CN104372058A - 一种土霉素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种土霉素的制备方法，具体为将龟裂链霉菌菌种制备后先进行种子罐培养，然后转为发酵培养。待pH值达5.2～6.5，总效价≥8000U/mL，总糖含量≤3.0％，滤速≥5mL/5min时，发酵结束并放罐。最后进行板框过滤，离子交换树脂脱色，结晶，气流干燥，制得土霉素。本发明所述方法发酵工艺简单，能有效提高发酵单位，提高收率，降低生产成本，同时避免了化学有机溶剂的使用。
Description
技术领域
本发明属于制药领域，涉及一种抗生素的制备方法，具体涉及一种土霉素的制备方法。
背景技术
土霉素为广谱抗生素，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌都有抑制作用，对衣原体、立克次氏体、霉形体、螺旋体等也有一定的抑制作用。土霉素主要用于防治畜禽大肠杆菌、沙门氏菌感染(如犊牛白痢、羔羊痢疾、仔猪黄白痢、幼畜副伤寒等)、巴氏杆菌、布氏杆菌感染及猪喘气病、鸡慢性呼吸道病；也常用于治疗狗的立克次氏体病、猫的传染性贫血，预防狗的衣原体病和钧端螺旋体病；局部用于坏死杆菌所引起的子宫内膜炎及组织坏死等。而土霉素作为饲料添加剂使用，具有促进生长和提高饲料转化率的作用。
随着畜牧业的进一步发展，近年来土霉素的市场需求量不断扩大，国内外客户对土霉素的质量要求越来越高，而现有关于土霉素的制备方法主要存在收率低，成本高，质量不高的缺点，因此有必要对土霉素的制备方法进行改进。
发明内容
本发明的目的在于提供一种土霉素的制备方法，该方法能有效提高发酵单位，降低生产成本。
本发明采用的具体技术方案如下：
一种土霉素的制备方法，包括以下步骤：
a.种子培养
1)菌种制备
将龟裂链霉菌孢子接种到含有孢子培养基的母斜面上并在34±0.5℃下培养3.5～4天；然后再接种到含有孢子培养基的子斜面上，在35.5±1℃下培养3～5天，至孢子成熟；
所述孢子培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：麸皮5.5±1％，MgSO40.005±0.001％，KH2PO40.01±0.002％，(NH4)2HPO40.015±0.005％，琼脂粉2.0～2.2％，余量为水；
2)种子罐培养
将制备的孢子转至种子罐培养，首先进行一级种子罐培养，培养条件为：培养温度30～33℃，通气量1:1.5～2.0v/v/min，罐压0.01～0.04MPa，搅拌速度150～230rpm/min，培养时间15～40小时；然后按一级种子罐培养液与二级种子罐培养基体积比为1:2的比例，将一级种子罐培养液转入二级种子罐继续培养，培养条件为：培养温度30～33℃，通气量1:1.5～2.0v/v/min，罐压0.01～0.04MPa，搅拌速度150～230rpm/min，培养时间10～40小时；
所述一级种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉0～3％，花生饼粉0～1.5％，黄豆饼粉0～1.5％，酵母粉0～1％，玉米浆0～1.5％，碳酸钙0～0.6％，硫酸铵0～1％，氯化钠0～0.6％，磷酸二氢钾0～0.03％，植物油0～0.6％，小麦粉0～1.0％，麦芽糊精0～2.0％，氯化钴0～0.005％，消泡剂0～0.1％，余量为水；
所述二级种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉0～6％，花生饼粉0～2.0％，黄豆饼粉0～2.0％，酵母粉0～1％，玉米浆0～1.5％，碳酸钙0～0.9％，硫酸铵0～1％，氯化钠0～0.5％，磷酸二氢钾0～0.03％，植物油0～0.5％，小麦粉0～1.0％，麦芽糊精0～1.5％，消泡剂0～0.1％，余量为水；
b.发酵培养
种子罐培养完毕后转为发酵培养，发酵培养条件为：罐内温度28～33℃，通气速率为1：0.8～1:1.0v/v/min，罐压0.02～0.05MPa，搅拌速度150～230rpm/min，pH值5.2～6.6，发酵时间130～250小时；发酵过程中通过添加补料培养基控制发酵液总糖质量百分浓度在3～5％之间；发酵结束前，依据发酵液总糖浓度来确定添加补料量，确保发酵结束时发酵液总糖质量百分浓度不高于3％；
发酵培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉0～9.0％，花生饼粉0～2.0％，黄豆饼粉0～2.0％，酵母粉0.4～1.0％，玉米浆0～2.5％，碳酸钙0～0.9％，硫酸铵0～1.2％，氯化钠0～0.3％，磷酸二氢钾0～0.03％，淀粉酶0～0.07％，植物油0～0.4％，消泡剂0～0.1％，余量为水；
补料培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉0～50％，花生饼粉0～0.5％，黄豆饼粉0～0.5％，酵母粉0～0.5％，玉米浆0～3％，碳酸钙0～0.9％，硫酸铵0～0.9％，氯化钠0～0.5％，淀粉酶0～0.2％，消泡剂0～0.3％，余量为水；
c.发酵液的分离纯化
发酵培养结束后，对发酵液进行预处理，然后板框过滤；过滤后的滤液用122离子交换树脂进行脱色，直至滤液透光度≥90％后进入结晶罐结晶；在结晶罐内温度为8～10℃条件下，用氨水将脱色后滤液pH值调至4.4～4.8，然后保温50～60min，再进行离心分离，直至分离后湿晶体含水量按质量百分浓度计达19～20％；将离心得到的湿晶体采用气流干燥方式进行干燥，保持进风温度为100～160℃，最后得到含水量按质量百分浓度计≤10％的干粉。
优选的，所述孢子培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：麸皮5.5％，MgSO40.004％，KH2PO40.01％，(NH4)2HPO40.015％，琼脂粉2.0％，余量为水。
优选的，所述一级种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉2％，花生饼粉1％，黄豆饼粉1％，酵母粉1％，玉米浆1％，碳酸钙0.4％，硫酸铵0.4％，氯化钠0.6％，磷酸二氢钾0.01％，植物油0.5％，小麦粉0.8％，麦芽糊精2.0％，氯化钴0.005％，消泡剂0.1％，余量为水。
优选的，所述二级种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉5.5％，花生饼粉1％，黄豆饼粉1％，酵母粉0.5％，玉米浆1％，碳酸钙0.6％，硫酸铵0.4％，氯化钠0.5％，磷酸二氢钾0.01％，植物油0.5％，小麦粉1.0％，麦芽糊精1％，消泡剂0.1％，余量为水。
优选的，所述发酵培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉8％，花生饼粉1％，黄豆饼粉1％，酵母粉0.5％，玉米浆1.5％，碳酸钙0.6％，硫酸铵0.8％，氯化钠0.3％，磷酸二氢钾0.03％，淀粉酶0.06％，植物油0.4％，消泡剂0.1％，余量为水。
优选的，所述补料培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉40％，花生饼粉0.4％，黄豆饼粉0.4％，酵母粉0.3％，玉米浆2.5％，碳酸钙0.5％，硫酸铵0.6％，氯化钠0.4％，淀粉酶0.1％，消泡剂0.1％，余量为水。
优选的，包括如下步骤：
a.种子培养
1)菌种制备
将龟裂链霉菌孢子接种到含有孢子培养基的母斜面上并在34℃下培养4天；然后再接种到含有孢子培养基的子斜面上，在35℃下培养3天，至孢子成熟；
所述孢子培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：麸皮5.5％，MgSO40.004％，KH2PO40.01％，(NH4)2HPO40.015％，琼脂粉2.0％，余量为水；
2)种子罐培养
将制备的孢子转至种子罐培养，首先进行一级种子罐培养，培养条件为：培养温度32℃，通气量1:1.8v/v/min，罐压0.03MPa，搅拌速度180rpm/min，培养时间30小时；然后按一级种子罐培养液与二级种子罐培养基体积比为1:2的比例，将一级种子罐培养液转入二级种子罐继续培养，培养条件为：培养温度32℃，通气量1:1.5v/v/min，罐压0.03MPa，搅拌速度180rpm/min，培养时间30小时；
所述一级种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉2％，花生饼粉1％，黄豆饼粉1％，酵母粉1％，玉米浆1％，碳酸钙0.4％，硫酸铵0.4％，氯化钠0.6％，磷酸二氢钾0.01％，植物油0.5％，小麦粉0.8％，麦芽糊精2.0％，氯化钴0.005％，消泡剂0.1％，余量为水；
所述二级种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉5.5％，花生饼粉1％，黄豆饼粉1％，酵母粉0.5％，玉米浆1％，碳酸钙0.6％，硫酸铵0.4％，氯化钠0.5％，磷酸二氢钾0.01％，植物油0.5％，小麦粉1.0％，麦芽糊精1％，消泡剂0.1％，余量为水；
b.发酵培养
种子罐培养完毕后转为发酵培养，发酵培养条件为：罐内温度32℃，通气速率为1：0.8v/v/min，罐压0.05MPa，搅拌速度180rpm/min，pH值6.0，发酵时间199小时；发酵过程中通过添加补料培养基控制发酵液总糖质量百分浓度在3～5％之间；发酵结束前，依据发酵液总糖浓度来确定添加补料量，确保发酵结束时发酵液总糖质量百分浓度不高于3％；
所述发酵培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉8％，花生饼粉1％，黄豆饼粉1％，酵母粉0.5％，玉米浆1.5％，碳酸钙0.6％，硫酸铵0.8％，氯化钠0.3％，磷酸二氢钾0.03％，淀粉酶0.06％，植物油0.4％，消泡剂0.1％，余量为水；
所述补料培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉40％，花生饼粉0.4％，黄豆饼粉0.4％，酵母粉0.3％，玉米浆2.5％，碳酸钙0.5％，硫酸铵0.6％，氯化钠0.4％，淀粉酶0.1％，消泡剂0.1％，余量为水；
c.发酵液的分离纯化
发酵培养结束后，对发酵液进行预处理，然后板框过滤；过滤后的滤液用122离子交换树脂进行脱色，直至滤液透光度达98％后进入结晶罐结晶；在结晶罐内温度为8℃条件下，用氨水将脱色后滤液pH值调至4.7，然后保温60min，再进行离心分离，直至分离后湿晶体含水量按质量百分浓度计达19.5％；将离心得到的湿晶体采用气流干燥方式进行干燥，保持进风温度为148℃，最后得到含水量按质量百分浓度计为8.5％的干粉。
优选的，所述步骤c中所述发酵液预处理包括：首先对发酵液进行稀释，然后用草酸进行酸化，酸化后pH值为1.90～2.00，然后按重量体积比向发酵液中加入发酵液体积3.0±0.3‰的黄血盐钠，20分钟后按重量体积比加入发酵液体积2.0‰的硫酸锌。
本发明的有益效果在于：本发明发酵工艺简单，能有效提高发酵单位，提高收率，降低生产成本，同时避免了化学有机溶剂的使用，防止有机溶剂对土霉素造成污染，避免了对动物的危害；并且采用本发明所述培养基利于土霉素特殊结构的合成，从而提高土霉素收率，还能有利于后续对土霉素的分离纯化；另外，由于气流干燥以蒸汽为热源，采用气流干燥方式对土霉素进行干燥，大大提高了生产效率，降低了工作量。
具体实施方式
下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
土霉素的制备方法具体如下：
a.种子培养
1)菌种制备
将龟裂链霉菌孢子接种到含有孢子培养基的母斜面上并在34℃下培养4天；然后再接种到含有孢子培养基的子斜面上，在35℃下培养5天，至孢子成熟；
所述孢子培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：麸皮5％，MgSO40.005％，KH2PO40.01％，(NH4)2HPO40.01％，琼脂粉2％，余量为水；
2)种子罐培养
将制备的孢子转至种子罐培养，首先进行一级种子罐培养，培养条件为：温度32℃，通气量1:2.0v/v/min，罐压0.04MPa，搅拌速度200rpm/min，培养时间35小时；然后按一级种子罐培养液与二级种子罐培养基体积比为1:2的比例，将一级种子罐培养液转入二级种子罐继续培养，培养条件为：培养温度32℃，通气量1:2.0v/v/min，罐压0.03MPa，搅拌速度200rpm/min，培养时间30小时；取样检测，测得种子液为浅黄色、稠，菌丝浓度20％，pH值为5.8，总糖2.5％，氨基氮78mg/100mL，效价150U/mL，镜检结果显示菌丝呈密网状分节菌丝粗壮，无杂菌；
所述一级种子罐培养与二级种子罐培养的培养基相同，培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉3％，花生饼粉1.5％，黄豆饼粉1.5％，酵母粉1％，玉米浆1.5％，碳酸钙0.5％，硫酸铵1％，氯化钠0.6％，磷酸二氢钾0.03％，植物油0.6％，小麦粉1.0％，麦芽糊精2.0％，氯化钴0.005％，消泡剂0.1％，余量为水；
b.发酵培养
种子罐培养完毕后转为发酵培养，发酵培养条件为：罐内温度33℃，通气速率为1：1.0v/v/min，罐压0.02MPa，搅拌速度180rpm/min，pH值6.4，发酵时间110小时；发酵过程中通过添加补料培养基控制发酵液总糖质量百分浓度在3～5％之间；发酵结束前，依据发酵液总糖浓度来确定添加补料量，确保发酵结束时发酵液总糖质量百分浓度不高于3％；发酵结束测得总糖1.5％，氨基氮78mg/100mL，效价18000U/mL，滤速12mL/min；
所述发酵培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉8％，花生饼粉2％，黄豆饼粉1％，酵母粉0.5％，玉米浆1.5％，碳酸钙0.6％，硫酸铵0.8％，氯化钠0.3％，磷酸二氢钾0.03％，淀粉酶0.06％，植物油0.4％，消泡剂0.1％，余量为水；
所述补料培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉40％，花生饼粉0.4％，黄豆饼粉0.4％，酵母粉0.3％，玉米浆2.5％，碳酸钙0.5％，硫酸铵0.6％，氯化钠0.4％，淀粉酶0.1％，消泡剂0.1％，余量为水；
c.发酵液的分离纯化
1)发酵液的酸化、净化、过滤
发酵液稀释后加入草酸进行酸化，调节发酵液的pH值为1.90，取酸化样测效价为17000U/mL，滤速为14mL/min。然后按重量体积比向发酵液中加入发酵液体积3.0±0.3‰的黄血盐钠，20分钟后按重量体积比加入发酵液体积2.0‰的硫酸锌，稀释后进行板框过滤；
2)脱色
过滤后的滤液用122离子交换树脂进行脱色，直至透光度为96％后进入连续结晶罐进行结晶；
3)结晶
在结晶罐内温度为9℃条件下，向脱色后的滤液中加入质量分数为15％的氨水调节pH值至4.6，保温60min后进入离心机分离；
4)离心分离
往离心机中加入结晶步骤获得的结晶液进行分离，并用纯水洗两次，共4分钟，最后获得的湿晶体含水量按质量百分浓度计为20％；
5)干燥与混粉
湿晶体的干燥采用气流干燥，进风温度为158℃，湿粉经粉碎机粉碎进入管道，物料随热空气经扩大罐至旋风干燥器，过筛后进入混粉器，得到含水量按质量百分浓度计在7％的干粉。
本实施例的收率为85％。
其中，种子罐转移至发酵罐中的移种指标如表1：
表1 种子罐转移至发酵罐中的移种指标
| 参数 | 参考值 |
| 种子龄 | 25～80小时 |
| 外观 | 浅黄色、稠厚 |
| 菌丝浓度 | ≥10％ |
| pH值 | 降至7.10以下 |
| 效价 | ≥100U/mL |
| 镜检 | 无杂菌 |
发酵过程中糖浓度控制指标如表2：
表2 发酵过程中糖浓度控制指标
| 周期(小时) | 糖含量(％) |
| 发酵前 | 6.0～8.5 |
| 发酵过程 | ≥3.0 |
| 放罐时 | ≤3.0 |
发酵完毕后，放罐指标如表3：
表3 发酵结束后放罐指标
| 参数 | 参数值 |
| pH值 | 5.2～6.5 |
| 总效价 | ≥8000U/mL |
| 总糖含量 | ≤3.0％ |
| 发酵周期 | ≥100小时 |
| 滤速 | ≥5mL/5min |
实施例2
土霉素的制备方法具体如下：
a.种子培养
1)菌种制备
将龟裂链霉菌孢子接种到含有孢子培养基的母斜面上并在34℃下培养4天；然后再接种到含有孢子培养基的子斜面上，在36℃下培养3天，至孢子成熟；
所述孢子培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：麸皮5％，MgSO40.005％，KH2PO40.01％，(NH4)2HPO40.015％，琼脂粉2.2％，余量为水；
2)种子罐培养
将制备的孢子转至种子罐培养，首先进行一级种子罐培养，培养条件为：培养温度33℃，通气量1:1.8v/v/min，罐压0.04MPa，搅拌速度200rpm/min，培养时间30小时；测得种子液为浅黄色、稠，菌丝浓度11％，pH值为6.5，效价168U/mL，镜检结果显示菌丝呈密网状分节菌丝粗壮，无杂菌；然后按一级种子罐培养液与二级种子罐培养基体积比为1:2的比例，将一级种子罐培养液转入二级种子罐继续培养，培养条件为：培养温度32℃，通气量1:1.8v/v/min，罐压0.015MPa，搅拌速度200rpm/min，培养时间34小时；测得种子液为浅黄色、稠，菌丝浓度20％，pH值为6.9，效价268U/mL，镜检菌丝呈密网状分节菌丝粗壮，无杂菌；
所述一级种子罐培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉3％，花生饼粉1.5％，黄豆饼粉1.5％，酵母粉1％，玉米浆0.5％，碳酸钙0.4％，硫酸铵0.4％，麦芽糊精2％，小麦粉1％，氯化钠0.6％，磷酸二氢钾0.01％，植物油0.5％，氯化钴0.005％，消泡剂0.1％，余量为水；
所述二级种子罐培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉5％，花生饼粉2％，黄豆饼粉2％，酵母粉1％，玉米浆1％，碳酸钙0.9％，硫酸铵0.4％，麦芽糊精1％，小麦粉1％，氯化钠0.5％，磷酸二氢钾0.01％，植物油0.5％，消泡剂0.1％，余量为水；
b.发酵培养
种子罐培养完毕后转为发酵培养，发酵培养条件为：罐内温度30℃，通气速率为1：1.0v/v/min，罐压0.02MPa，搅拌速度210rpm/min，pH值6.1，发酵时间180小时；发酵过程中通过添加补料培养基控制发酵液总糖质量百分浓度在3～5％之间；发酵结束前，依据发酵液总糖浓度来确定添加补料量，确保发酵结束时发酵液总糖质量百分浓度不高于3％；发酵结束后测得总糖1.6％，氨基氮88mg/100mL，效价21000U/mL，滤速22mL/min；
所述发酵培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉7％，花生饼粉2％，黄豆饼粉2％，酵母粉1％，玉米浆2％，碳酸钙0.9％，硫酸铵0.8％，氯化钠0.3％，磷酸二氢钾0.03％，淀粉酶0.06％，植物油0.4％，消泡剂0.1％，余量为水；
所述补料培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉50％，花生饼粉0.5％，黄豆饼粉0.5％，酵母粉0.4％，玉米浆3％，碳酸钙0.9％，硫酸铵0.8％，氯化钠0.5％，淀粉酶0.2％，消泡剂0.2％，余量为水；
c.发酵液的分离纯化
1)发酵液的酸化、净化、过滤
发酵液稀释后加入草酸进行酸化，调节pH值为1.77，取酸化样测效价为22500U/mL，滤速为18mL/min。然后按重量体积比向发酵液中加入发酵液体积3.2‰的黄血盐钠，20分钟后按重量体积比再加入发酵液体积2.0‰的硫酸锌，稀释后进行板框过滤；
2)脱色
过滤后的滤液用122离子交换树脂进行脱色，直至透光度为96％后进入连续结晶罐进行结晶；
3)结晶
在结晶罐内温度为10℃条件下，向脱色后的滤液中加入质量分数为15％的氨水调节pH值至3.6，保温60min后进入离心机分离；
4)离心分离
往离心机中加入结晶步骤获得的结晶液进行分离，并用纯水洗两次，共4分钟，获得的湿晶体含水量按质量百分浓度计为20％；
5)干燥与混粉
湿晶体的干燥采用气流干燥，进风温度为158℃，湿粉经粉碎机粉碎进入管道，物料随热空气经扩大罐至旋风干燥器，过筛后进入混粉器，得到含水量按质量百分浓度计在7％的干粉。
本实施例收率86.5％。
其中，种子罐转移至发酵罐中的移种指标、发酵过程中糖浓度控制指标以及发酵完毕的放罐指标同实施例1。
实施例3
土霉素的制备方法具体如下：
a.种子培养
1)菌种制备
将龟裂链霉菌孢子接种到含有孢子培养基的母斜面上并在34℃下培养4天；然后再接种到含有孢子培养基的子斜面上，在35℃下培养3天，至孢子成熟；
所述孢子培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：麸皮5.5％，MgSO40.004％，KH2PO40.01％，(NH4)2HPO40.015％，琼脂粉2.0％，余量为水；
2)种子罐培养
将菌种制备后获得的孢子转至种子罐培养，首先进行一级种子罐培养，培养条件为：培养温度32℃，通气量1:1.8v/v/min，罐压0.03MPa，搅拌速度180rpm/min，培养时间30小时；培养完毕后测得种子液为浅黄色、稠，菌丝浓度15％，pH值为6.3，效价245U/mL，镜检菌丝呈密网状分节菌丝粗壮，无杂菌；然后按一级种子罐培养液与二级种子罐培养基体积比为1:2的比例，将一级种子罐培养液转入二级种子罐继续培养，培养条件为：培养温度32℃，通气量1:1.5v/v/min，罐压0.03MPa，搅拌速度180rpm/min，培养时间30小时；培养完毕后测得种子液为浅黄色、稠，菌丝浓度24％，pH值为6.4，效价368U/mL，镜检菌丝呈密网状分节菌丝粗壮，无杂菌；
所述一级种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉2％，花生饼粉1％，黄豆饼粉1％，酵母粉1％，玉米浆1％，碳酸钙0.4％，硫酸铵0.4％，氯化钠0.6％，磷酸二氢钾0.01％，植物油0.5％，小麦粉0.8％，麦芽糊精2.0％，氯化钴0.005％，消泡剂0.1％，余量为水；
所述二级种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉5.5％，花生饼粉1％，黄豆饼粉1％，酵母粉0.5％，玉米浆1％，碳酸钙0.6％，硫酸铵0.4％，氯化钠0.5％，磷酸二氢钾0.01％，植物油0.5％，小麦粉1.0％，麦芽糊精1％，消泡剂0.1％，余量为水；
b.发酵培养
种子罐培养完毕后转为发酵培养，具体为：在罐内温度为32℃，通气速率为1：0.8v/v/min，罐压为0.05MPa，搅拌速度为180rpm/min，pH值为6.0的条件下发酵199小时；发酵过程中通过添加补料培养基控制发酵液总糖质量百分浓度在3～5％之间；发酵结束前，依据发酵液总糖浓度来确定添加补料量，确保发酵结束时发酵液总糖质量百分浓度不高于3％；发酵完毕后测得总糖1.5％，氨基氮78mg/100mL，效价25000U/mL，滤速24mL/min；
所述发酵培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉8％，花生饼粉1％，黄豆饼粉1％，酵母粉0.5％，玉米浆1.5％，碳酸钙0.6％，硫酸铵0.8％，氯化钠0.3％，磷酸二氢钾0.03％，淀粉酶0.06％，植物油0.4％，消泡剂0.1％，余量为水；
所述补料培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉40％，花生饼粉0.4％，黄豆饼粉0.4％，酵母粉0.3％，玉米浆2.5％，碳酸钙0.5％，硫酸铵0.6％，氯化钠0.4％，淀粉酶0.1％，消泡剂0.1％，余量为水；
c.发酵液的分离纯化
1)发酵液的酸化、净化、过滤
发酵液稀释后先加入草酸进行酸化，使酸化后发酵液pH值为1.95，然后按重量体积比向发酵液中加入发酵液体积3.0±0.3‰的黄血盐钠，20分钟后按重量体积比再加入发酵液体积2.0‰的硫酸锌，稀释后进行板框过滤；
2)脱色
过滤后的滤液用122离子交换树脂进行脱色，直至透光度为98％后进入连续结晶罐进行结晶；
3)结晶
在结晶罐内温度为8℃的条件下，向脱色后的滤液中加入质量分数为15％的氨水调节pH值至4，保温60min后送入离心机分离；
4)离心分离
对结晶步骤获得的结晶液进行离心分离，并用水洗两次，共3～5分钟，获得的湿晶体含水量按质量百分浓度计为19.5％；
5)干燥与混粉
湿晶体的干燥采用气流干燥，进风温度为148℃，湿粉经粉碎机粉碎进入管道，物料随热空气经扩大罐至旋风干燥器，过筛后进入混粉器，得到含水量按质量百分浓度计为8.5％的干粉。
本实施例收率87.5％。
其中，种子罐转移至发酵罐中的移种指标、发酵过程中糖浓度控制指标以及发酵完毕的放罐指标同实施例1。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (8)
1.一种土霉素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.种子培养
1)菌种制备
将龟裂链霉菌孢子接种到含有孢子培养基的母斜面上并在34±0.5℃下培养3.5～4天；然后再接种到含有孢子培养基的子斜面上，在35.5±1℃下培养3～5天，至孢子成熟；
所述孢子培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：麸皮5.5±1％，MgSO40.005±0.001％，KH2PO40.01±0.002％，(NH4)2HPO40.015±0.005％，琼脂粉2.0～2.2％，余量为水；
2)种子罐培养
将制备的孢子转至种子罐培养，首先进行一级种子罐培养，培养条件为：培养温度30～33℃，通气量1:1.5～2.0v/v/min，罐压0.01～0.04MPa，搅拌速度150～230rpm/min，培养时间15～40小时；然后按一级种子罐培养液与二级种子罐培养基体积比为1:2的比例，将一级种子罐培养液转入二级种子罐继续培养，培养条件为：培养温度30～33℃，通气量1:1.5～2.0v/v/min，罐压0.01～0.04MPa，搅拌速度150～230rpm/min，培养时间10～40小时；
所述一级种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉0～3％，花生饼粉0～1.5％，黄豆饼粉0～1.5％，酵母粉0～1％，玉米浆0～1.5％，碳酸钙0～0.6％，硫酸铵0～1％，氯化钠0～0.6％，磷酸二氢钾0～0.03％，植物油0～0.6％，小麦粉0～1.0％，麦芽糊精0～2.0％，氯化钴0～0.005％，消泡剂0～0.1％，余量为水；
所述二级种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉0～6％，花生饼粉0～2.0％，黄豆饼粉0～2.0％，酵母粉0～1％，玉米浆0～1.5％，碳酸钙0～0.9％，硫酸铵0～1％，氯化钠0～0.5％，磷酸二氢钾0～0.03％，植物油0～0.5％，小麦粉0～1.0％，麦芽糊精0～1.5％，消泡剂0～0.1％，余量为水；
b.发酵培养
种子罐培养完毕后转为发酵培养，发酵培养条件为：罐内温度28～33℃，通气速率为1：0.8～1:1.0v/v/min，罐压0.02～0.05MPa，搅拌速度150～230rpm/min，pH值5.2～6.6，发酵时间130～250小时；发酵过程中通过添加补料培养基控制发酵液总糖质量百分浓度在3～5％之间；发酵结束前，依据发酵液总糖浓度来确定添加补料量，确保发酵结束时发酵液总糖质量百分浓度不高于3％；
发酵培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉0～9.0％，花生饼粉0～2.0％，黄豆饼粉0～2.0％，酵母粉0.4～1.0％，玉米浆0～2.5％，碳酸钙0～0.9％，硫酸铵0～1.2％，氯化钠0～0.3％，磷酸二氢钾0～0.03％，淀粉酶0～0.07％，植物油0～0.4％，消泡剂0～0.1％，余量为水；
补料培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉0～50％，花生饼粉0～0.5％，黄豆饼粉0～0.5％，酵母粉0～0.5％，玉米浆0～3％，碳酸钙0～0.9％，硫酸铵0～0.9％，氯化钠0～0.5％，淀粉酶0～0.2％，消泡剂0～0.3％，余量为水；
c.发酵液的分离纯化
发酵培养结束后，首先对发酵液进行预处理，然后板框过滤；过滤后的滤液用122离子交换树脂进行脱色，直至滤液透光度≥90％后进入结晶罐结晶；在结晶罐内温度为8～10℃条件下，用氨水将脱色后滤液pH值调至4.4～4.8，然后保温50～60min，再进行离心分离，直至分离后湿晶体含水量按质量百分浓度计达19～20％；将离心得到的湿晶体采用气流干燥方式进行干燥，保持进风温度为100～160℃，最后得到含水量按质量百分浓度计≤10％的干粉。
2.根据权利要求1所述的一种土霉素的制备方法，其特征在于，所述孢子培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：麸皮5.5％，MgSO40.004％，KH2PO40.01％，(NH4)2HPO40.015％，琼脂粉2.0％，余量为水。
3.根据权利要求1所述的一种土霉素的制备方法，其特征在于，所述一级种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉2％，花生饼粉1％，黄豆饼粉1％，酵母粉1％，玉米浆1％，碳酸钙0.4％，硫酸铵0.4％，氯化钠0.6％，磷酸二氢钾0.01％，植物油0.5％，小麦粉0.8％，麦芽糊精2.0％，氯化钴0.005％，消泡剂0.1％，余量为水。
4.根据权利要求1所述的一种土霉素的制备方法，其特征在于，所述二级种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉5.5％，花生饼粉1％，黄豆饼粉1％，酵母粉0.5％，玉米浆1％，碳酸钙0.6％，硫酸铵0.4％，氯化钠0.5％，磷酸二氢钾0.01％，植物油0.5％，小麦粉1.0％，麦芽糊精1％，消泡剂0.1％，余量为水。
5.根据权利要求1所述的一种土霉素的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉8％，花生饼粉1％，黄豆饼粉1％，酵母粉0.5％，玉米浆1.5％，碳酸钙0.6％，硫酸铵0.8％，氯化钠0.3％，磷酸二氢钾0.03％，淀粉酶0.06％，植物油0.4％，消泡剂0.1％，余量为水。
6.根据权利要求1所述的一种土霉素的制备方法，其特征在于，所述补料培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉40％，花生饼粉0.4％，黄豆饼粉0.4％，酵母粉0.3％，玉米浆2.5％，碳酸钙0.5％，硫酸铵0.6％，氯化钠0.4％，淀粉酶0.1％，消泡剂0.1％，余量为水。
7.根据权利要求1所述的一种土霉素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.种子培养
1)菌种制备
将龟裂链霉菌孢子接种到含有孢子培养基的母斜面上并在34℃下培养4天；然后再接种到含有孢子培养基的子斜面上，在35℃下培养3天，至孢子成熟；
所述孢子培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：麸皮5.5％，MgSO40.004％，KH2PO40.01％，(NH4)2HPO40.015％，琼脂粉2.0％，余量为水；
2)种子罐培养
将制备的孢子转至种子罐培养，首先进行一级种子罐培养，培养条件为：培养温度32℃，通气量1:1.8v/v/min，罐压0.03MPa，搅拌速度180rpm/min，培养时间30小时；然后按一级种子罐培养液与二级种子罐培养基体积比为1:2的比例，将一级种子罐培养液转入二级种子罐继续培养，培养条件为：培养温度32℃，通气量1:1.5v/v/min，罐压0.03MPa，搅拌速度180rpm/min，培养时间30小时；
所述一级种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉2％，花生饼粉1％，黄豆饼粉1％，酵母粉1％，玉米浆1％，碳酸钙0.4％，硫酸铵0.4％，氯化钠0.6％，磷酸二氢钾0.01％，植物油0.5％，小麦粉0.8％，麦芽糊精2.0％，氯化钴0.005％，消泡剂0.1％，余量为水；
所述二级种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉5.5％，花生饼粉1％，黄豆饼粉1％，酵母粉0.5％，玉米浆1％，碳酸钙0.6％，硫酸铵0.4％，氯化钠0.5％，磷酸二氢钾0.01％，植物油0.5％，小麦粉1.0％，麦芽糊精1％，消泡剂0.1％，余量为水；
b.发酵培养
种子罐培养完毕后转为发酵培养，发酵培养条件为：罐内温度32℃，通气速率为1：0.8v/v/min，罐压0.05MPa，搅拌速度180rpm/min，pH值6.0，发酵时间199小时；发酵过程中通过添加补料培养基控制发酵液总糖质量百分浓度在3～5％之间；发酵结束前，依据发酵液总糖浓度来确定添加补料量，确保发酵结束时发酵液总糖质量百分浓度不高于3％；
所述发酵培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉8％，花生饼粉1％，黄豆饼粉1％，酵母粉0.5％，玉米浆1.5％，碳酸钙0.6％，硫酸铵0.8％，氯化钠0.3％，磷酸二氢钾0.03％，淀粉酶0.06％，植物油0.4％，消泡剂0.1％，余量为水；
所述补料培养基按质量百分浓度计由以下成分组成：玉米淀粉40％，花生饼粉0.4％，黄豆饼粉0.4％，酵母粉0.3％，玉米浆2.5％，碳酸钙0.5％，硫酸铵0.6％，氯化钠0.4％，淀粉酶0.1％，消泡剂0.1％，余量为水；
c.发酵液的分离纯化
发酵培养结束后，对发酵液进行预处理，然后板框过滤；过滤后的滤液用122离子交换树脂进行脱色，直至滤液透光度达98％后进入结晶罐结晶；在结晶罐内温度为8℃条件下，用氨水将脱色后滤液pH值调至4.7，然后保温60min，再进行离心分离，直至分离后湿晶体含水量按质量百分浓度计达19.5％；将离心得到的湿晶体采用气流干燥方式进行干燥，保持进风温度为148℃，最后得到含水量按质量百分浓度计为8.5％的干粉。
8.根据权利要求1～7任一项所述的一种土霉素的制备方法，其特征在于，所述步骤c中所述发酵液预处理包括：首先对发酵液进行稀释，然后用草酸进行酸化，酸化后pH值为1.90～2.00，然后按重量体积比向发酵液中加入发酵液体积3.0±0.3‰的黄血盐钠，20分钟后按重量体积比加入发酵液体积2.0‰的硫酸锌。
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