CN107574218A - 一种龟裂链霉菌发酵生产土霉素钙预混剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种龟裂链霉菌发酵生产土霉素钙预混剂的方法,属于兽药技术领域,该方法中通过优化种子制备过程的工艺条件,使制备得到的种子具有代谢稳定,批次差异小,菌丝浓度高,蛋白含量小,热源物质少等特点,同时,该方法通过优化培养基组分,利用该培养基培养上述种子,不但有利于土霉素特殊结构的合成,提高土霉素钙预混剂的收率,还能有利于后续对土霉素钙预混剂的分离纯化。采用高压隔膜板框机进行过滤及闪蒸干燥机进行干燥,相较于现有土霉素钙预混剂的生产方法,能有效提高发酵单位及收率,降低生产成本,同时避免化学有机溶剂的使用,防止有机溶剂对土霉素所造成的污染,避免对动物的危害。
Description
技术领域
本发明属于兽药技术领域,具体涉及一种龟裂链霉菌发酵生产土霉素钙预混剂的方法。
背景技术
土霉素为广谱抗生素,对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌都有抑制作用,对衣原体、立克次氏体、霉形体、螺旋体等也有一定的抑制作用。土霉素主要用于防治畜禽大肠杆菌感染、沙门氏菌感染(如犊牛白痢、羔羊痢疾、仔猪黄白痢、幼畜副伤寒等)、巴氏杆菌感染、布氏杆菌感染及猪喘气病、鸡慢性呼吸道病,也常用于治疗狗的立克次氏体病、猫的传染性贫血,预防狗的衣原体病和钧端螺旋体病,局部用于坏死杆菌所引起的子宫内膜炎及组织坏死等。将土霉素钙预混剂作为饲料添加剂使用,除了具有杀菌促生长、补充家畜身体所需的钙质的作用外,还可以提高饲料利用率,降低饲养成本,使得土霉素钙预混剂已在养殖行业中被广泛应用。
近年来,随着畜牧业的进一步发展,土霉素钙预混剂的市场需求量越来越大,国内外客户对土霉素钙预混剂的质量要求也越来越高。目前,土霉素钙预混剂的生产方法主要为喷雾干燥法、高温烘干法等一些传统方法,但是这些方法都存在耗能高、成本高、粉尘多、不环保等缺点。因此,为了解决传统土霉素钙预混剂生产中的问题,有必要开发新型的土霉素钙预混剂制备方法及产品。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种龟裂链霉菌发酵生产土霉素钙预混剂的方法。
为达到上述目的,本发明提供如下技术方案:
1、一种龟裂链霉菌发酵生产土霉素钙预混剂的方法,所述方法包含种子制备、种子罐培养、发酵培养、钙化处理和过滤干燥五个步骤,所述种子制备的具体方法如下:
将龟裂链霉菌孢子接种到含有孢子培养基的母斜面上,于温度为35.5±1.5℃,湿度为30~60%的条件下培养65~72小时;然后再接种到含有孢子培养基的子斜面上,于温度为29±1.5℃,湿度为30~60%的条件下培养0~24小时至孢子成熟。
进一步,所述种子罐培养的具体方法如下:
将成熟的孢子转至种子罐培养,首先进行一级种子罐培养,培养条件为:培养温度30~33℃,通气量1:1.5~2.0v/v/min,罐压0.01~0.04MPa,搅拌速度150~230rpm,培养时间15~40小时;然后按一级种子罐培养液与二级种子罐培养基体积比为1:2的比例,将一级种子罐培养液转入二级种子罐继续培养,培养条件为:培养温度30~33℃,通气量1:1.5~2.0v/v/min,罐压0.01~0.04MPa,搅拌速度150~230rpm,培养时间10~40小时。
进一步,所述发酵培养的具体方法如下:
种子罐培养完毕后转为发酵培养,发酵培养条件为:罐内温度28~33℃,通气速率为1:0.8~1:1.0v/v/min,罐压0.02~0.05MPa,搅拌速度150~230rpm,pH值5.2~6.6,发酵时间130~250小时;发酵过程中通过添加补料培养基控制发酵液总糖质量百分浓度在3~5%之间;发酵结束前,依据发酵液总糖浓度来确定添加补料量,确保发酵结束时发酵液总糖质量百分浓度不高于3%,最终得到发酵液。
进一步,所述发酵液效价≥28000u/mL。
进一步,所述钙化处理的具体方法如下:
向经发酵培养获得的发酵液中加入钙化剂,搅拌30min后获得土霉素钙化液。
进一步,所述种子制备过程中,孢子培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:麸皮5.5%,MgSO4 0.004%,KH2PO4 0.01%,(NH4)2HPO4 0.015%,琼脂粉2.0%,余量为水。
进一步,所述种子罐培养过程中,一级种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:玉米淀粉2%,花生饼粉1%,黄豆饼粉1%,酵母粉1%,玉米浆1%,碳酸钙0.4%,硫酸铵0.4%,氯化钠0.6%,磷酸二氢钾0.01%,植物油0.5%,小麦粉0.8%,麦芽糊精2.0%,氯化钴0.005%,消泡剂0.1%,余量为水。
进一步,所述种子罐培养过程中,二级种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:玉米淀粉5.5%,花生饼粉1%,黄豆饼粉1%,酵母粉0.5%,玉米浆1%,碳酸钙0.6%,硫酸铵0.4%,氯化钠0.5%,磷酸二氢钾0.01%,植物油0.5%,小麦粉1.0%,麦芽糊精1%,消泡剂0.1%,余量为水。
进一步,所述发酵培养过程中,发酵培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:玉米淀粉8%,花生饼粉1%,黄豆饼粉1%,酵母粉0.5%,玉米浆1.5%,碳酸钙0.6%,硫酸铵0.8%,氯化钠0.3%,磷酸二氢钾0.03%,淀粉酶0.06%,植物油0.4%,消泡剂0.1%,余量为水。
进一步,所述发酵培养过程中,补料培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:玉米淀粉40%,花生饼粉0.4%,黄豆饼粉0.4%,酵母粉0.3%,玉米浆2.5%,碳酸钙0.5%,硫酸铵0.6%,氯化钠0.4%,淀粉酶0.1%,消泡剂0.1%,余量为水。
进一步,所述钙化处理过程中,钙化剂为碳酸钙,所述碳酸钙的加入量为25wt%。
进一步,所述过滤干燥过程中,采用高压隔膜板框机进行过滤,采用闪蒸干燥机进行干燥。
本发明的有益效果在于:本发明提供了一种龟裂链霉菌发酵生产土霉素钙预混剂的方法,该方法中通过优化种子制备工程的工艺条件,使制备得到的种子具有代谢稳定,批次差异小,菌丝浓度高,蛋白含量小,热源物质少等特点,同时,本发明中的培养基营养合理,用于培养过程中无需单独补水。以本发明中培养基培养上述种子,不但有利于土霉素特殊结构的合成,从而提高土霉素收率,还能有利于后续对土霉素的分离纯化,有利于降低菌丝体蛋白含量,同时整体产品颗粒率明显提高,有利于土霉素钙预混剂在应用过程中分散。本发明采用高压隔膜板框机进行过滤及闪蒸干燥机进行干燥,相较于现有土霉素钙预混剂的生产方法,能有效提高发酵单位及收率,降低生产成本,同时避免化学有机溶剂的使用,防止有机溶剂对土霉素所造成的污染,避免对动物的危害。
具体实施方式
下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1
龟裂链霉菌发酵生产土霉素钙预混剂
(1)种子制备
将龟裂链霉菌孢子接种到含有孢子培养基的母斜面上,于温度为34℃,湿度为45%的条件下培养68小时;然后再接种到含有孢子培养基的子斜面上,于温度为30℃,湿度为45%的条件下培养22小时至孢子成熟。
所述孢子培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:麸皮5.5%,MgSO4 0.004%,KH2PO40.01%,(NH4)2HPO4 0.015%,琼脂粉2.0%,余量为水。
(2)种子罐培养
将成熟的孢子转至种子罐培养,首先进行一级种子罐培养,培养条件为:培养温度32℃,通气量1:2.0v/v/min,罐压0.02MPa,搅拌速度210rpm,培养时间25小时;然后按一级种子罐培养液与二级种子罐培养基体积比为1:2的比例,将一级种子罐培养液转入二级种子罐继续培养,培养条件为:培养温度32℃,通气量1:2.0v/v/min,罐压0.02MPa,搅拌速度210rpm,培养时间25小时。
所述一级种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:玉米淀粉2%,花生饼粉1%,黄豆饼粉1%,酵母粉1%,玉米浆1%,碳酸钙0.4%,硫酸铵0.4%,氯化钠0.6%,磷酸二氢钾0.01%,植物油0.5%,小麦粉0.8%,麦芽糊精2.0%,氯化钴0.005%,消泡剂0.1%,余量为水。
所述二级种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:玉米淀粉5.5%,花生饼粉1%,黄豆饼粉1%,酵母粉0.5%,玉米浆1%,碳酸钙0.6%,硫酸铵0.4%,氯化钠0.5%,磷酸二氢钾0.01%,植物油0.5%,小麦粉1.0%,麦芽糊精1%,消泡剂0.1%,余量为水。
(3)发酵培养
种子罐培养完毕后转为发酵培养,发酵培养条件为:罐内温度31℃,通气速率为1:1.0v/v/min,罐压0.03MPa,搅拌速度210rpm,pH值5.7,发酵时间210小时;发酵过程中通过添加补料培养基控制发酵液总糖质量百分浓度为4%;发酵结束前,依据发酵液总糖浓度来确定添加补料量,确保发酵结束时发酵液总糖质量百分浓度不高于3%,最终得到发酵液,该发酵液的指标为:pH为6.1,效价为34216u/mL,氨基氮含量大于自然值,滤速为1mL/min,菌丝开始自溶。
所述发酵培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:玉米淀粉8%,花生饼粉1%,黄豆饼粉1%,酵母粉0.5%,玉米浆1.5%,碳酸钙0.6%,硫酸铵0.8%,氯化钠0.3%,磷酸二氢钾0.03%,淀粉酶0.06%,植物油0.4%,消泡剂0.1%,余量为水。
所述补料培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:玉米淀粉40%,花生饼粉0.4%,黄豆饼粉0.4%,酵母粉0.3%,玉米浆2.5%,碳酸钙0.5%,硫酸铵0.6%,氯化钠0.4%,淀粉酶0.1%,消泡剂0.1%,余量为水。
(4)钙化处理
向步骤(3)中最终获得的发酵液中加入25wt%的碳酸钙,搅拌30min后获得土霉素钙化液;
(5)过滤干燥
利用高压隔膜板框机对步骤(4)中获得的土霉素钙化液进行过滤,获得土霉素湿滤饼;将获得土霉素湿滤饼放入闪蒸干燥机中干燥获得土霉素钙预混剂。
本实施例中土霉素钙收率99.5%,干燥失重3.49wt%,含砷盐小于0.0005%,含土霉素为标示量(20%)的101.9%(20.37%),颗粒率84%。
实施例2
龟裂链霉菌发酵生产土霉素钙预混剂
(1)种子制备
将龟裂链霉菌孢子接种到含有孢子培养基的母斜面上,于温度为36℃,湿度为50%的条件下培养69小时;然后再接种到含有孢子培养基的子斜面上,于温度为28℃,湿度为50%的条件下培养22小时至孢子成熟。
所述孢子培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:麸皮5.5%,MgSO4 0.004%,KH2PO40.01%,(NH4)2HPO4 0.015%,琼脂粉2.0%,余量为水。
(2)种子罐培养
将成熟的孢子转至种子罐培养,首先进行一级种子罐培养,培养条件为:培养温度32℃,通气量1:1.8v/v/min,罐压0.02MPa,搅拌速度220rpm,培养时间32小时;然后按一级种子罐培养液与二级种子罐培养基体积比为1:2的比例,将一级种子罐培养液转入二级种子罐继续培养,培养条件为:培养温度32℃,通气量1:1.8v/v/min,罐压0.02MPa,搅拌速度220rpm,培养时间32小时。
所述一级种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:玉米淀粉2%,花生饼粉1%,黄豆饼粉1%,酵母粉1%,玉米浆1%,碳酸钙0.4%,硫酸铵0.4%,氯化钠0.6%,磷酸二氢钾0.01%,植物油0.5%,小麦粉0.8%,麦芽糊精2.0%,氯化钴0.005%,消泡剂0.1%,余量为水。
所述二级种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:玉米淀粉5.5%,花生饼粉1%,黄豆饼粉1%,酵母粉0.5%,玉米浆1%,碳酸钙0.6%,硫酸铵0.4%,氯化钠0.5%,磷酸二氢钾0.01%,植物油0.5%,小麦粉1.0%,麦芽糊精1%,消泡剂0.1%,余量为水。
(3)发酵培养
种子罐培养完毕后转为发酵培养,发酵培养条件为:罐内温度29℃,通气速率为1:0.9v/v/min,罐压0.04MPa,搅拌速度220rpm,pH值6.0,发酵时间210小时;发酵过程中通过添加补料培养基控制发酵液总糖质量百分浓度为4%;发酵结束前,依据发酵液总糖浓度来确定添加补料量,确保发酵结束时发酵液总糖质量百分浓度不高于3%,最终得到发酵液,该发酵液的指标为:pH为6.3,效价为35160u/mL,氨基氮含量大于自然值,滤速为1mL/min,菌丝开始自溶。
所述发酵培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:玉米淀粉8%,花生饼粉1%,黄豆饼粉1%,酵母粉0.5%,玉米浆1.5%,碳酸钙0.6%,硫酸铵0.8%,氯化钠0.3%,磷酸二氢钾0.03%,淀粉酶0.06%,植物油0.4%,消泡剂0.1%,余量为水。
所述补料培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:玉米淀粉40%,花生饼粉0.4%,黄豆饼粉0.4%,酵母粉0.3%,玉米浆2.5%,碳酸钙0.5%,硫酸铵0.6%,氯化钠0.4%,淀粉酶0.1%,消泡剂0.1%,余量为水。
(4)钙化处理
向步骤(3)中最终获得的发酵液中加入25wt%的碳酸钙,搅拌30min后获得土霉素钙化液;
(5)过滤干燥
利用高压隔膜板框机对步骤(4)中获得的土霉素钙化液进行过滤,获得土霉素湿滤饼;将获得土霉素湿滤饼放入闪蒸干燥机中干燥获得土霉素钙预混剂。
本实施例中土霉素钙收率99.1%,干燥失重3.12%,含砷盐小于0.0005%,含土霉素为标示量(20%)的102.8%(20.56%),颗粒率90%。
实施例3
龟裂链霉菌发酵生产土霉素钙预混剂
(1)种子制备
将龟裂链霉菌孢子接种到含有孢子培养基的母斜面上,于温度为35℃,湿度为42%的条件下培养66小时;然后再接种到含有孢子培养基的子斜面上,于温度为30℃,湿度为50%的条件下培养23小时至孢子成熟。
所述孢子培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:麸皮5.5%,MgSO4 0.004%,KH2PO40.01%,(NH4)2HPO4 0.015%,琼脂粉2.0%,余量为水。
(2)种子罐培养
将成熟的孢子转至种子罐培养,首先进行一级种子罐培养,培养条件为:培养温度31℃,通气量1:1.5v/v/min,罐压0.02MPa,搅拌速度220rpm,培养时间35小时;然后按一级种子罐培养液与二级种子罐培养基体积比为1:2的比例,将一级种子罐培养液转入二级种子罐继续培养,培养条件为:培养温度31℃,通气量1:1.5v/v/min,罐压0.02MPa,搅拌速度220rpm,培养时间35小时。
所述一级种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:玉米淀粉2%,花生饼粉1%,黄豆饼粉1%,酵母粉1%,玉米浆1%,碳酸钙0.4%,硫酸铵0.4%,氯化钠0.6%,磷酸二氢钾0.01%,植物油0.5%,小麦粉0.8%,麦芽糊精2.0%,氯化钴0.005%,消泡剂0.1%,余量为水。
所述二级种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:玉米淀粉5.5%,花生饼粉1%,黄豆饼粉1%,酵母粉0.5%,玉米浆1%,碳酸钙0.6%,硫酸铵0.4%,氯化钠0.5%,磷酸二氢钾0.01%,植物油0.5%,小麦粉1.0%,麦芽糊精1%,消泡剂0.1%,余量为水。
(3)发酵培养
种子罐培养完毕后转为发酵培养,发酵培养条件为:罐内温度31℃,通气速率为1:0.8v/v/min,罐压0.03MPa,搅拌速度220rpm,pH值5.9,发酵时间220小时;发酵过程中通过添加补料培养基控制发酵液总糖质量百分浓度为4%;发酵结束前,依据发酵液总糖浓度来确定添加补料量,确保发酵结束时发酵液总糖质量百分浓度不高于3%,最终得到发酵液,该发酵液的指标为:pH为6.0,效价为35012u/mL,氨基氮含量大于自然值,滤速为1mL/min,菌丝开始自溶。
所述发酵培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:玉米淀粉8%,花生饼粉1%,黄豆饼粉1%,酵母粉0.5%,玉米浆1.5%,碳酸钙0.6%,硫酸铵0.8%,氯化钠0.3%,磷酸二氢钾0.03%,淀粉酶0.06%,植物油0.4%,消泡剂0.1%,余量为水。
所述补料培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:玉米淀粉40%,花生饼粉0.4%,黄豆饼粉0.4%,酵母粉0.3%,玉米浆2.5%,碳酸钙0.5%,硫酸铵0.6%,氯化钠0.4%,淀粉酶0.1%,消泡剂0.1%,余量为水。
(4)钙化处理
向步骤(3)中最终获得的发酵液中加入25wt%的碳酸钙,搅拌30min后获得土霉素钙化液;
(5)过滤干燥
利用高压隔膜板框机对步骤(4)中获得的土霉素钙化液进行过滤,获得土霉素湿滤饼;将获得土霉素湿滤饼放入闪蒸干燥机中干燥获得土霉素钙预混剂。
本实施例中土霉素钙收率99.5%,干燥失重4.03%,含砷盐小于0.0005%,含土霉素为标示量(20%)的101.5%(20.30%),颗粒率82%。
最后说明的是,以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述,但本领域技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种龟裂链霉菌发酵生产土霉素钙预混剂的方法,所述方法包含种子制备、种子罐培养、发酵培养、钙化处理和过滤干燥五个步骤,其特征在于,所述种子制备的具体方法如下:
将龟裂链霉菌孢子接种到含有孢子培养基的母斜面上,于温度为35.5±1.5℃,湿度为30~60%的条件下培养65~72小时;然后再接种到含有孢子培养基的子斜面上,于温度为29±1.5℃,湿度为30~60%的条件下培养0~24小时至孢子成熟。
2.根据权利要求1所述的一种龟裂链霉菌发酵生产土霉素钙预混剂的方法,其特征在于,所述种子罐培养的具体方法如下:
将成熟的孢子转至种子罐培养,首先进行一级种子罐培养,培养条件为:培养温度30~33℃,通气量1:1.5~2.0v/v/min,罐压0.01~0.04MPa,搅拌速度150~230rpm,培养时间15~40小时;然后按一级种子罐培养液与二级种子罐培养基体积比为1:2的比例,将一级种子罐培养液转入二级种子罐继续培养,培养条件为:培养温度30~33℃,通气量1:1.5~2.0v/v/min,罐压0.01~0.04MPa,搅拌速度150~230rpm,培养时间10~40小时。
3.根据权利要求1所述的一种龟裂链霉菌发酵生产土霉素钙预混剂的方法,其特征在于,所述发酵培养的具体方法如下:
种子罐培养完毕后转为发酵培养,发酵培养条件为:罐内温度28~33℃,通气速率为1:0.8~1:1.0v/v/min,罐压0.02~0.05MPa,搅拌速度150~230rpm,pH值5.2~6.6,发酵时间130~250小时;发酵过程中通过添加补料培养基控制发酵液总糖质量百分浓度在3~5%之间;发酵结束前,依据发酵液总糖浓度来确定添加补料量,确保发酵结束时发酵液总糖质量百分浓度不高于3%,最终得到发酵液。
4.根据权利要求1所述的一种龟裂链霉菌发酵生产土霉素钙预混剂的方法,其特征在于,所述钙化处理的具体方法如下:
向经发酵培养获得的发酵液中加入钙化剂,搅拌30min后获得土霉素钙化液。
5.根据权利要求1-4任一项所述的一种龟裂链霉菌发酵生产土霉素钙预混剂的方法,其特征在于,所述种子制备过程中,孢子培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:麸皮5.5%,MgSO4 0.004%,KH2PO4 0.01%,(NH4)2HPO4 0.015%,琼脂粉2.0%,余量为水。
6.根据权利要求1-4任一项所述的一种龟裂链霉菌发酵生产土霉素钙预混剂的方法,其特征在于,所述种子罐培养过程中,一级种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:玉米淀粉2%,花生饼粉1%,黄豆饼粉1%,酵母粉1%,玉米浆1%,碳酸钙0.4%,硫酸铵0.4%,氯化钠0.6%,磷酸二氢钾0.01%,植物油0.5%,小麦粉0.8%,麦芽糊精2.0%,氯化钴0.005%,消泡剂0.1%,余量为水。
7.根据权利要求1-4任一项所述的一种龟裂链霉菌发酵生产土霉素钙预混剂的方法,其特征在于,所述种子罐培养过程中,二级种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:玉米淀粉5.5%,花生饼粉1%,黄豆饼粉1%,酵母粉0.5%,玉米浆1%,碳酸钙0.6%,硫酸铵0.4%,氯化钠0.5%,磷酸二氢钾0.01%,植物油0.5%,小麦粉1.0%,麦芽糊精1%,消泡剂0.1%,余量为水。
8.根据权利要求1-4任一项所述的一种龟裂链霉菌发酵生产土霉素钙预混剂的方法,其特征在于,所述发酵培养过程中,发酵培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:玉米淀粉8%,花生饼粉1%,黄豆饼粉1%,酵母粉0.5%,玉米浆1.5%,碳酸钙0.6%,硫酸铵0.8%,氯化钠0.3%,磷酸二氢钾0.03%,淀粉酶0.06%,植物油0.4%,消泡剂0.1%,余量为水。
9.根据权利要求1-4任一项所述的一种龟裂链霉菌发酵生产土霉素钙预混剂的方法,其特征在于,所述发酵培养过程中,补料培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:玉米淀粉40%,花生饼粉0.4%,黄豆饼粉0.4%,酵母粉0.3%,玉米浆2.5%,碳酸钙0.5%,硫酸铵0.6%,氯化钠0.4%,淀粉酶0.1%,消泡剂0.1%,余量为水。
10.根据权利要求1-4任一项所述的一种龟裂链霉菌发酵生产土霉素钙预混剂的方法,其特征在于,所述钙化处理过程中,钙化剂为碳酸钙,所述碳酸钙的加入量为25wt%。
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