JPH08131176A

JPH08131176A - 大腸菌のニトロ還元酵素遺伝子

Info

Publication number: JPH08131176A
Application number: JP6298936A
Authority: JP
Inventors: Shuhei Yoshino; 修平善野
Original assignee: Chisso Corp
Current assignee: JNC Corp
Priority date: 1994-11-07
Filing date: 1994-11-07
Publication date: 1996-05-28

Abstract

(57)【要約】【目的】一次構造の明らかにされた大腸菌ニトロ還元
酵素遺伝子を提供すること。【構成】配列の長さ７２０の塩基配列を有するＤＮＡ
からなるニトロ還元活性を有する酵素遺伝子。この遺伝
子がコードしている２４０個のアミノ酸からなる分子量
２６７９９のニトロ還元酵素。【効果】本発明の遺伝子は、変異原の高感受性株の作
出ならびにニトロ還元酵素蛋白の調製に使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】本発明は大腸菌のニトロ還元酵素遺伝子及
びニトロ還元酵素に関する。

【０００２】

【従来の技術】我々の身の回りには、遺伝子ＤＮＡに損
傷を与える物質（変異原）が多数存在している。変異原
性、発癌性を示すニトロアレーン自体が直接反応してＤ
ＮＡを損傷するわけではなく、ニトロアレーンの代謝物
が突然変異を起こしＤＮＡを損傷する。ニトロ還元酵素
とニトロアレーンとの反応がニトロアレーンの変異原性
発現の律速段階と考えられている。

【０００３】大腸菌には１つの主要なＮＡＤＰＨ特異的
ニトロ還元酵素と２つの少ないＮＡＤ（Ｐ）Ｈニトロ還
元酵素が見い出されている（Ｂｒｙａｎｔ，Ｄ．Ｗ．，
ＭｃＣａｌｌａ，Ｄ．Ｒ．，Ｌｅｅｋｓｍａ，Ｍ．ａｎ
ｄＬａｎｅｕｖｉｌｌｅ，Ｐ．（１９８１）カナディ
アン・ジャーナル・オブ・マイクロバイオロジー（Ｃａ
ｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）２７８１−８
６．）。ＮＡＤＰＨニトロ還元酵素はｎｆｓＡ遺伝子に
コードされ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈニトロ還元酵素の１つはｎ
ｆｓＢ遺伝子にコードされている。ｎｆｓＢ遺伝子は染
色体上の８分から１７分の間に、ｎｆｓＡ遺伝子は１７
分以降に位置することがわかっている（ＭｃＣａｌｌ
ａ，Ｄ．Ｒ．，Ｋａｉｓｅｒ，Ｃ．ａｎｄＧｒｅｅ
ｎ，Ｍ．Ｈ．Ｌ．（１９７８）ジャナル・オブ・バクテ
リオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）１３３１０
−１６．）。ニトロ還元酵素に関する遺伝子の解析は最
近行なわれた。渡辺らは、サルモネラ菌からニトロ還元
酵素遺伝子を単離し、（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｍ．，Ｉｓ
ｈｉｄａｔｅ，Ｍ．Ｊｒ．＆Ｎｏｈｍｉ，Ｔ．（１９
８９）ミュウテーションリサーチ（Ｍｕｔａｔｉｏｎ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ），２１６，２１１−２２０）に開
示している。また、その一次構造を明らかにし、（Ｗａ
ｔａｎａｂｅ，Ｍ．，Ｉｓｈｉｄａｔｅ，Ｍ．Ｊｒ．＆
Ｎｏｈｍｉ，Ｔ．（１９９０）ヌクレイックアシッ
ドリサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓｅａ
ｒｃｈ），１８，１０５９）に示している。

【０００４】Ｂｒｙａｎｔらはエンテロバクター菌から
ニトロ還元酵素遺伝子を単離し、その一次構造を決定
し、（Ｂｒｙａｎｔ，Ｃ．，Ｈｕｂｂａｒｄ，Ｌ．，ａ
ｎｄＭｃＥｌｒｏｙ，Ｗ．Ｄ．（１９９１）ジャーナル
オブバイオロジカルケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．），２６６，４１２６−４１３０）に開
示している。善野らは、大腸菌のニトロ還元酵素遺伝子
を単離し、その一次構造を決定し、（特願平５−３４０
０６１）に開示している。この遺伝子はｎｆｓＢニトロ
還元酵素遺伝子で、染色体の１３分にマップされる。そ
れとは別の大腸菌染色体の１９分にマップされるニトロ
還元酵素遺伝子について、ＫｕｍａｒとＪａｙａｒａｍ
ａｎは報告している。（ＫｕｍａｒＡ．Ｎ．＆Ｊａ
ｙａｒａｍａｎＲ．（１９９１）ジャーナル・オブ・
バイオサイエンス（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．），１６１４
５−１５９．）しかしながら、その一次構造などの詳細
な解析はなされていない。本出願は、この１９分にマッ
プされているニトロ還元酵素遺伝子についての一次構造
の決定と、ｎｆｓＡニトロ還元酵素遺伝子としての同定
を行ったものである。

【０００５】また渡辺らはニトロ還元酵素遺伝子を導入
したサルモネラ菌がニトロアレーンに対し高い感受性を
示す指標菌株として用いることができることを（Ｗａｔ
ａｎａｂｅ，Ｍ．，Ｉｓｈｉｄａｔｅ，Ｍ．Ｊｒ．＆
Ｎｏｈｍｉ，Ｔ．（１９８９）ミュウテーションリサ
ーチ（ＭｕｔａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ），２１
６，２１１−２２０）に示している。すなわち、ニトロ
還元酵素遺伝子は、上述の変異原性あるいは発癌性物質
を検出する感度の向上に有用である。

【０００６】

【本発明が解決しようとする課題】本発明者は、鋭意研
究の結果、大腸菌のニトロ還元活性を有する酵素遺伝子
の一次構造を明らかにすることに成功し、本発明を完成
するに至った。すなわち、本発明の目的は、上述の技術
的事情に鑑み、該一次構造の解明された大腸菌のニトロ
還元活性を有する酵素遺伝子および酵素を提供すること
である。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、次の（１）〜
（２）の構成を有する。

【０００８】（１）配列番号１で表される塩基配列を含
む、ニトロ還元酵素遺伝子。

【０００９】（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列
を有する、ニトロ還元酵素。

【００１０】本発明の構成と効果につき以下に詳述す
る。本発明の酵素遺伝子は、配列番号１で表される配列
の長さ７２３のヌクレオチド鎖を含むのが特徴である。
配列の種類はゲノムＤＮＡであり、大腸菌Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａｃｏｌｉから単離されるものである。そ
の配列の特徴は塩基、塩基番号１から７２０までの２４
０個のアミノ酸からなる分子量２６７９９の蛋白質をコ
ードしている。本発明の酵素遺伝子産物は、ニトロ還元
活性を有し、たとえばニトロフラゾン還元活性を有する
ものである。本発明の酵素は、配列番号１の塩基配列か
ら予測される配列番号２で表されるアミノ酸配列を有す
る蛋白質である。その蛋白質は２４０個のアミノ酸から
なり分子量２６７９９のものであり、大腸菌中でニトロ
還元活性を有する。

【００１１】以下実施例によって本発明を説明する。

【実施例】

実施例１ニトロ還元酵素遺伝子の構造決定ＫｕｍａｒとＪａｙａｒａｍａｎが単離したｐＡＪ１０
２クローン（Ｋｕｍａｒ，Ａ．Ｎ．ａｎｄＪａｙａｒ
ａｍａｎ，Ｒ．（１９９１）ジャーナル・オブ・バイオ
サイエンス（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．），１６１４５−１
５９．）を出発材料として、適当な制限酵素切断部位を
利用して欠失したクローンを作製した。図１に示すよう
に、適当な制限酵素切断部位から、シーケンシングを行
った。それぞれのクローンを大腸菌に形質転換した。得
られた形質転換株を３７℃で一晩培養し、アルカリＳＤ
Ｓ法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．
Ｆ．ａｎｄＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙｍａｎｕａｌ．ｃｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｃｏｌ
ｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒ
ｋ．）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。完全なニ
トロ還元酵素遺伝子の配列をジデオキシ変法（Ｈａｔｔ
ｏｒｉ，Ｍ．＆Ｓａｋａｋｉ，Ｙ．（１９８６）アナ
リティカルバイオケミストリ−（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．）１５２２３２）にて決定し、配列表１に示
す一次構造を明らかにした。その結果、大腸菌のニトロ
還元酵素は、配列表２に示す２４０個のアミノ酸からな
る分子量２６７９９のポリペプチドである。

【００１２】実施例２ニトロ還元酵素の大腸菌による生産ｐＡＪ１０２形質転換株の一晩培養液０．２５ｍｌをア
ンピシリンを含有したＬＢ液体（１０ｍｌ）培地に植菌
し、３７℃で２時間振とう培養後、最終濃度が１ｍＭに
なるようにイソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクト
ピラノシド（ＩＰＴＧと略す）を添加し、さらに３時間
培養した。

【００１３】ＩＰＴＧ誘導処理した培養液１．５ｍｌを
１００００ｒｐｍで遠心分離し上清を除く。菌体を５０
ｍＭリン酸カリウム・１ｍＭジチオスレイトール緩衝液
０．５ｍｌに懸濁し超音波破砕した。１２０００ｒｐ
ｍ、４℃で３０分間遠心分離しその上清を細胞抽出液と
した。その細胞抽出液に対して、酵素活性を測定した。
ニトロ還元酵素活性は（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｍ．，Ｉｓ
ｈｉｄａｔｅ，Ｍ．Ｊｒ．＆Ｎｏｈｍｉ，Ｔ．（１９
８９）ミュウテーションリサーチ（Ｍｕｔａｔｉｏｎ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ），２１６，２１１−２２０）の方
法で行った。蛋白量はバイオラッド製の蛋白分析キット
を用いて色素結合法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．（１
９７６）アナリティカルバイオケミストリ−（Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）７２，２４８−２５４）により
決定した。ｐＡＪ１０２を含有した大腸菌の抽出液にお
いて、ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨを電子供与体として
用いた場合、それぞれ８ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ蛋白あ
るいは６１９ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ蛋白の酵素活性を
有していたのに対して、発現プラスミドを含まない大腸
菌の抽出液の酵素活性は、ＮＡＤＨを用いる場合９ｎｍ
ｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ蛋白、ＮＡＤＰＨを用いる場合、１
２１ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ蛋白であった。このことか
ら本遺伝子にコードされる蛋白は、ＮＡＤＰＨ特異的ニ
トロ還元酵素であり、ｎｆｓＡ遺伝子産物と考えられ
た。

【００１４】

【発明の効果】本発明の酵素遺伝子は、大腸菌のニトロ
還元活性を有する酵素の遺伝子である。適当な宿主、た
とえば大腸菌を宿主とすることにより変異原あるいは発
癌性物質の高感受性株を作出することにこれを使用でき
る。またその遺伝子から大量に該還元酵素蛋白を調製す
ることができる。

【００１５】

【配列表】

【００１６】配列番号：１配列の長さ：７２３配列の型：核酸鎖の数：１トポロジー：直鎖配列の種類：ゲノムＤＮＡ起源生物名：Escherichia coli 株名：ＡＢ１１５７配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ特徴を決定した方法：Ｅ

【００１７】配列 ATG ACG CCA ACC ATT GAA CTT ATT TGT GGC CAT CGC TCC ATT 42 Met Thr Pro Thr Ile Glu Leu Ile Cys Gly His Arg Ser Ile 1 5 10 CGC CAT TTC ACT GAT GAA CCC ATT TCC GAA GCG CAG CGT GAG GCG ATT 90 Arg His Phe Thr Asp Glu Pro Ile Ser Glu Ala Gln Arg Glu Ala Ile 15 20 25 30 ATT AAC AGC GCC CGT GCG ACG TCC AGT TCC AGT TTT TTG CAG TGC AGT 138 Ile Asn Ser Ala Arg Ala Thr Ser Ser Ser Ser Phe Leu Gln Cys Ser 35 40 45 AGC ATT ATT CGC ATT ACC GAC AAA GCG TTA CGT GAA GAA CTG GTG ACG 186 Ser Ile Ile Arg Ile Thr Asp Lys Ala Leu Arg Glu Glu Leu Val Thr 50 55 60 CTG ACC GGC GGG CAA AAA CAC GTA GCG CAA GCG GCG GAG TTC TGG GTG 234 Leu Thr Gly Gly Gln Lys His Val Ala Gln Ala Ala Glu Phe Trp Val 65 70 75 TTC TGT GCC GAC TTT AAC CGC CAT TTA CAG ATC TGT CCG GAT GCT CAG 282 Phe Cys Ala Asp Phe Asn Arg His Leu Gln Ile Cys Pro Asp Ala Gln 80 85 90 CTC GGC CTG GCG GAA CAA CTG TTG CTC GGT GTC GTT GAT ACG GCA ATG 330 Leu Gly Leu Ala Glu Gln Leu Leu Leu Gly Val Val Asp Thr Ala Met 95 100 105 110 ATG GCG CAG AAT GCA TTA ATC GCA GCG GAA TCG CTG GGA TTG GGC GGG 378 Met Ala Gln Asn Ala Leu Ile Ala Ala Glu Ser Leu Gly Leu Gly Gly 115 120 125 GTA TAT ATC GGC GGC CTG CGC AAT AAT ATT GAA GCG GTG ACG AAA CTG 426 Val Tyr Ile Gly Gly Leu Arg Asn Asn Ile Glu Ala Val Thr Lys Leu 130 135 140 CTT AAA TTA CCG CAG CAT GTT CTG CCG CTG TTT GGG CTG TGC CTT GGC 474 Leu Lys Leu Pro Gln His Val Leu Pro Leu Phe Gly Leu Cys Leu Gly 145 150 155 TGG CCT GCG GAT AAT CCG GAT CTT AAG CCG CGT TTA CCG GCC TCC ATT 522 Trp Pro Ala Asp Asn Pro Asp Leu Lys Pro Arg Leu Pro Ala Ser Ile 160 165 170 TTG GTG CAT GAA AAC AGC TAT CAA CCG CTG GAT AAA GGC GCA CTG GCG 570 Leu Val His Glu Asn Ser Tyr Gln Pro Leu Asp Lys Gly Ala Leu Ala 175 180 185 190 CAG TAT GAC GAG CAA CTG GCG GAA TAT TAC CTC ACC CGT GGC AGC AAT 618 Gln Tyr Asp Glu Gln Leu Ala Glu Tyr Tyr Leu Thr Arg Gly Ser Asn 195 200 205 AAT CGC CGG GAT ACC TGG AGC GAT CAT ATC CGC CGA ACA ATC ATT AAA 666 Asn Arg Arg Asp Thr Trp Ser Asp His Ile Arg Arg Thr Ile Ile Lys 210 215 220 GAA AGC CGC CCA TTT ATT CTG GAT TAT TTG CAC AAA CAG GGT TGG GCG 714 Glu Ser Arg Pro Phe Ile Leu Asp Tyr Leu His Lys Gln Gly Trp Ala 225 230 235 ACG CGC TAA 723 Thr Arg *** 240

【００１８】配列番号：２配列の長さ：２４０配列の型：アミノ酸配列の種類：蛋白質

【００１９】配列 Met Thr Pro Thr Ile Glu Leu Ile Cys Gly His Arg Ser Ile 1 5 10 Arg His Phe Thr Asp Glu Pro Ile Ser Glu Ala Gln Arg Glu Ala Ile 15 20 25 30 Ile Asn Ser Ala Arg Ala Thr Ser Ser Ser Ser Phe Leu Gln Cys Ser 35 40 45 Ser Ile Ile Arg Ile Thr Asp Lys Ala Leu Arg Glu Glu Leu Val Thr 50 55 60 Leu Thr Gly Gly Gln Lys His Val Ala Gln Ala Ala Glu Phe Trp Val 65 70 75 Phe Cys Ala Asp Phe Asn Arg His Leu Gln Ile Cys Pro Asp Ala Gln 80 85 90 Leu Gly Leu Ala Glu Gln Leu Leu Leu Gly Val Val Asp Thr Ala Met 95 100 105 110 Met Ala Gln Asn Ala Leu Ile Ala Ala Glu Ser Leu Gly Leu Gly Gly 115 120 125 Val Tyr Ile Gly Gly Leu Arg Asn Asn Ile Glu Ala Val Thr Lys Leu 130 135 140 Leu Lys Leu Pro Gln His Val Leu Pro Leu Phe Gly Leu Cys Leu Gly 145 150 155 Trp Pro Ala Asp Asn Pro Asp Leu Lys Pro Arg Leu Pro Ala Ser Ile 160 165 170 Leu Val His Glu Asn Ser Tyr Gln Pro Leu Asp Lys Gly Ala Leu Ala 175 180 185 190 Gln Tyr Asp Glu Gln Leu Ala Glu Tyr Tyr Leu Thr Arg Gly Ser Asn 195 200 205 Asn Arg Arg Asp Thr Trp Ser Asp His Ile Arg Arg Thr Ile Ile Lys 210 215 220 Glu Ser Arg Pro Phe Ile Leu Asp Tyr Leu His Lys Gln Gly Trp Ala 225 230 235 Thr Arg 240

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の酵素遺伝子の制限酵素地図およびシー
クエンスストラテジーを示す。矢印は塩基配列を決定し
た方向を示す。ボックスで示したところが酵素遺伝子に
相当する部分である。

【符号の説明】

ｐＡＪ１０２：発現プラスミドＮａｅＩ：制限酵素ＰｖｕII：制限酵素ＢａｌＩ：制限酵素ＢｇｌII：制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉ：制限酵素ＳｍａＩ：制限酵素

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１で表される塩基配列を含む、
ニトロ還元酵素遺伝子。【配列表１】
【請求項２】配列番号２で表されるアミノ酸配列を有
する、ニトロ還元酵素。【配列表２】