CN101087876A - 中性纤维素酶催化核心及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新型纤维素酶蛋白及其衍生物在宿主细胞中的克隆以及高水平表达。本发明进一步的方面涉及表达所述新型纤维素酶的转化体，以及包含DNA基因片段或其变体的表达载体，使用遗传工程技术，所述的DNA基因片段或变体编码来自于放线菌的新型纤维素酶。本发明也涉及新型纤维素酶组合物及其在工业加工过程中的使用方法。具体而言，本发明涉及用来自放线菌属某些种(Actinomycete spp.)的新型纤维素酶处理纺织品。本发明还涉及使用来自于放线菌属某些种的纤维素酶以增强动物饲料的可消化性，以及将所述纤维素酶用于去污剂中、用于浆和纸的处理，和用于淀粉生产及其副产品的处理。

Description

中性纤维素酶催化核心及其制备方法
关于对在联邦资助的研究和开发下所作发明的权利的声明
【0001】不适用。
相关申请的交叉参考
【0002】本申请是2004年12月23日提交的美国申请号60/638,953的部分延续并要求其优先权权益，在此以其全部内容并入本文作为参考。
发明领域
【0003】本发明涉及在宿主细胞中生产高水平的新型截短型纤维素酶蛋白的方法，涉及通过遗传工程技术产生的宿主细胞转化体；以及涉及由此类转化体生产的新型纤维素酶蛋白。新型纤维素酶蛋白是新型的纤维素酶催化核心。用本发明的纤维素酶核心结构域处理含纤维素的织物被公开，其提供了减少的染料再沉淀以及增加的磨损的特殊优势。
发明背景
【0004】纤维素酶是水解纤维素中β-D-葡萄糖苷键的酶。传统上，纤维素水解酶已被划分为三种主要类别：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶或者纤维素生物水解酶以及β-葡萄糖苷酶(Knowles，J.等TIBTECH 5：255-261(1987))。已知纤维素酶是由为数众多的细菌、酵母和真菌产生的。
【0005】已被开发的使用纤维素水解酶的各种应用中，主要的应用涉及将(木质)纤维素浆降解为糖以用于(生物)乙醇生产、纺织品处理如“石洗(stonewashing)”和“生物抛光”以及用于去污剂组合物。同样已知纤维素酶在用于去除污渍即清洁的去污剂组合物中是有用的。例如，英国(Great Britain)申请号2,075,028、2,095,275和2,094,826举例说明了使用加入纤维素酶的去污剂的改善的清洁性能。此外，英国申请号1,358,599举例说明了在去污剂中使用纤维素酶以减少含棉织物的粗糙感。
【0006】在处理纺织品的过程中，纤维素酶的另一个有用的特征是其具有通过使旧织物颜色更加鲜明而修理旧织物的能力。例如，反复洗涤含棉织物导致该织物产生灰色脱落物。据信是由于由机械作用引起的断裂而杂乱无序的小纤维造成的，有时被称为“起球”。这种灰色脱落物在有色的织物上特别明显。因而，已发现纤维素酶去除纤维的无序表层并从而改善织物整体外观的能力具有价值。因为作为纤维素酶的主要用途的去污剂，一般是在碱性条件下进行操作，所以强烈需要在pH7-10下表现出高活性的纤维素酶。被充分表征的真菌纤维素酶，诸如来自异常腐质霉(Humicola insolens)和里氏木霉(Trichoderma reesei)的那些纤维素酶，在中性至弱碱性pH条件下充分地发挥作用。大量在强碱性pH条件下表现纤维素酶活性的酶已从芽孢杆菌(Bacillus)和其它原核生物中分离出来，参见例如PCT公开文本号WO 96/34092和WO 96/34108。因此，不论是真菌纤维素酶还是细菌纤维素酶都已被充分研究。然而，第三类纤维素酶，即那些由放线菌(Actinomycete)中分离的纤维素酶，还较少引起关注。Wilson等，Critical Reviews Biotechnology，12：45-63(1992)已经研究了由褐色高温单孢菌(Thermomonospora fusca)、弯曲高温单孢菌(Thermonomospora curvata)和双孢小双孢菌(Microbispora bispora)所产生的纤维素酶，并表明许多此类纤维素酶表现出宽pH特征以及良好的温度稳定性。同样，Nakai等Agric.Biol.Chem.，51：3061-3065(1987)和Nakai等Gene，65：229-238(1988)已证实了来自链霉属(Streptomyces)菌株KSM-9的耐碱型纤维素酶casA。此纤维素酶具有最适碱性pH和极好的温度稳定性。
【0007】尽管本领域的知识涉及许多具有期望特性的维素酶组合物，包括一些来自于放线菌的实例，但对于具有变化谱特征的新型纤维素酶仍有着持续的需求，所述新型纤维素酶用于例如纺织品处理、去污剂组合物的组分、浆和纸的处理、动物饲料添加剂、烘焙加工助剂和生物量转化剂。申请人已发现了具有此类整套特征的纤维素酶，其在纤维素酶的这些已知的应用方面是有用的。
发明概述
【0008】本发明涉及纤维素酶催化核心的结构域、构建物、载体和宿主细胞，其包括一个或多个被可操纵地连接于异源编码序列的启动子序列。
【0009】根据本发明，提供新型纤维素酶或者所述纤维素酶的衍生物，其可从放线菌(Actinomycete)获得。优选地，本发明的纤维素酶包括根据图1E(SEQ ID NO：_)的氨基酸序列，或者与之具有95％以上序列同一性的衍生物。
【0010】本发明的一个进一步的目的是提供具有优异特性的新型纤维素酶，用于去污剂、处理纺织品、作为饲料添加剂以及用于浆和纸的制造。
【0011】在一种实施方式中，提供了一种编码图1E所示氨基酸序列的DNA序列。在此实施方式的一个方面，所述DNA序列在图2中表示。
【0012】根据一种实施方式，提供了一种包括编码本发明纤维素酶的DNA的组合物。优选地，该DNA编码一种根据图1E(SEQ ID NO：_)的氨基酸序列，或者与之具有76％以上序列同一性、优选地80％以上序列同一性以及更优选地90％以上序列同一性的衍生物和由此产生的纤维素酶。本发明进一步包括与取自图2中所示DNA的DNA探针在适宜条件下杂交的DNA以及由此产生的纤维素酶。
【0013】在另一实施方式中，提供了包含编码图1E所示氨基酸序列的DNA的载体。在此实施方式的一个方面，所述载体是pKB107。
【0014】在一种实施方式中，本发明提供了已用载体转化的宿主细胞，所述载体包括编码图1E所示氨基酸序列的DNA。在一方面，当宿主细胞是链霉菌属某种时，宿主细胞可以任选地缺失cyc2基因(土臭味素通路基因(geosmin pathwaygene))。
【0015】在最后的实施方式中，提供了本文所述的新型纤维素酶催化核心结构域的使用方法。
【0016】所述方法可以被用于使用本发明的纤维素酶核心结构域处理含纤维素织物。所述方法提供了减少的染料再沉淀、增加的磨损、改善的织物手感(即变柔软)、光滑的织物表面、去除小球和/或防止起球的特殊优势。
【0017】在其它方面，所述方法被用于增强动物饲料的可消化性、用于去污剂、用于处理浆和纸以及用于生产淀粉和处理它们的副产品。
【0018】通过下列详细描述，本发明的其它目的、特征和优势将变得明显起来。然而应当理解，详细描述和具体实例尽管表明了本发明的优选实施方式，但仅是以举例说明的方式提供，因为根据此详细描述，在本发明的范围和精神内的各种变化和修改对于本领域的技术人员而言将是明显的。
附图说明
【0019】图1举例说明了多种纤维素酶蛋白。图1A是前体蛋白(pre-protein)。图1B是成熟的11AG8纤维素酶蛋白。图1C是无CBD的233个氨基酸的11AG8纤维素酶蛋白。图1D是无CBD的230个氨基酸的11AG8纤维素酶蛋白。图1E是221个氨基酸的11AG8纤维素酶催化核心，即无CBD和接头。信号序列为粉红色。接头长度为12个氨基酸，9个残基为棕色，3个为红色。233个氨基酸蛋白中的三个氨基酸为红色(并仅在图1A中加下划线)。CBD为蓝色。
【0020】图2是一个DNA序列，其编码11AG8纤维素酶的221个氨基酸催化核心。
【0021】图3表示pSEGCT11 AG8载体，其包括：
来源于密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)的葡萄糖异构酶启动子、
变铅青链霉菌(S.lividans)纤维素酶celA的信号序列、
编码来自链霉菌属某种的纤维素酶11AG8基因的多核苷酸、
纤维素酶11AG3的终止子序列。
【0022】图4表示pSEA4CT-11AG8载体，其包括：
来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的A4启动子、
变铅青链霉菌纤维素酶celA的信号序列、
编码来自链霉菌属某种的纤维素酶11AG8基因的多核苷酸、
纤维素酶11AG3的终止子序列。
pSEGCT11AG8的GI启动子已被用黑曲霉A4启动子替换。
【0023】图5表示pKB105的构建策略。
【0024】图6表示pKB105载体，其包括：
来源于黑曲霉的A4启动子、
变铅青链霉菌纤维素酶celA的信号序列、
编码来自链霉菌属某种的11AG8纤维素酶的221个氨基酸催化核心的多核苷酸、
纤维素酶11AG3的终止子序列。
【0025】图7表示pKB107载体，其是大肠杆菌(E.coli)序列已被去除的pKB105。
【0026】图8表示各种纤维素酶样品在本文所述NPC试验中的活性。50R6是来自商用生产菌株IndiAgeNeutra L的蛋白样品。pKB105和pKB107是由各自载体表达的蛋白样品。该催化核心表现出比商业产品更高的活性。
【0027】图9是一张表现新型Neutra G磨损性能的图(与商业产品IndiAgeNeutraG的性能相比)。不论是何种类型斜纹粗棉布，以65％的NPC活性添加的新型NeutraG表现出与以100％活性添加的IndiAgeNeutra G非常相近的磨损性能。当以与IndiAgeNeutra G相同的活性添加时，新型Neutra G表现出明显更高的磨损性能。
【0028】图10是一张表现与商业产品IndiAgeNeutra G的性能相比，新型NeutraG的回染性能的图。在相似磨损水平下，新型Neutra G和目前的商业IndiAgeNeutra G之间未观察到明显的回染性能。
【0029】图11表示了IndiAgeNeutra L和KB107C的DSC温度记录图。相对于IndiAgeNeutra L的67.87℃的熔点，KB107C分子具有68.7℃的熔点(Tm)，这表明KB107C更加稳定。
发明详述
【0030】现在，本发明将通过仅使用下列定义和实施例作为参考的方式来加以详细描述。此处所指的所有专利和出版物，包括此类专利和出版物中公开的所有序列，被特意明确并入本文作为参考。
【0031】除非在本文中另作定义，此处所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同的含义。Singleton等DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，2D ED.，John Wiley and Sons，New York(1994)和Hale&Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OFBIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)为技术人员提供了有关本发明中所使用的许多术语的普通字典。尽管与本文所述相似或等同的任何方法和材料都可以被用于本发明的实践或检测，但还是描述了优选的方法和材料。数字范围包括限定该范围的数字。除非另作说明，分别地，核酸是按照5′至3′方向从左至右书写；氨基酸序列是按照氨基至羧基方向从左至右书写。对于本领域的定义和术语，专业人员具体参考Sambrook等1989和Ausubel FM等1993。应当理解，由于可以改变，本发明并非被限定于所述的具体方法、方案和试剂。
【0032】此处所提供的标题并非是限定本发明的各个方面或实施方式，其可以作为整体通过参考说明书而被包含于其中。因此，下面即将被定义的术语作为整体通过参考说明书而被更充分地定义。
定义
【0033】术语“核酸分子”包括RNA、DNA和cDNA分子。应当理解，由于遗传密码的简并性，可以产生大量编码给定蛋白诸如纤维素酶的核苷酸序列。本发明考虑了每一种编码目前要求保护的纤维素酶的可能的变体核苷酸序列，考虑到遗传密码的简并性，所有这些序列都是有可能的。
【0034】术语“氨基酸”包括涉及被整合入蛋白质、多肽或肽(统称为“多肽”)中的氨基酸。该氨基酸可以是天然存在的氨基酸，或者除非另作限定，可以包括天然氨基酸已知的类似物，其以与天然存在的氨基酸相似的方式发挥作用。
【0035】“衍生物”是意欲表示一种来源于天然蛋白的多肽或蛋白质，是通过在天然蛋白的C-末端、N-末端或者两者上加入一个或多个氨基酸，在天然氨基酸序列中的一个或大量不同位点置换一个或多个氨基酸，在天然蛋白的单个或两个末端或者在该氨基酸序列的一个或多个位点缺失一个或多个氨基酸，或者在天然氨基酸序列中的一个或多个位点插入一个或多个氨基酸而获得的。酶衍生物的制品优选地通过修饰编码天然蛋白的DNA序列，将该DNA序列转化进合适的宿主并表达该修饰的DNA序列以形成衍生物酶而获得。制备衍生物的可选方法是本领域所熟知的，并且包括例如，天然蛋白或其衍生物的蛋白水解切割。与前体酶的氨基酸序列(例如根据本发明的野生型或天然状态的酶)相比，本发明纤维素酶的衍生物包括包含改变的氨基酸序列的肽，其保留了前体酶的特征性酶促特性，但在某些具体方面具有改变的特性。例如，改变的纤维素酶可以具有增加的最适pH或增加的温度耐受性，但将保留其特征性纤维素水解活性。此外，如此处所用，当涉及表达载体组分时，术语“来源于”表示与参考序列一致的序列是天然存在的或人工改造的变体，或者是化学合成的复制体(copy)或其变体，其保留了所需的功能。因此，来源于游动放线菌葡萄糖异构酶基因的启动子序列的参考将包括来自密苏里游动放线菌葡萄糖异构酶基因的功能性启动子序列、来自改造的蛋白衍生物诸如GIT的功能性启动子序列及类似物。(参见欧洲专利申请351029)。同样，共同未决申请USSN 10/992,149中所述的启动子(一种或多种)可在此处使用。
【0036】特定氨基酸序列的“保守取代”指对那些对于功能活性并非关键的氨基酸进行的氨基酸取代，或者用其它具有相似特性(例如酸性的、碱性的、荷正电或负电的、极性的或非极性的等)的氨基酸进行的氨基酸取代，以使对甚至关键氨基酸的取代也基本不改变活性。提供了功能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域所熟知的。
【0037】术语“启动子”在此被定义为一DNA序列，其结合RNA聚合酶并指导该聚合酶至感兴趣编码序列的正确的下游起始位点，从而导致转录。术语“启动子”也被理解为包括转录为mRNA后用于翻译的5’非编码区(在启动子和翻译起点之间)和顺式作用转录控制元件诸如增强子。该启动子对于在链霉菌中表达感兴趣的编码序列是有效的。
【0038】当一核酸与另一核酸序列被以功能相关方式放置时，则该核酸被“可操纵地连接”。例如，如果编码分泌前导物即信号肽的DNA被表达为参与多肽分泌的前蛋白，则该信号肽的DNA被可操纵地连接于编码多肽的DNA；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则其被可操纵地连接于该序列；或者如果放置核糖体结合位点以利于翻译，则该核糖体结合位点被可操纵地连接于编码序列。一般而言，“可操纵地连接”表示被连接的DNA序列是相邻的，且在分泌前导物的情况下，是相邻的并处于阅读相。然而，增强子不必是相邻的。连接是通过在方便的限制性位点进行连接反应完成的。如果此类位点不存在，则根据常规实践，使用合成的寡核苷酸连接物或接头。
【0039】如此处所用，术语“基因”表示涉及产生多肽链的DNA片段，其可以包括或者可以不包括编码序列之前和之后的区域，例如5′非翻译(5′UTR)或″前导″序列和3′UTR或″末尾″序列，以及单个编码片段(外显子)间的插入序列(内含子)。
【0040】当被用于有关核酸部分时，术语“异源的”表示该核酸包括两种或多种亚序列，其在自然界中正常情况下相互间未发现处于相同的关系。例如，核酸典型地通过重组产生，其具有两种或多种序列，例如来自不相关的基因，它们被排列以产生新的功能性核酸，例如来自一种来源的启动子和来自另一种来源的编码区。同样，异源蛋白通常将指两种或多种亚序列，其在自然界中相互间未发现处于相同的关系(例如融合蛋白)。
【0041】如此处所用，术语“分离的”或“纯化的”指从与其天然相关的至少一种组分中移出的核酸或者氨基酸。
【0042】在本上下文中，术语“基本纯的多肽”表示含有按重量计至多10％(10wt.％)与其天然相关的其它多肽物质的多肽制品(优选更低百分比的其它多肽物质，例如，至多8wt.％、至多6wt.％、至多5wt.％、至多4wt.％、至多3wt.％、至多2wt.％、至多1wt.％和至多1/2wt.％)。因此，优选基本纯的多肽为至少92％的纯度，即该多肽占多肽制品中存在的总多肽物质的至少92wt.％，且优选更高的百分比诸如至少94％的纯度、至少95％的纯度、至少96％的纯度、至少97％的纯度、至少98％的纯度、至少99％和至多99.5％的纯度。此处所公开的多肽优选地为基本纯的形式。具体而言，优选此处所公开的多肽为“基本纯的形式”，即该多肽制品基本上无与其天然相关的其它多肽物质。这可以通过例如用已熟知的重组方法制备该多肽来完成。据此，术语“基本纯的多肽”与术语“分离的多肽”和“分离形式的多肽”含义相同。
【0043】术语“重组体”当被用于涉及例如细胞、或核酸、蛋白或载体时，表示该细胞、核酸、蛋白或载体通过导入异源核酸或蛋白或者通过改变天然核酸或蛋白已被改造，或者表示该细胞来源于被如此改造的细胞。因此，例如，重组体细胞表达在天然(非重组)形式的细胞中不曾发现的基因，或者表达在其他情况下异常表达、表达不足或完全不表达的天然基因。
【0044】术语“分泌型信号肽”表示编码多肽(“分泌肽(secretory peptide)”)的DNA序列，作为较大多肽的组成部分，其引导该较大多肽经过合成该多肽的细胞的分泌通道。在通过分泌通道运输期间，该较大的多肽通常被切割以去除分泌肽。
【0045】“载体”指被设计为将核酸导入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌粒、盒以及类似载体。
【0046】如此处所用，“表达载体”表示一种DNA构建物，其包含被可操纵地连接于合适的调控序列的DNA序列，所述调控序列能够影响该DNA在合适宿主中的表达。此类调控序列可以包括影响转录的启动子、控制转录的任选的操纵子序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、增强子以及控制转录和翻译终止的序列。“表达载体”可以重组生成或合成产生，其带有一系列具体的核酸元件，这些元件允许特定核酸在靶细胞中转录。
【0047】术语“选择性标记”指一种能够在宿主中表达的基因，其使对含有导入的核酸或载体的宿主进行选择变得容易。可选择性标记的实例包括但不限于抗微生物剂(例如潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或赋予宿主细胞代谢优势诸如营养优势的基因。
【0048】“宿主株”或“宿主细胞”表示用于表达载体或DNA构建物的合适宿主，该表达载体或DNA构建物包含编码根据本发明的纤维素酶的多核苷酸。具体而言，宿主株可以是细菌诸如链霉菌属某种或者芽孢杆菌属某种。在本发明的实施方式中，“宿主细胞”表示由丝状真菌菌株细胞产生的细胞和原生质体，且具体而言是木霉属某种(Trichoderma sp.)或曲霉属某种(Aspergillus sp.)。
优选实施方式
A.宿主生物
【0049】根据本发明可以被使用的宿主细胞包括细菌和真菌细胞。优选的真菌宿主细胞包括丝状真菌细胞诸如曲霉属(Trichoderma)细胞和木霉属(Aspergillus)细胞。优选的细菌宿主细胞包括芽孢杆菌属(Bacillus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、放线菌属(Actinomyces)和链霉菌属(Streptomyces)细胞。特别优选的宿主细胞包括大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、缓慢芽孢杆菌(B.Lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、淀粉液化芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、凝结芽胞杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、B.lautus、巨大芽胞杆菌(B.megatherium)和苏云金芽胞杆菌(B.thuringiensis)。特别优选的宿主细胞还包括链霉属细胞，诸如灰色链霉菌(S.griseus)、变铅青链霉菌(S.lividans)、S.rubiginosis、纳塔尔链霉菌(S.natalensis)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)和阿维链霉菌(S.avermitilis)。在特别优选的实施方式中，宿主细胞是变铅青链霉菌(S.lividans)的菌株，且最特别优选的为菌株TK23和/或TK24。
【0050】在一种实施方式中，宿主细胞已被改造以减少或消除土臭味素或类土臭味素化合物的产生。土臭味素(geosmin)是由常见的细菌，链霉菌属某种产生的化学物。这是一个希腊词，翻译为“土壤的臭味(smell of earth)”。因此，土臭味素或类土臭味素化合物的减少或消除将产生臭味较少的组合物。
B.DNA构建物和载体
【0051】本发明的核酸构建物包括编码新型纤维素酶的序列，可以通过已建立的标准方法合成制备，例如Beaucage和Caruthers(1981)Tetrahedron Letters22：1859-1869所描述的亚磷酰胺方法或Matthes等(1984)EMBO Journal 3：801-805所描述的方法。核酸构建物可以是混合的合成来源与基因组来源，并可以通过连接合成DNA片段或基因组DNA片段加以制备。核酸构建物也可以使用特定引物通过聚合酶链式反应加以制备，例如如美国专利号4,683,202或Saiki等Science 239(1988)，487-491中所述。
【0052】本发明的DNA构建物可以被插入载体，诸如表达载体。各种适合于在真菌、酵母和细菌中克隆、转化和表达多肽的载体是本领域技术人员已知的。一般地，该载体或盒将包含本发明的启动子、任选的信号序列、感兴趣的编码区和终止子序列。在优选的实施方式中，载体将包括一个或多个位于信号序列和终止子序列间的克隆位点。
【0053】在一些优选的实施方式中，当纤维素酶基因被转入链霉菌宿主细胞时，转化作用包括使用载体，其包括本发明的启动子、编码来源于链霉菌纤维素酶基因的信号序列的核酸，优选变铅青链霉菌纤维素酶基因、以及编码细菌纤维素酶的多核苷酸，具体而言，是来源于链霉菌菌株的纤维素酶基因，最特别地，是变铅青链霉菌纤维素酶基因。该信号序列也可以来源于链霉菌菌株具体而言变铅青链霉菌的其它信号序列。
【0054】可以被用于本发明实践的示例性载体包括pSEGCT、pSEGCT11AG8和pSEACT。此类载体的构建是本领域所熟知的，并参考美国专利号6,287,839；美国专利号6,562,612和国际公布号WO 02/50245。pSEGCT的构建涉及使用两种质粒，pIJ486，其在Ward等(1986)Mol.Gen.Genet.203：468-478中有所描述，和pIJ488，其在Yanisch-Perron等(1985)Gene 33：103-119中有所描述。此外，参考了Hopwood等(1983)J.Gen.Microbiol.129：2257-2260。可以使用的其它载体包括pSEA4CT-11AG8、pKB105和pKB107，如实施例中所述。
C.宿主细胞的转化
【0055】本发明的载体将被转化进宿主细胞。一般的转化技术是本领域已知的(Ausubel等1994，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY和Campbell等1989 Curr.Genet 16：53-56)。一些此类一般技术包括，但不限于使用微粒或基因枪(生物射弹法)、在转化过程前对丝状真菌细胞壁进行渗透(例如通过使用高浓度的碱，例如0.05M至0.4M CaCl2或者乙酸锂)、原生质体融合、电穿孔或农杆菌介导的转化(美国专利号6,255,115)以及在Campbell等(1989)Curr.Genet.16：53-56，1989和Penttila，M等(1988)Gene，63：11-22中描述的用聚乙二醇和CaCl2处理原生质体或原生质球。
【0056】细菌的转化和表达方法在Brigidi，DeRossi，Bertarini、Riccardi和Matteuzzi(1990)，FEMS Microbiol.Lett. 55：135-138中公开。在Ferrari等美国专利号5,264,366中提供了优选的用于蛋白酶缺失芽孢杆菌菌株的优选的通用转化和表达流程。
【0057】链霉菌的转化和表达可以在Hopwood等GENETIC MANIPULATION OFSTREPTOMYCES：A LABORATORY MANUAL，(1985)John Innis Foundation，Norwich UK中发现。
【0058】在其它实施方式中，曲霉和木霉的转化和表达被在例如美国专利号5,364,770；美国专利号6,022,725和Nevalainen等1992，The Molecular Biology ofTrichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous andHeterologous Genes，in MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY，Eds.Leon andBerka，Marcel Dekker，Inc.pp.129-148中加以描述。
D.细胞培养
【0059】宿主细胞和转化细胞可以被培养在常规的营养培养基中。可以将用于被转化的宿主细胞的培养基修改为适于活化启动子并选择转化体。具体培养条件诸如温度、pH以及类似条件，可以是用于宿主细胞的那些条件，所述宿主细胞是经挑选用于表达的，而且这些条件对于本领域的技术人员而言是显然的。此外，优选的培养条件可以在科技文献诸如Sambrook，(1982)supra；Kieser，T，MJ.Bibb，MJ.Buttner，KF Chater，和D.A.Hopwood(2000)PRACTICAL STREPTOMYCESGENETICS.John Innes Foundation，Norwich UK；Harwood等(1990)MOLECULARBIOLOGICAL METHODS FOR BACILLUS，John Wiley中和/或从美国典型培养物保藏中心(ATCC；www.atcc.org)中发现。真菌宿主细胞诸如木霉细胞的稳定转化体，一般可以通过其较快的生长速率或在固体培养基上形成具有光滑而非粗糙轮廓的圆形克隆而与不稳定转化体相区别。
E.表达的多肽的回收
【0060】由转化的宿主细胞产生的多肽可以通过常规方法从培养基中回收，所述常规方法包括从培养基中通过离心或过滤分离宿主细胞，或者如有必要，破裂细胞并从细胞碎片和沉淀物移取上清液。
F.纯化蛋白的方法
【0061】一般在澄清之后，将上清或滤液中的蛋白质组分通过盐例如硫酸铵的方法加以沉淀。然后将沉淀的蛋白质溶解并通过各种色谱方法例如离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲合色谱以及其它本领域承认的方法加以纯化。在一些优选的实施方式中，为了纤维素酶的生产，优选在碱性条件下使用含基于纤维素酶的能量源的培养基培养宿主细胞。
G.应用
【0062】根据本发明的纺织品处理考虑用包含本发明纤维素酶的组合物进行纺织品加工或清洁。此类处理包括，但不限于石洗、改变含纤维素织物的质地、触感和/或外观、或者在含纤维素织物的制造或清洁/修复过程中所用的其它技术。此外，本发明上下文中的处理考虑从纤维素织物或纤维中去除“未成熟”棉或“死”棉。未成熟棉明显比成熟棉更加无定形，原因在于例如不均匀的染色。织物使用某些标准诸如织物的厚度、柔软度、硬度、光滑度和丰度(fullness)来进行主观评价。织物手感指人由触觉得到的对于纺织品材料的主观评价，具体而言是柔软度，并由专家小组各成员评价，从而产生专家组分数(panel score)。可选地，手感可以使用Kawabata评估体系进行客观地评价。参见例如，Kawabata，S.，″The Standardizationand Analysis of Hand Evaluation，″Textile Machinery Society of Japan，Osaka，1980。
【0063】本发明所考虑的组合物进一步包括用于清洗污染的、制成的含纤维素织物的纤维素酶组分。例如，本发明的纤维素酶可以被用于洗衣店所用的去污剂组合物。根据本发明有用的去污剂组合物包括特殊的配方诸如预洗、预浸以及家用彩色修理组合物。如此处所述，此类处理组合物可以是需要稀释的浓缩物的形式或稀溶液的形式，其可以直接应用于含纤维素织物。用于纺织品纤维素酶处理的一般处理技术在例如欧洲专利公布号220 016以及英国申请号1,368,599和2,095,275中被加以描述。
【0064】出于本领域已知的目的，根据本发明对纤维素物质进行处理进一步考虑对动物饲料、浆和/或纸、食品以及谷物进行处理。例如，已知纤维素酶能够提高动物饲料的价值、改善木浆的排水性能、强化食品，以及在谷物的湿法碾磨加工或干法碾磨加工过程中减少谷物中的纤维。
【0065】用本文所述的纤维素酶处理废纸可以使纸脱墨。因此，在由废纸加工再循环纸的过程中，使用本文中所述的纤维素酶可以极大地减少残留墨迹的纤维，从而提高废纸的白度。可以被用于本发明的废纸的实例包括用过的印刷纸诸如旧报纸、旧杂志纸和含机械浆和化学浆的低等级或中等级旧印刷纸；包含化学浆的用过的无木材纸；及其包被的纸。此处所用的术语“脱墨剂”表示那些在废纸脱墨过程中通常使用的药品，包括碱诸如NaOH或Na2CO3、硅酸钠、过氧化氢、磷酸盐、阴离子或非离子表面活性剂、捕集剂诸如油酸、pH稳定剂如助剂、螯合剂或分散剂。
【0066】用本文所述的纤维素酶处理纸浆可以在不明显降低其强度的条件下显著改善纸浆的游离度(排水性)。因此，本纤维素酶提供了一种改善纸浆游离度的方法，包括用本文所述的纤维素酶处理纸浆的步骤。可以通过本发明的方法进行处理的纸浆实例包括废纸纸浆、再循环纸板纸浆、牛皮纸浆、亚硫酸盐浆或加工/热处理的纸浆以及其它高产率纸浆。
【0067】此外，动物饲料中葡聚糖的可消化性可以通过在此类饲料中使用本文所述的纤维素酶而得以改善。因此，此处所提供的是一种改善动物饲料的可消化性的方法，包括用本文所述的纤维素酶处理动物饲料的步骤。
【0068】根据本发明的处理包括制备水溶液，其含有有效量的纤维素酶或者纤维素酶与其它任选组分的组合，所述其它任选组分包括，例如缓冲液、表面活性剂和/或分散剂。有效量的纤维素酶组合物是指纤维素酶的浓度足以达到预期的目的。因此，例如在根据本发明的石洗组合物中“有效量的”纤维素酶是指将提供预期效果的量，例如在接缝和布块(fabric panel)上产生穿旧的且退色的外观。同样，组合物中意欲用于改善含纤维素织物的手感和/或外观的“有效量”的纤维素酶是指其量在手感方面产生可测量的改善，例如改善织物的光滑度或外观，例如去除容易降低织物外观清晰度的起球和小纤维。所使用的纤维素酶的量还决定于所用的设备、所用的加工参数(纤维素酶处理溶液的温度、暴露于纤维素酶的时间及类似的参数)、纤维素酶活性(例如当与较低活性的纤维素酶组合物相比，使用较高活性的纤维素酶组合物的特定溶液将要求较低的纤维素酶浓度)以及织物类型。含水处理溶液中的纤维素酶的准确浓度可以由普通技术人员根据以上各因素以及所期望的结果容易地确定，所述含水处理溶液中将加入将要被处理的织物。在石洗过程中，一般优选地，纤维素酶以大约0.5至5,000ppm且最优选地大约10至200ppm总蛋白的浓度存在于含水处理溶液中。在用于改善含纤维素织物的手感和/或外观的组合物中，一般优选地，纤维素酶以大约0.1至2,000ppm且最优选地大约0.5至200ppm总蛋白的浓度存在于含水处理溶液中。
【0069】在一种优选的处理实施方式中，缓冲液被应用于该处理组合物，以便使缓冲液的浓度足以使溶液的pH保持在使所用纤维素酶显示出活性的范围内。纤维素酶显示活性时的pH决定于所用纤维素酶的特性。所用缓冲液的准确浓度将决定于若干因素，技术人员可以容易地考虑这些因素。例如，在一种优选的实施方式中，对缓冲液以及缓冲液浓度进行选择以便将最终纤维素酶溶液的pH保持在最适纤维素酶活性所要求的pH范围内。本发明纤维素酶的最适pH范围的测定可以根据熟知的技术加以确定。pH在所述纤维素酶的活力范围内的合适缓冲液对于本领域技术人员而言也是熟知的。
【0070】除纤维素酶与缓冲液之外，所述处理组合物可以任选地含有表面活性剂。合适的表面活性剂包括与所用的纤维素酶以及织物相容的任何表面活性剂，包括例如阴离子、非离子以及两性表面活性剂。合适的阴离子表面活性剂包括，但不限于直链或支链烷基苯磺酸盐；含有直链或支链烷基基团或烯基基团的烷基或烯基醚磺酸酯；烷基或烯基磺酸盐；烯烃磺酸盐；链烷磺酸盐及类似物。阴离子表面活性剂的合适的相反离子包括，但不限于碱金属离子诸如钠和钾；碱土金属离子诸如钙和镁；铵离子；以及含有碳数2或3的1至3个烷醇基团的链烷醇胺。两性表面活性剂包括，例如季铵盐磺酸盐和三甲铵乙内酯型两性表面活性剂。此类两性表面活性剂在同一分子中同时具有正电基团和负电基团。非离子型表面活性剂一般包括聚乙二醇醚、以及高级脂肪酸的链烷醇酰胺或其环氧烷烃加合物、和脂肪酸甘油单酯。表面活性剂的混合物也可以按照本领域技术人员已知的方式加以利用。
【0071】可以制备浓缩的纤维素酶组合物用于本文所述的方法中。此类浓缩物包含浓缩量的上述纤维素酶组合物、缓冲液和表面活性剂，优选地在水溶液中。当如此配制时，纤维素酶浓缩物可以用水容易地稀释以便迅速而准确地制备含有所需浓度的每种组分的纤维素酶制剂。在配制含水浓缩物时，可以将这些浓缩物稀释以便达到如上所示的纤维素酶溶液中所需的组分浓度。显而易见，此类纤维素酶浓缩物使得能够容易地配制纤维素酶溶液，并使得能够切实可行地将此组合物输送至将被使用的部位。该处理浓缩物可以是本领域已知的任何形式，例如液体、乳剂、凝胶或软膏。此类形式是本领域技术人员所熟知的。
【0072】在使用固体纤维素酶浓缩物时，该纤维素酶组合物可以是颗粒、粉末、附聚物或固体盘。可以配制颗粒以便包含各种物质从而降低颗粒溶入洗涤介质的速率。此类物质和颗粒在美国专利号5,254,283中被公开，该专利以其整体并入本文作为参考。
【0073】如果需要，其它物质也可以与本发明的纤维素酶组合物一起使用或者放入本发明的纤维素酶组合物中，包括石料、浮石、填充剂、溶剂、酶活化剂和抗再沉淀剂，这取决于组合物的最终用途。
【0074】以举例方式，将具体描述石洗的方法，但是，所述参数可被技术人员方便地修改以用于其它应用，即改善纤维的手感和/或外观。将含纤维素织物与含纤维素酶的石洗组合物接触，并因此使纤维素酶与织物接近，所述石洗组合物通过将处理组合物与石洗组合物相混合而含有有效量的纤维素酶。随后，将含纤维素酶的水溶液与织物搅动。如果处理组合物是水溶液，则可以将织物直接浸入溶液。同样，当石洗组合物是浓缩物时，将浓缩物稀释入装有含纤维素织物的水浴中。当石洗组合物为固体形式例如预洗凝胶或固体棒时，石洗组合物可以通过将组合物直接应用于织物或者应用于洗涤液而与织物相接触。
【0075】在能够有效地进行酶促作用以赋予含纤维素织物石洗外观的条件下，将含纤维素的织物与石洗溶液一起温育。例如，在石洗过程中可以调整pH、液体比例、温度和反应时间从而优化石洗组合物起作用的条件。“有效条件”必然是指pH、液体比例和温度，其使得纤维素酶能够与含纤维素织物有效地进行反应，在此情况下以产生石洗效果。将本发明使用石洗组合物的条件最大化是在本领域技术人员的技能范围内的。
【0076】此处所用的石洗过程中的液体比例，即石洗组合物溶液(即洗涤液)的重量与织物重量之比，一般是足以获得预期的斜纹粗棉布织物石洗效果的量，并决定于所使用的方法。优选地，液体比例为大约3∶1至大约50∶1；更优选地大约5∶1至大约20∶1；且最优选地大约10∶1至大约15∶1。
【0077】使用本石洗组合物的石洗过程中的反应温度受两个竞争性因素控制。首先，较高的温度一般对应于增强的反应动力学，即更快的反应，与在较低温度下所需的反应时间相比，其允许减少反应时间。因此，反应温度一般是至少大约10℃以及更高。其次，纤维素酶是一种蛋白质，其在超出给定的反应温度时损失活力，该温度决定于所用纤维素酶的性质。因此，如果使反应温度上升过高，将因为纤维素酶的变性而损失纤维素水解活性。尽管本领域中纤维素酶使用的标准温度一般为范围35℃至65℃，且同样期望这些条件适于本发明的纤维素酶，但是对于所用的具体纤维素酶，最佳的温度条件应当根据的熟知的技术加以确定。
【0078】反应时间决定于进行石洗的具体条件。例如，纤维素酶的pH、温度和浓度都将影响最适反应时间。一般而言，反应时间为大约5分钟至大约5小时，且优选地大约10分钟至大约3小时，更优选地，大约20分钟至大约1小时。
【0079】根据本发明的仍一优选实施方式，本发明的纤维素酶可以被应用于去污剂组合物。根据本发明的去污剂组合物被用作预洗组合物、预浸组合物，或者用于常规清洗或漂洗循环过程中的清洁。优选地，本发明的去污剂组合物包括有效量的纤维素酶、表面活性剂，且任选地包括以下所述的其它组分。
【0080】本发明的去污剂组合物中所用的有效量的纤维素酶，其量足以提供由纤维素酶在含纤维素织物上所产生的理想的效果，例如去球、软化、抗起球、表面小纤维的清除、抗泛灰以及清洁。优选地，去污剂组合物中的纤维素酶以浓度为去污剂的大约10ppm至大约20,000ppm使用。
【0081】去污剂组合物中所用的纤维素酶的浓度经优选地选择，以使得当稀释入洗涤介质后，纤维素酶的浓度范围为大约0.01至大约1000ppm，优选地大约0.02至大约500ppm，且最优选地大约0.5至大约250ppm的总蛋白。去污剂组合物中所用纤维素酶的量将决定于该去污剂在被加入水中以形成洗涤溶液时将被稀释的程度。
【0082】本发明的去污剂组合物可以是本领域所认知的任何形式，例如，如液体、颗粒、乳剂、凝胶或软膏形式。此类形式是技术人员所熟知的。当使用固体去污剂组合物时，优选地将纤维素酶配制为颗粒。优选地，可以将颗粒配制为使其额外地含有纤维素酶保护剂。可以将颗粒配制为使其含有降低颗粒溶于洗涤介质的溶解速率的物质。此类物质和颗粒在美国专利号5,254,283中被公开，该专利被整体并入本文作为参考。
【0083】本发明的去污剂组合物使用表面活性试剂，即表面活性剂，包括阴离子、非离子和两性表面活性剂，它们在去污剂组合物中的用途是熟知的。
【0084】适用于本发明的去污剂组合物的阴离子表面活性剂包括直链或支链烷基苯磺酸盐；含有直链或支链烷基基团或烯基基团的烷基或烯基醚磺酸酯；烷基或烯基磺酸盐；烯烃磺酸盐；链烷磺酸盐。阴离子表面活性剂的合适的相反离子包括碱金属离子诸如钠和钾；碱土金属离子诸如钙和镁；铵离子；以及含有碳数2或3的1至3个烷醇基团的链烷醇胺。两性表面活性剂包括，例如季铵盐磺酸盐和三甲铵乙内酯型两性表面活性剂。此类两性表面活性剂在同一分子中同时具有正电基团和负电基团。非离子型表面活性剂一般包括聚乙二醇醚、以及高级脂肪酸链烷醇酰胺或其环氧烷烃加合物、和脂肪酸甘油单酯以及类似物。适用于本发明的表面活性剂在英国专利申请号2 094 826 A中公开，其公开内容在此被并入本文作为参考。也可以使用此类表面活性剂的混合物。一般被用于本发明去污剂组合物的表面活性剂或表面活性剂混合物的量为总去污剂组合物的大约1wt.％至大约95wt.％，且优选地为总去污剂组合物的大约5wt.％至大约45wt.％。除纤维素酶组合物和表面活性剂(一种或多种)外，本发明的去污剂组合物可以任选地含有一种或多种下列组分：
除纤维素酶外的水解酶
【0085】合适的水解酶包括作用于酯键的羧酸酯水解酶、硫酯水解酶、磷酸单酯水解酶和磷酸二酯酶；作用于糖基化合物的葡糖苷水解酶；水解N-糖基化合物的酶；作用于醚键的硫醚水解酶；以及α-氨基-酰基-肽水解酶、肽基-氨基酸水解酶、酰基-氨基酸水解酶、二肽水解酶、以及作用于肽键的肽基-肽水解酶。其中优选的是羧酸酯水解酶、葡糖苷水解酶和肽基-肽水解酶。合适的水解酶包括：
(1)属于肽基-肽水解酶的蛋白酶，诸如胃蛋白酶、胃蛋白酶B、凝乳酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶A、胰凝乳蛋白酶B、弹性蛋白酶、肠激酶、组织蛋白酶C、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、无花果蛋白酶、凝血酶、纤维蛋白溶酶、高血压蛋白原酶、枯草杆菌蛋白酶、曲霉菌肽酶A(aspergillopeptidase A)、胶原酶、梭菌肽酶B(clostridiopeptidase B)、激肽释放酶、gastrisin、组织蛋白酶D、菠萝蛋白酶、角蛋白酶、胰凝乳蛋白酶C、胃蛋白酶C、曲霉菌肽酶B(aspergillopeptidase B)、尿激酶、羧肽酶A和B、以及氨基肽酶；
(2)葡糖苷水解酶(为主要成分的纤维素酶被排除在本组之外)α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、转化酶、溶菌酶、果胶酶、几丁质酶和葡聚糖酶。其中优选的是α-淀粉酶和β-淀粉酶。它们在酸性至中性体系中发挥作用，但从细菌中获得的一种酶在碱性体系中表现出高活性；
(3)羧酸酯水解酶，包括羧基酯酶、脂肪酶、果胶酯酶和叶绿素酶。其中特别有效的是脂肪酶。
【0086】根据目的所需，将除纤维素酶外的水解酶加入去污剂组合物。依据纯化的蛋白，应当优选地以0.001t.％至5wt.％，且更优选地0.02wt.％至3wt.％的量加入水解酶。此酶应当以颗粒形式使用，所述颗粒由粗制酶单独制成或者由粗制酶与去污剂组合物中的其它组分组合制成。粗制酶的颗粒以纯化酶占颗粒的0.001wt.％至50wt.％的量使用。该颗粒以0.002wt.％至20wt.％且优选地0.1wt.％至10wt.％的用量使用。当与纤维素酶一起使用时，这些颗粒可以被配制为含有酶保护剂和溶解延迟物质。
阳离子表面活性剂和长链脂肪酸盐
【0087】此类阳离子表面活性剂和长链脂肪酸盐包括饱和或不饱和脂肪酸盐、烷基或烯基醚的羧酸盐、α-硫代脂肪酸盐或酯、氨基酸型表面活性剂、磷酸酯表面活性剂、包括那些具有3至4个烷基取代基以及多至1个苯基取代的烷基取代基的季铵盐。合适的阳离子表面活性剂和长链脂肪酸盐在英国专利申请号2 094 826 A中被公开，其公开内容在此被并入本文作为参考。该组合物可以含有大约1wt.％至大约20wt.％的此类阳离子表面活性剂和长链脂肪酸盐。
助洗剂
A.二价螯合剂
【0088】该组合物可以含有大约0wt.％至大约50wt.％的一种或多种助剂组分，选自下列化合物的碱金属盐和链烷醇胺盐：磷酸盐、膦酸盐、膦基羧酸盐、氨基酸盐、氨基聚乙酸盐高分子电解质、非解离聚合物(non-dissociating polymers)、二羧酸盐和铝硅酸盐。合适的二价螯合剂在英国专利申请号2 094 826 A中被公开，其公开内容在此被并入本文作为参考。
B.碱金属或无机电解质
【0089】该组合物可以含有基于组合物的大约1至大约50wt.％，优选地大约5至大约30wt.％下列化合物的一种或多种碱金属盐，如碱或无机电解质：硅酸盐、碳酸盐和硫酸盐，以及有机碱诸如三乙醇胺、二乙醇胺、单乙醇胺和三异丙醇胺。抗再沉积剂
【0090】该组合物可以含有大约0.1至大约5wt.％的一种和多种下列化合物，如抗沉淀剂：聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和羧甲基纤维素。
【0091】其中，羧甲基纤维素和/或聚乙二醇与本发明的纤维素酶组合物的组合提供了一种特别有用的污渍清除组合物。
漂白剂
【0092】将本发明的纤维素酶与漂白剂，诸如单过硫酸钾、重碳酸钠、过硼酸钠、硫酸钠/过氧化氢加合物以及氯化钠/过氧化氢加合物或/和光敏感型漂白染料诸如磺酸化苯二甲蓝染料的锌盐或铝盐，组合使用进一步改善了去污效果。同样，可以使用EP 684 304中所述的漂白剂和漂白催化剂。
上蓝剂和荧光染料
【0093】如有必要，可以将各种上蓝剂和荧光染料加入该组合物中。合适的上蓝剂和荧光染料在英国专利申请号2 094 826 A中被公开，其公开内容在此被并入本文作为参考。
结块抑制剂
【0094】下列结块抑制剂可以被加入粉末状去污剂中：对甲苯磺酸盐、二甲苯磺酸盐、乙酸盐、硫代琥珀酸盐、滑石、精细研磨的硅石、无定形硅石、粘土、硅酸钙(诸如Micro-Cell of Johns Manville Co.)、碳酸钙和氧化镁。
抗氧化剂
【0095】抗氧化剂包括，例如叔丁基-羟基甲苯、4，4′-亚丁基双(6-叔丁基-3-甲基苯酚)、2，2′-亚丁基双(6-叔丁基-4-甲基苯酚)、单苯乙烯甲酚、二苯乙烯甲酚、单苯乙烯苯酚、二苯乙烯苯酚和1，1-双(4-羟基-苯基)环己烷。
增溶剂
【0096】增溶剂包括，例如低碳醇类诸如乙醇、苯磺酸盐、低碳烷基苯磺酸盐诸如对甲苯磺酸盐，二元醇诸如丙二醇、乙酰基苯磺酸盐、乙酰胺、吡啶二羧酸酰胺、苯甲酸盐和脲。
【0097】本发明的去污剂组合物可以在酸性至碱性pH的宽pH范围内使用。在优选的实施方式中，本发明的去污剂组合物可以在弱酸性、中性或者碱性去污剂洗涤介质中使用，所述介质具有从5以上至不大于约12的pH。
【0098】除以上组分外，如需要，可以将香精、缓冲液、防腐剂、染料以及类似物与本发明的去污剂组合物一起使用。此类组分按本领域此前的用量常规使用。
【0099】当本发明中所用的去污剂基础物为粉末形式时，其可以通过任何已知的制备技术加以制备，包括喷雾干燥法和造粒法。具体而言，优选通过喷雾干燥法、团聚法、干燥混合法或非塔式线路法(non-tower route method)获得的去污剂基础物。通过喷雾干燥法获得的去污剂基础物并未限定制备条件。通过喷雾干燥法获得的去污剂基础物是中空的颗粒，其是通过将耐热组分诸如表面活性剂和助洗剂的含水浆喷洒进入热空间而获得。在喷雾干燥以后，可以加入香精、酶、漂白剂、无机碱助洗剂。与诸如通过喷雾干燥造粒或团聚法获得的高稠度颗粒状去污剂基础物一起，也可以在制备该基础物之后加入各种组分。
【0100】当去污剂基础物是液体时，其可以是均一的溶液或者不均一的分散系。为消除由去污剂中纤维素酶造成的羧甲基纤维素分解，期望在加入组合物以前，将羧甲基纤维素颗粒化或者包被。
【0101】在工业或家庭用途中，本发明的去污剂组合物可以与含纤维素织物例如污损的织物，在此类环境中所常规使用的温度、反应时间和液体比例下一起温育。
【0102】此外，根据本发明的去污剂可以配制为中性pH下适宜溶液中的预洗剂，在此溶液中存在充分的活性以提供所需的软化、去球、防起球、表面小纤维的清除或者清洁。当去污剂组合物是作为液体、喷雾剂、凝胶或膏组合物的预浸(例如预洗或预处理)组合物时，纤维素酶一般是按预浸或预处理组合物总重量的大约0.0001至大约1wt.％使用的。在此类组合物中，可以任选地使用表面活性剂，当使用表面活性剂时，其一般以预浸剂总重量大约0.005至大约20wt.％的浓度存在。该组合物的剩余部分包括预浸剂中所使用的常规组分，即稀释剂、缓冲液、其它酶类(蛋白酶)以及类似物，浓度为它们的常规浓度。
【0103】包含此处所述的纤维素酶的组合物预计可以作为单一的组合物用于家庭使用，该组合物适用于使已退色的织物恢复色彩(参见例如美国专利号4,738,682，其在此以其整体并入本文作为参考)，和用于污渍清除剂以及用于去除起球和抗起球(起球预防)。
【0104】根据本发明的纤维素酶的用途可以在饲料添加剂以及在浆和纸的加工过程中特别有效。其它此类工业应用在例如PCT公布号95/16360和芬兰授权专利号87372中被分别描述。
【0105】为进一步举例说明本发明及其优势，提供了下列具体实施例，其应当理解为被提供用于对本发明进行举例说明，而不应当以任何方式被解释为对本发明范围的限定。
【0106】以下实验公开内容中，应用了下列缩略语：eq(当量)；M(摩尔的)；μM(微摩尔)；N(正常)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；μmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)；g(克)；mg(毫克)；kg(千克)；μg(微克)；L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(纳米)；℃(摄氏度)；h(小时)；min(分钟)；sec(秒)；msec(毫秒)；Ci(居里)；mCi(毫居里)；μCi(微居里)；TLC(薄层色谱)；Ts(甲苯磺酰基)；Bn(苄基)；Ph(苯基)；Ms(甲磺酰基)；Et(乙基)、Me(甲基)。
实施例
【0107】本发明在下列实施例中被进一步地详细描述，所述实施例并非意欲以任何方式限定本发明所要求保护的范围。所附的附图意欲被视为本发明的说明或描述的完整部分。对于在其中描述的所有内容，所有引用的参考文献在此被明确并入本文作为参考。提供下列实施例用以举例说明而非限定所要求保护的发明。
实施例1
载体的构建
【0108】此实施例举例说明了质粒的构建，该质粒包括新型纤维素酶催化核心。
【0109】如本文中图3所示以及美国专利号6,562,612的实施例6中所述，含GI启动子的pSEGCT11 AG8载体被用作制作本发明所用载体的基础。pSEA4CT-11AG8载体的构建在美国专利申请系列号10/992,149(2004年11月18日提交)的实施例2中有所描述，并参考本申请的图4(pSEA4CT-11 AG8的图谱)。
【0110】质粒pKB105是通过用编码新型纤维素酶催化核心的序列替换编码全长11AG8纤维素酶的片段，由质粒pSEA4CT-11 AG8构建而成的。参见图5(其中编码新型纤维素酶催化核心的序列被命名为“11AG8核心I”)。图6表示pKB105载体。
【0111】新型纤维素酶催化核心表达载体pKB107来源于pKB105。去除pKB105中的大肠杆菌DNA序列产生质粒pKB107。为了去除大肠杆菌序列，用SphI、EcoRI和HindIII在37℃下将pKB105消化过夜。用Qiagen试剂盒纯化消化后的DNA，然后重新连接用于转化链霉菌宿主细胞。图7表示pKB107载体。
实施例2
表达与活性
【0112】下列实施例描述了新型纤维素酶的表达与活性。
2A.转化与表达
【0113】实施例1中构建的表达载体pSEA4CT-11 AG8和pKB107被用于本实施例。
【0114】在这些实验中，用上述载体转化宿主变铅青链霉菌细胞。转化技术为Hopwood等，GENETIC MANIPULATION OF STREPTOMYCES，A LABORATORYMANUAL.The John Innes Foundation，Norwich，United Kingdom(1985)中所述的原生质体法。
【0115】用如上所述的表达载体之一转化变铅青链霉菌细胞。将转化后的细胞在azo-CMC培养板上铺板，并通过“晕”的产生鉴定出表达纤维素酶的克隆。在30℃，存在50ug/ml硫链丝菌肽的情况下，使产生晕的克隆在摇瓶里的TS中生长3天。然后将细胞转移至无抗生素的生产培养基中，并继续生长另外的3天。取样用于酶活性分析。
【0116】TS＝16g Difco胰化蛋白胨、4g Difco大豆蛋白胨、20g酪蛋白(水解产物)sigm和5g K2HPO4，定容至1升。经高压灭菌后，加入50％的过滤除菌的葡萄糖，至终浓度1.5％。
【0117】生产培养基：2.4g柠檬酸*H2O；8.3g Biospringer酵母提取物；2.4g(NH4)2SO4；72.4g MgSO4 *7H2O；0.1g CaCl2 *2H2O；0.3ml Mazu DF204(防沫剂)；5ml链霉菌修饰的痕量元素(1升贮存液，含：250g柠檬酸*H2O；3.25gFeSO4 *7H2O；5g ZnSO4 *7H2O；5g MnSO4 *H2O；0.25g H3BO3)；10g葡萄糖，将体积调至1升。用NaOH将pH调至6.9。
2B.回收
【0118】从每一摇瓶中取1ml样品并在14,000rpm下离心。将上清部分用于酶分析。
【0119】此外，用转化的培养物进行发酵培养。在各时点，移取发酵肉汤样品用于分析。离心除去细胞物质。
2C.纤维素酶活性的改性分析
【0120】本实施例说明了，通过使用微量滴定板，一种简便、直接、可靠且省时的试验可以被用于评价纤维素酶活性。
【0121】使用来自前面定量发酵样品的、具有2201单位/mL活性的标准酶参照物。稀释缓冲液：100mM磷酸钠，pH8.0，经0.2um滤膜除菌，被用于稀释样品和底物。通过将12g NaH2PO4混入800mfl去离子水以制备稀释缓冲液，并用6N NaOH将pH调至达pH8.0，定容至终体积1.0L，然后0.2um滤膜除菌。
【0122】将标准酶参照物40×(40倍)稀释，然后2×系列稀释3至5次。将摇瓶样品2×系列稀释3至5次。将发酵罐样品20至50×稀释，随后2×系列稀释，3至5次。因此，对于每一实验样品和标准酶参照物而言，都有总共3至5个不同蛋白浓度的样品。
【0123】对于该试验，将180uL 0.5mg/ml 2-硝基苯基β-D-纤维二糖苷(Sigma)在稀释缓冲液中(见上)与20ul样品于室温下在96孔板(″9017″型，Costar，Cambridge，MA)中混合。
【0124】通过使用Spectra MAX250分光光度计(Spectra，Sunnyvale，CA，U.S.A.)在8分钟内以9秒的时间间隔在405nm处读取吸光度来测量纤维素酶活性，并确定动力学平均值。
【0125】结果在图8中表示。Y-轴是NPC单位/ml。由此可见，与完整的纤维素酶相比，去除CBD显著增加了中性纤维素酶的活性。
实施例3
洗涤性能
【0126】下列实施例比较了颗粒化的实验新型催化核心样品KB107C混合物(95％KB107C+5％IndiAgeNeutra L)与商业11AG8产品IndiAgeNeutra G(GenencorIntl.)的洗涤性能。每一轮使用相同的总ONPC活性给予酶。
【0127】用于35kg斜纹粗棉布基质的实验方法可以被概括如下：
步骤1：脱浆(55℃/20分钟)
步骤2：沥干与漂洗
步骤3：纤维素酶处理(55℃/pH 6.5/60分钟)
步骤4：冷漂洗(1-2分钟)
步骤5：热漂洗(70℃/5分钟)
步骤6：冷漂洗(1-2分钟)
步骤7：在萃取器中萃取
步骤8：在滚筒式干燥器中干燥
步骤9：评价
试验
【0128】在55℃下用0.57g/L配制的Optisize和0.25g/L Triton X-100脱浆20分钟。
【0129】用新颗粒(95％KB107C+5％IndiAgeNeutra L)和IndiAgeNeutra G在生产级腹式洗衣机(production scale belly washer)中处理脱浆的斜纹粗棉布基质，条件如下：
●液体比例(LR)：15∶1(525 L水，35Kg脱浆的斜纹粗棉布牛仔裤)
●表面活性剂：Lutensol AT80，于0.14g/L
●处理温度：55℃；pH：6.5±0.2(磷酸二氢钠缓冲液，用乙酸调节pH)
●处理时间：60分钟
●漂洗3次
【0130】使用下列酶剂量进行了多种试验：1)IndiAgeNeutra G，1,702×103单位/轮；2)0.65×颗粒，1,106×103单位/轮(#1,65％活力)；3)IndiAgeNeutra G，1,702×103单位/轮-双倍于#1；4)0.65×颗粒，1106×103单位/轮(试验3，65％活力)-双倍于#2；和5) 0.65×颗粒，1,702×103单位/轮。
【0131】纤维素酶处理后，从试验1-5的每一轮中随机选取五条斜纹粗棉布裤腿，微微漂白以去除该斜纹粗棉布的前面上的回染。在Unimac中，将所有选取的斜纹粗棉布裤腿与10g/L次氯酸钠(6.15％活性)和苏打灰一起在65℃下漂白20分钟，随后进行表面活性剂洗涤。
回染和磨损的评估：
【0132】为对纤维素酶处理后的回染和磨损水平定量，用Minolta的Chroma MeterCR-200从每条斜纹粗棉布裤腿获取6个反射计读数。CIE L*值被用于定量测定磨损情况，而CIE b*值被用于定量测定回染情况。L*表示亮度，而-b*表示CIELAB彩色空间中的蓝色。因此，较高的L*表示较高的磨损，而较高的-b*表示较高的回染。
【0133】如“Precise Color Communication”，Minolta Camera Co.，Ltd，1993，2.Hunter，R.S.abd G+Harold，R.“The measurement of Appearance”，J.Wiley and Sons，NY，2ndedition，1987中所述，进行测量。
结果
【0134】试验结果表明，1×活力的商业IndiAgeNeutra G的洗涤强度大致等同于0.65×活力的新型Neutra G(95％KB107C+5％IndiAgeNeutra L)。该结果在以下的表1中以及图9和10中表示。
表1：IndiAgeNeutra G与0.65×新型Neutra G的磨损与回染性能
试验号   酶   剂量(NPCU/轮)           磨损(CIE L*)       回染(CIE Ib*I)
    SB/靛蓝     靛蓝   SB/I-BL    SB/靛蓝   靛蓝   SB/I-BL
12   IndiAgeNeutraGNeutraG-新型 1702×1031106×103 30.8230.18 22.7322.40 n/an/a 3.883.08 3.402.71 n/an/a
34   IndiAgeNeutraG(DPT1)NeutraG-新型(DPT2) 1702×1031106×103 31.2131.12 23.4223.45 37.4837.35 4.023.75 3.923.63 3.893.90
5   NeutraG-新型 1702×103 32.73 24.25 39.14 4.43 4.26 3.93
注：
*SB/靛蓝：用纤维素酶处理的硫磺底(sulfur bottom)/靛蓝染色的斜纹粗棉布
**靛蓝：用纤维素酶处理的靛蓝染色的斜纹粗棉布
***SB/I-BL：用纤维素酶处理，随后经漂白的硫磺底/靛蓝染色的斜纹粗棉布
【0135】在测试条件下，65％活性的新型Neutra G(95％KB107C+5％IndiAgeNeutra L)表现出与100％活性的IndiAgeNeutra G非常相似的磨损性能，而100％活性的新型Neutra G明显表现出比100％活性的IndiAgeNeutra G更高的磨损性能。在相似的磨损性能下，新型Neutra G与IndiAgeNeutra G之间未观察到回染性能方面的显著差异。
实施例4
差示扫描量热法(Differential Scanning Calorimetry)
【0136】下列实施例描述了新型纤维素酶热稳定性的测定。
【0137】按以上实施例2所述制备KB107C。然后按如下配制KB107C：
蔗糖40.0％
柠檬酸钠，二水合物       2.84％(2.50％无水)
磷酸钠，二碱价七水合物   4.72％(2.50％无水)
山梨酸钾                 0.25％
对羟基苯甲酸甲酯         0.03％
对羟基苯甲酸丙酯         0.01％
                                                     
总计                     47.85％
活性                     7500-9000U/g
pH                       5.8-6.2
【0138】加入对羟基苯甲酸酯作为贮存液：15％对羟基苯甲酸甲酯；5％对羟基苯甲酸丙酯；80％丙二醇。以上配方与商业产品IndiAgeNeutra L相同。
【0139】用1.2 M硫酸铵将IndiAgeNeutra L和KB107C从该制剂中沉淀。将沉淀重悬并透析入20mM磷酸钠，pH6.8中。Slide-A-Lyzer 7K透析盒(Pierce，IL)被用于透析，并在24小时内更换四次缓冲液进行透析。最终的透析液被用于稀释蛋白样品。相对于最终透析液作为参照，对样品的过热容量(excessive heat capacity)进行测量。
【0140】用超灵敏扫描微量热量计VP-DSC E-2000(Microcal，Inc.，Northhampton，Ma.)测量过热容量曲线。应用90℃/分钟的加热速率，且蛋白质浓度在0.2mg/ml的范围内。之前已经公开了DSC测量的标准方法以及该技术的原理(Freire，E.(1995)Differential Scanning Calorimetry Methods.Mol. Biol. 41，191-218)。
【0141】IndiAgeNeutra L和KB107C的热稳定性作为温度(20-100℃)的函数，分别表示为IndiAgeNeutra L和KB107C的热中点(themal midpoint，Tm)67.8℃和68.7℃(参见图11)。在该仪器给定的灵敏度下，对于KB107C而言，升高1℃的转变温度的作用是显著的。这表明，KB107C的热动力学特征与IndiAgeNeutra L的不同，并且与其在应用研究中的强化性能相一致。
【0142】应当理解，本文所述的实施例和实施方式仅为举例说明的目的，其各种修改和变动对本领域的技术人员而言是不言自明的，并且将包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。对于所有目的，本文中所引用的所有出版物、专利以及专利申请以其整体并入本文作为参考。

Claims (37)

1.一种分离的纤维素酶，包括SEQ.ID NO：_中所提供的氨基酸序列；或其衍生物，其具有纤维素水解活性并与SEQ.ID NO：_具有至少95％的序列同一性。
2.根据权利要求1所述的纤维素酶，其中所述纤维素酶包括SEQ ID NO：_中所提供的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的纤维素酶，其中所述纤维素酶是由与SEQ ID NO：(图2)具有至少90％序列同一性的DNA序列编码的。
4.根据权利要求1所述的纤维素酶，其中所述纤维素酶可从放线菌(Actinomycete)获得。
5.一种分离的纤维素酶，来自于放线菌，当在SDS-PAGE上测量时具有大约23kD的分子量，并具有大约5.16的计算等电点。
6.一种分离的DNA序列，其编码图1E所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：_)。
7.根据权利要求6所述的DNA序列，其中所述DNA序列在图2(SEQ IDNO：_)中表示。
8.一种表达载体，包括根据权利要求6所述的DNA分子。
9.根据权利要求8所述的表达载体，其中所述表达载体进一步包含被可操纵地连接于所述DNA分子的aprE启动子或glaA启动子或A4启动子。
10.根据权利要求8所述的表达载体，其中所述表达载体进一步包含被可操纵地连接于所述DNA分子的A4启动子。
11.一种表达载体，包含编码具有SEQ.ID NO：_的氨基酸序列的多核苷酸序列。
12.根据权利要求11所述的表达载体，其中所述表达载体是pKB107。
13.一种宿主细胞，其用根据权利要求8所述的表达载体转化。
14.权利要求13所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是链霉菌属某些种(Streptomyces spp)或芽孢杆菌属某些种(Bacillus spp)。
15.权利要求13所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是链霉菌属某些种。
16.权利要求15所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是链霉菌属某些种，其中cyc2基因(土臭味素通路基因)已被缺失。
17.权利要求13所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是丝状真菌诸如曲霉属(Aspergillus)或木霉属(Trichoderma)，或者酵母诸如酵母属(Saccharomyces)。
18.一种组合物，包括根据权利要求1所述的纤维素酶。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述组合物是去污剂组合物。
20.一种去污剂组合物，包括根据权利要求1所述的纤维素酶。
21.一种生产具有纤维素活性的酶的方法，包括：
(a)用包含如权利要求6所限定的多核苷酸的表达载体稳定地转化分离的宿主细胞；
(b)在适于所述宿主细胞产生所述酶的条件下，培养所述转化的宿主细胞；以及
(c)回收所述的酶。
22.一种生产根据权利要求21所述的纤维素酶的方法，所述方法包括：
(a)在适于编码所述纤维素酶的所述DNA表达的条件下，使根据权利要求13所述转化的宿主细胞生长；和
(b)收集所产生的包含所述纤维素酶的含水混合物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述纤维素酶被进一步从所述含水混合物中纯化。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述宿主细胞是芽孢杆菌属某些种或链霉菌属某些种。
25.一种处理含纤维素织物的方法，包括将所述含纤维素的织物与根据权利要求1所述的纤维素酶相接触的步骤。
26.权利要求25所述的方法，其中所述处理是石洗。
27.权利要求25所述的方法，其中所述处理提供了有色的含纤维素织物的局部颜色变化。
28.权利要求25所述的方法，其中所述处理提供了含纤维素织物上的表面抛光效果。
29.权利要求25所述的方法，其中所述处理提供了含纤维素织物的改良的手感。
30.权利要求25所述的方法，其中所述处理提供了对含纤维素织物的颜色澄清。
31.权利要求25所述的方法，其中对所述织物的处理是通过浸泡、洗涤或漂洗所述织物来进行的。
32.一种处理纸浆的方法，包括将所述纸浆与根据权利要求1所述的纤维素酶相接触的步骤。
33.一种改善动物饲料可消化性的方法，包括用根据权利要求1所述的纤维素酶处理含纤维素饲料的步骤。
34.根据权利要求1所述纤维素酶的用途，用作动物饲料添加剂。
35.根据权利要求1所述纤维素酶的用途，用于处理纺织物。
36.根据权利要求1所述纤维素酶的用途，用于处理浆和纸。
37.根据权利要求1所述纤维素酶的用途，用于去污剂组合物中。
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