has a high preference for NAD + over NADP + and in position 37 the glycine was exchanged for aspartic acid.
  • the mutant 2G37D can thus be described in relation to the wild type as follows: A9G, G37D, R38L, K48M.
  • mutant 2/3 is a subsequent mutant of mutant 2, this was used as a template for the PCR.
  • G37DR38LK48M 5 acc gac ctg cac agc gat gtt gtt gaa aaa gca gct atg agt gtc3 '
  • BRAS (3 trimers) that make up the large fragment
  • BRS (5 ' primer) and G37DR38LK48M rev: 5' gac act cat agc tgc ttt ttc acc aac atc gct gtg cag gtc ggt 3 '(3' primer) which give the small fragment.
  • a mutant2 100 ng 100 pmol 100 pmol 0.2 lO ⁇ l l ⁇ l
  • B mutant 2 100 ng 100 pmol BRS 100 pmol 0.2 10 ⁇ l 1 ⁇ l
  • the product of this fusion PCR is the complete mutant 2/3, the mutations R38L, K48M and A9G were taken from mutant 2.
  • the gene was then overexpressed in E. coli HB101 + (pUBS520) to obtain the enzyme mutant.
  • the correct mutagenesis was verified by sequencing the positive clone.
  • the propagation of the E. coli strain, which contains the enzyme modified by mutagenesis, is carried out as described in Examples 1 to 4.
  • the enzyme-containing supernatant (crude extract) is obtained.

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Abstract

Die NADH-Spezifität von bevorzugt NADPH-abhängigen Dehydrogenasen kann durch Basizitätsminderung im Coenzym-Andockbereich durch entsprechende gentechnologische Abwandlung der relevanten Aminosäure-Sequenz verbessert werden. So können Dehydrogenasen mit für präparative Zwecke tauglicher NADH-Abhängigkeit entsprechend einem kcat/KM- Wert für NAD+ ≥ 20 mikrobiell dadurch gewonnen werden, daß man einen für das Enzym kodierenden Mikroorganismus mit einer Gen-Sequenz im genetischen Kode verwendet, die für das Enzym mit einer Aminosäure-Sequenz kodiert, deren basische Aminosäure(n) an der Coenzym-Bindungsstelle bzw. den -stellen zumindest teilweise durch ungeladene Aminosäuren ersetzt ist bzw. sind. Alternativ oder zusätzlich können basische bzw. positiv geladene oder ungeladene Aminosäure(n) durch negativ geladene Aminosäure(n) ersetzt sein. Das Verfahren wird insbesondere für die Gewinnung von short-chain Dehydrogenasen mit Coenzym-Bindungsstellen am N-Terminus angewandt. Gemäß Beispiel wurde Alkohol-Dehydrogenase mit Hilfe von E.coli HB101+ (pUBS 520) gewonnen, der das für die Dehydrogenase kodierende mutierte Gen, kloniert im Expressionsplasmi pKK-117-3HB, überexprimiert enthält.

Description

Dehydrogenasen mit verbesserter NAD-Abhängigkeit, deren Herstellung und Verwendung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der NADH-Spezifität von bevorzugt NADPH-abhängigen Dehydrogenasen, das insbesondere zur Gewinnung von Dehydrogenase - speziell von short-chain Dehydrogenasen und vorzugsweise Alkohol- Dehydrogenasen - mit für präparative Zwecke tauglicher NADH- Abhängigkeit entsprechend einem kcat/KM-Wert für NAD+ > 20 brauchbar ist und sie umfaßt danach erhältliche Dehydrogenasen und deren Verwendung.
Dehydrogenasen und insbesondere Alkohol-Dehydrogenasen (nachfolgend durch ADHn abgekürzt) sind wertvolle Katalysatoren zur Gewinnung chiraler Produkte durch stereoselektive Reduktion prochiraler Ketone zu den entsprechenden chiralen Alkoholen. Kommerziell verfügbar sind im wesentlichen entsprechende Enzyme aus Hefe (NAD-abhängig), Pferdeleber (NAD-abhängig) und Thermoanaerobium brockii (NADP-abhängig), für spezielle Substrate auch noch beispielsweise Steroid-Dehydro- genasen (NAD- und NADP-abhängig). Wegen des teilweise recht begrenzten Substratspektrums sind in den letzten Jahren weitere neue ADHn gefunden worden, die gerade für den präparativen Einsatz gut geeignet sind, beispielsweise eine (S)-spezifische ADH aus Rhodococcus erythropolis (NAD-abhängig) oder (R)-spezifische Enzyme aus der Gattung Lactobacillus. Beide Enzymtypen setzen ein sehr breites Spektrum an Ketonen mit hoher Enantioselektivität um. Die Enzyme aus L. keflr (DE 40 14 573) oder L. brevis sind besonders interessant, da sie als einzige zu (R)- Alkoholen führen. Nachteilig für eine Anwendung dieser Enzyme ist allerdings, daß sie das Coenzym NADP+, bzw. NADPH benötigen, da dieses Coenzym beträchtlich instabiler und teurer (Faktor 5-10) als NAD+ bzw. NADH ist.
Ziel der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Verbesserung der NAD+- Abhängigkeit solcher ADHn, das aber auch ganz allgemein zur entsprechende Verbesserung von Dehydrogenasen anwendbar ist. Das zu diesem Zweck entwickelte erfindungsgemäße Verfahren der eingangs genannten Art ist im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß man die Basizität des Enzyms im Coenzym- Andockbereich durch angemessene Änderung der Amino säure- Sequenz mit Hilfe gentechnologischer Mittel vermindert. Diese Basizitätsminderung der Aminosäurereste der Dehydrogenase im Coenzym- Andockbereich kann insbesondere druch Austausch positiv geladener Aminosäure(n) gegen ungeladene Aminosäure(n) erreicht werden.
Alternativ oder zusätzlich kann die Basizität der Aminosäuren der Dehydrogenase im Coenzym- Andockbereich auch durch Austausch neutraler oder positiv geladener Aminosäure(n) gegen negativ geladene Aminosäure(n) vermindert werden, wobei zur Basizitätsminderung natürlich Kombinationen dueser Abwnadlungen vorgesehen werden können.
Weitere Besonderheiten der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen und der nachfolgenden Beschreibung.
Dieses Verfahren geht davon aus, daß für die Mitwirkung des Coenzyms bei der enzy- matischen Redoxreaktion eine Akzeptanz des Coenzyms an der Coenzym-Bindungsstelle bedeutsam ist und daß durch Minderung der Basizität im „Andockbereich" des Enzyms für das Coenzym durch entsprechende Änderung der Aminosäure-Sequenz eine Verbesserung der Akzeptanz von NAD+ im Vergleich zum NADP+ erreicht werden kann. Die Realisierung einer solchen Abwandlung wurde gentechnologisch vorgenommen und untersucht und auf diese Weise eine deutlich faßbare Verbesserung erzielt, wie aus der nachfolgenden Beschreibung ersichtlich werden wird.
Als Realisierungsbeispiel diente die ADH aus Lactobacillus brevis (DSM 20 054), bei der eine Coenzym-Bindungsstelle im N-Terminus vermutet wird und deren Sequenz der ersten 50 Aminosäuren im N-terminalen Bereich lautet: S-N-R-L-D-G-K-V-A-Iιo-I-T-G-G-T-L-G-I-G-L20-A-I-A-T-K- F-V-E-E-G3o-A-K-V-M-I-T-G-R-H-S40-D-V-G-E-K-A-A-K-S-V5o Die vollständige Sequenz einer Untereinheit dieser ADH, die aus vier identischen Untereinheiten besteht, ist in der Dissertation B. Riebel (1997, Universität Düsseldorf) veröffentlicht, ebenso dort die zugehörige DNA-Sequenz, über die letztendlich die Mutation erfolgt.
Bei dieser N-terminalen Sequenz wurden mit Hilfe an sich bekannter gentechnologischer Methoden bestimmte basizitätsrelevante Aminosäuren ausgetauscht und die Veränderung der Akzeptanz von NAD+ an Hand von zwei Größen ermittelt: durch Bestimmung des KM und des kat Wertes. Der KM-Wert (Michaelis-Menten-Konstante [Mol/L]) kann als Maß für die Affinität des Coenzyms zum Enzym betrachtet werden, vorteilhaft ist ein möglichst kleiner KM-Wert. Der kat-Wert (Mol gebildetes Produkt/Mol Enzym x sec) ist ein Maß für den Umsatz, er sollte möglichst hoch sein. Ein kombinierter Wert, der beide Größen berücksichtigt, ist der Quotient kcat/KM. Dieser sollte zum Erreichen eines für präparative Zwecke nützlichen Enzyms vorzugsweise >20 sein.
In den folgenden Beispielen 1-4 wurde ein Austausch basischer gegen neutrale Aminosäuren wurde an den Stellen R38, H39, K45 und/oder K48 vorgenommen. Die Charakterisierung der Mutanten zeigt, daß es tatsächlich möglich ist, die Spezifität der ADH aus L. brevis von NADP+ hin zum NAD+ zu verändern. Obwohl nur eine begrenzte Zahl von Aminosäure-Austauschen durchgeführt wurde, zeigen die Ergebnisse, daß die gewünschte Verbesserung der NAD+- Abhängigkeit durch Basizitätsminderung erreicht werden kann.
Ein in den nachfolgenden Beispielen zusätzlich durchgeführter Austausch von A9G (Alanin gegen Glycin; beide sind ungeladen) wurde nicht aus Gründen der Basizitäts- änderung vorgenommen, sondern in Anbetracht zusätzlicher Stabilitätsüberlegungen. Es ist klar und belegbar, daß die durch den erfindungsgemäßen Austausch zur Basizitätsminderung erzielte NAD+-Spezifitätsänderung durch diesen in den nachfolgenden Beispielen „begleitenden Austausch" (A9G) nicht merklich beeinflußt wird. Abgesehen von den im N-Terminus-nahen Bereich der ADH aus L. brevis vorgenommenen - nicht erschöpfenden - Aminosäure-Austauschen kann ein solcher Austausch selbstverständlich auch in der verbleibenden Aminosäure-Kette (gemäß Dissertation, s.o.) durchgeführt werden und auf positiven Erfolg bzgl. der Spezifität für NAD+ überprüft werden.
Ganz allgemein setzt das erfindungsgemäße Verfahren zur Abwandlung von Dehydrogenasen natürlich die Kenntnis bzw. einleitende Bestimmung der zu verändernden Aminosäure-Sequenz des zu verbessernden Enzyms voraus, um einen gezielten Austausch basischer Aminosäuren durch ungeladene oder auch durch negativ geladene Aminosäuren bzw. einen Austausch ungeladener gegen negativ geladene Aminosäuren vornehmen zu können. Der für die NAD-Spezifitätsverbesserung nützliche Austausch bzw. Austauschbereich ergibt sich dann - auch ohne Vorab-Kenntnis der Coenzym- Bindungsstelle - nach dem trial-and-error-Prinzip, wobei die derzeit kommerziell zur Verfügung stehenden Fertig-Kits für die wesentlichen Teilschritte der gentechnologischen Arbeiten diese ohne allzu großen Aufwand durchführbar machen. Als basische Aminosäuren können insbesondere Lysin und Arginin ausgetauscht werden, und zwar vorzugsweise gegen ungeladene wie beispielsweise Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Methionin, Serin, Tyrosin oder Phenylalanin. Von den negativ geladenen Aminosäuren kommen insbesondere Glutaminsäure und Asparaginsäure in Betracht.
Der Nachweis der positiven Veränderung der mutierten Enzyme erfolgte durch die Bestimmung der kinetischen Parameter für die Coenzyme NAD+, NADP+, NADH und NADPH über die entsprechenden kinetischen Parameter für das Keton-Substrat (Acetophenon) bzw. bei der Oxidationsreaktion für den Alkohol (Phenylethanol). Des weiteren wurde am Beispiel der Reduktion von Acetophenon geprüft, ob die Enantioselektivität erhalten geblieben ist. Im übrigen wurden Temperatur-optima und - Stabilität, pH-optima und -Stabilität und der isoelektrischen Punkt bestimmt und mit den entsprechenden Daten für das nichtmutierte Wildtyp-Enzym verglichen. Das Wildtyp-Enzym zeigt folgende Eigenschaften:
A) Kinetische Daten für die Coenzyme NADP+, NAD+, NADPH und NADH (Tab. 1):
Tabelle 1 : Kinetische Daten für die oxidierten und reduzierten Coenzyme bei Reaktion mit der ADH aus Lactobacillus brevis.
Parameter KM-Wert kcat-Wert kcat/ M [mM] [sec '*] [mM"1 -sec"1]
NADP+ 0,241 65 270
NAD+ 2,938 21 7
NADPH 0,218 536 2461
NADH nicht meßbar nicht meßbar -
Tabelle 1 zeigt, daß das Coenzym NADH vom Wildtyp der ADH aus L. brevis im Rahmen der Nachweismöglichkeit nicht umgesetzt wird. Lediglich sehr hohe Konzentrationen von NAD+ werden mit schwacher Aktivität akzeptiert, so daß die Selektivität (kcat/KM) des Wildtyps für NAD+ (=7) im Vergleich zum Wert für NADP+ (=270) bei ca. 2,5% liegt.
B) Temperaturoptimum und -Stabilität
Das Temperaturoptimum der Wildtyp- ADH liegt bei 55°C, nach 24-stündiger Inkubation bei verschiedenen Temperaturen zeigt es bei 30°C noch 100% Restaktivität, bei 37°C noch 50%.
C) pH-Optimum und -Stabilität
Das pH-Optimum für die Reduktion von Acetophenon mit NADPH liegt bei 6,5. Der optimale Bereich ist sehr schmal, bereits bei pH 6,0 oder 7,0 findet man nur noch ca. 60% Restaktivität. Für die Oxidation von Phenylethanol mit NADP+ liegt das Optimum bei 8,0 mit einem breiteren Optimumsbereich von 7-9. Das Wildtyp-Enzym zeigt höchste Stabilität bei Lagerung bei pH 7,0 bis 8,5. D) Bestimmung des isoelektrischen Punkts
Der isoelektrische Punkt des Wildtyp-Enzyms liegt bei 4,95.
E) Reduktion von Acetophenon im Batch unter Coenzym-Regenerierung und Bestimmung der Enantioselektivität dieser Umsetzung
Die Reduktion von Acetophenon mit NADPH mit dem Wildtyp-Enzym unter Coenzym-Regenerierung zeigt bei gaschromatographischer Trennung ausschließlich das (R)-Isomere von Phenylethanol.
In den folgenden Beispielen wird die Herstellung und Charakterisierung von Mutanten beschrieben, bei denen mit gentechnischen Methoden Aminosäuren im N-terminalen Bereich ausgetauscht wurden.
Beispiel 1:
Herstellung und Charakterisierung der M utante 1 (A9G, R38L, K45I):
Ziel dieser Mutation war es, im Vergleich zum Wildtyp drei Aminosäure- Austausche vorzunehmen: Arginin (R) in Position 38 soll gegen Leucin (L) ausgetauscht werden (R38L), Lysin (K) in Position 45 gegen Isoleucin (I) (K45I) und Alanin (A) in Position 9 gegen Glycin (G) (A9G). Mutante 1 kann also im Vergleich zum Wildtyp folgendermaßen beschrieben werden kann: A9G, R38L, K45I.
A) Methode der Mutagenese:
Ein wesentlicher methodischer Schritt bei der Herstellung der Mutanten stellt die PCR (Polymerase chain reaction) zur Vermehrung von DNA dar. Ausgangspunkt ist die DNA-Replikation durch DNA-Polymerasen, die anhand eines vorgegebenen Templats dieses in einem 1. Schritt einfach verdoppeln. Durch Zyklisierung dieses einfachen Schrittes wird jedes neu erzeugte und jedes alte Templat wieder Vorlage für die DNA- Replikation. Dadurch wird eine Vermehrung im exponentiellen Maßstab bewirkt ( ). Jeder einzelne Zyklus einer PCR besteht aus 3 Schritten, einem Denaturierungsschritt bei 94-96°C, wo die doppelsträngige DNA in den einzelsträngigen Zustand versetzt wird, einem Annealingschritt bei wählbarer Temperatur, wo sogenannte Primer an die jetzt einzelsträngige DNA binden können, und einem Polymeraseschritt bei 72°C (dem gängigen Temperaturoptimum thermophilen Polymerasen), wo diese Polymerasen an die Primer binden und den Einzelstrang der DNA wieder zu einem Doppelstrang vervollständigen. Da es sich hierbei um doppelsträngige DNA handelt, müssen Primer für beide Stränge, den sense und den antisense Strang, zugegeben werden. Diese Primer werden entsprechend sense und antisense Primer genannt. Als Annealingtemperatur wird bei allen Fusions-PCR-Schritten 52°C verwendet, bei den anderen PCR-Schritten bei der Herstellung der Mutanten 1 und 2 eine Temperatur von 52°C und den Mutanten 1/1 und 2/2 ein von 56°C.
Diese 3 Schritte sind beliebig oft wiederholbar, sodaß in ein und demselben Reaktionsgefäß die gleichen 3 Schritte in dieser Reihenfolge an der stetig wachsenden Zahl der vorliegenden und neu erzeugten Template durchgeführt werden.
Die im 2. Schritt erwähnten Primer sind notwendig für das richtige Ansetzen der Poly- merase und setzen auch die Spezifität der PCR fest. Durch die vorgegebene Primer- sequenz werden die gewünschten DNA- Abschnitte amplifiziert. Primer können jedoch nur an die Ziel-DNA binden, wenn sie eine mehr oder minder komplementäre Sequenz in der Ziel-DNA vorfinden. Die komplemetäre Bindungskapazität wird einerseits durch die Sequenzhomologie und andererseits durch die Annealingtemperatur des 2. Schritts festgelegt, wobei die Annealingtemperatur aus der Schmelztemperatur des Primers resultiert.
Die PCR wurde in dem vorliegenden Fall für die Generierung der einzelnen Cofaktor- mutanten eingesetzt. Dabei wurden die Punktmutationen an der Ziel-DNA durch die Verwendung solcher Primer eingeführt, d.h. die Primer zeigten in einzelnen Basen nicht die korrekte Homologie zur DNA-Sequenz. Da jedoch die Homologie der Primer trotz Punktmutationen noch 94% betrug, war eine Durchführung der PCR möglich (bei einer Basenlänge der Primer von durchschnittlich 33 Basen wurden 2 Basen ausgetauscht). Die Punktmutationen müssen für eine korrekte Änderung der Zielsequenz auf beiden Strängen der doppelsträngigen DNA eingefügt werden. Das bedeutet, das für die Einführung einer Punktmutation im Gen zwei einzelne PCR-Reaktionen benötigt werden. In einer Reaktion wird vom 5 'Ende des Gens (sense-Primer) bis zur Mutation (anti- sense-Primer) eine PCR durchgeführt, in der 2. Reaktion wird von der Mutation (sense- Primer) bis zum 3 Ende des Gens (anti sense-Primer) eine PCR durchgeführt.
Sollen mehrere Punktmutationen eingeführt werden, deren Abstände zueinander die endliche Länge eines Primers (40-60 Basen) überschreiten, muß für jede Punktmutation die oben angeführten 2 PCR-Reaktionen gesondert durchgeführt werden.
Sind nun solche Punktmutationen durch PCR eingeführt worden, liegt in der Regel kein komplettes Gen vor, sondern die aus den Einzelreaktionen hervorgegangenen Teilstücke des Gens, das 5 Ende bis zur Mutation und das Stück von der Mutation bis zum 3 Ende. Diese müssen durch eine sogenannte Fusions-PCR zu einem kompletten Gen fusioniert werden.
Fusions-PCR:
Das Prinzip dieser PCR entspricht der oben beschriebenen, nur werden in diesem Fall 2 verschiedene Template zugegeben, die aber in dem Mutationsbereich eine 100% Homologie aufweisen, und zwar für die Länge des vorher eingesetzten Mutationsprimer (in der Regel ca. 30-40 Basen). Dieser Mutationsbereich füngiert durch seine Homologie als ein Primer der PCR, d.h. nach Denaturierung der DNA in die Einzelstränge können sich im darauffolgenden Annealingschritt die beiden Ausgangsstränge wieder zusammen finden, aber auch die beiden verschiedenen Stränge in dem Homologiebereich paaren. Die Polymerase kann dann von dem Mutationsbereich als dem Primer die restliche DNA wieder zu einem Doppelstrang vervollständigen. Um nur diese Variante als Möglichkeit zuzulassen, werden bei der Fusions-PCR in den ersten 5- 10 Cyclen keine genspezifischen Primer zugegeben. Nach 5-10 Zyklen liegt genügend vervollständigte Gen-DNA zur Verfügung, so daß dann nach Zugabe der 5 und 3 'Primer des Gens dieses zur Amplifikation in den folgenden Zyklen gebracht wird. Die vorher zugegebenen Genstücke können nicht amplifiziert werden, da für jedes Genteilstück immer nur ein Primer zur Verfügung steht (entweder nur der sense oder nur der antisense). Nur das in den ersten Zyklen komplettierte Gen kann mit beiden Primern amplifiziert werden.
Die erste nach dieser Methode erzeugte Mutante enthält im Vergleich zum Wildtyp- Enzym drei Aminosäure- Austausche: Arginin (R) in Position 38 wurde gegen Leucin (L) ausgetauscht (R38L), Lysin (K) in Position 45 gegen Isoleucin (I) (K45I) und (nicht erfindungsspezifisch) zusätzlich Alanin (A) in Position 9 gegen Glycin (G) (A9G). Dazu wurde im einzelnen folgendermaßen vorgegangen:
Als Templat für die Herstellung der Punktmutationsfragmente diente rekombinantes Plasmid [recADHpkk-177-3H], aus dem durch Restriktionsanalyse über Restriktions- Endonucleasen Eco Rl und Hind III das ADH-Gen (recADH) ausgeschnitten wurde. Das ausgeschnittene Fragment wurde nach Reinigung über ein Agarosegel in die PCR eingesetzt. Als Primer für die Mutante 1 dienten:
R38LK46I: acc ggc ctg cac agc gat gtt ggt gaa ata gca gct (36 bp) (5 '-Primer sense) und
BRAS: gcgc aag ctt cta cta ttg agc agt gta gcc acc gtc aac tac aaa ttc aga (3 '-Primer antisense),die das große Fragment B ergeben; sowie BRS: gcgc gaa ttc atg tct aac cgt ttg gat ggt (5 '-Primer sense) und R38LK46Irev:agc tgc tat ttc acc aac atc gct gtg cag gcc ggt (3 '-Primer antisense), die das kleine Fragment A ergeben.
Alle Primer sind stets in 5 '-> 3 '-Leserichtung aufgeführt, die Primer BRS und BRAS entsprechen den 5 bzw. 3 'Enden des recADH Gens. Die Komponenten und die jeweils verwendeten Konzentrationen sind in Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2: PCR-Ansätze (NTP=je 0,2 mM von dTTP, dATP, dCTP und dGTP; Puffer (Stammlösung) - 100 mM Tris/HCl pH 8,8; 15 mM MgCl2; 500 mM KC1; 1% Triton X-100 (v/v); Taq=Thermus aquaticus-Polymerase). Die Erläuterungen der Abkürzungen gelten für alle fogenden Tabelle mit PCR-Ansätzen.
PCR Templat 5 '-Primer 3 '-Primer NTP [mM] Puffer Taq
1 recADH; 100 pmol 100 pmol 0.2 lOμl l μl
100 ng R38LK46I BRAS
2 recADH; 100 pmol BRS 100 pmol 0.2 10 μl l μl
100 ng R38LK46Irev
Je nach Volumina der einzelnen Substanzen wird der Reaktionsansatz mit Wasser auf 100 μl ergänzt, das gilt im folgenden für alle PCR-Ansätze.
Die PCR-Fragmente wurden aufgereinigt und durch den überlappenden Teil in der Fusions-PCR (Tabelle 3) zu dem kompletten Gen mit den enthaltenden Punktmutationen zusammengefügt.
Tabelle 3: PCR- Ansatz (Abkürzungen s. Tab. 2):
PCR Templat 5 '-Primer 3 '-Primer NTP [mM] Puffer Taq
3 Fragmente aus 100 pmol BRS 100 pmol 0,2 lOμl l μl PCR 1 und 2 BRAS
Die Fragmentmengen sind abhängig von der Größe der Fragmente, es müssen für die Fusions-PCR gleiche pmol-Mengen an freien Enden der Fragmente vorhanden sein, d.h. bei gleicher Konzentration in ng haben kleinere Fragmente eine höhere Anzahl an pmol Enden als größere Fragmente. Für Mutante 1 ist das Verhältnis 1 : 4,4 (kleines zu großes Fragment), d.h. von dem kleinen muß 4,4 mal weniger eingesetzt werden als von dem großen. Einführung der dritten Mutation A9G:
A9G: ggt aag gta gga atc att aca (5 Trimer) und BRAS: (3 'Primer), die das große Fragment ergeben. BRS: (5 'Primer) und A9Grev: tgt aat gat tcc tac ctt acc (3 'Primer), die das kleine Fragment ergeben (Komponenten und Konzentrationene siehe Tabelle 4).
Tabelle 4: PCR-Ansätze (Abkürzungen s. Tab. 2):
PCR Templat 5 '-Primer 3 '-Primer NTP [mM] Puffer Taq
4 Produkt aus 3; 100 pmol A9G 100 pmol 0,2 lOμl 1 μl lOOng BRAS
5 Produkt aus 3; 100 pmol BRS 100 pmol 0,2 10 μl 1 μl 100 ng A9Grev
Die aus der PCR entstandenden amplifizierten Fragmente werden erneut über Fusions- PCR zusammengefügt (Tabelle 5).
Tabelle 5: PCR- Ansatz:
PCR Templat 5 '-Primer 3 '-Primer NTP [mM] Puffer Taq
6 Fragmente aus 100 pmol BRS 100 pmol 0,2 lOμl l μl PCR 4 und 5 BRAS
Die Fragmente wurden im Verhältnis von 1: 14.5 eingesetzt (klein zu groß). Das Produkt aus dieser PCR stellt die Mutante 1 dar, es wurde nach Reinigung in den Expressionsvektor pkk-177-3H kloniert und in E.coli HB101+ (pUBS520) überexprimiert. Das mutierte Genstück kann selbstverständlich auch in andere Vektoren als den pkk-177-3H eingefügt werden, beispielsweise pBTac (Fa. Boehringer Mannheim), pKK-233 (Fa. Stratagene) oder pET (Fa. Novagen). Ebenso können als Wirtsorganismus andere E. coli-Stämme als HB101+ (ρUBS520) verwendet werden wie E. coli NM 522, E. coli RRl, E. coli DH5α oder E. coli TOP 10", die von öffentlichen Stammsammlungen oder Vektor-vertreibenden Firmen erhältlich sind. B) Enzymgewinnung. Zellvermehrung:
Zellmasse für die Aufarbeitung der einzelnen Mutanten wurde immer durch 5 L Schüttelkolbenfermentation produziert, als Wirt für die mutierten recADH Plasmide diente immer der HB101+ Stamm, d.h. man benötigt für die Anzucht doppelten Selektionsdruck durch Ampicillin und Neomycin. Nach Anzucht in Flüssigkultur (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 1% NaCl; pH 7,5) bei 37°C bis zu einer OD550 von 0.5 wurde das Enzym dann durch Zusatz von 1 mM LPTG induziert. Nach weiteren 4 h Stunden Wachstum wurden die Zellen geerntet, und die Genexpression nach Zellaufschluß durch Aktivitätsnachweis und SDS-PAGE der Proteine überprüft. Alternativ können die durch Fermentation gewonnenen Zellen auch bei -20°C eingefroren gelagert werden.
Zellaufschluß durch Ultraschall:
Zur Freisetzung des Enzyms können Standard- Aufschlußmethoden angewandt werden. In diesem Fall wurden die rekombinanten Organismen durch gepulsten Ultraschall aufgeschlossen. Die in Tris-Puffer (0,1 M Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM MgCl2) resuspendierten Zellen wurden einem Aufschluß mit 2 x 25 sec Zyklen mit 30 sec Intervall zur Kühlung am Pulsed Sonifier (Fa. Branson) mit 25 % Intensität unterzogen. Die aufgeschlossenen Zellen wurden zentrifugiert und der Überstand abpipettiert, er wird im folgenden als Rohextrakt bezeichnet.
Wie die nachfolgenden Charakterisierungen zeigen werden, ist dieses mutierte Enzym (Mutante 1), gerade im Vergleich zur Enzymmutante 2, relativ stabil.
Aufreinigung der Enzymmutante 1 :
Zur Gewinnung von gereinigtem Enzym wurden Standardverfahren der Proteinreinigung verwendet. Eingesetzt wurden 3 Reinigungsschritte durch Chromatographie an Phenylsepharose 6 FF, Q-Sepharose FF und Octylsepharose FF (alles kommerziell erhältliche produkte der Fa. Pharmacia, Freiburg). Tabelle 6 faßt die Aktivitäten und Ausbeuten der Reinigungsschritte zusammen. Tabelle 6: Aufreinigung der Mutante 1 :
Reinigungsschritt Aktivität spez. Aktivität Ausbeute Reinigungs- Gesamtaktivität
[U/ml] [U/mg] [%] Faktor [U]
Rohextrakt 13 0,9 100 1,0 390
Phenylsepharose 13 7,4 69 8,5 269
Q-Sepharose 71 25,0 64 29,0 252
Octylsepharose 53 53,0 20 62,0 80
C) Bestimmung der kinetischen Parameter
Die Charakterisierung der ADH-Mutante 1 bezüglich der kinetischen Daten ergab folgende, in Tabelle 7 zusammengefaßte Werte.
Tabelle 7: Kinetische Daten für die Enzymmutante 1.
Parameter KM-Wert kcat-Wert kcat KM
[mM] [sec "'] [mM"1 -sec"1]
NADP+ 0,254 114,8 451
NAD+ 1,823 79,8 44
NADPH 0,149 156,0 1046
NADH 0,179 17,7 99
Im Vergleich zum Wildtyp ist bei dieser Mutante 1 bereits eine deutliche Verbesserung in der Reaktivität gegenüber dem Coenzym NAD+ eingetreten: Der KM-Wert hat sich signifikant von 2,9 auf 1,8 mM verringert, gleichzeitig hat sich die Aktivität ( at) von 21 auf nahezu 80 erhöht. Beide Verbesserungen zusammengenommen zeigen, daß diese Mutante NAD+ bereits deutlich besser akzeptiert. Während die Selektivität (kcat M) des Wildtyps für NAD+ im Vergleich zu NADP+ bei nur ca. 2,5% liegt, ist dieser Wert bei der Mutante 1 auf ca. 10% angestiegen.
D) Temperaturoptimum und -Stabilität
Das Temperaturoptimum wurde für Reduktionsreaktionen bei pH 7,0 mit den beiden Coenzymen NADH und NADPH aufgenommen. Es liegt in beiden Fällen bei 55°C. Die Temperaturstabilität wurde als Restaktivität nach 25 h Inkubation bei verschiedenen Temperaturen bestimmt. Bei 37°C wurden dabei noch 95 % Restaktivität erhalten, bei 42°C noch 34%.
E) pH-Optimum und -Stabilität
Zur Bestimmung des pH-Optimums wurden folgende Puffer verwendet: pH 4,6 = Na-Acetat; pH 5,0 und 5,5 = Na-Acetat; pH 6,0 und 6,5 = Kpi oder MES; pH 7,0 und 7,5 = Kpi oder TEA; pH 8,0 und 8,5 = Tris; pH 9,0 = Bicine. Alle Puffer wurden in einer Konzentration von 100 mM eingesetzt. Zur Bestimmung der Reduktionsreaktion wurde 10 mM Acetophenon zugesetzt und für «die Oxidation 25 mM Phenylethanol. Die Konzentration an NADP/NAD betrug jeweils 2 mM. Die Konzentration an NADH/NADPH betrug je 0,25 mM. Für die Messung wurden 970 μl der jeweiligen Pufferlösung, die bereits mit Substrat in der richtigen Konzentration versetzt war, mit 20 μl der Stammlösung an dem gewünschten Coenzym gemischt. Die Reaktion wurde mit 10 μl Enzym gestartet, je nach Aktivität unverdünnt oder so verdünnt, so daß die Aktivität bei der Messung zwischen 1 und 3 U/ml lag.
Das pH-Optimum der Mutante für die Reduktions-Reaktionen liegt sowohl bei Verwendung von NADH als auch mit NADPH im relativ sauren Bereich zwischen 5,0 und 6,0. Bei pH 7,5 wurden dazu im Vergleich nur noch 4% Aktivität gemessen. Für die Oxidations-Reaktionen mit NAD und NADP erhält man maximale Aktivität bei einem pH-Wert von 7,0.
Die pH-Stabilität wird als Restaktivität nach 25-stündiger Inkubation bei verschiedenen pH- Werten ausgedrückt, wobei die gleichen Puffer wie zur Bestimmung des pH-Optimums verwendet wurden. 45 μl des jeweiligen Puffers wurden mit 5 μl der Enzym- lösung gemischt und bei Raumtemperatur inkubiert. Probenahmen erfolgten nach 30 min, 60 min, 6 h und 25 h.
Bei Mutante 1 erhielt man die höchste Restaktivität (100%) bei Lagerung bei pH 5,0. Bereits ein pH von 5,5 resultiert in nur noch 80% Restaktivität und pH 7,0 ergibt nur noch 34 % Aktivität nach 25 h. F) Bestimmung des isoelektrischen Punkts
Der isoelektrische Punkt liegt nach Bestimmung mit isoelektrischer Fokussierung (LEF) bei pH 4,28. Das ist gerade im Vergleich zur Mutante 2 (s. Beispiel 4) bemerkenswert. Bei Mutante 2 liegt der LP bei 4,65, obwohl in beiden Mutanten jeweils ein Lysin ausgetauscht wurde: bei Mutante 1 das Lysin-45 (in Isoleucin) und bei Mutante 2 das Lysin-48 (in Methionin).
G) Reduktion von Acetophenon im Batch unter Coenzym-Regenerierung und Bestimmung der Enantioselektivität dieser Umsetzung
Im Batch- Ansatz zur Reduktion von Acetophenon unter Coenzym-Regenerierung mit Isopropanol wurde eine vollständige Umsetzung zu Phenylethanol erreicht, eingesetzt wurden dazu 960 μl Triethanolamin-Puffer, 50 mM pH 7,0 mit 11 mM Acetophenon; 10 μl Magnesiumchlorid (100 mM Stammlösung); 25 μl NADP+ (10 mM Stammlösung); 9,4 μl Isopropanol; 1 U Alkohol-Dehydrogenase. Die Bestimmung der Enan- tiomerenreinheit mittels Gaschromatographie in einer Probe nach vollständigem Umsatz (4 h) zeigt, daß nur der (R)- Alkohol erhalten wurde, (S)-Phenylethanol war nicht nachweisbar.
Beispiel 2:
Herstellung und Charakterisierung der Mutante 1/1 (A9G, R38L, K45M):
Ziel dieser Mutation war es, im Vergleich zu Mutante 1 das Lysin in Position 45 in Methionin an Stelle von Isoleucin (Mutante 1) auszutauschen. Die übrigen in Mutante 1 vorgenommenen Austausche in Position 9 und 38 sind beibehalten worden, so daß Mutante 1/1 im Vergleich zum Wildtyp folgendermaßen beschrieben werden kann: A9G, R38L, K45M.
A) Gewinnung von Mutante 1/1 :
Zur Gewinnung von Mutante 1/1 wurden prinzipiell die gleichen Methoden wie in Beispiel 1 beschrieben verwendet. Da die Mutante 1/1 ist eine Erweiterung der Mutante 1, daher wird als Templat für die nachfolgende PCR die Mutante 1 verwendet. R38LK45M: acc ggc ctg cac agc gat gtt gaa atg gca (5 Primer) und BRAS (3 Primer), die das große Fragment ergeben.
BRS (5 'Primer) und R38LK45Mrev: tgc cat ttc acc aac atc gct gtg cag gcc ggt
(3 Primer), die das kleine Fragment ergeben.
Tabelle 8: PCR- Ansatz:
PCR Templat 5 -Primer 3 '-Primer NTP [mM] Puffer Taq
~7 Produkt aus 6; 100 pmol 100 pmol BRAS 0^2 ΪÖμ TμT
100 ng R38LK45M
8 Produkt aus 6; 100 pmol BRS 100 pmol 0,2 10 μl l μl
100 ng R38LK45Mrev
Die Fragmente wurden aufgereinigt und in die Fusions-PCR eingesetzt.
Tabelle 9: PCR-Ansatz:
PCR Templat 5 -Primer 3 '-Primer NTP [mM] Puffer Taq
9 Fragmente aus 100 pmol BRS 100 pmol BRAS 0,2 lOμl l μl PCR 7 und 8
Die Fragmente wurden im Verhältnis 1:4.4 in die PCR eingesetzt. Das Produkt stellt die Mutante 1/1 dar, da ja aus Mutante 1 die Mutation A9G übernommen wurde.
Wie bei Mutante 1 wurde auch hier die eingeführten Mutationen durch Sequenzierung des Gens bestätigt. Zur Gewinnung der Enzymmutante wurde das Gen dann in E.coli HB101+ (pUBS520) überexprimiert.
B) Enzymgewinnung:
Fermentation und Zellaufschluß entsprechen der in Beispiel 1 beschriebenen Vorgehensweise. Aufreinigung der Enzymmutante 1/1:
Die Aufreinigung dieses mutierten Enzyms entspricht der in Beispiel 1 beschriebenen
Methode. Tabelle 10 faßt die charakteristischen Daten zusammen.
Tabelle 10: Aufreinigung der Enzymmutante 1/1:
Reinigungsschritt Aktivität spez. Ausbeute Faktor Gesamtaktivität [U/ml] Aktivität [%] [U]
[U/mg]
Rohextrakt 178 14 100 1 2470
Phenylsepharose 137 81 64 6 1576
Q-Sepharose 179 75 29 6 716
Octylsepharose 140 100 11 7 280
C) Bestimmung der kinetischen Parameter für die Enzymmutante 1/1:
Die Charakterisierung der ADH-Mutante 1/1 bezüglich der kinetischen Daten für die
Coenzyme ergab die folgenden in Tabelle 11 zusammengestellten Werte.
Tabelle 11 : Kinetische Daten für die oxidierten und reduzierten Coenzyme für die Enzymmutante 1/1.
Parameter KM-Wert kcat-Wert kcat M [mM] [sec -1] [mM"1 -sec"1]
NADP+ 0,502 33,3 66
NAD+ 0,502 33,3 66
NADPH 0,352 166,4 473
NADH 0,188 10,3 55
Die kinetischen Daten zeigen, daß diese Mutante das Coenzym NAD+ genauso gut akzeptiert wie NADP+. Der KM-Wert für NAD+ hat sich signifikant erniedrigt, er liegt bei 0,5 mM an Stelle von 2,9 für den Wildtyp. Diese Mutante zeigt also bereits eine besonders gute, niedrige Affinität zum Coenzym NAD+. Auch der kat-Wert hat sich leicht verbessert, er liegt bei 33,3 sec "\ Der Vergleich der Selektivitäten (kcat/KM) für beide Coenzyme zeigt für NAD+ denselben Wert von 66 mM1 -sec"1 wie für NADP+. Im Vergleich zum Wildtyp, der NAD+ zu ca. 2,5% bezogen auf NADP+ umsetzt, wird NAD+ von dieser Mutante mit 100% umgesetzt.
D) Temperaturoptimum und -Stabilität
Das Temperaturoptimum für die Enzymmutante 1/1 liegt mit NADPH gemessen bei mindestens 65°C, höhere Temperaturen wurden meßtechnisch bedingt nicht erreicht. Wird das Temperaturoptimum mit dem Coenzym NADH bestimmt, findet man einen optimalen Wert bei 40°C. Vermutlich wird NADH bei höheren Temperaturen nicht mehr so gut am Enzym gebunden, so daß dann nur noch verminderte Aktivität nachweisbar ist. Die Messung zur Temperaturstabilität zeigt, daß nach 25 Std. nur bei 25°C noch 100% Restaktivität nachweisbar ist, bei 30°C nur noch 59%. Die Temperaturstabilität der Mutante 1/1 hat sich im Vergleich zum Wildtyp-Enzym also signifikant verschlechtert.
E) pH-Optimum und -Stabilität
Das pH-Optimum für die Reduktionsrichtung (Messung mit Acetophenon) liegt sowohl mit NADPH als auch mit NADH gemessen bei ca. 6,0. Für die Oxidation liegt das Optimum bei 7,0 (NADP+) bzw. 7,5 (NAD+).
F) Bestimmung des isoelektrischen Punkts
Der isoelektrischen Punkts der Enzymmutante 1/1 liegt bei 4,85.
G) Reduktion von Acetophenon im Batch unter Coenzym-Regenerierung und Bestimmung der Enantioselektivität dieser Umsetzung
Die Reduktion von Acetophenon unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen ergab nur das (R)-Isomere von Phenylethanol. Beispiel 3:
Herstellung und Charakterisierung der Mutante 2 (A9G, R38L, K48M):
Ziel dieser Mutation war es, im Vergleich zu Mutante 1 das Lysin in Position 48 durch Methionin auszutauschen - an Stelle des K45I- Austausche. Die übrigen in Mutante 1 vorgenommenen Austausche in Position 9 und 38 sind beibehalten worden, so daß Mutante 2 im Vergleich zum Wildtyp folgendermaßen beschrieben werden kann: A9G, R38L, K48M.
A) Methode der Mutagenese:
Zur Gewinnung von Mutante 2 wurden prinzipiell die gleichen Methoden wie in Beispiel 1 beschrieben verwendet. Da die Mutante 2 unabhängig von Mutante 1 hergestellt wurde, wurde hier wieder das Gen der Wildtyp- ADH (recADH) als Templat eingesetzt.
R38LK48M: acc ggc ctg cac agc gat gtt ggt gaa aaa gca gct atg agt gtc (5 'Primer) und
BRAS (3 'Primer), die das große Fragment ergeben;
BRS (5 Primer) und
R38LK48Mrev: gac act cat agc tgc ttt ttc acc aac atc gct gtg cag gcc ggt (3 'Primer), die das kleine Fragment ergeben.
Tabelle 12: PCR-Ansätze
PCR Templat 5 '-Primer 3 '-Primer NTP [mM] Puffer Taq
~Ϊ3 recADH; 100 pmol 100 pmol BRAS 02 ΪÖμϊ f μT lOOng R38LK48M
14 recADH; 100 pmol BRS 100 pmol R38LK48Mrev 0.2 10 μl l μl
100 ng
Die Fragmente wurden aufgereinigt und in die Fusions-PCR eingesetzt.
Tabelle 13: PCR- Ansatz
PCR Templat 5 -Primer 3 -Primer NTP [mM] Puffer Taq
15 Fragmente aus 100 pmol BRS 100 pmol BRAS 0.2 lOμl l μl PCR 13 und 14 Die Fragmente wurden in einem Verhältnis von 1:4.4 eingesetzt, das Produkt dieser Fusions-PCR ist ein Zwischenprodukt der Mutante 2, da die Mutation A9G noch eingefügt werden muß.
Einführung der dritten Mutation A9G:
A9G: ggt aag gta gga atc att aca (5 'Primer) und BRAS: (3 'Primer), die das große
Fragment ergeben;
BRS: (5 'Primer) und A9Grev: tgt aat gat tcc tac ctt acc (3 'Primer), die das kleine
Fragment ergeben (Tabelle 18).
Tabelle 14: PCR-Ansätze
PCR Templat 5 '-Primer 3 '-Primer NTP [mM] Puffer Taq
16 Produkt aus 15; 100 pmol A9G 100 pmol BRAS 0.2 lOμl 1 μl lOOng
17 Produkt aus 15; 100 pmol BRS 100 pmol A9Grev 0.'2 10 μl 1 μl 100 ng
Die Fragmente wurden im Verhältnis 1 : 14.5 in die Fusions-PCR (Tabelle 19) eingesetzt.
Tabelle 15: PCR- Ansatz:
PCR Templat 5 -Primer 3 -Primer NTP [mM] Puffer Taq
18 Fragmente aus 100 pmol BRS 100 pmol BRAS 0.2 lOμl l μl PCR 16 und 17
Das Produkt dieser Fusions-PCR stellt die Mutante 2 dar, diese wurde wie alle anderen Mutanten in den Expressionsvektor pkk-177-3H einkloniert. Zur Gewinnung der Enzymmutante wurde das Gen dann in E.coli HB101+ (pUBS520) überexprimiert. B) Enzymgewinnung: Fermentation und Zellaufschluß.
Fermentation, Zellaufschluß und Enzymreinigung entsprechen der in Beispiel 1 beschriebenen Vorgehensweise. Tabelle 20 faßt die charakteristischen Daten der Reinigung zusammen.
Tabelle 16: Aufreinigung der Enzymmutante 2:
Reinigungsschritt Aktivität spez. Akt. Ausbeute Faktor Aktivität
[U/ml] [U/m ] gesamt
Rohextrakt 310 18 100 1 3300
Hitzefällung 330 35 100 2 3300
Phenylsepharose 73 91 11 5 364
Q-Sepharose 90 65 8,2 270
C) Bestimmung der kinetischen Parameter für die Enzymmutante 2:
Die Charakterisierung der ADH-Mutante 2 bezüglich der kinetischen Daten für die
Coenzyme ergab die folgenden in Tabelle 21 zusammengestellten Werte.
Tabelle 17: Kinetische Daten für die oxidierten Coenzyme für die Enzymmutante 2.
Parameter KM-Wert kat-Wert at/KM [mM] [sec -1] [mM"1 -sec"1]
NADP+ 6,155 47,0 8
NAD+ 0,619 33,1 54
Bei dieser Mutante haben sich im Vergleich zum Wildtyp beide Parameter vorteilhaft bezüglich NAD+ verändert, der KM-Wert ist von 2,9 auf 0,62 mM gesunken, der kcat- Wert hat sich von 21 auf 33 verbessert. Damit hat sich der at/KM-Wert von 7,3 auf 54 verbessert. Gleichzeitig haben sich bei dieser Mutante vor allem Affinität zu NADP+ (KM-Wert), aber auch der kat-Wert drastisch verschlechtert, so daß diese Mutante bevorzugt NAD* als Coenzym verwendet. D) Temperaturoptimum und -Stabilität
Das Temperaturoptimum liegt deutlich niedriger als beim Wildtyp-Enzym, mit NADP gemessen liegt es bei 50°C, mit NAD+ bei 33-37°C. Die Temperaturstabilität zeigt, daß nach 25 h nur bei 25°C noch 100% Restaktivität vorhanden sind, bei 30°C nur noch 40%.
E) pH-Optimum und -Stabilität
Das pH-Optimum für die Reduktion von Acetophenon liegt mit NADPH gemessen bei 8,0, mit NADH gemessen dagegen bei 6,5. Dieses Optimum bei 6,5 entspricht dem Wildtyp-Enzym, gemessen mit NADPH. Vergleichbar mit dem Wildtyp-Enzym zeigt auch die mit NADH gemessene Aktivität nur einen schmalen Aktivitätsbereich, bei pH 7,0 findet man nur noch 46% Restaktivität. Die Stabilität der Enzymmutante bei verschiedenen pH-Werten nach 25 h zeigt ein Maximum bei pH 7,0, bei pH 6,0 wie auch bei 8,0 wurden noch 84% Restaktivität gemessen.
F) Bestimmung des isoelektrischen Punkts
Der isoelektrische Punkt der Enzymmutante liegt bei pH 4,65.
G) Reduktion von Acetophenon im Batch unter Coenzym-Regenerierung und Bestimmung der Enantioselektivität dieser Umsetzung
Die Reduktion von Acetophenon unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen ergab nur das (R)-Isomere von Phenylethanol.
Beispiel 4:
Herstellung und Charakterisierung der Mutante 2/2 (A9G, R38L, H39L, K48M) :
Ziel dieser Mutation war es, im Vergleich zu Mutante 2 noch zusätzlich einen weiteren Aminosäure- Austausch einzuführen, indem die basische Aminosäure Histidin in Position 39 gegen eine neutrale Aminosäure, das Leucin, ausgetauscht wurde. Die Mutante 2/2 kann also in Bezug auf den Wildtyp folgendermaßen beschrieben werden: A9G, R38L, H39L, K48M. A) Methode der Mutagenese:
Zur Gewinnung von Mutante 2/2 wurden prinzipiell die gleichen Methoden wie in Beispiel 1 beschrieben verwendet. Da die Mutante 2/2 eine Folgemutante der Mutante 2 darstellt, wurde diese als Templat für die PCR eingesetzt.
R38LH39L: acc ggc ctg ctc agc gat gtt (5 'Primer) und
BRAS (3 Primer), die das große Fragment ergeben;
BRS (5 Primer) und R38LH39Lrev: aac atc gct gag cag gcc ggt (3 Primer), die das kleine Fragment ergeben.
Tabelle 18: PCR-Ansätze
PCR Templat 5 '-Primer 3 -Primer NTP [mM] Puffer Taq
19 Produkt aus 18; 100 pmol 100 pmol 0.2 lOμl 1 μl lOOng R38LH39L BRAS
20 Produkt aus 18; 100 pmol BRS 100 pmol 0.2 10 μl 1 μl 100 ng R38LH39Lrev
Die Fragmente wurden aufgereinigt und in die Fusions-PCR eingesetzt, in einem Verhältnis von 1:4.4 (klein zu groß).
Tabelle 19: PCR- Ansatz:
PCR Templat 5 -Primer 3 '-Primer NTP [mM] Puffer Taq
21 Fragmente aus 100 pmol BRS 100 pmol BRAS 0.2 lOμl l μl PCR 19 und 20
Das Produkt dieser Fusions-PCR stellt die komplette Mutante 2/2 dar, die Mutationen K48M und A9G wurden aus der Mutante 2 übernommen. Zur Gewinnung der Enzymmutante wurde das Gen dann in E.coli HB101+ (pUBS520) überexprimiert. B) Enzymgewinnung
Fermentation, Zellaufschluß und Aufreinigung der Enzymmutante 2/2
Die Enzymproduktion und Aufreinigung dieses mutierten Enzyms entspricht der in Beispiel 1 beschriebenen Methode Tabelle 24 faßt die charakteristischen Daten der Enzymreinigung zusammen
Tabelle 20 Reinigung der Enzymmutante 2/2
Reinigungsschritt Aktivität spez Akt Ausbeute Faktor Gesamtakt [U/mll [U/mg] r%ι [U]
Rohextrakt 35 1 9 100 1 467
Hitzefallung 30 3 96 1 6 450
Phenylsepharose 72 26 98 14 457
Q-Sepharose 80 89 85 47 398
Octylsepharose 65 93 28 49 130
C) Bestimmung der kinetischen Parameter für die Enzymmutante 2/2
Die Charakterisierung der ADH-Mutante 2/2 bezuglich der kinetischen Daten ergab folgende in Tabelle 25 aufgeführte Werte
Tabelle 21
Parameter KM-Wert kat-Wert kcat/KM [mM] [sec _1] [mM"1 -sec"1]
NADPT 0,143 30,8 215
NAD+ 0,955 23,2 24
NADPH 0,370 101,1 273
NADH 0,070 33,6 479
Für NAD+ hat sich im Vergleich zum Wildtyp-Enzym der KM-Wert von 2,9 auf 0,96 mM erniedrigt Für NADP+ haben sich KM- wie auch at-Wert leicht verschlechtert Auffallend ist die besonders gute Affinität der Mutante gegenüber NADH, der K -Wert liegt bei 0,07 mM.
D) Temperaturoptimum und -Stabilität
Das Temperaturoptimum der Mutante 2/2,gemessen bei pH 5,0, liegt bei 42°C, gemessen mit NADPH und bei Verwendung von NADH bei 50oC. Diese Optima sind relativ breit, mit NADPH gemessen erhält man noch 95% Aktivität bei Messung bei 50°C, mit NADH gemessen bei 60°C noch 70%. Die Stabilität bei Lagerung (6h) bei verschiedenen Temperaturen ergibt für 30°C noch 67%, bei 37°C nur noch 7%.
E) pH-Optimum und -Stabilität
Das pH-Optimum liegt für die Reduktion von Actophenon mit NADPH bei 6,0, bei Verwendung von NADH bei 5,0. Gerade mit NADH ist diese Mutante eigentlich nur im sauren Bereich aktiv, bei pH 7,0 erhält man nur noch 6% Aktivität im Vergleich zum Wert bei 5,0. Auch für die Oxidation ist das Optimum signifikant leicht in den sauren Bereich verschoben, maximale Aktivität findet man sowohl mit NADP+ als auch NAD+ bei pH 7,5. Bei pH 8,0, dem Optimum des Wildtyps, findet man nur noch 77% (NADP+) bzw. 61% (NAD4) Aktivität. Wird das Enzym bei verschiedenen pH-Werten gelagert und die Restaktivität nach 6 h gemessen, findet man noch 100% Restaktivität bei pH 7,0. Bei pH 8,5 erhält man nur noch 58%.
F) Bestimmung des isoelektrischen Punkts
Der isoelektrische Punkt der Enzymmutante 2/2 liegt bei 4,47.
G) Reduktion von Acetophenon im Batch unter Coenzym-Regenerierung und Bestimmung der Enantioselektivität dieser Umsetzung
Die Reduktion von Acetophenon unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen ergab nur das (R)-Isomere von Phenylethanol.
Die Beispiele 1 bis 4 zeigen, daß die Basizitätsminderung im Coenzym-relevanten Aminosäure-Sequenzbereich des ADH-Proteins der NADP-bevorzugenden Alkohol- Dehydrogenase aus Lactobacillus brevis durch gentechnologisch erreichbaren Austausch von basischen durch ungeladene Aminosäurereste wie R38L, H39L, K45I, K45M bzw. K48M in unterschiedlicher Kombination zu einer praxisrelevanten Verbesserung der NAD+-Spezifität des Enzyms führt.
Ein solcher Austausch basischer gegen ungeladene Aminosäurereste im coenzym- sensiblen bzw. Coenzym- Andockbereich zur NAD+-Spezifιtätsverbesserung ist natürlich analog bei anderen Dehydrogenasen bekannter oder noch zu bestimmender Aminosäure- und zugehöriger DNA-Sequenz möglich, wobei sich die coenzym-sensible Abwandlung - soweit der spezifische Bereich nicht bekannt ist - am Erfolg zu erkennen gibt.
So sind z.B. bei weiteren NADP-bevorzugenden Dehydrogenasen Aminosäure- Sequenzen bekannt und in Datenbanken recherchierbar, wobei zunächst am einfachsten im Ähnlichkeitsbereich eines bereits bekannten Coenzym-Bindungsmotivs gesucht werden kann.
Im vorliegenden Fall wurden aus einer Protein- Sequenz-Datenbank („Swiss-Prot") Enzyme gesucht, die Ähnlichkeiten mit der Sequenz der L. brevis ADH aufzeigen. Als Suchmotiv wurde die Sequenz von Aminosäure- 17 bis Aminosäure-50 der L. brevis- ADH eingegeben, das Suchprogramm ermittelt dann alle Proteine, die Sequenzähnlichkeiten aufweisen. Das Programm (Referenz: Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein data- base search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402) kann auch Lücken einfügen, um die Ähnlichkeit von Sequenzbereichen zu verdeutlichen, wobei angenommen wird, daß es auch natürlicherweise durch Deletionen und Insertionen zu solchen Verschiebungen kommen kann.
Tab. 22 zeigt als Ergebnis einer solchen Recherche Aminosäure-Sequenzen im Ähnlichkeitsbereich bezogen auf Consensus-Sequenzen für NADP-abhängige Dehydrogenasen. Dabei bedeuten „sp-Q93761" eine Oxidoreduktase aus Caenorhabditis elegans, „sp-P50161" eine Versicolorin-Reductase aus Aspergillus parasiticus, „sp-O67610" eine Oxidoreduktase aus Aquifex aeolicus, „sp-P42317" eine Oxidoreduktase aus Bacillus subtilis und „sp-Q49721" eine Oxidoreduktase aus Mycobacterium leprae.
Tab. 22: Vergleich von Sequenz-Bereichen in NADP-abhängigen Oxidoreduktasen, die der vermuteten Coenzym-Bindungsstelle der ADH aus Lactobacillus brevis (LB ADH) entsprechen.
LBADH: 17 GIGLAIATKFVEEGAKVMITGRHSDVG-EKAAKSV sp-Q93761 37 GLGKAIATTFAHLGASVAIAARRLDVL-EKTADEI sp-P50161 20 GIGAAIAVALGERGAKVWNYAHSREAΑEKWEQI sp-O67βl0 18 GIGRAIAEKLASAGSTVIITGT-SGERA-KAVAEEI sp-P42317 14 GIRFEIAREFAREGASVIVDLR-PEAC-EK7ΛASKL sp-Q49721 77 EG LI-GRHADVGA-KVAQLI
Man erkennt analog zur ADH aus L. brevis basische Aminosäurereste in zum Teil analoger räumlicher Zuordnung, insbesondere etwa in der Position 45 und 38 von LBADH analoger Entfernung vom Consensus-Sequenzbereich. Der erfindungsgemäße Austausch gegen ungeladene Reste dürfte auch bei diesen bekannten Enzymen zu einer besseren NAD+-Akzeptanz führen.
In Weiterführung des detailliert beschriebenen Prinzips der Basizitätsänderung wurde nunmehr festgestellt, daß an Stelle des Austauschs basischer gegen ungeladene Aminosäurereste auch ein Wechsel von basischer oder von ungeladener Aminosäure zu negativ geladener Aminosäure mit positiver Wirkung für die NAD+- Akzeptanz vorgenommen werden kann. Die gewünschte Basizitätsminderung kann natürlich auch durch Mischformen solcher Austausche erzielt werden.
Das nachfolgende Beispiel 5 belegt den Nutzen einer solchen Einführung eines negativ geladenen Aminosäurerests zusätzlich zu Austauschen basischer durch neutrale Aminosäuren im Coenzym- sensiblen Bereich. Beispiel 5:
Herstellung und Charakterisierung der Mutante2/3 (A9G, G37D, R38L, K48M) :
Ziel dieser Mutation war es, im Vergleich zu Mutante 2 in eine Bindungsstelle für das Coenzym in der Region 37/38 eine saure Aminosäure einzufügen. Dazu wurde von der Mutante 2 ausgegangen, die bereits eine hohe Präferenz für NAD+ gegenüber NADP+ aufweist und in Position 37 das Glycin gegen Asparaginsäure ausgetauscht. Die Mutante 2G37D kann also in Bezug auf den Wildtyp folgendermaßen beschrieben werden: A9G, G37D, R38L, K48M.
A) Methode der Mutagenese:
Zur Gewinnung von Mutante 2/3 wurden prinzipiell die gleichen Methoden wie in den vorangehenden Beispielen angewandt. Da die Mutante 2/3 eine Folgemutante der Mutante 2 darstellt, wurde diese als Templat für die PCR eingesetzt.
G37DR38LK48M: 5 acc gac ctg cac agc gat gtt gtt gaa aaa gca gct atg agt gtc3 '
(5 Primer) und
BRAS (3 Trimer), die das große Fragment ergeben;
BRS (5 'Primer) undG37DR38LK48M rev: 5 'gac act cat agc tgc ttt ttc acc aac atc gct gtg cag gtc ggt 3 ' (3 'Primer), die das kleine Fragment ergeben.
Tabelle 23: PCR- Ansatz (Gesamt- Ansatz = 100 μl)
PCR Templat 5 -Primer 3 -Primer NTP Puffer Taq
[mM]
A Mutante2; 100 ng 100 pmol 100 pmol 0.2 lOμl l μl
G37DR38LK48M BRAS
B Mutante2; 100 ng 100 pmol BRS 100 pmol 0.2 10 μl 1 μl
G37DR38LK48M Rev
Die Fragmente wurden aufgereinigt und in die Fusions-PCR eingesetzt, in einem Verhältnis von 1 :4.4 (klein zu groß). Tabelle 24: PCR- Ansatz:
PCR Templat 5 -Primer 3 -Primer NTP [mM] Puffer Taq
C Fragmente aus 100 pmol BRS 100 pmol BRAS 0.2 lOμl l μl
PCR A und B
Das Produkt dieser Fusions-PCR stellt die komplette Mutante 2/3 dar, die Mutationen R38L, K48M und A9G wurden aus der Mutante 2 übernommen. Zur Gewinnung der Enzymmutante wurde das Gen dann in E.coli HB101+ (pUBS520) überexprimiert. Die korrekte Mutagenese wurde durch Sequenzierung des positiven Klons verifiziert.
B) Enzymgewinnung und Aktivitätstest mit NAD+, NADP+, NADH und NADPH:
Fermentation, Zellaufschluß und Aufreinigung der Enzymmutante 2/3:
Die Vermehrung des E. coli-Stamms, der das durch Mutagenese veränderte Enzym enthält, wird wie in den Beispielen 1 bis 4 beschrieben durchgeführt.
Nach Aufschluß der Zellen und Abzentrifugation der Zellbruchstücke erhält man den enzymhaltigen Überstand (Rohextrakt).
Im Standard-Enzymtest für die Reduktion von Acetophenon wurden mit NADPH 0,032 U/mg (0,318 U/ml; 9,75 mg Protein/ml) und mit NADH 0,47 U/mg (4,61 U/ml; 9,75 mg Protein/ml) gemessen. In der Rückreaktion (Alkohol-Oxidation) mit Phenylethanol wurde mit NAD+ eine spezifische Aktivität von 1,1 U/mg (10,8 U/ml; 9,75 mg Protein/ml) gemessen, mit NADP+ zeigte dieses Enzympräparat keine Aktivität.
Durch die erfindungsgemäße Abwandlung der genetischen Information wurde also ein Enzym erhalten, das nur noch NAD+ und kein NADP+ mehr akzeptiert. Anhang
Aminosäure-Sequenzen von Wildtyp- und mutierten ADHn aus Lactobacillus brevis im N-terminalen Bereich bis zur 50. Aminosäure (die Austausche in Bezug auf den Wildtyp sind durch Unterstreichung hervorgehoben):
A) Wildtyp-Enzym:
S-N-R-L-D-G-K-V-A-I10-I-T-G-G-T-L-G-I-G-L20-A-I-A-T-K-F-V-E-E-G3o- A-K-V-M-I-T-G-R-H-S^-D-V-G-E-K-A-A-K-S-Vso
B) Mutante 1:
S-N-R-L-D-G-K-V-G-I10-I-T-G-G-T-L-G-I-G-L2o-A-I-A-T-K-F-V-E-E-G3o- A-K-V-M-I-T-G-L-H-S^-D-V-G-E-I-A-A-K-S-Vso
C) Mutante 1/1:
S-N-R-L-D-G-K-V-G-I^-I-T-G-G-T-L-G-I-G-Lzo-A-I-A-T-K-F-V-E-E-Gso- A-K-V-M-I-T-G-L-H-S^-D-V-G-E-M-A-A-K-S-Vso
D) Mutante 2:
S-N-R-L-D-G-K-V-G-I10-I-T-G-G-T-L-G-I-G-L20-A-I-A-T-K-F-V-E-E-G3o- A-K-V-M-I-T-G-L-H-S40-D-V-G-E-K-A-A-M-S-V5o
E) Mutante 2/2:
S-N-R-L-D-G-K-V-G-I10-I-T-G-G-T-L-G-I-G-L2o-A-I-A-T-K-F-V-E-E-G3o- A-K-V-M-I-T-G-L-L-S40-D-V-G-E-K-A-A-M-S-V5o
F) Mutante 2/3:
S-N-R-L-D-G-K-V-G-I10-I-T-G-G-T-L-G-I-G-L20-A-I-A-T-K-F-V-E-E-G3o- A-K-V-M-I-T-D-L-H-S4n-D-V-G-E-K-A-A-M-S-V o

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Verbesserung der NADH-Spezifität von bevorzugt NADPH- abhängigen Dehydrogenasen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Basizität des Enzyms im Coenzym-Andockbereich durch angemessene Änderung der Aminosäure-Sequenz mit Hilfe gentechnologischer Mittel vermindert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Basizität der Aminosäure-Sequenz der Dehydrogenase im Coenzym-Andockbereich durch Austausch positiv geladener Aminosäure(n) gegen ungeladene Aminosäure(n) vermindert.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Basizität der Aminosäure-Sequenz der Dehydrogenase im Coenzym-Andockbereich allein oder zusätzlich durch Austausch neutraler oder positiv geladener Aminosäure(n) gegen negativ geladene Aminosäure(n) vermindert.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Dehydrogenase mit für präparative Zwecke tauglicher NADH- Abhängigkeit entsprechend at/KM fiir NAD+ > 20 auf gentechnologischem Wege erzeugt, indem man von einem NADPH-bevorzugenden Dehydrogenase-Produzentenstamm mit bekannter oder zu ermittelnder Aminosäure-Sequenz im Coenzym-Andockbereich ausgeht und für die gewünschte Basizitätsänderung eine entsprechende Veränderung der zugehöigen DNA-Sequenz mittels PCR-Technik vornimmt und die durch diese Methode veränderte genetische Information innerhalb des gewünschten Gens in einen geeigneten Vektor kloniert und anschließend in einem Dehydrogenase- produzierenden Mikroorganismus überexprimiert.
5. Verfahren nach Anspruch 4, gekennzeichnet durch die Herstellung von short-chain Dehydrogenasen mit Coenzym-Bindungsstellen am N-Terminus.
6. Verfahren nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch die Herstellung von Alkohol- Dehydrogenasen, insbesondere von (R)-spezifischen Alkohol-Dehydrogenasen.
7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Dehydrogenase mit Hilfe von E. coli, insb. von E. coli HB101+(pUBS 520), gewonnen wird, der das für die gewünschte Dehydrogenase kodierende mutierte, in einem Expressionsplasmid, insb. pKK-117-3HB, klonierte Gen überexprimiert enthält.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß Alkohol-Dehydrogenase ausgehend von Lactobacillen, insbesondere von L.brevis oder L.kefir gewonnen wird.
9. Für präparative Zwecke taugliche (R)-sρezifische Alkohol-Dehydrogenase mit einem kcat KM für NAD+ > 20, erhältlich ausgehend von Lactobacillus-Stämmen, insb. von L.brevis oder L.kefir, mit einem für short-chain Dehydrogenasen mit Coenzym-Bindungsstelle im N-Terminus kodierenden Gen durch Abwandlung der entsprechenden Gen-Sequenz im Hinblick auf die gewünschte Basizitätsminderung an der Coenzym-Bindungsstelle druch Ersatz positiv geladener und / oder ungeladener Aminosäure(n) durch negativ geladene Aminosäuren und / oder Aminosäuren mit positiv geladenen Restgruppen durch Aminosäuren mit ungeladenen Restgruppen.
10. Alkohol-Dehydrogenase nach Anspruch 9, gekennzeichnet durch zumindest einen G37D-, R38L-, H39L-, K45I-, K45M- und/oder K48M-Austausch bei der Alkohol- Dehydrogenase aus L.brevis im N-terminalen Sequenz-bereich, der - unverändert - S-N-R-L-D-G-K-V-A-I10-I-T-G-G-T-L-G-I-G-L2o-A-I-A-T-K- F-V-E-E-G3o-A-K-
V-M-I-T-G-R-H-S-w-D-V-G-E-K-A-A-K-S-Vso lautet, insb. durch einen der folgenden Austausche
- R38L, K45I;
- R38L, K45M;
- R38L, K48M;
- R38L, H39L, K48M;
- G37D, R38L, K48M.
11. Verfahren zur stereo-selektiven Gewinnung von (R)-Hydroxy- Verbindungen durch enzymatische Reduktion entsprechender Keto- Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym eine nach einem der Ansprüche 1 bis 8 erhältliche Dehydrogenase verwendet.
12. Verfahren zur stereo-selektiven Gewinnung von S-Hydroxy- Verbindungen aus Racematen durch enzymatische Oxidation der R-Hydroxy- Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym eine nach einem der Ansprüche 1 bis 8 erhältliche Dehydrogenase verwendet.
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