CN103911396A - 一种枯草芽孢杆菌发酵培养基 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌发酵培养基，其有效成分包括葡萄糖、蛋白胨、磷酸氢二钾、氯化钠、无水氯化钙和硫酸锰，蛋白胨的含量为1.2%～2.5%、葡萄糖的含量为1.0%～2.0%，因其成分简单且用量较少，每吨发酵液成本可降低3000～7500元；各有效成分均可溶且相辅相成，发酵液粘稠度下降，有利于后期提取工艺的简化；所得发酵液成分简单，便于提取菌体抑菌代谢产物，进而大幅提高提取物效价，所述发酵培养基培养菌体所得的发酵液效价与基础培养基培养所得发酵液相比，提高了47.89%，本发明所述培养基具有降低成本、简化后期提取工艺、提高代谢产物抑菌效价的优点，为大规模生产提供了基础。

Description

一种枯草芽孢杆菌发酵培养基

技术领域

本发明涉及一种培养基，适用于枯草芽孢杆菌发酵产生抑菌代谢产物，具体地说，涉及一种枯草芽孢杆菌发酵培养基，属于微生物发酵技术领域。

背景技术

枯草芽孢杆菌的发酵代谢产物可通过多途径杀灭致病菌，不会产生耐药性，使用的同时能够增强机体免疫机能，而且不会在畜禽体内蓄积，安全无残留，但是在规模化生产时受到一些条件的制约：由于其发酵培养基的各组成成分如酵母提取物和牛肉膏等单价较高，用量也较大，导致生产成本过高，无法应用于大规模生产；培养基中某些成分溶解性差，降低了代谢效率和产物效价，同时导致后期提取工艺复杂；培养基中组分较多，将直接导致发酵液成分复杂，增加了提取的难度，且提取物的效价难以保证，种种问题限制了枯草芽孢杆菌发酵产物在医药、农业、工业上的应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对以上不足，提供一种枯草芽孢杆菌发酵培养基，所述发酵培养基可达到降低成本、简化后期提取工艺、提高代谢产物抑菌效价的目的。

为解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：一种枯草芽孢杆菌发酵培养基，其特征在于：所述发酵培养基的有效成分包括碳源、氮源和无机盐。

一种优化方案，所述碳源为葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖或甘露醇中的一种。

另一种优化方案，所述氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、豆粕粉、玉米浆或硝酸钾中的一种。

再一种优化方案，所述无机盐为磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、氯化钾、氯化钠、硫酸镁、硫酸锰、无水氯化钙或硫酸亚铁中的一种或多种。

进一步的优化方案，所述发酵培养基的有效成分包括葡萄糖、蛋白胨、磷酸氢二钾、氯化钠、无水氯化钙和硫酸锰。

再进一步的优化方案，所述发酵培养基的组分及含量为：蛋白胨1.2%～2.5%、葡萄糖1.0%～2.0%、磷酸氢二钾0.1%～0.3%、氯化钠0.08%～0.2%、无水氯化钙0.01%～0.1%、硫酸锰0.001%～0.005%，余量为纯化水。

更进一步的优化方案，所述发酵培养基的组分及含量为：葡萄糖1.6%、蛋白胨1.45%、磷酸氢二钾0.2%、氯化钠0.08%、无水氯化钙0.05%、硫酸锰0.002%，余量为纯化水。

本发明还提供一种枯草芽孢杆菌发酵培养基的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：

1）按含量比取葡萄糖，将葡萄糖溶解于纯化水中得到葡萄糖溶液，在无菌条件下过滤，滤液保持无菌，备用；

2）按含量比取蛋白胨、磷酸氢二钾、氯化钠、无水氯化钙和硫酸锰，混合均匀，加纯化水至完全溶解；

3）将步骤2）中的混合溶液高压蒸汽灭菌；

4）在无菌条件下将步骤1）中的滤液加入到步骤3）得到的混合溶液中，混合均匀。

一种优化方案，所述步骤2）中调整混合溶液的pH值至7.2～7.4。

另一种优化方案，所述步骤3）中将步骤2）中的混合溶液置于115℃高压蒸汽灭菌30min。

本发明采用以上技术方案后，与现有技术相比，具有以下优点：所述发酵培养基的有效成分仅含有蛋白胨、葡萄糖和4种无机盐，蛋白胨的含量为1.2%～2.5%、葡萄糖的含量为1.0%～2.0%，这两种主要成分的含量大大降低，而且无机盐的种类和含量也都减少，因其成分简单且用量较少，大大降低了成本，粗略估计，每吨发酵液成本可降低3000～7500元，各有效成分均可溶且相辅相成，发酵液粘稠度下降，有利于后期提取工艺的简化；所得发酵液成分简单，便于提取菌体抑菌代谢产物，进而大幅提高提取物效价，所述发酵培养基培养菌体所得的发酵液效价与基础培养基培养所得发酵液相比，提高了47.89%，本发明所述培养基具有降低成本、简化后期提取工艺、提高代谢产物抑菌效价的优点，为大规模生产提供了基础。

下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明。

附图说明

附图1是本发明实施例1中不同碳源的发酵培养基的发酵产物效价；

附图2是本发明实施例2中不同葡萄糖含量的发酵培养基的发酵产物效价；

附图3是本发明实施例3中不同氮源的发酵培养基的发酵产物效价；

附图4是本发明实施例4中不同蛋白胨含量的发酵培养基的发酵产物效价；

附图5是本发明实施例5中不同无机盐的发酵培养基的发酵产物效价。

具体实施方式

实施例1，一种枯草芽孢杆菌发酵培养基，包括基础培养基和碳源，所述基础培养基的有效组分包括蛋白胨1%、牛肉膏0.5%和氯化钠0.5%，余量为纯化水，混合均匀后调整pH值为7.2～7.4，115℃高压灭菌30min。

取700mL上述基础培养液，平均分装于7个培养瓶中，然后往培养瓶中加入碳源，所述碳源包括葡萄糖、糊精、乳糖、麦芽糖、蔗糖、壳聚糖和甘露醇，每个培养瓶中加入所述碳源中的一种，碳源的加入量为所述发酵培养基的1%，其他成分不变，将所述碳源与基础培养液混合均匀后115℃高压灭菌30min，以基础培养基为对照，比较不同碳源对枯草芽孢杆菌发酵结果的影响，经过对发酵产物效价的测定，结果如图1所示。

由图1可知，以上碳源中，壳聚糖对抑菌物质的产生有不利影响，糊精、麦芽糖对其影响不大，葡萄糖对抑菌物质的产生最有利。

实施例2，一种枯草芽孢杆菌发酵培养基，包括基础培养基和碳源，所述基础培养基的有效组分包括蛋白胨1%、牛肉膏0.5%和氯化钠0.5%，余量为纯化水，将各组分混合均匀后于115℃高压灭菌30min。

所述碳源选用葡萄糖，葡萄糖的添加量分别设为1%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%，将称量好的葡萄糖分别溶解于纯化水中得到葡萄糖溶液，在无菌条件下过滤，滤液添加至灭菌后的基础培养基中，比较不同葡萄糖添加量对枯草芽孢杆菌发酵结果的影响，经过对发酵产物效价的测定，结果如图2所示。

由图2可知，葡萄糖添加量为1.6%时，代谢产物效价最高。

综上所述，培养基最优碳源为葡萄糖，且含量为1.6%时，枯草芽孢杆菌菌体代谢产物效价最高。

实施例3，一种枯草芽孢杆菌发酵培养基，其有效成分包括葡萄糖1.6%（单独滤膜灭菌，不进行高压灭菌）、氯化钠0.5%和氮源1%，余量为纯化水，混合均匀后调整pH值为7.2～7.4，115℃高压灭菌30min。

其中，氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、豆粕粉、玉米浆或硝酸钾中的一种。

比较不同氮源对枯草芽孢杆菌发酵结果的影响，经过对发酵产物效价的测定，结果如图3所示。

由图3可看出，以上氮源中，以蛋白胨为氮源的培养基中培养的菌体代谢产物效价最高。

实施例4，一种枯草芽孢杆菌发酵培养基，其有效成分包括葡萄糖1.6%（单独滤膜灭菌，不进行高压灭菌）、氯化钠0.5%和氮源，余量为纯化水，混合均匀后调整pH值为7.2～7.4，115℃高压灭菌30min。

所述氮源选用蛋白胨，蛋白胨的添加量为1.2%～2.5%，本实施例中所述蛋白胨的添加量分别设为1.25%、1.45%、1.65%、1.85%、2.0%、2.5%，其他成分不变，将各组分混合均匀后于115℃高压灭菌30min，比较不同含量的蛋白胨对枯草芽孢杆菌发酵结果的影响，经过对发酵产物效价的测定，结果如图4所示。

由图4可以看出，蛋白胨添加量为1.45%时，代谢产物效价最高。

综上所述，培养基中氮源为蛋白胨，且含量为1.45%时，菌体代谢产物效价最高。

实施例5，一种枯草芽孢杆菌发酵培养基，包括碳源、氮源和无机盐，余量为纯化水，所述碳源选用葡萄糖，葡萄糖的添加量为1.6%，所述氮源选用蛋白胨，蛋白胨的添加量为1.45%，所述无机盐选用磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、氯化钾、氯化钠、硫酸镁、硫酸锰、无水氯化钙或硫酸亚铁中的一种，无机盐的添加量为0.1%，比较不同无机盐对枯草芽孢杆菌发酵结果的影响，经过对发酵产物效价的测定，结果如图5所示。

由图5可看出，当无机盐选用NaCl、K₂HPO₄、CaCl₂或MnSO₄时，所得代谢产物效价最高。

实施例6，一种枯草芽孢杆菌发酵培养基，包括碳源、氮源和无机盐，余量为纯化水，所述碳源选用葡萄糖，葡萄糖的添加量为1.6%，所述氮源选用蛋白胨，蛋白胨的添加量为1.45%，所述无机盐选用氯化钠、磷酸氢二钾、无水氯化钙和硫酸锰。

通过单因素试验确定氯化钠的添加量为0.08%～0.2%，磷酸氢二钾的添加量为0.1%～0.3%，无水氯化钙的添加量为0.01%～0.1%，硫酸锰的添加量为0.001%～0.005%。

以氯化钠、磷酸氢二钾、无水氯化钙和硫酸锰四种无机盐为考察对象设计四因素三水平正交试验L₉（3⁴），对无机盐添加量进行优化，所述正交试验的因素和水平表如表1所示。

表1 无机盐优化正交实验因素和水平表

 正交试验的试验结果如表2所示。

表2 无机盐优化正交试验结果

 

影响枯草芽孢杆菌发酵产生抑菌物质的无机盐主次顺序为A＞D＞C＞B，即：K₂HPO₄＞MnSO₄＞CaCl₂＞NaCl，由表2可知，效价最高的组合是A₂B₁C₂D₃，进一步进行无机盐正交试验的验证，分别检测发酵液效价，组合A₂B₁C₂D₁效价为9986，组合A₂B₁C₂D₂效价为11000，组合A₂B₁C₂D₃效价为10910，因此经过验证，确定最佳组合为A₂B₁C₂D₂，即磷酸氢二钾0.2%、氯化钠0.08%、无水氯化钙0.05%、硫酸锰0.002% 。

实施例7，一种枯草芽孢杆菌发酵培养基，其有效组成及含量为：葡萄糖1.6%、蛋白胨1.45%、磷酸氢二钾0.2%、氯化钠0.08%、无水氯化钙0.05%、硫酸锰0.002%，余量为纯化水。

以配制100mL所述发酵培养基为例，称量1.6g葡萄糖溶解于纯化水中得到10mL葡萄糖溶液，在无菌条件下用0.22μm滤膜过滤，滤液保持无菌，备用；分别称量蛋白胨1.45g、磷酸氢二钾0.2g、氯化钠0.08g、无水氯化钙0.05g、硫酸锰0.002g，混匀，加入纯化水至90mL，待完全溶解后，进行pH值的测量，并将其调节至7.2～7.4，之后瓶口覆盖纱布和牛皮纸，用棉线扎紧，置于115℃高压蒸汽灭菌30min，无菌条件下加入灭菌的葡萄糖溶液，混匀。

取培养于YPD液体培养基（市售商品）中的枯草芽孢杆菌菌种2ml接种于该培养基中，37℃，150r/min培养36h，将发酵液离心，取上清进行药敏试验（指示菌为大肠杆菌），以无菌水为阴性对照，抗生素为阳性对照，试验结果显示，装有发酵液上清的样品孔与阳性对照相同，周围出现明显抑菌圈，说明本实施例中所述发酵培养基培养的枯草芽孢杆菌代谢产物具有较为明显的抑菌作用，对所述发酵培养基培养枯草芽孢杆菌所得的发酵液和基础培养基培养所得发酵液效价进行检测，前者效价为10046，后者为6793，二者相比，本实施例中的发酵培养基的效价提高了47.89%。

通过对现有公开的枯草芽孢杆菌发酵培养基的成分进行分析发现，多数培养基含有蛋白胨、牛肉膏、豆粕、葡萄糖、酵母浸粉以及多种无机盐等成分，而本培养基仅含有蛋白胨、葡萄糖和4种无机盐，多数培养基蛋白胨含量一般在2%～9%之间，葡萄糖含量一般在5%～10%之间，而本培养基两种主要成分含量大大降低，无机盐的种类和含量也都减少，因此粗略估计，每吨发酵液成本降低了3000～7500元，本发明在枯草芽孢杆菌代谢产物效价大幅提高的基础上，极大地降低了发酵培养基的成本，为大规模生产提供了基础。

    以上所述为本发明最佳实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识。本发明的保护范围以权利要求的内容为准，任何基于本发明的技术启示而进行的等效变换，也在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种枯草芽孢杆菌发酵培养基，其特征在于：所述发酵培养基的有效成分包括碳源、氮源和无机盐。

2.如权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌发酵培养基，其特征在于：所述碳源为葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖或甘露醇中的一种。

3.如权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌发酵培养基，其特征在于：所述氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、豆粕粉、玉米浆或硝酸钾中的一种。

4.如权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌发酵培养基，其特征在于：所述无机盐为磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、氯化钾、氯化钠、硫酸镁、硫酸锰、无水氯化钙或硫酸亚铁中的一种或多种。

5.如权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌发酵培养基，其特征在于：所述发酵培养基的有效成分包括葡萄糖、蛋白胨、磷酸氢二钾、氯化钠、无水氯化钙和硫酸锰。

6.如权利要求5所述的一种枯草芽孢杆菌发酵培养基，其特征在于：所述发酵培养基的组分及含量为：蛋白胨1.2%～2.5%、葡萄糖1.0%～2.0%、磷酸氢二钾0.1%～0.3%、氯化钠0.08%～0.2%、无水氯化钙0.01%～0.1%、硫酸锰0.001%～0.005%，余量为纯化水。

7.如权利要求6所述的一种枯草芽孢杆菌发酵培养基，其特征在于：所述发酵培养基的组分及含量为：葡萄糖1.6%、蛋白胨1.45%、磷酸氢二钾0.2%、氯化钠0.08%、无水氯化钙0.05%、硫酸锰0.002%，余量为纯化水。

8.如权利要求6或7所述的一种枯草芽孢杆菌发酵培养基的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：

1）按含量比取葡萄糖，将葡萄糖溶解于纯化水中得到葡萄糖溶液，在无菌条件下过滤，滤液保持无菌，备用；

2）按含量比取蛋白胨、磷酸氢二钾、氯化钠、无水氯化钙和硫酸锰，混合均匀，加纯化水至完全溶解；

3）将步骤2）中的混合溶液高压蒸汽灭菌；

4）在无菌条件下将步骤1）中的滤液加入到步骤3）得到的混合溶液中，混合均匀。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中调整混合溶液的pH值至7.2～7.4。

10.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述步骤3）中将步骤2）中的混合溶液置于115℃高压蒸汽灭菌30min。