CN103937717B

CN103937717B - 一种高效提高枯草芽孢杆菌出芽率的方法

Info

Publication number: CN103937717B
Application number: CN201410162370.5A
Authority: CN
Inventors: 张玲华; 邝哲师; 蔡海明; 赵祥杰; 楚品品; 叶明强
Original assignee: South China Agricultural University; Sericulture and Agri Food Research Institute GAAS
Current assignee: South China Agricultural University; Sericulture and Agri Food Research Institute GAAS
Priority date: 2014-04-22
Filing date: 2014-04-22
Publication date: 2016-05-25
Anticipated expiration: 2034-04-22
Also published as: CN103937717A

Abstract

本发明涉及微生物制备技术领域，具体地涉及一种高效提高枯草芽孢杆菌出芽率的方法。本发明在枯草芽孢杆菌发酵菌液中添加甘油作为发酵菌种，并且在发酵菌种培养至15～18h添加能提高芽孢出芽率的无机盐溶液，所述无机盐溶液含以下重量百分比的各组分：0.12～0.125%？MgSO₄·7H₂O，0.01～0.015%？MnSO₄·H₂O，0.05～0.1%？CaCl₂，0.005～0.008%？FeSO₄·7H₂O，0.015～0.02%？KI，0.035～0.04%？KH₂PO₄，上述方法获得的菌株发酵可达到5.8×10¹¹CFU/ml，芽孢数为5.49×10¹¹CFU/ml，芽孢出芽率为94.7%。

Description

一种高效提高枯草芽孢杆菌出芽率的方法

技术领域

本发明涉及微生物制备技术领域，更具体地，涉及一种高效提高枯草芽孢杆菌出芽率的方法。

背景技术

枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种，其菌体呈杆状，菌落表面粗糙不透明，污白色或微带黄色。枯草芽孢杆菌能形成芽孢，是重要的工业酶制剂的生产菌，它可用于生产α-淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、碱性磷酸酶等，另外，枯草芽孢杆菌的菌体可直接用于生物农药，因此具有广泛的应用范围和应用价值。

芽孢是产芽孢细菌在生长过程中形成的一种抗逆性休眠体，枯草芽孢杆菌的芽孢较其营养体细胞易保存，复活率高，是制备枯草芽孢杆菌制剂的理想存在形式，而制剂中的芽孢含量是影响制剂应用效果的关键因素，芽孢的形成受环境因素的影响，不同菌种形成芽孢的条件不同。

目前国内众多发酵（芽孢杆菌微生物制剂类）企业的产品存在发酵生产菌芽孢含量较低的问题，一般只有10～50×10⁷CFU/g，大大影响了产品的成本及质量。为此，采取措施提高芽孢杆菌产品发酵生产的芽孢含量、保持产品使用过程中菌体的高活性是十分必要的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中芽孢杆菌微生物制剂类产品中芽孢含量低的缺陷，提供一种高效提高枯草芽孢杆菌出芽率的方法。

本发明的另一个目的是提供上述方法制备得到的活性高、芽孢含量高的枯草芽孢杆菌产品。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现：

本发明提供一种高效提高枯草芽孢杆菌出芽率的方法，所述方法是将枯草芽孢杆菌原始出发菌株经复活和扩大培养后，接种并转入发酵培养基中，在发酵的特定阶段，向发酵液中加入特定配方组成的无机盐溶液，该无机盐溶液可以提高芽孢杆菌的出芽率；所述枯草芽孢杆菌原始出发菌种（Bacillussubtilis）可采用市购的枯草芽孢杆菌产品。

所述高效提高枯草芽孢杆菌出芽率的方法包括以下步骤：

S1.原始出发菌株经复活，扩大培养得到发酵菌液；

S2.往S1所得发酵菌液中添加甘油作为发酵菌种，保存备用；

S3.将S2所述发酵菌种接入发酵培养基，在发酵过程中添加无机盐溶液，所述无机盐溶液含以下重量百分比的各组分：0.12～0.125%MgSO₄·7H₂O、0.01～0.015%MnSO₄·H₂O、0.05～0.1%CaCl₂、0.005～0.008%FeSO₄·7H₂O、0.015～0.02%KI、0.035～0.04%KH₂PO₄，最后调pH值为6.8～7.2。

作为一种优选方式，S3所述无机盐溶液含以下重量百分比的各组分：0.122%MgSO₄·7H₂O，0.012%MnSO₄·H₂O，0.056%CaCl₂，0.007%FeSO₄·7H₂O，0.018%KI，0.037%KH₂PO₄，最后调pH值为7.0。

其中，Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、I^-、K⁺、P⁵⁺配合在一起能够有效促进细菌营养体向芽孢这种休眠体转化。细菌营养体当遇到逆境时，它自我保护产生芽孢，而无机盐以某种形式配合起来，却能起到为细菌营养体提供一个逆境的环境，促进芽孢的生成。

优选地，S3中所述无机盐溶液的添加量为发酵液体积百分数的5～10%。

最优选地，S3中所述无机盐溶液的添加量为发酵液体积百分数的8.5%。

具体地，S1所述原始出发菌株的复活和扩大培养包括以下步骤：

S11.从原始出发菌种中挑取一环菌体，接种到种子固体平板培养基上，划线分离，于36～37℃培养12～16h培养得单细胞菌落；所述种子固体平板培养基是在菌种液体培养基中加入1.5～2%琼酯倒入无菌平板中制成；

S12.挑出S11所述单细胞菌落，接种在种子固体斜面培养基上，于36～37℃培养12～16h长出菌体；所述种子固体斜面培养基是在菌种液体培养基中加入1.5～2%琼酯倒入无菌试管中制成；

S13.将S12所述菌体以1%的接种量接种到菌种液体培养基中，摇床培养至OD₆₀₀＝0.7～0.9时停止培养；

所述摇床培养是在36～37℃、150～170rpm条件下培养16～20h；所述菌种液体培养基包括以下重量百分比的组分：0.3～0.5%的葡萄糖、0.3～0.5%的NaCl、0.3～0.5%的蛋白胨；

S14.将S13所得菌液转至种子复壮固体斜面培养基上，于36～37℃培养5～6h，长出菌体；所述种子复壮固体斜面培养基是在种子复壮液体培养基中加入1.5～2%琼脂倒入无菌试管中制成；

S15.从S14所述菌体中挑取一环菌体转至种子复壮液体培养基上，摇床培养至OD₆₀₀＝1.0～1.2，停止培养，所得菌液为发酵菌液。

所述种子复壮液体培养基包括以下重量百分比的组分：0.3～0.5%的葡萄糖、0.3～0.5%的NaCl、0.2～0.5%的蛋白胨、0.5～0.6%豆粉、1.0～1.2%低聚异麦芽糖、0.8～1.0%的大豆低聚糖，该培养基配方主要是为有效提高枯草芽孢杆菌的菌种的活性而设计的。

优选地，S2所述甘油的添加量为发酵菌种体积的12～15%。

优选地，S3所述发酵培养基包括以下重量百分比的组分：1～1.1%糖蜜、0.9～1.0%玉米淀粉、0.05～0.06%K₂HPO₄、0.05～0.06%KH₂PO₄、0.18～0.2%NaCl、0.8～0.9%MgCl₂、1.5～1.6%鱼粉和1.4～1.5%豆粉。

优选地，S3中待发酵菌种生长至对数期时，添加无机盐溶液。更优选地，S3中待发酵菌种培养至15～18h时，添加无机盐溶液。这是因为细菌生长到对数生长期的中后期，细菌含量几乎达到最高，而此时细菌的活力也是最大的，对外界的影响因素也最敏感，在为了保持细菌的含量的情况下，令细菌能在发酵终止前尽可能转化为芽孢，因此选择对数生长期的中后期添加无机盐溶液。

优选地，S3所述发酵菌种接入发酵培养基的接种量为1.0～1.2%。

优选地，S3所述发酵过程中还添加泡敌、豆油、硫酸钙溶液进行发酵培养；当还原糖降至0.5～0.6g/L，氨态氮降至21～23g/L时，终止发酵。

更优选地，S3中所述泡敌和豆油分次添加，即在培养6～8h、10～12h、16～18h、24～26h时分别添加占发酵液重量百分数为0.4～0.5%的泡敌和占发酵液重量百分数为0.8～1%的豆油；所述硫酸钙溶液是在发酵菌种培养至12～14h时，添加质量浓度为18～22%的硫酸钙溶液至其浓度为6～8mg/L。

优选地，S3所述发酵可采用500～1000L发酵罐，内盛350～700L发酵培养液，S3所述发酵培养为：初始搅拌转速为300～320rpm，通风量为1:0.8～1:1vvm，控制DO在80～100%；在发酵进入8～10h时，搅拌转速为350～400rpm，通风量1:0.5～0.6vvm，控制DO值在控制在80～100%范围内；在发酵进入16～18h时，搅拌转速为300～330rpm，通风量1:1.0～1.1vvm，控制DO值在控制在80～100%范围内。

本发明还提供了上述方法制备得到的枯草芽孢杆菌产品。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种高效提高枯草芽孢杆菌出芽率的方法，所述发酵方法简单，成本低，本发明将将枯草芽孢杆菌菌株经斜面活化及种子的复壮后，得到活性高的发酵种子，再经独特设计，即在发酵培养基中加入特定配方组成的无机盐溶液促进芽孢生成的发酵工艺发酵，非常有利于提高芽孢含量及产品中菌体的活性。

本发明还提供了所述方法所得到的高活性、高芽孢含量的产品，上述方法获得的菌株发酵可达到5.8×10¹¹CFU/ml，芽孢数为5.49×10¹¹CFU/ml，芽孢出芽率为94.7%。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进一步具体描述。下述所使用的实验方法若无特殊说明，均为本技术领域现有常规的方法，所使用的配料或材料，如无特殊说明，均为通过商业途径可得到的配料或材料。

实施例1

本实施例所用的菌种为枯草杆菌属细菌（Bacillussubtilis），是从中国普通微生物菌种保藏中心购买的枯草芽孢杆菌，编号CGMCC1.433。

芽孢杆菌产品的发酵制备方法包括下述步骤：

（1）菌种液体培养基的配制：5g葡萄糖、5g氯化钠、3g蛋白胨和1L水（pH值为6.5）；配制三份；

种子复壮液体培养基的配制：5g葡萄糖、5g氯化钠、3g蛋白胨、6g豆粉、12g食用级低聚异麦芽糖、10g食用级大豆低聚糖和1L水（pH值为6.5），配制一份；

在一份上述菌种液体培养基中加入2%琼酯，倒入无菌试管中，制成种子固体斜面培养基；

在另一份上述菌种液体培养基中加入2%琼酯，倒入无菌平板中，制成种子固体平板培养基；

在第三份菌种液体培养基中加入2%琼酯，倒入无菌斜面中，制成种子固体斜面培养基；

在上述种子复壮液体培养基中加入2%琼脂，倒入无菌试管中，制成种子复壮固体斜面培养基；

（2）用无菌接种环从原始出发菌种中挑取一环菌体，接种到种子固体平板培养基上，划线分离，于37℃培养16h；

（3）待种子固体平板培养基上长出单细胞菌落，用无菌接种环挑出单细胞菌落，接种在种子固体斜面培养基上，于37℃培养16h；

（4）将种子斜面固体培养基上长出的菌体，以1%的接种量接种到菌种液体培养基中，于37℃温度下，170rpm，摇床培养20h，每h测定一次OD值，直到OD₆₀₀＝0.9，停止培养；

（5）将步骤（4）中的菌液转至种子复壮固体斜面培养基上，于37℃培养6h；

（6）从步骤（5）的种子复壮固体斜面培养基上长出的菌体中再挑取一环菌体转至种子复壮液体培养基上，于37℃，170rpm，摇床培养20h后，直到OD₆₀₀＝1.2，停止培养，作为发酵菌种；

（7）步骤（6）中培养的菌液中按体积百分比添加菌液的15%的甘油，放置于-20℃保存；

（8）发酵培养：

在1000L发酵罐内，将发酵菌种以1.2%接种量接入700L发酵培养基，分别在培养8h、12h、18h、26h时添加泡敌和豆油，每次按照发酵液重量的0.5%添加泡敌，按照发酵液重量的1%添加豆油，在培养至13h时，添加质量浓度为20%CaSO₄至CaSO₄的浓度7mg/L；

上述发酵培养基包括以下重量百分比的各组分：1%糖蜜、0.9%玉米淀粉、0.05%K₂HPO₄、0.05%KH₂PO₄、0.18%NaCl、0.8%MgCl₂、1.5%鱼粉和1.4%豆粉。

另外，可在菌种培养至对数生长期，即在菌种培养至15h，在上述发酵培养液添加能促进芽孢生成的无机盐溶液，所述无机盐溶液的添加量为发酵液体积百分数的的5%，所述无机盐溶液含以下重量百分比的各组分：0.12%MgSO₄·7H₂O，0.01%MnSO₄·H₂O，0.05%CaCl₂，0.005%FeSO₄·7H₂O，0.015%KI，0.035%KH₂PO₄，pH为6.8。

在发酵培养过程中，搅拌转速设定为320rpm、通风量设定为1:1vvm，控制DO在90%；在发酵进入10h时，调整转速至400rpm和通风量至1:0.6vvm，以保证DO值在控制在80～100%范围内；在发酵进入18h时，调整转速至330rpm和通风量至1:1.1vvm，以保证DO值在控制在80～100%范围内；

当还原糖降至0.57g/L和氨态氮降至21g/L（3,5－二硝基水杨酸法和纳氏试剂比色法）时，终止发酵得发酵产品。

实施例2

本实施例所用的菌种为枯草杆菌属细菌（Bacillussubtilis）1株，从中国普通微生物菌种保藏中心购买的枯草芽孢杆菌，编号CGMCC1.504。

芽孢杆菌产品的发酵制备方法包括下述步骤：

（1）菌种液体培养基的配制：3g葡萄糖、3g氯化钠、3g蛋白胨和1L水（pH值为6.5）；配制三份；

种子复壮液体培养基的配制：3g葡萄糖、3g氯化钠、5g蛋白胨、5g豆粉、10g食用级低聚异麦芽糖、8g食用级大豆低聚糖和1L水（pH值为6.5），配制一份；

（2）用无菌接种环从原始出发菌种中挑取一环菌体，接种到种子固体平板培养基上，划线分离，于36℃温度下培养15h；

（3）待种子固体平板培养基上长出单细胞菌落，用无菌接种环挑出单细胞菌落，接种在种子固体斜面培养基上，于36℃温度下培养15h；

（4）将种子斜面固体培养基上长出的菌体，以1%的接种量接种到菌种液体培养基中，于36℃温度下，160rpm，摇床培养18h，每h测定一次OD₆₀₀直到OD₆₀₀＝0.8，停止培养；

（5）将步骤（4）中的菌液转至种子复壮固体斜面培养基上，于36℃温度下培养5h；

（6）从步骤（5）的种子复壮固体斜面培养基上长出的菌体中再挑取一环菌体转至种子复壮液体培养基上，于36℃温度下，160rpm，摇床培养18h后，直到OD₆₀₀＝1.0，停止培养，作为发酵菌种；

（7）步骤（6）中培养的菌液中按体积百分比添加菌液的12%的甘油，放置于-18℃温度下保存；

（8）发酵培养：

在1000L发酵罐内，将发酵菌种以1.0%接种量接入350L发酵培养基，分别在培养6h、10h、16h、24h时添加泡敌和豆油，每次按照发酵液重量的0.5%添加泡敌，按照发酵液重量的1%添加豆油，在培养至12h时，添加质量浓度为19%CaSO₄至CaSO₄的浓度8mg/L；

上述发酵培养基包括以下重量百分比的各组分：1.02%糖蜜、0.95%玉米淀粉、0.055%K₂HPO₄、0.055%KH₂PO₄、0.185%NaCl、0.85%MgCl₂、1.55%鱼粉和1.45%豆粉。

另外，可在菌种培养至对数生长期，即在菌种培养至16h，在上述发酵培养液中添加无机盐溶液，所述无机盐溶液的添加量为发酵液体积百分数的6%，所述无机盐溶液含以下重量百分比的各组分：0.121%MgSO₄·7H₂O，0.011%MnSO₄·H₂O，0.06%CaCl₂，0.006%FeSO₄·7H₂O，0.016%KI，0.036%KH₂PO₄，pH为6.9。

在发酵培养过程中，搅拌转速设定为300rpm、通风量设定为1:0.9vvm，控制DO在100%；在发酵进入8h时，调整转速至350rpm和通风量至1:0.5vvm，以保证DO值在控制在80～100%范围内；在发酵进入16h时，调整转速至300rpm和通风量至1:1vvm，以保证DO值在控制在80～100%范围内；

当还原糖降至0.55g/L和氨态氮降至21.5g/L（3,5－二硝基水杨酸法和纳氏试剂比色法）时，终止发酵得发酵产品。

实施例3

本实施例所用的菌种为枯草杆菌属细菌（Bacillussubtilis），从中国普通微生物菌种保藏中心购买的枯草芽孢杆菌，编号CGMCC1.460。

芽孢杆菌产品的发酵制备方法包括下述步骤：

（1）菌种液体培养基的配制：4g葡萄糖、3.5g氯化钠、4g蛋白胨和1L水（pH值为7）；配制三份；

种子复壮液体培养基的配制：4g葡萄糖、4g氯化钠、2g蛋白胨、5.5g豆粉、11g食用级低聚异麦芽糖、8.5g食用级大豆低聚糖和1L水（pH值为7），配制一份；

（2）用无菌接种环从原始出发菌种中挑取一环菌体，接种到种子固体平板培养基上，划线分离，于36.5℃温度下培养12h；

（3）待种子固体平板培养基上长出单细胞菌落，用无菌接种环挑出单细胞菌落，接种在种子固体斜面培养基上，于36.5℃温度下培养12h；

（4）将种子斜面固体培养基上长出的菌体，以1%的接种量接种到菌种液体培养基中，于36.5℃温度下，150rpm，摇床培养16h左右，每h测定一次OD₆₀₀直到OD₆₀₀＝0.7，停止培养；

（5）将步骤（4）中的菌液转至种子复壮固体斜面培养基上，于36.5℃温度下培养5.5h；

（6）从步骤（5）的种子复壮固体斜面培养基上长出的菌体中再挑取一环菌体转至种子复壮液体培养基上，于36.5℃温度下，150rpm，摇床培养16h后，直到OD₆₀₀＝1.1，停止培养，作为发酵菌种；

（7）步骤（6）中培养的菌液中按体积百分比添加菌液的13%的甘油，放置于－19℃温度下保存；

（8）发酵培养：

在1000L发酵罐内，将发酵菌种以1.1%接种量接入500L发酵培养基，分别在培养7h、11h、16h、24h时添加泡敌和豆油，每次按照发酵液重量的0.5%添加泡敌，按照发酵液重量的1%添加豆油，在培养至13h时，添加质量浓度为20%CaSO₄至CaSO₄的浓度6mg/L；

上述发酵培养基包括以下重量百分比的各组分：1.04%糖蜜、0.96%玉米淀粉、0.056%K₂HPO₄、0.056%KH₂PO₄、0.188%NaCl、0.89%MgCl₂、1.56%鱼粉和1.47%豆粉。

另外，可在生长至对数生长期时，即在菌种培养至17h，在上述发酵培养液中添加无机盐溶液，所述无机盐的添加量为发酵液体积百分数的8.5%，所述无机盐溶液含以下重量百分比的各组分：0.122%MgSO₄·7H₂O，0.012%MnSO₄·H₂O，0.056%CaCl₂，0.007%FeSO₄·7H₂O，0.018%KI，0.037%KH₂PO₄，pH为7.0。

在发酵培养过程中，搅拌转速设定为310rpm，通风量设定为1:0.8vvm，控制DO在80%；在发酵进入8h时，调整转速至380rpm和通风量至1:0.55vvm，以保证DO值在控制在80～100%范围内；在发酵进入16.5h时，调整转速至320rpm和通风量至1:1.05vvm，以保证DO值在控制在80～100%范围内；

当还原糖降至0.60g/L和氨态氮降至22.5g/L（3,5－二硝基水杨酸法和纳氏试剂比色法）时，终止发酵得发酵产品。

实施例4

本实施例所用的菌种为枯草杆菌属细菌（Bacillussubtilis），从中国普通微生物菌种保藏中心购买，编号为CGMCC1.440。

枯草芽孢杆菌产品的发酵制备方法包括下述步骤：

（1）菌种液体培养基的配制：5g葡萄糖、5g氯化钠、4g蛋白胨和1L水（pH值为7）；配制三份；

种子复壮液体培养基的配制：4g葡萄糖、4g氯化钠、3g蛋白胨、6g豆粉、12g食用级低聚异麦芽糖、9g食用级大豆低聚糖和1L水（pH值为7），配制一份；

（2）用无菌接种环从原始出发菌种中挑取一环菌体，接种到种子固体平板培养基上，划线分离，于37℃培养15h；

（3）待种子固体平板培养基上长出单细胞菌落，用无菌接种环挑出单细胞菌落，接种在种子固体斜面培养基上，于37℃培养15h；

（4）将种子斜面固体培养基上长出的菌体，以1%的接种量接种到菌种液体培养基中，于37℃，160rpm，摇床培养18h左右，直到OD₆₀₀=0.9，停止培养；

（5）将步骤（4）中的菌液转至种子复壮固体斜面培养基上，于37℃培养5h；

（6）从步骤（5）的种子复壮固体斜面培养基上再挑取一环菌体转至种子复壮液体培养基上，于37℃，160rpm，摇床培养18h直到OD₆₀₀＝1.2，停止培养，作为发酵菌种；

（7）步骤（6）中培养的菌液中按体积百分比添加菌液15%的甘油，放置于-20℃温度下保存；

（8）发酵培养：

在1000L发酵罐内，将发酵菌种以1.2%的接种量接入600L发酵培养基，分别在培养8h、10h、17h、25h添加泡敌和豆油，每次按照发酵液重量的0.5%添加泡敌，1%添加豆油，在培养至13h时，添加质量浓度为21%CaSO₄至CaSO₄的浓度6.5mg/L。

上述发酵培养基包括以下重量百分比的各组分：1.1%糖蜜、1.0%玉米淀粉、0.06%K₂HPO₄、0.06%KH₂PO₄、0.2%NaCl、0.9%MgCl₂、1.6%鱼粉和1.5%豆粉。

另外，可在生长至对数生长期时，即在菌种培养至18h，在上述发酵培养液中添加无机盐溶液，所述无机盐溶液的添加量为发酵液体积百分数的10%；所述无机盐溶液含以下重量百分比的各组分：0.124%MgSO₄·7H₂O，0.015%MnSO₄·H₂O，0.1%CaCl₂，0.008%FeSO₄·7H₂O，0.02%KI，0.04%KH₂PO₄，pH为7.2。

在发酵培养过程中，搅拌转速设定为320rpm、通风量设定为1:0.9vvm，控制DO在85%；在发酵进入9h时，调整转速至360rpm和通风量至1:0.6vvm，以保证DO值在控制在80～100%范围内；在发酵进入17h时，调整转速至320rpm和通风量至1:1vvm，以保证DO值在控制在80～100%范围内。

当还原糖降至0.547g/L和氨态氮降至22.4g/L（3,5－二硝基水杨酸法和纳氏试剂比色法）时，终止发酵得发酵产品。

对比例1

将枯草芽孢杆菌按照实施例3所述发酵条件和步骤进行发酵，唯一不同的就是在发酵过程中不加入实施例3所述的无机盐溶液。

对比例2

将枯草芽孢杆菌按照实施例3所述发酵条件和步骤进行发酵，唯一不同的就是在发酵过程中所加入的无机盐溶液不含KI。

对比例3

将枯草芽孢杆菌按照实施例3所述发酵条件和步骤进行发酵，唯一不同的就是在发酵过程中所加入的无机盐溶液不含KI和MnSO₄·H₂O。

实施例5

从植物根系和根系土壤，按照常规稀释平板分离法选育获得的枯草杆菌属细菌（Bacillussubtilis）菌种和现有从广东省微生物研究所菌种保藏中心购买的枯草芽孢杆菌1株，分别采用本发明实施例1～4和对比例1～3所述方法和常规方法进行发酵处理（按照常用的肉汤培养基进行发酵，未添加无机盐溶液），发酵后的产品采用稀释平板计数方法测定产品活菌含量，测定结果见表1所示。

表1枯草芽胞杆菌发酵的效果对比

从表1可知，经本发明发酵方法所得活菌含量大幅度提高，其芽胞含量以达到2.05×10¹¹～7.9×10¹¹CFU/ml，其出芽率可达到94.7%。

综上所述，利用本发明技术能大幅度提高单位体积的发酵菌及芽胞含量，这极利于降低发酵企业的成本，也能提高单位体积发酵罐的利用率，提高枯草芽胞杆菌制品的产品质量。

Claims

1.一种高效提高枯草芽孢杆菌出芽率的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.原始出发菌株经复活，扩大培养得到发酵菌液；

S2.往S1所得发酵菌液中添加甘油作为发酵菌种，保存备用；

S3.将S2所述发酵菌种接入发酵培养基，在发酵过程中添加无机盐溶液，所述无机盐溶液含以下重量百分比的各组分：0.12～0.125%MgSO₄·7H₂O、0.01～0.015%MnSO₄·H₂O、0.05～0.1%CaCl₂、0.005～0.008%FeSO₄·7H₂O、0.015～0.02%KI、0.035～0.04%KH₂PO₄，最后调pH值为6.8～7.2；所述无机盐溶液的添加量为发酵液体积百分数的5～10%。

2.根据权利要求1所述高效提高枯草芽孢杆菌出芽率的方法，其特征在于，S3所述无机盐溶液含以下重量百分比的各组分：0.122%MgSO₄·7H₂O，0.012%MnSO₄·H₂O，0.056%CaCl₂，0.007%FeSO₄·7H₂O，0.018%KI，0.037%KH₂PO₄，最后调pH值为7.0。

3.根据权利要求1所述高效提高枯草芽孢杆菌出芽率的方法，其特征在于，S3中所述无机盐溶液的添加量为发酵液体积百分数的8.5%。

4.根据权利要求1所述高效提高枯草芽孢杆菌出芽率的方法，其特征在于，S3中待发酵菌种生长至对数期时，添加无机盐溶液。

5.根据权利要求4所述高效提高枯草芽孢杆菌出芽率的方法，其特征在于，S3中待发酵菌种培养至15～18h时，添加无机盐溶液。

6.根据权利要求1所述高效提高枯草芽孢杆菌出芽率的方法，其特征在于，S3所述发酵菌种接入发酵培养基的接种量为1.0～1.2%。

7.根据权利要求1所述高效提高枯草芽孢杆菌出芽率的方法，其特征在于，S3所述发酵过程中还添加泡敌、豆油、硫酸钙溶液进行发酵培养；当还原糖降至0.5～0.6g/L，氨态氮降至21～23g/L时，终止发酵；S3中所述泡敌和豆油分次添加，即在培养6～8h、10～12h、16～18h、24～26h时分别添加占发酵液重量百分数为0.4～0.5%的泡敌和占发酵液重量百分数为0.8～1%的豆油；所述硫酸钙溶液是在发酵菌种培养至12～14h时，添加质量浓度为18～22%的硫酸钙溶液至其浓度为6～8mg/L。