CN114657111A - 顺式环氧琥珀酸水解酶细胞表面展示体系及构建和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了顺式环氧琥珀酸水解酶细胞表面展示体系。所述的展示体系为细胞表面展示顺式环氧琥珀酸水解酶的重组大肠杆菌；所述重组大肠杆菌中导入了锚定蛋白细菌冰晶核蛋白N端区域（InpN）基因与顺式环氧琥珀酸水解酶CESH基因。本发明还提供了前述展示体系的构建及其在生产L型酒石酸的应用。本发明所述的重组大肠杆菌，不但酶活高、可重复使用，而且稳定性好，可在一定温度下稳定存放，应用前景广阔。此外，采用本发明所述的顺式环氧琥珀酸水解酶细胞表面展示体系生产L型酒石酸，不但克服解决了天然产CESH细菌或重组大肠杆菌的胞内CESH通透性较低的问题，也不存在纯化的重组酶稳定性不足且制备成本高的问题，具有重要的产业化应用价值。

Description

顺式环氧琥珀酸水解酶细胞表面展示体系及构建和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及通过细胞表面展示提高顺式环氧琥珀酸水解酶催化生产酒石酸效率的技术，具体涉及通过锚定蛋白表面展示顺式环氧琥珀酸水解酶的重组大肠杆菌其构建方法与应用。

背景技术

L型酒石酸是重要的手性拆分剂及化工原料，也是重要的食品添加剂、医药拆分剂、印染防染剂、照相显影剂和金属离子屏蔽剂等。目前，微生物转化法是目前工业化生产高手性纯度L型酒石酸的主要方法，即以价格低廉的顺式环氧琥珀酸为原料，在顺式环氧琥珀酸水解酶(CESH)或具备该酶的生物细胞催化下，使原料水解为L型酒石酸。最常用的顺式环氧琥珀酸水解酶(CESH)是来自诺卡氏菌或红球菌的CESH，具体应用方式通常包括三种：(1)使用可在胞内产生CESH的天然菌株作为全菌催化剂，如酒石酸诺卡氏菌(Nocardiatartaricans)、遮光红球菌(Rhodococcus opacus)等。但由于CESH是胞内酶，采用全菌催化剂时，其催化效率受到细菌细胞膜通透性(即底物和产物穿过细胞膜的能力)的影响，故而催化效率并不理想。(2)使用胞内表达CESH的重组大肠杆菌作为全菌催化剂。重组大肠杆菌可以产生更多的酶，并可表达CESH的改良突变体。但和使用天然菌株一样，胞内表达的酶存在细胞膜通透性的问题，不能高效、最大化利用其产生的酶。(3)使用纯化的重组酶。采用重组酶不存在细胞膜通透性的问题，但离体纯化的酶极易失活，稳定性不佳，且制备成本较高，也在一定程度上限制了其在工业生产中的应用。

为解决前述问题，有文献报道了多种方法来增强天然产CESH细菌或重组大肠杆菌的细胞膜通透性，以改善转化效率。如发明专利申请201410379113.7公开了“一种通过改善细胞通透性生产L(+)-酒石酸的方法”，该方法通过采用表面活性剂作为通透剂对细胞进行通透性处理，增加细胞的通透性，缩短转化时间，增加顺式环氧琥珀酸水解酶的利用率。为了进一步提高酶的催化效率和利用率，研究人员将固定化引入了L型酒石酸的生产过程。与游离细胞相比，固定化细胞克服了酶利用率低、催化效率低的缺陷，但仍然不能彻底解决细胞膜的扩散屏障作用。

发明内容

针对现有技术中微生物转化法生产L型酒石酸所存在的问题，本发明提供了顺式环氧琥珀酸水解酶细胞表面展示体系及构建方法，并采用表面展示顺式环氧琥珀酸水解酶的重组大肠杆菌生产L型酒石酸，不但克服解决了天然产CESH细菌或重组大肠杆菌的胞内CESH通透性较低的问题，也不存在纯化的重组酶稳定性不足且制备成本高的问题，具有重要的产业化应用价值。

本发明的技术方案：

细胞表面展示顺式环氧琥珀酸水解酶的重组大肠杆菌；所述重组大肠杆菌中导入了锚定蛋白细菌冰晶核蛋白N端区域(InpN)基因与顺式环氧琥珀酸水解酶CESH基因。

进一步的，所述的锚定蛋白InpN基因具有下列氨基酸序列之一：

(1)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

(2)SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；

(3)与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有90％以上同源性的，且所能够实现顺式环氧琥珀酸水解酶CESH表面展示的氨基酸序列。

其中，SEQ ID NO：1为来自北极假单胞菌Pseudomonas borealis DL7的InpN蛋白(以下简称为InaPbN)；SEQ ID NO：3为来自丁香假单胞菌Pseudomonas syringae KCTC1832的InpN蛋白(以下简称为InaKN)。

进一步的，所述的顺式环氧琥珀酸水解酶CESH基因具有下列氨基酸序列之一：

(1)SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；

(2)SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；

(3)SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；

(4)与SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9所示氨基酸序列具有90％以上同源性、且具有顺式环氧琥珀酸水解酶活性的氨基酸序列。

其中，SEQ ID NO：5为来自酒石酸诺卡氏菌的顺式环氧琥珀酸水解酶，SEQ ID NO：7为来自克雷伯氏菌的顺式环氧琥珀酸水解酶，SEQ ID NO：9为来自双头菌的顺式环氧琥珀酸水解酶。

优选的是，编码所述的顺式环氧琥珀酸水解酶CESH的核苷酸序列选自如下(1)、(2)、(3)：

(1)如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；

(2)如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；

(3)如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。

其中，SEQ ID NO：6为编码来自酒石酸诺卡氏菌的顺式环氧琥珀酸水解酶的核苷酸序列，SEQ ID NO：8为编码来自克雷伯氏菌的顺式环氧琥珀酸水解酶的核苷酸序列，SEQID NO：10为编码来自双头菌的顺式环氧琥珀酸水解酶的核苷酸序列；这些序列已经根据大肠杆菌的密码子偏好性进行了优化。

优选的是，所述锚定蛋白InpN基因与CESH基因之间的连接区域的核苷酸序列编码如下氨基酸残基：GlyGlyGlyGlySer。

如前所述的重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)化学合成锚定蛋白InpN基因；

(2)利用PCR扩增将锚定蛋白InpN基因的核苷酸序列和CESH基因的核苷酸序列连接，得到融合序列；

(3)将融合序列连接到大肠杆菌表达载体pET-28a上，得到融合表达载体；

(4)将融合表达载体转入表达宿主大肠杆菌中，得到细胞表面展示顺式环氧琥珀酸水解酶的重组大肠杆菌。

如前所述的重组大肠杆菌在制备L型顺式环氧琥珀酸中的应用，将所述的重组大肠杆菌与顺式琥珀酸或其盐反应，得到L型酒石酸或其盐；具体包括以下步骤：

(1)在培养基中培养权利要求1-3中任意一项所述的重组大肠杆菌菌株，所述重组大肠杆菌的诱导温度为16-28℃，诱导时间为20-28小时；

(2)将步骤(1)中得到的重组大肠杆菌菌株的细胞与顺式环氧琥珀酸或其盐反应生产L型酒石酸或其盐。

优选的是，步骤(2)所述的重组大肠杆菌菌株为步骤(1)得到的重组大肠杆菌在2-10℃下放置24-48h。发明人意外发现，表面展示的CESH经过前述低温放置可以进一步被激活，放置后重组大肠杆菌的酶活性得到了显著提升。

通过对比不同的锚定蛋白，两种使用细菌冰晶核蛋白N端区域InpN的展示系统显著优于其它展示系统，并且优于胞内表达CESH的大肠杆菌菌株。其中，使用InaPbN的展示系统具有最好的展示效果，其次为InKN。

本发明的有益效果：

1.采用本发明所述的细胞表面展示顺式环氧琥珀酸水解酶的重组大肠杆菌生产L型酒石酸，不但克服解决了天然产CESH细菌的胞内CESH通透性较低的问题，也不存在重组酶稳定性不足且制备成本高的问题，具有重要的产业化应用价值。

2.本发明所述的重组大肠杆菌，经检测，其展示出的全细胞酶活远高于经过通透性改善处理的胞内表达CESH的全细胞催化剂的酶活，并且总酶活高于胞内过表达的总酶活，说明其产生了预料不到的技术效果。

3.本发明所述的重组大肠杆菌使用3次后的酶活仍能达到最高酶活的75％，说明，其具有较高的重复利用率，与现有技术相比，进一步降低了成本。

4.本发明所述的重组大肠杆菌具备良好的稳定性，可在一定温度条件下长期稳定存放，进一步增加了产业化应用的前景。

附图说明

附图1为实施例1表面展示InaPbN-CESH的工程菌株全细胞在不同pH的缓冲液中的酶活(图1A)和在不同pH值的Tris-HCl缓冲液中随时间的酶活性变化(图1B)。

附图2为实施例1表面展示InaPbN-CESH的全细胞在不同温度下的酶活性变化。

附图3为实施例1的CESH表面展示工程菌株的重复利用率测试结果。

附图4为实施例1CESH表面展示工程菌株与增加细胞通透性的胞内表达菌株的酶活比较。其中，I-L：表示胞内诱导表达CESH的细胞经超声破碎后的裂解液；I-T：表示胞内诱导表达CESH的细胞经Triton X-100处理后的全细胞；I-T-S：表示胞内诱导表达CESH的细胞经Triton X-100处理后，离心得到的上清；I：表示胞内诱导表达CESH的全细胞；InaPbN：表示表达InaPbN-CESH蛋白的工程菌株全细胞。

附图5为实施例2中多种锚定蛋白展示效率的电泳对比图。其中，泳道M：分子量标准。泳道1：胞内表达CESH的全细胞电泳，未经胰蛋白酶处理。泳道2，胞内表达CESH的全细胞，经过胰蛋白酶处理后电泳。泳道3：胞内表达CESH的全细胞经裂解后使用胰蛋白酶处理再电泳。泳道4：表达LOA-CESH的全细胞，未经胰蛋白酶处理。泳道5：表达LOA-CESH的全细胞，经过胰蛋白酶处理后电泳。泳道6：表达MipAV₁₄₀-CESH的全细胞，未经胰蛋白酶处理。泳道7：表达MipAV₁₄₀-CESH的全细胞，经过胰蛋白酶处理后电泳。泳道8：表达YiaTR₂₃₂-CESH的全细胞，未经胰蛋白酶处理。泳道9：表达YiaTR₂₃₂-CESH的全细胞，经过胰蛋白酶处理后电泳。泳道10：表达InaKN-CESH的全细胞，未经胰蛋白酶处理。泳道11：表达InaKN-CESH的全细胞，经过胰蛋白酶处理后电泳。泳道12：表达InaPbN-CESH的全细胞，未经胰蛋白酶处理。泳道13：表达InaPbN-CESH的全细胞，经过胰蛋白酶处理后电泳。

附图6为实施例2中多种锚定蛋对应工程菌株的酶活比较。其中LOA、MipA、YiaT、InaKN、InaPbN分别表示：表达LOA-CESH、MipAV₁₄₀-CESH、YiaTR₂₃₂-CESH、InaKN-CESH和InaPbN-CESH蛋白的工程菌株细胞。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1：细胞表面展示诺卡氏菌CESH的大肠杆菌工程菌株构建及应用

1.基因获得：

化学合成编码锚定蛋白InaPbN(来自北极假单胞菌Pseudomonas borealis DL7的冰晶核蛋白1-165残基，SEQ ID No.1所示)的基因(序列如SEQ ID No.2所示)。根据大肠杆菌的密码子偏好性，设计编码如SEQ ID No.5所示的诺卡氏菌CESH的基因(SEQ ID No.6)。

2.引物设计：

以InaPbN基因序列和CESH基因序列设计引物如下：

InaPbN-NcoI-F：5’-CATGCCATGGGCATGAACGATGACAAAG-3’(划线部分为NcoI酶切位点)

InaPbN-BamHI-R：5’-CGCGGATCCCACCGCTGTCTCCAGCG-3’(划线部分为BamHI酶切位点)

linker-L-BamHI-F：5’-CATGGGATCCGGCGGCGGCGGCAGCATGGGCAGCAGCC-3’(划线部分为BamHI酶切位点)

L-HindIII-R：5’-CCAAGCTTGTCGATACCAGCGGTACCACCCAGACGCG-3’(划线部分为HindIII酶切位点)

3.构建表达载体：

以InaPbN基因为模板，InaPbN-NcoI-F和InaPbN-BamHI-R为引物，PCR扩增获得锚定蛋白InaPbN基因。反应参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec；52℃退火30sec；72℃延伸1min；30个循环后72℃保温5min。分别对该基因序列和表达载体pET-28a用NcoI和BamHI酶切，电泳回收目的片段。以基因片段和载体片段的摩尔数比值在1:5～1:7时进行连接，22℃连接30min，连接产物转入到大肠杆菌TOP10感受态细胞中，涂布于含卡那霉素抗性的固体培养基平板上，37℃过夜培养。对平板上长出的单克隆进行菌液PCR检测，对阳性的克隆接入10ml含卡那霉素的液体培养基培养12小时，提取质粒进行基因测序验证，获得重组质粒pET-28a-InaPbN。

以CESH基因为模板，以linker-L-BamHI-F和L-HindIII-R为引物，PCR扩增获得在N端带有额外5个氨基酸残基GGGGS编码区的CESH基因。反应参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec；62℃退火30sec；72℃延伸1min；30个循环后72℃保温5min。分别对该基因序列和pET-28a-InaPbN质粒用BamHI和HindIII酶切，电泳回收目的片段。以基因片段和载体片段的摩尔数比值在1:5～1:7时进行连接，22℃连接30min，连接产物转入到大肠杆菌TOP10感受态细胞中，涂布于含卡那霉素抗性的固体培养基平板上，37℃过夜培养。对平板上长出的单克隆进行菌液PCR检测，对阳性的克隆接入10ml含卡那霉素的液体培养基培养12小时，提取质粒进行基因测序验证，获得重组质粒pET-28a-InaPbN-CESH。

4.构建重组菌株：

将重组质粒pET-28a-InaPbN-CESH转入大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于含卡那霉素抗性的固体培养基平板上，37℃过夜培养。从平板上挑取单克隆菌落，由此获得细胞表面展示CESH的重组大肠杆菌BL21/pET-28a-InaPbN-CESH，简称CESH表面展示工程菌株。

5.培养工程菌株：

将前述CESH表面展示工程菌株的种子菌液接种于含100μg/ml Amp或100μg/mlKan的LB中，接种量为1％。在37℃、200rpm培养至菌液OD600在0.5～0.8，加入终浓度为0.2mM-1.0mM的IPTG，然后在16-28℃下200rpm诱导表达20-28小时。表达之后的菌体在2-10℃放置24-48小时，经过低温放置的工程菌株中的CESH被激活，此时菌体具有最大的酶活(见下面第7条)，是进行酒石酸生产的最佳菌株状态。

6.测定CESH表面展示工程菌株的酶活性

CESH的酶活(U)定义为每分钟内催化生成1μmol的L-(+)酒石酸所需要的酶的量。全细胞展示CESH酶活(U/OD)定义为每100μl细胞密度OD600为1.0的细胞所展示出的酶活数。全细胞酶活的测定方法：使用50mM Tris-HCl(pH 8.0)的缓冲液将菌液稀释至OD600＝1.0，取100μl稀释后的菌液与相同体积同种缓冲液溶解的200mM环氧琥珀酸钠在37℃反应20min；反应完成后，12000rpm离心1min，上清中分别加入80μl 1M的H₂SO₄和200μl的1％的偏钒酸铵显色；取200μl用酶标仪测定OD480吸光值，必要时先用适量去离子水进行稀释，以保证吸光度在酒石酸标准曲线的线性范围内；以未诱导表达的细胞进行上述同样的反应和测定，其值作为空白对照；所得数据通过酒石酸标准曲线计算CESH的酶活，具体结果如图1-3所示。

7.CESH表面展示工程菌株的最适pH和稳定性测试

1)最适pH测试：将25℃过夜诱导InaPbN-CESH的细胞悬浮于不同pH值溶液中，置于4℃，定期取相同体积细胞悬液测定表面展示InaPbn-CESH的全细胞在Tris-HCl缓冲液和PBS缓冲液中的酶活变化，结果如图1A所示。由图1A可知，InaPbn-CESH的全细胞在Tris-HCl缓冲液中的细胞酶活高于在PBS中的细胞酶活，且在Tris-HCl中pH 8.0-8.5之间酶活最高。将不同pH(8.0、8.5、9.0)Tris-HCl悬浮的细胞置于4℃，在不同时间取样测定全细胞的酶活变化，结果如图1B所示。由图3B可知，随着放置时间的延长，在pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中的全细胞酶活最稳定(图1B)。

2)稳定性测试：将诱导表达InaPbN-CESH的细胞悬浮在pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液中，分别置于4℃、16℃、25℃和37℃，观察全细胞酶活在不同温度下的酶活变化。结果发现，(1)在37℃放置1d后，全细胞酶活丧失58％的活性；(2)在16℃或25℃放置9d后，酶活下降为0.45U/OD(分别丧失了48％和45％的活性)；(3)4℃放置15d后，酶活仍然达到1.52U/OD，活性仅丧失了8％。这表明诱导表达InaPbN-CESH的细胞在4℃下酶活更稳定，可以保存一周以上。(图2)

8.CESH表面展示工程菌株的重复利用率测试

为了测定表面展示CESH的重复利用率，将4℃放置不同时间的细胞重复使用进行反应3次，并测试其酶活。具体过程如下：37℃反应完成后的细胞在13000rpm离心1min，上清用于测定本次反应的产生的酒石酸量，沉淀中的菌体用100μl的pH 8.0缓冲液洗涤一次，加入100μl的缓冲液悬浮，再次作为催化剂进行反应测定酶活。依次重复反应3次。

经过测试可知，在4℃放置2d的全细胞酶活达到最高1.67U/OD，使用1次后的酶活是初始酶活的98％，使用2次的酶活是最高酶活的95％，使用3次后的酶活仍能达到最高酶活的75％。随着4℃放置时间的延长，酶活也稍微有所下降，但是放置14d后，使用1次的酶活达到同时4℃放置14d的全细胞初始酶活的91％，使用3次后的酶活达到初始酶活的51％。这说明，该表面展示系统具有较高的重复利用率(图3)。

9.CESH表面展示工程菌株与胞内表达菌株的活性比较

CESH胞内表达菌株为含pET-28a-CESH质粒的大肠杆菌BL21(DE3)。胞内表达菌株生长到对数生长期时，用终浓度为0.1mM的IPTG 16℃诱导表达24h。取1ml诱导后的细胞，用50mM PBS(pH8.0)洗涤两次，并悬浮在1ml PBS中进行细胞破碎，之后在4℃、12000rpm离心30min。20μl的细胞破碎上清中加入80μl的pH＝8.0的PBS缓冲液，总体积为100μl，然后与相同体积的底物反应，测定CESH的酶活为1.40U。由此计算胞内表达CESH时250mL菌液中总酶活达到17613.83U，通过BCA标准曲线换算为CESH表达量为55.95mg。

而对于250ml表面展示InaPbN-CESH的全细胞，在4℃放置2d后，20μl的全细胞酶活为1.53U，250ml的诱导后菌液总酶活为19242.41U，换算为总CESH展示量为61.12mg(不计标签)，高于前述的胞内表达CESH的表达量55.95mg。由此可知，表面展示的InaPbN-CESH的有效酶活高于胞内表达CESH的酶活。

10.CESH表面展示工程菌株与增加细胞通透性的胞内表达菌株的比较

首先使用CESH胞内表达菌株，通过表面活性剂处理改善通透性。具体操作为：将诱导表达后的细胞，离心后用50mM PBS(pH8.0)洗涤两次，重新悬浮细胞调节OD600至1.0。离心后使用含有0.2g/L的Triton X-100的0.9％氯化钠溶液重新悬浮细胞，在室温下放置30分钟后，测定全细胞液的酶活。如附图4示，表面活性剂处理后的全细胞(I-T)活性达到未处理(I)活性的大约6倍，相当于细胞裂解液(I-L)活性的一半左右，说明提升细胞通透性有助于提升整体全细胞酶活，但仍然远低于细胞裂解液(I-L)全部的活性，也远低于CESH表面展示工程菌株(InaPbN)的活性。

此外，将表面活性剂处理后的细胞溶液离心后，检测上清溶液(I-T-S)的活性，发现其达到全细胞(I-T)活性的一半左右。这表明，细胞通透性的改变虽然提升了全细胞酶活，但却导致部分酶泄漏到了细胞外，从而不利于细胞的回收和重复使用。因此，CESH表面展示工程菌株不仅活性高，而且能够重复使用，其性能显著优于增加细胞通透性的胞内表达菌株。

实施例2：多种锚定蛋白展示效率及对应工程菌株酶活性的对比

1.构建多种锚定蛋白展示CESH的工程菌株

使用和实施例1相同的方法，不同的是，锚定蛋白分别更改为LOA(大肠杆菌脂蛋白Lpp的N端9残基和外膜蛋白OmpA的46-161残基融合蛋白)、MipAV₁₄₀(大肠杆菌外膜蛋白MipA的1-140残基)、YiaTR₂₃₂(大肠杆菌外膜蛋白YiaT的1-232残基)、InaKN(丁香假单胞菌Pseudomonas syringae KCTC1832冰晶核蛋白InaK的1-215残基，氨基酸序列SEQ ID NO：3，核酸序列SEQ ID NO：4)，分别构建使用这些锚定蛋白展示CESH的工程菌株。

2.检测CESH展示效率

检测方法：收集16℃0.2mM IPTG过夜诱导的菌液，在4000rpm离心5min收集菌体，50mM pH 8.0Tris-HCl的缓冲液洗涤两次细胞，重新悬浮细胞调节OD600至5.0。在OD6002.0细胞悬液中加入终浓度为400μg/ml的胰蛋白酶，37℃水浴反应1h，再加入终浓度2.5mMPMSF终止反应。分别以未经胰蛋白酶处理的细胞为对照。取细胞样品100μl，加入150μl1.5×SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴10min，待冷却到室温，14000rpm离心1min，上清用于SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE的分离胶和浓缩胶的浓度分别为10％和5％。在室温下，以30mA恒定电流电泳。

如附图5所示，胞内表达CESH的细胞胰蛋白酶处理前和处理后CESH的条带变化不大；但是细胞破碎物经胰蛋白处理后CESH蛋白消失。这说明，胰蛋白酶可以处理CESH，同时胰蛋白酶不能进入细胞。采用胰蛋白酶处理表达带有不同锚定蛋白的融合蛋白的细胞，与未经胰蛋白酶处理的细胞相比，表达LOA-CESH的细胞经胰蛋白处理前、后的条带均未变浅，这说明锚定蛋白LOA不能将CESH展示到细胞外。而表达MipAV₁₄₀-CESH、YiaTR232、InaPbN-CESH和InaKN-CESH的细胞，与未经胰蛋白酶处理的细胞相比，经胰蛋白处理前的条带未变浅，而经胰蛋白处理后的条带明显变浅；说明，这四种锚定蛋白可以将部分CESH展示到大肠杆菌表面。

3.检测工程菌株酶活性

采用实施例1所述的方法进行CESH表面展示工程菌株的酶活性测定。

由图6可知，表达MipAV₁₄₀-CESH和LOA-CESH蛋白的全细胞酶活测定数值几乎和空白对照相同。这是因为，如前所述，(1)锚定蛋白LOA不能将CESH展示到细胞外；(2)虽然锚定蛋白MipAV₁₄₀可以将部分CESH展示到大肠杆菌表面，但展示到大肠杆菌表面的CESH没有活性。而表达YiaTR₂₃₂-CESH、InaKN-CESH和InaPbN-CESH蛋白的全细胞均有显著的酶活，说明这三个锚定蛋白均实现了其在大肠杆菌表面的展示。但三者的酶活不同，表明不同锚定蛋白具有不同的展示效率。根据前述结果可知，使用细菌冰晶核蛋白N端区域作为锚定蛋白的两个工程菌株的全细胞酶活最高，其中表达InaPbN-CESH的细胞又比表达InaKN-CESH的略高。对比图4可以发现，它们的活性高于Triton X-100处理的胞内表达CESH的细胞，说明本发明解决了细胞通透性的问题，其效果显著由于胞内表达并进行细胞通透性增强的效果。

综上可知，(1)锚定蛋白能否展示CESH、展示效率是不确定的，(2)即便锚定蛋白能展示CESH，但展示的CESH有没有活性也是不确定的，这是因为：1)不同的锚定蛋白与CESH之间可能存在无法预知的相互影响，2)不同锚定蛋白从胞内向细胞表面转运的机制不清楚，CESH融合对其转运过程的影响不确定，3)CESH在从胞内到细胞表面转运之后需要重新折叠才能形成正确的具有功能的酶，而不同的锚定蛋白可能对折叠过程产生无法预知的影响。

因此，本领域技术人员无法预测何种锚定蛋白能实现CESH的表面展示、且具有工业应用前景的酶活性能。

实施例3：细胞表面展示酒石酸诺卡氏菌CESH突变体的大肠杆菌工程菌株构建及应用

与实施例1不同的是，所述的顺式环氧琥珀酸水解酶是CESH的稳定增强突变体(其氨基酸序列为SEQ ID NO：5基础上进行五个位点的突变：D8K，F26W，I83R，S90R，Q122R)。最终检测得到，采用该锚定蛋白得到的细胞表面展示工程菌株，250毫升培养液的总酶活为19835.02U，与实施例1相近。但其在25度放置9天后酶活仍保持其85％的活性，稳定性高于实施例1。

实施例4：细胞表面展示克雷伯氏菌CESH的大肠杆菌工程菌株构建及应用

与实施例1不同的是，所述的顺式环氧琥珀酸水解酶是氨基酸序列为SEQ ID NO：7的克雷伯氏菌CESH(来源于Klebsiella sp.BK-58)，其与酒石酸诺卡氏菌CESH氨基酸序列(SEQ ID NO：5)的等同性为36％。

合成根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化的克雷伯氏菌CESH基因(SEQ IDNO：8)，使用相应的引物和PCR条件，其它和实施例1相同。最终测定，250毫升培养液的总酶活为22379.06U，在25度放置9天后酶活仍保持其80％的活性。由此可知，本实施例构建的工程菌株的总活性与稳定性均高于实施例1。

实施例5：细胞表面展示双头菌CESH的大肠杆菌工程菌株构建及应用

与实施例1不同的是，所述的顺式环氧琥珀酸水解酶是氨基酸序列为SEQ ID NO：9的双头菌CESH(来源于Labrys sp.WH-1)，其与酒石酸诺卡氏菌CESH氨基酸序列(SEQ IDNO：5)的等同性为37％，与克雷伯氏菌CESH氨基酸序列(SEQ ID NO：7)的等同性47％。

合成根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化的双头菌CESH基因(SEQ ID NO：10)，使用相应的引物和PCR条件，其它和实施例1相同。最终测定，250毫升培养液的总酶活为23094.81U，在25度放置9天后酶活仍保持其85％的活性。由此可知，本实施例构建的工程菌株的总活性与稳定性均高于实施例1。

实施例4和实施例5表明，本发明所述的重组大肠杆菌能够用于展示不同菌株来源的顺式环氧琥珀酸水解酶，即使它们的序列等同性低于40％。

综上可知，本发明所述的重组大肠杆菌，其展示出的全细胞酶活不但远高于经过通透性改善处理的胞内表达CESH的全细胞催化剂的酶活，并且总酶活高于胞内过表达的总酶活，产生了预料不到的技术效果，具有重要应用价值。同时，本发明所述的重组大肠杆菌使用3次后的酶活仍能达到最高酶活的75％，具有较高的重复利用率，这是包括改善细胞透通透性技术在内的现有技术所没有实现的，进一步降低了成本。此外，本发明所述的重组大肠杆菌可在一定条件下长期稳定存放，具备良好的稳定性，进一步增加了产业化应用的前景。

SEQ ID NO：1

InaPbN蛋白质序列(165氨基酸残基)

MNDDKVLVLRTCANNMSDHCGQIWPVSGVVECKYWEPTRKLENGLAGLLWGKGASTHLNMQADARWVICEVAVSDIIFLDAQGGVKFPRAEVVHVGTRNSAAGYISANIASYASSTVALNETFVFPEVRTETKVDFPASPATADSTFDIDRHATIQGPQTLETAV

SEQ ID NO：2

InaPbN核酸序列(495碱基)

ATGAACGATGACAAAGTTTTGGTCTTGCGCACCTGTGCCAATAATATGTCCGATCACTGTGGCCAGATATGGCCTGTTTCCGGTGTTGTCGAATGTAAATATTGGGAACCCACCCGAAAGCTCGAGAATGGGCTGGCCGGGCTGCTATGGGGCAAAGGGGCGAGCACGCATTTGAATATGCAGGCTGACGCCCGGTGGGTTATTTGTGAAGTTGCGGTGAGCGATATCATCTTTCTGGATGCGCAGGGCGGGGTCAAGTTTCCGCGTGCTGAAGTTGTTCACGTCGGCACAAGAAACAGCGCGGCGGGCTATATTTCGGCGAATATTGCCAGTTATGCGTCTTCCACAGTTGCGTTGAATGAAACATTTGTTTTTCCTGAAGTTCGCACAGAAACGAAGGTGGATTTCCCCGCTTCGCCCGCGACCGCTGATAGCACTTTTGATATTGATCGACACGCAACTATTCAAGGCCCACAAACGCTGGAGACAGCGGTG

SEQ ID NO：3

InaKN蛋白质序列(251氨基酸残基)

MTLDKALVLRTCANNMADHCGLIWPASGTVESRYWQSTRRHENGLVGLLWGAGTSAFLSVHADARWIVCEVAVADIISLEEPGMVKFPRAEVVHVGDRISASHFISARQADPASTSTSTSTSTLTPMPTAIPTPMPAVASVTLPVAEQARHEVFDVASVSAAAAPVNTLPVTTPQNLQTATYGSTLSGDNHSRLIAGYG

SEQ ID NO：4

InaKN核酸序列(645碱基)

ATGACGCTCGACAAGGCGTTGGTGCTGCGTACCTGTGCAAATAACATGGCCGATCACTGCGGCCTTATATGGCCCGCGTCCGGCACGGTGGAATCCAGATACTGGCAGTCAACCAGGCGGCATGAGAATGGTCTGGTCGGTTTACTGTGGGGCGCTGGAACCAGCGCTTTTCTAAGCGTGCATGCCGATGCTCGATGGATTGTCTGTGAAGTTGCCGTTGCAGACATCATCAGTCTGGAAGAGCCGGGAATGGTCAAGTTTCCGCGGGCCGAGGTGGTTCATGTCGGCGACAGGATCAGCGCGTCACACTTCATTTCGGCACGTCAGGCCGACCCTGCGTCAACGTCAACGTCAACGTCAACGTCAACGTTAACGCCAATGCCTACGGCCATACCCACGCCCATGCCTGCGGTAGCAAGTGTCACGTTACCGGTGGCCGAACAGGCCCGTCATGAAGTGTTCGATGTCGCGTCGGTCAGCGCGGCTGCCGCCCCAGTAAACACCCTGCCGGTGACGACGCCGCAGAATTTGCAGACCGCCACTTACGGCAGCACGTTGAGTGGCGACAATCACAGTCGTCTGATTGCCGGTTATGGCAGTAACGAGACCGCTGGCAACCACAGTGATCTAATTGCAGGGTATGGA

SEQ ID NO：5

CESH蛋白质序列(253氨基酸残基)

MQLNNANDNTQFRALLFDVQGTLTDFRSTLIEHGLSILGDRVDRELWEELVDQWRGCYRDELDSLVKQEKWRSVRAVYRDSLINLLAKFSDSFCATSAEVELLTDGWERLRSWPDVPSGLEQLRSKYLVAALTNADFSAIVNVGRSAKLQWDAVLSAQLFGAYKPHRSTYEGAATLLGIAPSEILMVASHAYDLEAAREVGAGTAYVRRPLEYGPTGRTEDVPDGRFDFLVDSISELADQLGCPRLGGTAGID

SEQ ID NO：6

CESH核酸序列(759碱基，根据大肠杆菌密码子偏好性优化了密码子)

ATGCAGCTGAACAACGCTAACGACAACACCCAGTTCCGTGCTCTGCTGTTCGACGTTCAGGGTACCCTGACCGACTTCCGTTCTACCCTGATCGAACACGGTCTGTCTATCCTGGGTGACCGTGTTGACCGTGAACTGTGGGAAGAACTGGTTGACCAGTGGCGTGGTTGCTACCGTGACGAACTGGACTCTCTGGTTAAACAGGAAAAATGGCGTTCTGTTCGTGCTGTTTACCGTGACTCTCTGATCAACCTGCTGGCTAAATTCTCTGACTCTTTCTGCGCTACCTCTGCTGAAGTTGAACTGCTGACCGACGGTTGGGAACGTCTGCGTTCTTGGCCGGACGTTCCGTCTGGTCTGGAACAGCTGCGTTCTAAATACCTGGTTGCTGCTCTGACCAACGCTGACTTCTCTGCTATCGTTAACGTTGGTCGTTCTGCTAAACTGCAGTGGGACGCTGTTCTGTCTGCTCAGCTGTTCGGTGCTTACAAACCGCACCGTTCTACCTACGAAGGTGCTGCTACCCTGCTGGGTATCGCTCCGTCTGAAATCCTGATGGTTGCTTCTCACGCTTACGACCTGGAAGCTGCTCGTGAAGTTGGTGCTGGTACCGCTTACGTTCGTCGTCCGCTGGAATACGGTCCGACCGGTCGTACCGAAGACGTTCCGGACGGTCGTTTCGACTTCCTGGTTGACTCTATCTCTGAACTGGCTGACCAGCTGGGTTGCCCGCGTCTGGGTGGTACCGCTGGTATCGAC

SEQ ID NO：7

Kl-CESH蛋白质序列(274氨基酸残基)和CESH的序列等同度36％

MKFSGASLFAAVSGASLFAAVSSSNTFADASLIRKGGQPDGLKALFFDVQGTLVDFYSTITREGEAFSAVRGFQADWTTVTEQWRAEYRSRLDQVIKGERPWTTTDRIYREALDGILANHPWGASLNSADRDELNSLWSKLIPWDDTAPGLARLRSKYITSTLSNGSMASVLRISKLGALPFDAILTAELVRSSKPDPKVYQLALDSVGIEAHQAMMVACHKYDLQAAKRLGFKVAFIARPFEFGPNKKVDTKPEQYFDYYANSVVELAGMLGA

SEQ ID NO：8

Kl-CESH核酸序列(822碱基，根据大肠杆菌密码子偏好性优化了密码子)

ATGAAATTCTCTGGTGCTTCTCTGTTCGCTGCTGTTTCTGGTGCTTCTCTGTTCGCTGCTGTTTCTTCTTCTAACACCTTCGCTGACGCTTCTCTGATCCGTAAAGGTGGTCAGCCGGACGGTCTGAAAGCTCTGTTCTTCGACGTTCAGGGTACCCTGGTTGACTTCTACTCTACCATCACCCGTGAGGGCGAAGCGTTCTCTGCTGTTCGTGGTTTCCAGGCTGACTGGACCACCGTTACCGAACAGTGGCGTGCTGAATACCGTTCTCGTCTGGACCAGGTTATCAAAGGTGAACGTCCGTGGACCACCACCGACCGTATCTACCGTGAAGCTCTGGACGGTATCCTGGCTAACCACCCGTGGGGTGCTTCTCTGAACTCTGCTGACCGTGACGAACTGAACTCTCTGTGGTCTAAACTGATCCCGTGGGACGACACCGCTCCGGGTCTGGCTCGTCTGCGTTCTAAATACATCACCTCTACCCTGTCTAACGGTTCTATGGCTTCTGTTCTGCGTATCTCTAAACTGGGTGCTCTGCCGTTCGACGCTATCCTGACCGCTGAACTGGTTCGTTCTTCTAAACCGGACCCGAAAGTTTACCAGCTGGCTCTGGACTCTGTTGGTATCGAAGCTCACCAGGCTATGATGGTTGCTTGCCACAAATACGACCTGCAGGCTGCTAAACGTCTGGGTTTCAAAGTTGCTTTCATCGCTCGTCCGTTCGAATTCGGTCCGAACAAAAAAGTTGACACCAAACCGGAACAGTACTTCGACTACTACGCTAACTCTGTTGTTGAACTGGCTGGTATGCTGGGTGCTSEQ IDNO：9

La-CESH蛋白序列，和CESH的序列等同度37％，和Kl-CESH的等同度47％(274氨基酸残基)

MKLSGLSTRLNRRDILAGAGAAVLAMAPDRKGAVAAEALEGVRALTFDVQGTCVDFYRPVSRMGEALNRAKAIEVDWARLSAEWRDLYRRTLDGVIAGQRPWIRVDAIYRQALDVLLERHGLSGRFSLAERDELNTVWTTLDAWPDSVAGLDRLGRKFVTSTLSNAGMAAVVAVVRHAGLPFDAVLTAELARSYKPAPAVYQLAVDYLGYRPDQIMMVACHKYDLKAARAFGMRTAFVARPHEFGPDARPDIAPEPWFDIYAGSFTELADRLGA

SEQ ID NO：10

La-CESH核酸序列(822碱基，根据大肠杆菌密码子偏好性优化了密码子)

ATGAAACTGTCTGGTCTGTCTACCCGTCTGAACCGTCGTGACATCCTGGCTGGTGCTGGTGCTGCTGTTCTGGCTATGGCTCCGGACCGTAAAGGTGCTGTTGCTGCTGAAGCTCTGGAAGGTGTTCGTGCTCTGACCTTCGACGTTCAGGGTACCTGCGTTGACTTCTACCGTCCGGTTTCTCGTATGGGTGAAGCTCTGAACCGTGCTAAAGCTATCGAAGTTGACTGGGCTCGTCTGTCTGCTGAATGGCGTGACCTGTACCGTCGTACCCTGGACGGTGTTATCGCTGGTCAGCGTCCGTGGATCCGTGTTGACGCTATCTACCGTCAGGCTCTGGACGTTCTGCTGGAACGTCACGGTCTCTCGGGTAGGTTCTCTCTGGCTGAGCGTGACGAACTGAACACCGTTTGGACCACCCTGGACGCTTGGCCGGACTCTGTTGCTGGTCTGGACCGTCTGGGTCGTAAATTCGTTACCTCTACCCTGTCTAACGCTGGTATGGCTGCTGTTGTTGCTGTTGTTCGTCACGCTGGTCTGCCGTTCGACGCTGTTCTGACCGCTGAACTGGCTCGTTCTTACAAACCCGCTCCAGCTGTGTACCAGCTGGCAGTTGACTACCTGGGTTACCGTCCGGACCAGATCATGATGGTTGCTTGCCACAAATACGACCTGAAAGCTGCTCGTGCTTTCGGCATGAGGACCGCGTTCGTTGCTCGTCCACACGAATTCGGTCCGGACGCTCGTCCGGACATCGCTCCGGAACCGTGGTTCGACATCTACGCTGGTTCTTTCACCGAACTGGCTGACCGTCTGGGTGCT

Claims (10)

1.细胞表面展示顺式环氧琥珀酸水解酶的重组大肠杆菌；其特征在于：所述重组大肠杆菌中导入了锚定蛋白细菌冰晶核蛋白N端区域InpN基因与顺式环氧琥珀酸水解酶CESH基因。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌；其特征在于：所述的锚定蛋白InpN基因具有下列氨基酸序列之一：

（1）SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

（2）SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；

（3）与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有90%以上同源性的，且所能够实现顺式环氧琥珀酸水解酶CESH表面展示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌；其特征在于：所述的顺式环氧琥珀酸水解酶CESH基因具有下列氨基酸序列之一：

（1）SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；

（2）SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；

（2）SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；

（3）与SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9所示氨基酸序列具有90%以上同源性、且具有顺式环氧琥珀酸水解酶活性的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌；其特征在于：编码所述的顺式环氧琥珀酸水解酶CESH的核苷酸序列选自如下（1）、（2）、（3）：

（1）如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；

（2）如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；

（3）如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌；其特征在于：所述锚定蛋白InpN基因与CESH基因之间的连接区域的核苷酸序列编码如下氨基酸残基：GlyGlyGlyGlySer。

6.如权利要求1所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）化学合成锚定蛋白InpN基因；

（2）利用PCR扩增将锚定蛋白InpN基因的核苷酸序列和CESH基因的核苷酸序列连接，得到融合序列；

（3）将融合序列连接到大肠杆菌表达载体上，得到融合表达载体；

（4）将融合表达载体转入表达宿主大肠杆菌中，得到细胞表面展示顺式环氧琥珀酸水解酶的重组大肠杆菌。

7.权利要求1～5任一项所述的重组大肠杆菌在制备L型酒石酸或其盐中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：包括以下步骤：

（1）在培养基中培养权利要求1-5中任意一项所述的重组大肠杆菌菌株；

（2）将步骤（1）中得到的重组大肠杆菌菌株的细胞与顺式环氧琥珀酸或其盐反应生产L型酒石酸或其盐。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：步骤（2）所述的重组大肠杆菌菌株为步骤（1）得到的重组大肠杆菌在2-10℃下放置24-48h。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：步骤（1）所述的重组大肠杆菌菌株的诱导温度为16-28℃，诱导时间为20-28小时。

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