KR950010819B1

KR950010819B1 - 클로닝된 n-메틸하이단토이나제

Info

Publication number: KR950010819B1
Application number: KR1019910011455A
Authority: KR
Inventors: 슈마커 권테르; 부쳐 헬무트; 묄러링 한스
Original assignee: 뵈링거 만하임 게엠베하; 다움·콜프
Priority date: 1990-07-06
Filing date: 1991-07-06
Publication date: 1995-09-23
Also published as: EP0464832A3; JP2546554B2; CA2045839A1; JP2984906B2; EP0464832A2; AU7949991A; US5432070A; CA2045839C; JPH04229181A; DE59109072D1; ES2124694T3; JPH07313196A; US5213969A; ATE173762T1; EP0464832B1; AU628265B2; DE4021571A1; KR920002786A; ZA915211B

Abstract

내용 없음.

Description

클로닝된 N-메틸하이단토이나제

제 1 도는 길이가 약 0.6kb인 NMHase 유전자 단편을 갖고 있는, 아트로박터로부터 얻은 6kb 길이의 EcoR I 단편을 표시한다.

제 2 도는 NMHase 유전자를 암호화한 3.0kb 길이의 영역을 갖고 있는, 아트로박터로부터 얻은 3.7kb 길이의 Sal I 단편을 표시한다.

제 3 도는 NMHase 유전자의 3'-말단 부분을 표시한다.

제 4 도는 EcoR I /AatII 링커(linker)를 표시한다.

제 5 도는 플라즈미드 pBP008의 구성을 표시한다.

제 6 도는 플라즈미드 pBP009의 구성을 표시한다.

제 7 도는 NMHase 발현 플라즈미드 pBP010의 구성을 표시한다.

제 8 도는 살모넬라 티피무륨으로부터 얻은 mgl 프로모터를 갖고 있는 플라즈미드 pBP011의 구성을 표시한다.

제 9 도는 pBP010으로부터 NMHase 유전자 단편의 분리를 표시한다.

제10도는 NMHase 발현 플라즈미드 pBP006의 구성을 표시한다.

본 발명은 클로닝(cloning)된 N-메틸하이단토이나제(NMHase)에 관한 것이다. 액체내 크레아티닌의 함량을 정량하는데 효소인 N-메틸하이단토이나제가 필요하다. 크로아티닌 농도는 신장 진단에 있어 중요한 파라미터이다. 해마다 약 10억개의 테스트가 세계적으로 행해진다. 그러므로 저렴한 비용으로 NMHase를 제공하는 것과 문제점없이 발효을 행할수 있는 것이 크레아티닌 정량을 위한 진단 키트를 제공하는데 있어 기본적인 요건이다. NMHase의 분자량은 SDS 젤에서 125kD이다. 특히 활성은 2U/mg이고 N-메틸하이단토인에 대한 K_M은 2×10^-5mol/l이다. NMHase은 보통 아트로박터(Arthrobacter)로부터 분리된다. 그러나, 상기 방법은 사용한 미생물과 관련된 단점이 있다.

그러므로 다량이 NMHase를 얻기 위해 개선된 분리방법을 개발해야 한다. 이것이 또한 본 발명의 목적이다.

아트로박터로부터 분리한 NMHase를 암호화한 유전자를 클로닝하고 이것을 적당한 숙주 생물내에서 발현시키므로써 본 발명의 목적이 성취될 수 있다.

그러므로 본 발명은 (1) 서열번호 1에 표시된 핵산 서열 (2) 유전암호의 동의성(degeneracy) 범위내에서 이것에 상응하는 서열 또는 (3) 엄격한 잡종형성 조건(stringent hybridization conditions) 하에서 (1) 및 또는 (2)의 서열과 잡종형성을 하는 서열을 함유하며, NMHase 활성을 지닌 단백질을 암호화하는 DNA를 제공한다.

이것과 관련하여 본 발명의 엄격한 조건(stringent conditions) 하에서의 잡종형성에 대한 참고사항이 Maniatis외의 "Molecolar Cloning, A laboratory Manual", (1982), Cold Spring Harbor Laboratory, New York에 기재되어 있다.

본 발명에 따른 DNA는 서열 번호 2에 표시된 1288개의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화한다. 그러므로 본 발명은 또한 NMHase 활성을 지니며 서열 번호 2에 표시된 아미노산 서열이나 이것으로부터 유도된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함하는데, 이것은 유전자 공학 방법, 예를들어 이종의 미생물, 즉 본 발명의 단백질을 암호화한 유전자가 원래 존재하지 않는 미생물내에서 발현시키므로써 얻어진다. 다른 한편, 본 발명의 DNA가 존재하는 미생물내에 본 발명에 따른 DNA의 하나 또는 몇개의 카피(copy)를 도입시키므로써 NMHase 유전자의 발현을 개선시킬 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 DNA의 하나 또는 몇개의 카피를 함유한 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명에 따른 재조합 벡터는 원핵 생물이나 진핵 생물내의 단백질 발현에 적당한 벡터일 수 있다. 이것은 바람직하게 원핵생물용 벡터이다.

본 발명에 따른 재조합 벡터는 숙주 세포내에서 염색체외로 존재하는 벡터(예를들어 플라즈미드)이거나 숙주(예를들어 박테리오파지 람다)의 게놈(genome)에 통합된 벡터일 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게 플라즈미드이다. 본 발명에 따라 적당한 플라즈미드는 플라즈미드 pBP010이다.

NMHase 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA는 본 발명에 따른 재조합 벡터상에 위치하며 바람직하게 조절가능한 프로모터(promoter)의 조절하에 있는데, 이것은 본 발명의 DNA 발현이 예를들어 억제제에 의해 억제될 수 있으며 단지 조절가능한 프로모터가 특이적으로 유도될때 일어남을 의미한다. 상기 유도는 예를들어 온도를 변화시키거나 화학적 인듀서(inducer)(예를들어, lac 프로모터 유도체에 대한 IPTG)를 부가하므로써 일어날 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에서 유전자를 조절하는 조절가능한 프로모터는 살모넬라 티피무륨(salmonella typhimurium)(WO 88/09373)으로부터 얻은 mgl 프로모터인데, 이것은 글루코스 및 프럭토스같은 당류에 의한 이화대사산물 억제로 조절될 수 있다.

그람음성(gram-negative) 균, 특히 E.coli 내에서 NMHase를 발현시키는데 적당한 본 발명의 벡터는 예를들어 플라즈미드 pBP006이다. pBP006을 구성하기 위해, 살모넬라 티피무륨에서 얻은 mgl프로모터의 서열을 함유한 DNA 단편을 플라즈미드 pPZ07-mgl-lac(WO 88/09373에 기재되어 있음, 제 8 도)으로부터 분리하고 그것의 프로모터없이 아트로박터로부터 NMHase 유전자를 암호화한 서열을 함유한 DNA 단편을 위쪽으로 클로닝시켰다.

본 발명은 또한 본 발명의 DNA 또는 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다. 상기 세포는 바람직하게 박테리아 세포이며, 특히 바람직하기로는 E.coli 세포이다.

NMHase 유전자를 클로닝하여 본 발명의 DNA를 얻는다. 이러한 것을 위해 아트로박터로부터의 염색체 DNA를 통상적인 방법으로 분리하여 적당한 제한 효소로 절단하였다. 이들 DNA 단편의 유전자 뱅크(bank)을 E.coli에서 만들었다. 그러나, 일반적인 방법(유전자 뱅크를 올리고누클레오타이드 프로브(probe)로 스크리닝(screening)하고 NMHase 활성으로 클론을 선별함)으로 NMHase 유전자를 클로닝시키지 못했다. 실제로, E.coli에 클로닝시켰을때 사용한 흑종의 아트로박터 DNA 단편에서 NMHase 활성이 발견되지 않았다. 이러한 사실은 출발 코돈(codon) 및 정지 코돈과 함께 정확한 길이의 DNA 단편이 올리고누클레오타이드 프로브와의 잡종 형성에 기초해 동정(identifying)될 수 있으므로 놀라왔다. NMHase 활성은 단지 원래의 NMHase 프로모터가 없는 DNA 단편을 클로닝할때만 검출될 수 있다.

본 발명은 또한, NMHase 활성을 갖는 단백질의 제조방법을 제공하는데, 여기서 세포를 본 발명의 DNA나 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환시키고, 이 형질전환된 세포를 적당한 배지에서 배양하며, 이러한 배지 또는 세로포로부터 단백질을 분리한다.

E.coli가 숙주 생물로서 본 발명의 방법에 바람직하게 사용된다. 그러나 이것과 관련하여 최적 조건에 못미치는 배양 조건하에서 형질전환된 세포를 배양하는 것이 유리하다. 최적 조건에 못미치는 배양 조건 이라 함은 예를들어 인큐베이션하는 동안의 감소된 온도(30℃ 이하), 산소 공급의 감소 및/또는 최소 배지(즉, 배양된 미생물에 대한 흑종의 필수 영양물을 제한 농도로 함유한 배지)을 사용하는 것이다.

그러므로 예를들어, tac 프로모터 조절하의 NMHase 유전자를 함유한 재조합 벡터를 사용하여 E.coli로부터 NMHase을 분리하는 방법에 있어서 배양 조건은 최소 배지, 30℃ 미만의 인큐베이션 온도 및 0.3% 락토스를 이용한 tac 프로모터의 불완전 유도이다.

살모넬라 티피무륨의 mgl 프로모터 조절하의 NMHase 유전자는 30℃ 이하의 인큐베이션 온도에서 특히 바람직하게 발현되는데, 필요하다면 산소 공급을 부가적으로 감소시켜 형성된 NMHase가 침전체 같은 불활성 형태로 축적되지 않도록 한다. mgl 프로모터는 이화대사산물 억제로 조절된다(US 특허 출원 제 300,357호).

일반적으로 각 경우에 사용된 조절가능한 프로모터가 단지 불완전하게 유도되어 이것이 또한 침전체의 형성을 감소시키게 하는 것이 본 발명의 방법에 바람직하다.

또한, 안정화시키려는 목적으로, 형질전환된 세포나 배지로부터 NMHase를 분리하는 동안 단백질을 효소 기질인 N-메틸하이단토인과 함께 인큐베이팅하는 것이 본 발명의 방법에 특히 바람직하다. 놀랍게도 본 발명의 방법으로 얻은 재조합 NMHase의 안정성이 효소 1단위(U) 당 약 3.8nmol/l의 N-메틸하이단토인을 사용하므로써 상당히 증가할 수 있다. 이것에 대해, 효소는 1-100mmol/l, 특히 바람직하게 10-70mmol/l, 가장 바람직하게 50mmol/l 농도의 N-메틸하이단토인 용액과 함께 인큐베이팅된다. 이러한 인큐베이션 단계에서 온도를 예를들어 55℃까지 증가시키는 것이 유리하다. 효소 자체의 기질이 존재하므로써 효소가 안정화되고 동시에 재조합 효소의 효소반응이 저해되지 않는 것이 특히 놀랍다.

본 발명은 또한 일반적인 성분들외에 본 발명의 방법으로 얻은 단백질을 함유하는, 액체내 크레아티닌 함량을 정량하기 위한 시약을 포함한다.

다음 실시예는 다음 서열 또는 프로토콜과 함께 본 발명을 더 설명한다. 서열은 1은 NMHase 유전자의 DNA 서열을 표시하며, 서열번호 2는 이것으로부터 유도된 NMHase의 아미노산 서열을 표시한다.

[실시예 1]

NMHase의 클로닝

일반적인 방법에 따라 DNA를 아트로박터종 DSM 2563으로부터 분리하고(J.Marnur-미생물로부터 DNA를 분리하는 방법, J. Mol. Biol. 3, 208-218(1961) ; S. Visuvanathan의의-여러가지 박테리아로부터 DNA를 분리하는 간단한 효소적 방법, Journal of Microbiological Methods 10, 59-64(1989), 제한 효소 EcoR I 또는 HindIII로 절단하였다. 박테리오파지 λgt10(Boehringer Mannhein GmbH)를 아트로박터 DNA에 대한 클로닝 벡터로서 사용했다. 이러한 아트로박터 DNA를 제조자의 지시사항에 따라 λgt10에 클로닝시켰다.

얻은 아트로박터 유전자 뱅크를 NMHase의 부분 펩타이드 서열로부터 유도된 올리고누클레오타이드 프로브로 스크리닝하였다.

NMHase의 부분 펩타이드 서열은 다음과 같다.

Met Lys Arg Ile Gly Val Asp Val Gly Gly Thr Phe Thr Asp Leu Tyr Phe.

상기 부분 펩타이드 서열로부터 다음 올리고누클레오타이드 프로브를 유도하였다.

1. ATG AA(G/A) (C/A)G(G/A) AT(A/C/T) GG(G/A/T/C) GT

2. ATG AA(G/A) (C/A)G(T/C) AT(A/C/T) GG(G/A/T/C) GT

3. ATG AAG CGC ATC GGC GTG GAC GTG GGC GGC ACG TTC ACC GAT CTG TAC TT

이들 올리고누클레오타이드 프로브를 사용해, NMHase 유전자의 일부(약 0.6kb)을 함유한 6kb 길이의 EcoR I 단편을 λgt10에서 발견하였다(제 1 도).

상기 단편의 일부(절단 부위 Pst I 과 EcoR I 사이의 약 300bp)를 32p로 방사성 라벨링했다. 연속해서 아트로박터 DNA를 제한 효소 Sal I 로 절단하고 아가로스 젤상에서 분리하며 써던 블롯(Southern Blot)으로 방사성 동위원소로 라벨링된 DNA 단편과 잡종 형성시켰다. 잡종형성을 DNA 부분을 아가로스 젤에서 절단하여 pBR323(Boehringer Mannheim GmbH)의 테트라시클린 내성 유전자의 Sal I 제한 절단 부위에 클로닝시켰다.

상기 플라즈미드로 형질전환된 E.coli 세포를 검사했더니 길이가 약 3.0kb인 NMHase유전자의 영역을 함유한 3.7kb 길이의 DNA 단편이 관찰되었다(제 2 도).

점선으로 표시된 상기 삽입에 의한 EcoR I/HindIII 단편을 디곡시게닌(Boehringer Mannheim, Dig Kit)으로 라벨링하였다. 상기 λgt10 유전자 뱅크를 상기 프로브로 다시 스크리닝하여 NMHase 유전자의 3'-말단 부분을 함유한 2.7kb 조각을 발견하였다(제 1 도). 이 DNA 단편을 벡터 pBR328에 또 클로닝시켰다.

[실시예 2]

NMHase의 발현

2.1 통상적인 방법

3.7kb 길이의 Sal I 단편(제 2 도)을 시판되고 있는 벡터 pUC19(Boehringer Mannheim GmbH)에 클로닝시켰다. 연속해서 제 3 도의 EcoR I 단편에 클로닝시켜 NMHase 유전자를 완성시켰다. 그러나, 이러한 구조는 활성 NMHase을 발현시키지 않았다.

유도가능한 tac 프로모터의 조절하에서 클로닝하고 일반적인 방법(37℃, 완전 배지에서의 인큐베이션 및 tac 프로모터의 완전한 유도)으로 tac 프로모터를 유도시켜 상기 구조를 발현시키려 했으나 실패하였다. 이것을 위해 플라즈미드 pKK 177-3(DSM 3062)을 EcoR I 및 HindIII로 절단하고 EcoR I 와 HindIII에 의해 pUC19에서 절단된 폴리링커와 리게이팅(ligating)시켰다. 형성된 플라즈미드를 pBP 177-4로 표시했다. 연속해서 플라즈미드 pBP177-4를 EcoR I 및 Kpn I 로 절단하고 2.5kb의 C-말단 NMHase 단편(또한, EcoR I 및 Kpn I 로 절단됨)과 결합시켜 플라즈미드 pBP008를 만들었다(제 5 도).

플라즈미드 pBP008을 Xho I 및 EcoR I 로 절단하고 결과하는 큰(5kb) 단편을 말단의 절단 부위 AatII 및 Xho I 를 갖는 NMHase N-말단의 1.5kb 단편 및 EcoR I-AatII 링커와 결합시켜(제 4 도 참조) 플라즈미드 pBP009를 만들었다(제 6 도). 분자량이 대략 NMHase 분자량에 해당하는 단백질을 상기 플라즈미드로 형질전환된 E.coli 세포에 발현시켰다. 그러나, 효소 활성을 검출할 수 없었다.

2.2 본 발명의 방법

우선 NMHase의 C-말단을 증대시켰다. 플라즈미드 pBP009(제 6 도)를 Xho I 및 Sam I 로 절단하고 tac 프로모터, NMHase의 N-말단 부분 및 암피실린 내성의 유전자를 함유한 결과하는 5.5kb의 DNA 단편을 분리하였다. 이 단편을 말단 절단부위 EcoR I (Klenow 폴리머라제로 처리함에 의한 블런트 말단) 및 Xho I 를 갖는 pBR328의 C-말단 NMHase 단편과 결합시켜 플라즈미드 pBP010(제 7 도)을 만들었는데, 이 pBP010은 NMHase를 발현시킬 수 있다.

다음 단계에서 NMHase 유전자를 살모넬라 티피무륨으로부터의 mgl 프로모터(WO 88/09373에 기재되어 있음) 조절하에 있게 하였다. 이것에 대해 플라즈미드 pPZ07/mallac(WO 88/09373에 기재되어 있음)을 Nco I 및 AtaII로 절단하고, 이것으로부터 mgl 프로모터를 함유한 2.9kb 길이의 DNA 단편을 분리하였다. 이 단편을 Nco I-AatII 링커와 결합시켜 플라즈미드 pBP011(제 8 도)를 만들었다.

플라즈미드 pBP011을 EcoR I 로 절단하고 이것을 Klenow DNA 폴리머라제로 처리하여 블런트 말단을 얻고 AatII로 다시 절단하였다. 연속해서 mgl 프로모터와 링커 단편을 함유하며 블런트 말단과 AatII 말단을 갖는 0.8kb 길이의 DNA 단편을 분리하였다(제 8 도).

플라즈미드 pBP010을 Nde I 로 절단하고 Klenow DNA 폴리머라제로 처리하여 말단의 블런트 단편을 얻었다. 연속해서 이들 단편을 Xho I 로 절단하고 NMHase 유전자의 C-말단 부분을 함유한 4.9kb 길이의 단편을 분리하였다(제 9 도).

플라즈미드 pBP010을 또한 Xho I 및 AatII 로 절단하며 이러한 과정에서 NMHase 유전자의 N-말단 부분을 함유한 1.5kb 길이의 단편을 분리할 수 있다.

플라즈미드 pBP010으로부터 얻은 두개의 단편(4.9kb 및 1.5kb)을 mgl 프로모터를 함유한 pBP011로부터의 0.8kb 단편과 리게이팅시켰다. 결과의 플라즈미드를 pBP006(제10도)으로 표시했으며 이것은 NMHase를 발현시킬 수 있다.

[실시예 3]

E.coli내 재조합 NMHase의 발효 및 축적

E.coli HB101 세포(DSM 1607)를 NMHase 발현 플라즈미드 pBP010으로 형질전환시켰다. tac 프로모터의 조절성을 더 양호하게 만들기 위해 상기 세포를 pBP010와 함께 사용하기에 적합하며 lac I^q유전자를 함유한 플라즈미드로 더 형질전환시켰다. lac I^q유전자는 당업자에게 이미 공지되어 있는 것이어서 용이하게 입수할 수 있다. pACYC 177(DSM 3693P) 또는 이것으로부터 유도된 플라즈미드가 pBP010와 함께 사용하기에 적합한 플라즈미드로서 고려된다.

3.1 증식 및 전배양(preculture)

두개의 2000ml들이 얼렌미어(Erlenmeyer) 플래스크에 들어있는 카나마이신 및 암피실린을 함유한 2×500ml LB 배지에다 E.coli HB101/lac I^q/pBP010 세포를 접종하였다. 다음에 이것을 37℃ 및 150rpm(회전 세이커, Braun Certomat M)에서 인큐베이팅시켰다. 578nm에서의 OD는 약 7.6의 pH에서 10시간내에 약 3.0-4.0이었다.

주된 발효 :

영양 배지 및 주된 배양 ;

86% 글리세롤 2500g

락토스 500g

NH₄Cl 50g

MgSO₄*7H₂O 50g

K₂HPO₄150g

카제인 펩톤 3000g

25% 암모니아 용액 Merk 5432 500g

물 100g

발효 과정 :

접종(1% 접종물) 후 배양물을 지체함 없이 대수적으로 증식하기 시작한다. 발효조의 온도를 578nm에서의 OD가 1.400이 될때까지 28℃로 유지시킨다. 원하는 OD에 이르렀을때 온도를 25℃로 감소시키므로써 증식 속도를 느끼게 한다. 또한, 산소의 공급을 감소시킬 수 있다. 이러한 것들은 증식을 제한하여 침전체의(봉입체 : inclusion body) 형성을 방해하기 위해 필요하다. 온도를 변화시키는 정확한 시간이 중요한데, 이것을 너무 빠르게 행하면 증식이 여러 시간동안 늦추어지고, 너무 늦게 행하면 단지 불용성 단백질만을 얻게된다.

부가적으로 산소를 감소시키므로써 활성을 더 증가시키게 된다. 온도를 변화시키면서 행한 발효에서, 수율은 약 2500U/L이며 30 시간 후 최대 3000U/L 이다. 배지내의 O₂양을 감소시켰을때 45시간 후에 4000U/L 까지의 수율을 얻는다.

[실시예 4]

E.coli로부터 재조합 NMHase의 분리

4.1 효소 활성의 측정

인산염 완충액(pH 7.8)내의 카바모일-사코신 하이드롤라제, 사코신 옥시다제, 퍼옥시다제, N-메틸하이단토인, 4-아미노안티피린, 트리브로모-3-하이드록시벤조산, ATP 및 MgCl₂를 포함하는 비색정량 테스트로 효소 활성을 측정하였다.

[측정 원리]

NMHase의 부가한 N-메틸하이단토인을 카바모일-사코신으로 전환시키고, 카바모일-사코신 하이드롤라제는 이것을 사코신으로 전환시키며, 사코신 옥시다제가 상기 사코신을 분해시켜 글리신, 포름알데하이드 및 과산화수소를 얻는다. 퍼옥시다제는 형성된 과산화수소의 도움으로 부가된 컬러 기질을 진보라색으로 변화시킨다. 546nm에서 흡광도의 증가정도를 측정한다. 이러한 효소 테스트에 대해 US 특허 제 4,816,393호에 상세히 기재되어있다.

단위(U)는 카바모일-사코신 하이드롤라제, 사코신 옥시다제 및 퍼옥시다제를 함께 사용하는 테스트의 측정 조건하 25℃에서 1분당 형성된 카바모일-사코신의 μmol로서 정의된다. 5ml의 테스트 배양물에서 0.16U/ml의 활성을 얻었다. 이것은 원래의 배양물(아트로박터종 DSM 2563)과 비교하여 약 20 펙터(factor) 증가한 것이다.

4.2 효소 정제

NMHase의 총 활성이 16KU인 101의 발효 배양물로부터 얻은 315g의 생물량(실시예 3에 따른)을 10% 글리세롤을 함유한 2ℓ의 0.1mol/l 인산칼륨 완충액(pH 8.0)에 현탁시키고 라이소자임(lysoyme)으로의 처리 및 700bar의 고압 분산 처리로 용균시켰다. 핵산과 셀 파편을 제거하기 위해, 10% 폴리에틸렌이민 용액 G20(Luvalgan, 분자량 20000)을 침전이 더 이상 일어나지 않고 모든 NMHase 활성이 상등액에 남아있을때까지 부가하였다. 이것을 위해 3%v/v 용액을 상온에서 부가하고 30분간 교반한 후 원심 분리하였다. 배취(batch)내 젖은 상태로 압축된 8%v/v DEAE 세파덱스를 NMHase 상등액에 부가하고 2시간 동안 교반한 후에 95%의 효소가 흡착되었다. 여과 후 상기 교환기를 인산염 완충액으로 세척하고 NMHase를 0.1mol/l K-PO₄완충액(pH 8.0)을 함유한 0.5mol/l 황산암모늄 용액으로 용리시켰다. 용리액의 특이 활성은 단백질 mg당 1.1U 였다. 연속해서 이것을 50mmol/l N-메틸하이단토인(최종 농도)의 존재하에서 10분간 55℃까지 가열하였는데 이렇게 하는 동안 방해가 되는 이종 단백질이 침전하였다. 원심분리한 후에 맑은 상등액을 황산암모늄으로 2.2mol/l까지 더 포화시키고 이렇게하여 침전된 NMHase를 원심분리해냈다. 이것을 두번 결정화시켰는데, 첫번째 결정화를 약 60mg/ml의 단백질 농도, 0.1mol/l K-PO₄완충액(pH 8.0), 1.27mol/l 황산암모늄으로 실행하였다. 단시간 후에 프리즘이 나타났으며 24시간 후에 결정화가 완결되었고 단지 5% NMHase가 상기 원심분리한 상등액에 남았다. NMHase 결정을 0.1mol/l K-PO₄완충액에 용해시키고 용해되지 않은 성분들을 제거한 후 이 효소 용액을 두번째 결정화시켰다(1.05mol/l 황산암모늄). 밤새 형성된 효소 결정을 수집하여 완충액에 재현탁시키고 20mmol/l 인산염 완충액에 대해 투석시키며 2부(단백질 양에 대해)의 라피노스를 부가하고 동결건조시켰다. 2.15U/단백질 mg의 특이 활성과 함께 5.8KU NMHase 활성(처음 활성의 34% 임)을 얻었다.

각각의 정제 단계 후에 실시예 4.1에 따라 효소 활성을 테스트하였다.

카탈라제, 크레아티나제, 크레아티니나제 및 카바모일-사코신하이드롤라제 활성을 측정할 수 없었다. 0.002%의 최소 옥시다제 활성(글루코스 옥시다제, 피루베이트 옥시다제, 락테이트 옥시다제, 우리카제 및 콜레스테롤 옥시다제의 총합)이 나타났다.

최적 pH, pH 안정성, 온도, 열 안정성, K_M, ATP 및 마그네슘 의존성, 암모늄 의존성 및 분자량과 관계된 재조합 NMHase의 특성은 아트로박터로부터 얻은 NMHase의 특성에 상응하였다.

[실시예 5]

NMHase 유전자의 시퀀싱(sequencing)

NMHase을 암호화한 유전자의 단편을 클로닝 벡터 M13에 서브클로닝시키고 표준 방법에 따라 시퀀싱시켰다. 이 핵산 서열을 서열번호 1 에 표시하였다. 이것으로써 서열번호 2 에 표시되어 있는 1288개의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 결과되었다.

Claims

(1) 서열번호 1에 표시된 핵산 서열. (2) 유전암호의 동의성(degeneracy) 범위내에서 이것에 상응하는 서열 또는 (3) 엄격한 조건(stringent conditions) 하에서 (1) 및 또는 (2)의 서열과 잡종형성을 하는 서열을 가지며 N-메틸하이단토이나제 활성을 지닌 단백질을 암호화하는 DNA.
제 1 항에 정의된 DNA의 1개 이상의 카피를 함유한 재조합 벡터.
제 2 항에 있어서, 플라즈미드인 재조합 벡터.
플라즈미드 pBP010.
제 2 항 또는 제 3 항중 어느 한 항에 있어서, 제 1 항의 DNA가 조절가능한 프로머터의 조절하에 있는 재조합 벡터.
제 5 항에 있어서, 조절가능한 프로모터가 살모넬라 티피무륨으로부터 얻은 mgl 프로모터인 재조합 벡터.
플라즈미드 pBP006.
제 1 항의 DNA로 형질전환된 E.coli 세포.
제 1 항의 DNA로 형질전환된 세포를 적당한 배지에서 배양하고 상기 배지나 세포로부터 NMHase 활성을 지닌 단백질을 분리하는 것으로 구성된, NMHase 활성을 지닌 단백질의 제조방법.
제 9 항에 있어서, E.coli가 상기 세포로서 사용되는 방법.
제 9 항에 있어서, NMHase 활성을 지닌 단백질을 암호화한 유전자가 조절가능한 프로모터의 조절하에 있는 DNA 또는 벡터가 형질전환에 사용되는 방법.
제 9 항에 있어서, 형질전환된 세포가 최적 배양 조건에 못미치는 조건하에 배양되는 방법.
제12항에 있어서, 상기 세포가 최소 배지내에서 배양되는 방법.
제12항에 있어서, 상기 세포가 30℃인 최대 인큐베이션 온도에서 인큐베이팅되는 방법.
제12항에 있어서, 배지내로의 산소공급을 감소시킨 방법.
제 9 항에 있어서, 조절가능한 프로모터가 단지 불완전하게 유도되는 방법.
제 9 항에 있어서, NMHase 1단위 (u) 당 약 3.8nmol의 N-메틸하이단토인이 안정화를 위해 NMHase에 부가되는 방법.
제17항에 있어서, NMHase가 상승된 온도에서 N-메틸하이단토인 용액과 함께 인큐베이팅되는 방법.
제 9 항 내지 제18항중 어느 한 항의 방법에 따라 얻은, NMHase 활성을 갖는 단백질.